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KR101881168B1 - 약물 저항성과 관련된 유전적 변이 - Google Patents

약물 저항성과 관련된 유전적 변이 Download PDF

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KR101881168B1
KR101881168B1 KR1020107020409A KR20107020409A KR101881168B1 KR 101881168 B1 KR101881168 B1 KR 101881168B1 KR 1020107020409 A KR1020107020409 A KR 1020107020409A KR 20107020409 A KR20107020409 A KR 20107020409A KR 101881168 B1 KR101881168 B1 KR 101881168B1
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제넨테크, 인크.
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Abstract

암이 T-DM1로의 치료가 포함되는 항유사분열제로의 치료에 대해 저항성인지를 결정하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 이러한 방법은 암에서 ABCC3 유전자가 증폭 및/또는 과발현되었는지를 결정하는 것에 관한 것이다.

Description

약물 저항성과 관련된 유전적 변이 {GENETIC VARIATIONS ASSOCIATED WITH DRUG RESISTANCE}
본 출원은 미국 가출원 일련 번호 61/036,874 (2008년 3월 14일 출원) 및 미국 가출원 일련 번호 61/054,064 (2008년 5월 16일 출원)를 우선권으로 청구하고, 이들은 거명에 의해 전문이 본원에 포함된다.
기술 분야
일반적으로 본 발명은 약물 저항성의 전조가 되는 유전적 변이에 관한 것이다.
현대 분자 종양학의 주요 목표는 환자가 최상의 이점을 제공할 가능성이 있는 화학요법제로의 표적화된 치료법을 받을 수 있도록 소정의 종양을 특성화하는 근원적인 유전적 및 게놈 변이를 확인하는 것이다. 유방암은 서방 세계에서 여성에서 가장 통상적인 형태의 암이고, 세계적으로 연간 백만명의 신규 진단 및 400,000명의 사망이 추정된다 (1). 에스트로겐 수용체 양성 암에 대한 타목시펜(Tamoxifen) (2) 및 HER2 종양유전자의 증폭이 존재하는 종양에 대한 헤르셉틴(Herceptin) (3)과 같은 표적화된 치료법의 출현이 환자 생존에 대한 상당한 효과가 있었지만, 다양한 화학요법 계획이 유방암 치료의 중요한 성분을 여전히 형성한다 (4). 유방암은 표적화된 작용제 및 화학요법제에 대한 상이한 응답을 특징으로 하는 별개의 분자 서브타입(subtype)들이 있는 이질성 질환이다. 화학요법이 다수의 경우에서 성공적인 치료 계획이지만, 50％로 추정되는 환자가 내인성 또는 후천성 다중약물(multidrug) 저항성으로 인해 이익을 얻지 못한다 (1). 다중약물 저항성 (MDR)은 구조적으로 및 기계적으로 관련되지 않을 수 있는 여러 클래스의 화학요법 약물들에 대한 암세포의 저항성을 지칭하고, ATP-의존적 유출 펌프로 작용하는 다양한 단백질의 과발현과 관련된다 (5). 유방암에서의 MDR에 기여하는 분자적 변경을 이해하는 것은 소정의 치료법에 대한 저항성 예측 및 더욱 효력이 있는 치료제의 합리적인 선택이 가능한 진단 테스트를 개발할 수 있게 하는 것에서의 중대한 첫번째 단계이다.
ABCC3 과발현이 기존의 연구에서 암 세포주에서의 후천성 다중약물 저항성에 연루되었다. 예를 들어, 리우(Liu) 등은 독소루비신의 존재 하에서의 성장에 대한 선별에 의해 유도된 세포주인 MCF-7/AdVp3000에서 어버이에 비해 ABCC3의 459배 과발현을 보고하였다 (36). 또한, 빈크리스틴으로 암종 세포주를 처리하면 이러한 세포에서 ABCC2 및 ABCC3 전사물의 유의한 상향조절이 초래되는 것으로 최근 나타났다 (37). 관련된 펌프 ABCC2(MRP2) 및 ABCC10 (MRP7)이 과발현되는 경우에 양쪽 모두 파클리탁셀 저항성을 부여하는 것으로 나타났고 (38) (39), ABCC2는 마우스 모델에서 생체내 파클리탁셀 약동학의 중요한 결정인자인 것으로 나타났다 (40). 파클리탁셀은 기존에 ABCC3에 대한 기질인 것으로 증명되지 않았고, 실제로 MDCK 또는 NIH-3T3 세포에서의 ABCC3의 이소성 과발현의 연구는 파클리탁셀에 대한 증가된 저항성을 증명하지 못했다 (41, 42). 특히, ABCC3가 장기 분석법에서 독소루비신에 대한 저항성을 부여할 수 없다는 것이 또한 발견되었지만 (41), 기능성 연구의 또다른 공개된 보고서들은 이러한 작용제의 수송에서의 ABCC3의 역할을 시사하였다 (36).
이러한 다양한 관찰들은 유방암이 여러 메커니즘을 통해 화학요법을 피할 수 있는 이질성 질환이라는 사실을 설명하고, 개별적인 암 환자에서 치료 응답을 예측하는데 사용될 수 있는 바이오마커들의 패널에 대한 필요성을 강조한다.
발명의 개요
본 발명의 한 양상은 ABCC3 유전자가 환자로부터의 테스트 암 샘플에서 증폭되었는지 여부를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 ABCC3 유전자의 증폭은 암이 항유사분열제로의 치료에 대해 저항성임을 지시하는, 환자의 암이 항유사분열제로의 치료에 대해 저항성인지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 테스트 암 샘플은 암 종양 샘플이다.
예를 들어, ABCC3 유전자의 카피수를 결정함으로써 ABCC3 유전자의 증폭이 결정된다. 일부 실시양태에서는 3 이상의 카피수가 ABCC3 유전자 증폭을 지시하고, 또다른 실시양태에서는 5 이상의 카피수가 ABCC3 유전자 증폭을 지시한다.
예를 들어, 형광 원위치 혼성화 (FISH), 서던 블롯(Southern Blot), 면역조직화학 (IHC), 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 정량적 PCR (qPCR), 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR), 비교 게놈 혼성화, 마이크로어레이-기반 비교 게놈 혼성화, 또는 라이게이스 연쇄 반응 (LCR)에 의해 ABCC3 유전자의 카피수가 결정된다.
본 발명의 또다른 양상은 ABCC3 유전자가 환자로부터의 테스트 암 샘플에서 과발현되었는지 여부를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 ABCC3 유전자의 과발현은 암이 항유사분열제로의 치료에 대해 저항성임을 지시하는, 환자의 암이 항유사분열제로의 치료에 대해 저항성인지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, ABCC3 유전자로부터의 mRNA 전사 수준을 결정함으로써 ABCC3 유전자의 과발현이 검출된다. 일부 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 유전자로부터의 mRNA 전사 수준에서의 5배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다. 또다른 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 유전자로부터의 mRNA 전사 수준에서의 25배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다.
또다른 실시양태에서, ABCC3 폴리펩티드 발현 수준을 결정함으로써 ABCC3 유전자의 과발현이 검출된다. 일부 실시양태에서, ABCC3 폴리펩티드 발현 수준은 테스트 암 샘플을 항-ABCC3 항체와 접촉시키는 단계 및 ABCC3 폴리펩티드에 대한 항-ABCC3 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 폴리펩티드 발현 수준에서의 2배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다. 또다른 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 폴리펩티드 발현 수준에서의 10배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다.
일부 실시양태에서, 암은 유방암, 난소암 및 결장직장암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항유사분열제는 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 포함), 메이탄시노이드 (예를 들어, DM1 및 DM4 포함), 및 오리스타틴 (예를 들어, 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 오리스타틴 F (MMAF) 포함), 및 이들의 유사체 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항유사분열제가 항체에 접합된다. 한 실시양태에서, 항유사분열제-항체 접합체는 메이탄시노이드-항-Her2 항체 접합체, 예컨대 트라스투주맵-DM1이다.
본 발명의 또다른 양상은 ABCC3 유전자가 유방암 종양 샘플에서 증폭되었는지 여부를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 ABCC3 유전자의 증폭은 유방암 종양이 항유사분열제로의 치료에 대해 저항성임을 지시하는, 유방암 종양이 항유사분열제로의 치료에 대해 저항성인지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
예를 들어, ABCC3 유전자의 카피수를 결정함으로써 ABCC3 유전자의 증폭이 결정된다. 일부 실시양태에서는 3 이상의 카피수가 ABCC3 유전자 증폭을 지시하고, 또다른 실시양태에서는 5 이상의 카피수가 ABCC3 유전자 증폭을 지시한다.
예를 들어, 형광 원위치 혼성화 (FISH), 서던 블롯, 면역조직화학 (IHC), 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 정량적 PCR (qPCR), 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR), 비교 게놈 혼성화, 마이크로어레이-기반 비교 게놈 혼성화, 또는 라이게이스 연쇄 반응 (LCR)에 의해 ABCC3 유전자의 카피수가 결정된다.
본 발명의 또다른 양상은 ABCC3 유전자가 환자로부터의 유방암 종양 샘플에서 과발현되었는지 여부를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 ABCC3 유전자의 과발현은 유방암 종양이 항유사분열제로의 치료에 대해 저항성임을 지시하는, 유방암 종양이 항유사분열제로의 치료에 대해 저항성인지 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, ABCC3 유전자로부터의 mRNA 전사 수준을 결정함으로써 ABCC3 유전자의 과발현이 검출된다. 일부 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 유전자로부터의 mRNA 전사 수준에서의 5배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다. 또다른 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 유전자로부터의 mRNA 전사 수준에서의 25배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다.
또다른 실시양태에서, ABCC3 폴리펩티드 발현 수준을 결정함으로써 ABCC3 유전자의 과발현이 검출된다. 일부 실시양태에서, ABCC3 폴리펩티드 발현 수준은 테스트 암 샘플을 항-ABCC3 항체와 접촉시키는 단계 및 ABCC3 폴리펩티드에 대한 항-ABCC3 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 폴리펩티드 발현 수준에서의 2배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다. 또다른 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 폴리펩티드 발현 수준에서의 10배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다.
일부 실시양태에서, 유방암 종양은 Her-2 양성 유방암 종양이다.
일부 실시양태에서, 항유사분열제는 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 포함), 메이탄시노이드 (예를 들어, DM1 및 DM4 포함), 및 오리스타틴 (예를 들어, 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 오리스타틴 F (MMAF) 포함), 및 이들의 유사체 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항유사분열제가 항체에 접합된다. 한 실시양태에서, 항유사분열제-항체 접합체는 메이탄시노이드-항-Her2 항체 접합체, 예컨대 트라스투주맵-DM1이다.
본 발명의 또다른 양상은 a) 환자로부터의 테스트 암 샘플에서 ABCC3 유전자가 증폭되었는지 여부를 검출하는 단계, 및 b) ABCC3 유전자의 증폭이 테스트 암 샘플에서 검출되지 않으면 환자를 항유사분열 약물-기반 화학요법에 대해 선택하는 단계를 포함하는, 항유사분열제-기반 화학요법에 대해 유방암 환자를 선택하는 방법을 제공한다.
예를 들어, ABCC3 유전자의 카피수를 결정함으로써 ABCC3 유전자의 증폭이 결정된다. 일부 실시양태에서는 3 이상의 카피수가 ABCC3 유전자 증폭을 지시하고, 또다른 실시양태에서는 5 이상의 카피수가 ABCC3 유전자 증폭을 지시한다.
예를 들어, 형광 원위치 혼성화 (FISH), 서던 블롯, 면역조직화학 (IHC), 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 정량적 PCR (qPCR), 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR), 비교 게놈 혼성화, 마이크로어레이-기반 비교 게놈 혼성화, 또는 라이게이스 연쇄 반응 (LCR)에 의해 ABCC3 유전자의 카피수가 결정된다.
본 발명의 또다른 양상은 a) 환자로부터의 테스트 암 샘플에서 ABCC3 유전자가 과발현되었는지 여부를 검출하는 단계, 및 b) ABCC3 유전자의 과발현이 테스트 암 샘플에서 검출되지 않으면 환자를 항유사분열 약물-기반 화학요법에 대해 선택하는 단계를 포함하는, 항유사분열제-기반 화학요법에 대해 유방암 환자를 선택하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, ABCC3 유전자로부터의 mRNA 전사 수준을 결정함으로써 ABCC3 유전자의 과발현이 검출된다. 일부 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 유전자로부터의 mRNA 전사 수준에서의 5배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다. 또다른 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 유전자로부터의 mRNA 전사 수준에서의 25배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다.
또다른 실시양태에서, ABCC3 폴리펩티드 발현 수준을 결정함으로써 ABCC3 유전자의 과발현이 검출된다. 일부 실시양태에서, ABCC3 폴리펩티드 발현 수준은 테스트 암 샘플을 항-ABCC3 항체와 접촉시키는 단계 및 ABCC3 폴리펩티드에 대한 항-ABCC3 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 폴리펩티드 발현 수준에서의 2배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다. 또다른 실시양태에서, 대조군 샘플에 비해 테스트 암 샘플에서의 ABCC3 폴리펩티드 발현 수준에서의 10배 이상의 증가에 의해 ABCC3 유전자의 과발현이 지시된다.
일부 실시양태에서, 유방암 환자는 Her-2 양성 유방암에 걸린 환자이다.
일부 실시양태에서, 항유사분열제는 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 포함), 메이탄시노이드 (예를 들어, DM1 및 DM4 포함), 및 오리스타틴 (예를 들어, 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 오리스타틴 F (MMAF) 포함), 및 이들의 유사체 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항유사분열제가 항체에 접합된다. 한 실시양태에서, 항유사분열제-항체 접합체는 메이탄시노이드-항-Her2 항체 접합체, 예컨대 트라스투주맵-DM1이다.
본 발명의 또다른 양상은 암 세포를 ABCC3의 길항제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 항유사분열제에 대한 암 세포의 저항성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 길항제는 ABCC3 항체 또는 ABCC3에 결합하는 siRNA이다.
본 발명의 또다른 양상은 환자에게 ABCC3의 길항제 및 치료적 유효량의 항유사분열제를 투여하는 단계를 포함하는, 항유사분열제에 대해 저항성인 암에 걸린 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 길항제는 ABCC3 항체 또는 ABCC3에 결합하는 siRNA이다. 일부 실시양태에서, 항유사분열제는 탁산, 메이탄시노이드 및 오리스타틴, 및 이들의 유사체 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항유사분열제가 항체에 접합된다. 한 실시양태에서, 항유사분열제-항체 접합체는 메이탄시노이드-항-Her2 항체 접합체, 예컨대 트라스투주맵-DM1이다.
본 발명은 환자의 암의 ABCC3 증폭 상태를 기초로 암 환자를 치료하는 방법을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 환자로부터의 테스트 암 샘플에서 ABCC3 유전자가 증폭 또는 과발현되었는지 여부를 검출하는 단계 및 ABCC3 유전자의 증폭 또는 과발현이 테스트 암 샘플에서 검출되지 않으면 환자에게 치료적 유효량의 항유사분열 약물-기반 화학요법을 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 환자는 Her2 양성 유방암에 걸린 환자이고, 항-Her2 항체-항유사분열제 접합체, 예컨대 트라스투주맵-DM1 또는 트라스투주맵-MMAE가 환자에게 투여된다.
본 발명의 또다른 양상에서, 환자의 암에서의 ABCC3 증폭 또는 과발현의 부재를 기초로 환자가 항유사분열 약물-기반 화학요법에 대해 선택되고, 치료적 유효량의 항유사분열 약물이 환자에게 투여된다. 한 실시양태에서, 선택된 환자는 Her2 양성 유방암에 걸린 환자이고, 항-Her2 항체-항유사분열제 접합체, 예컨대 트라스투주맵-DM1 또는 트라스투주맵-MMAE이 환자에게 투여된다.
도 1a는 MMAE에 대한 유방암 세포주들의 시험관내 응답을 도해한다. 도 1b는 파클리탁셀에 대한 유방암 세포주들의 시험관내 응답을 도해한다. x축 상에, 유방암의 주요 분자 서브타입으로 세포주들이 분류되었다. y축은 시험관내 IC50 값, 또는 세포 생육력의 50％ 억제를 초래한 약물 농도를 가리킨다. 수평선은 소정의 서브타입의 세포주들에 대한 각각의 작용제의 평균 민감도를 가리킨다.
도 2a는 파클리탁셀에 대한 시험관내 저항성이 염색체 17q21 영역의 증폭과 관련된다는 것을 나타낸다. 도 2b는 MMAE에 대한 시험관내 저항성이 염색체 17q21 영역의 증폭과 관련된다는 것을 나타낸다. 왼쪽에서 오른쪽으로 작용제에 대한 민감도가 증가하는 순서로 세포주들이 제시된다. SNP 어레이 데이터의 지도(supervised) 분석 및 저항성 바이오마커의 확인에 사용된 분류 (민감성, 중간, 저항성)가 도면의 상부에서 지시된다. 게놈 DNA 카피수 증폭이 있는 세포주들이 다이아몬드로 지시된다.
도 3은 17q21.3 증폭이 있는 세포주에서 ABCC3가 과발현된다는 것을 나타낸다. 31개의 세포주가 영역 내에서의 카피수 차단값 4를 기초로 증폭 클래스 및 비-증폭 클래스로 비닝(binning)되었다. 상자-수염(box-and-whisker) 플롯이 각각의 군에서의 ABCC3의 발현을 나타낸다. 208161_s_at이 ABCC3를 나타내는 가장 가변성인 어피메트릭스(Affymetrix) 발현 프로브 셋트로서 선택되었다. 또다른 프로브 셋트들이 유사한 결과를 제공하였다. 중앙의 상자는 사분위(interquartile) 범위를 나타내고, 상자 내부의 선은 중앙값을 가리키며, 수직 점선은 중앙값으로부터 가장 멀지만 사분위 범위의 1.5배 이내인 데이터 포인트에 달한다. 수직 점선 외부의 데이터 포인트는 개별적인 원으로 표시된다.
도 4a-4d는 ABCC3 또는 대조군 siRNA 처리 후 4가지 상이한 세포주에 대한 파클리탁셀 처리에 응답한 유사분열 지수를 나타내는 그래프이다. EFM-192A (a) 및 ZR-75-30 (b) 세포는 ABCC3의 증폭 및 과발현이 있고 녹다운(knockdown) 후 강화된 민감도 (증가된 유사분열 지수)를 나타낸 반면, HCC-1428 (c) 및 MDA-MB-453 (d)은 카피수 및 발현이 낮고, 증가된 민감도를 나타내지 않는다.
도 5는 ABCC3의 안정적인 과발현이 파클리탁셀 및 MMAE에 대한 시험관내 저항성을 초래한다는 것을 나타낸다. CMV 프로모터로부터 ABCC3을 과발현하는 단일 세포 클론으로부터 유래된 안정적인 세포주 또는 빈 벡터가 있는 대조군 세포주를 파클리탁셀 (도 5a) 또는 MMAE (도 5b)의 성장 억제 효과에 대해 분석하였다.
도 6은 MMAE (a) 또는 파클리탁셀 (b)로 처리된 유방암 세포주의 성장 억제를 나타낸다. 포인트들은 비-선형 용량-응답 곡선 피팅(fitting)으로 384웰 플레이트 내의 4개의 복제 웰의 평균을 나타낸다. y축은 대조군 비히클로 처리된 웰에 대한 세포 생육력 백분율을 가리킨다. 오차 막대는 표준 편차를 가리킨다.
도 7은 표준 세포 생육력 분석법에서 유리 DM1에 대한 민감도에 대해 분석된 3개의 ABCC3 과발현 클론 및 대조군 세포주를 나타낸다.
도 8은 대조군 (NTC) 또는 ABCC3 siRNA로 형질감염된 EFM-192A 세포의 트라스투주맵-mc-vc-PAB-MMAF로 처리되었을 때의 유사분열 지수를 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 9a는 대조군 (NTC) 또는 ABCC3 siRNA로 형질감염된 EFM-192A 세포의 유리 DM1로 처리되었을 때의 유사분열 응답을 나타낸다. 도 9b는 대조군 (NTC) 또는 ABCC3 siRNA로 형질감염된 EFM-192A 세포의 T-DM1로 처리되었을 때의 유사분열 응답을 나타낸다.
도 10은 T-DM1 II상 시험으로부터 수득된 샘플에 대해 수행된 FISH 분석의 결과를 나타낸다.
도 11은 세포주의 분자 서브타입 및 이들의 항유사분열 약물에 대한 민감도에 관한 정보를 나타내는 표이다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
"유전자 증폭" 및 "유전자 중복" (및 "유전자의 증폭" 또는 "유전자의 중복"과 같은 변형)라는 구절은 상호교환가능하게 사용되고, 특정 세포 또는 세포주에서 유전자 또는 유전자 단편의 여러 카피가 형성되는 프로세스를 지칭한다. 중복된 영역 (증폭된 DNA의 스트레치(stretch))은 종종 "앰플리콘(amplicon)"으로 지칭된다. 일반적으로, 생산된 메신저 RNA (mRNA)의 양, 즉 유전자 발현 수준이 특정 유전자로 제조된 카피의 수와 비례하여 또한 증가된다.
본원에서 사용된 용어 "ABCC3"는, 달리 지시되지 않는 한, 영장류 (예를 들어, 인간 및 원숭이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)와 같은 포유동물이 포함되는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 ABCC3 (MRP-3으로 또한 공지됨)을 지칭한다. 이 용어는 프로세싱되지 않은 "전장" ABCC3, 뿐만 아니라 세포 내에서의 프로세싱으로부터 초래된 임의 형태의 ABCC3을 포함한다. 이 용어는 ABCC3의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스(splice) 변이체, 대립유전자 변이체, 및 기타 이소형(isoform)을 또한 포함한다. 이 용어는 ABCC3의 하나 이상의 생물학적 활성을 유지하는 천연 ABCC3의 단편 또는 변이체를 또한 포함한다. ABCC3의 예로는 진뱅크(Genbank) 접속 번호 NM_003786 (인간) 및 XM_358306 (마우스)로 확인되는 것들이 포함된다. [Kiuchi, et al., FEBS Lett. 433:149-152 (1998)]; 및 [Borst, et al., JNCI 92(16):1295-1302 (2000)]을 또한 참조한다.
용어 "유전적 변이"는 유전자 또는 폴리펩티드의 증폭에서의 변이, 뿐만 아니라 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 변이를 포함한다.
용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
본원에서 사용된 "종양"은 모든 신생물성 세포 성장 및 증식 (악성이든 또는 양성이든), 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본원에서 지칭될 때 서로 배타적이지 않다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않은 세포 성장/증식을 전형적으로 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종 (예를 들어, 호지킨(Hodgkin) 및 비-호지킨 림프종), 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 이같은 암의 더욱 특정한 예로는 편평세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포 암, 위장관 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 기타 림프증식성 장애, 및 다양한 유형의 두경부암이 포함된다.
항유사분열제로의 "치료에 응답하는" 또는 "치료에 대해 응답성인" 암 환자는 항유사분열제로의 치료로부터 또는 이러한 치료의 결과로서 임상 또는 치료 이점을 나타내는 환자이다. 이같은 이점에는 세포성 또는 생물학적 응답, 완전한 응답, 부분적인 응답, 안정적인 질환 (진행 또는 재발 없음), 또는 재발이 더 늦어진, 항유사분열제로의 치료로부터 또는 이러한 치료의 결과로서의 환자의 응답이 포함된다.
항유사분열제로의 "치료에 대해 저항성인" 암, 암 세포, 또는 암 종양은 항유사분열제에 대해 통계학적으로 유의한 세포성 또는 생물학적 응답을 나타내지 않는 것이다. 역으로, 항유사분열제로의 치료에 대해 저항성이지 않은 암, 암 세포 또는 암 종양은 항유사분열제에 대해 통계적으로 유의한 세포성 또는 생물학적 응답, 예를 들어, 항유사분열제로 치료되지 않은 암 세포 또는 종양과 비교하여 세포 사망 속도 또는 세포자멸사의 증가, 또는 증식 또는 성장의 감소를 나타낸다. 특정 실시양태에서, IC50이 MMAE 30 nM을 초과하거나, 또는 별법적으로 50 nM을 초과하거나, 또는 별법적으로 100 nM을 초과한다면 암, 암 세포, 또는 암 종양이 MMAE로의 치료에 대해 저항성이다. 또다른 실시양태에서, IC50이 파클리탁셀 50 nM을 초과하거나, 또는 별법적으로 100 nM을 초과하거나, 또는 별법적으로 500 nM을 초과하거나, 또는 별법적으로 1000 nM을 초과한다면 암, 암 세포, 또는 암 종양이 파클리탁셀로의 치료에 대해 저항성이다.
"항유사분열제"는 유사분열을 억제하거나, 방지하거나, 또는 다른 방식으로 파괴하는 화합물이다. 항유사분열제의 구체적인 예로는 탁산, 예컨대 파클리탁셀 및 도세탁셀; 메이탄시노이드, 예컨대 DM1 및 DM4; 돌라스타틴 10; 돌라스타틴 15; 오리스타틴, 예컨대 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 오리스타틴 F (MMAF); 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈블라스틴 및 빈크리스틴; 및 이들의 유사체 및 유도체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 임의적으로, 항유사분열제가 항체에 접합된다.
용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 수단 양쪽 모두를 지칭하고, 이때 목표는 원치 않는 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 발달 또는 확산을 방지하거나 느리게 (작게) 하는 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 이로운 또는 원하는 임상 결과에는 검출가능 또는 검출불능 여부와 관계없이 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 진정 (부분적 또는 전체적)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 또한 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상은 용태 또는 장애가 이미 있는 대상, 뿐만 아니라 용태 또는 장애에 걸리기 쉬운 대상 또는 용태 또는 장애를 방지하려는 대상이 포함된다.
"개체" 또는 "환자"는 척추동물이다. 특정 실시양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물에는 농장 동물 (예컨대 소), 스포츠 동물, 애완 동물 (예컨대, 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 환자는 인간이다.
"유효량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 이를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다.
본 발명의 물질/분자의 "치료적 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 응답을 도출하는 물질/분자의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료적 유효량은 치료적으로 이로운 효과가 물질/분자의 임의의 독성 또는 해로운 효과를 능가하는 양을 포함한다. "예방적 유효량"은 원하는 예방적 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 그리고 기간 동안 이를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 필수적이지는 않지만 전형적으로, 예방 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사망 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제 (예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터칼레이팅제(intercalating agent)), 효소 및 이의 단편, 예컨대 뉴클레오용해성(nucleolytic) 효소, 항생제, 및 박테리아, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 (이의 단편 및/또는 변이체 포함) 또는 소형-분자 독소와 같은 독소, 및 하기에 개시되는 다양한 항종양 또는 항암 작용제를 포함하도록 의도된다. 기타 세포독성제가 하기에 기술된다. "종양치사제(tumoricidal agent)"는 종양 세포의 파괴를 야기한다.
"독소"는 세포의 성장 또는 증식에 대해 해로운 효과를 지닐 수 있는 임의의 물질이다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 폴리펩티드, 예컨대 ABCC3의 생물학적 활성, 또는 이의 전사 또는 번역을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 적절한 길항제 분자에는 길항제 항체, 폴리펩티드 단편, 올리고펩티드, 유기 분자 (소형 분자 포함), 및 안티-센스(anti-sense) 핵산 (siRNA 포함)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
"항체" (Ab) 및 "면역글로불린" (Ig)은 구조적 특징이 유사한 당단백질을 지칭한다. 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로불린은 항체 및 일반적으로 항원 특이성이 없는 기타 항체-유사 분자 양쪽 모두를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는, 예를 들어, 림프계에 의해 낮은 수준으로 생산되고, 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 가장 넓은 의미로 상호교환가능하게 사용되고, 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 또는 무손상 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 1가 항체, 다가 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 항체, 단 원하는 생물학적 활성을 나타냄)를 포함하며, 특정 항체 단편 (본원에서 더욱 상세하게 기술됨)을 또한 포함할 수 있다. 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 인간화 항체 및/또는 친화력 성숙 항체일 수 있다.
용어 "항-ABCC3 항체" 또는 "ABCC3에 결합하는 항체"는 항체가 ABCC3의 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화력으로 ABCC3에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 관련되지 않은 비-ABCC3 단백질에 항-ABCC3 항체가 결합하는 정도는, 방사선면역분석법 (RIA)에 의해 예를 들어 측정 시, ABCC3에 대한 항체의 결합의 약 10％ 미만이다. 특정 실시양태에서, ABCC3에 결합하는 항체의 해리 상수 (Kd)는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.1 nM이다. 특정 실시양태에서, 항-ABCC3 항체는 여러 종으로부터의 ABCC3 간에 보존되는 ABCC3의 에피토프에 결합한다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 하기에 기술되는 바와 같은 항체 단편이 아닌, 실질적으로 무손상 형태인 항체를 지칭하도록 상호교환가능하게 본원에서 사용된다. 이 용어들은 Fc 영역을 함유하는 중쇄가 있는 항체를 특히 지칭한다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 일부만을 포함하고, 이때 이러한 부분은 무손상 항체 내에 존재할 때 이러한 부분과 정상적으로 관련되는 기능들 중 하나 이상, 많게는 대부분 또는 모두를 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체의 항원 결합 영역을 포함하고, 따라서 항원에 결합하는 능력을 유지한다. 또다른 실시양태에서, 항체 단편, 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 단편은 무손상 항체 내에 존재할 때 Fc 영역과 정상적으로 관련된 생물학적 기능, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조정, ADCC 기능 및 보체 결합 중 하나 이상을 유지한다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 생체내 반감기가 무손상 항체와 실질적으로 유사한 일가 항체이다. 예를 들어, 이같은 항체 단편은 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 연결된 항원 결합 팔(arm)을 포함할 수 있다.
항체를 파파인(papain)으로 소화시키면 "Fab" 단편으로 칭해지는, 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원-결합 단편과, 나머지 "Fc" 단편이 생산되는데, Fc라는 명칭은 이의 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것이다. 펩신으로 처리하면 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원과 가교될 수 있는 F(ab')2 단편이 산출된다.
"Fv"는 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-사슬 Fv 종은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단한 비공유결합으로 회합되어 있는 이량체로 구성된다. 단일쇄 Fv (scFv) 종에서, 1개의 중쇄 가변 도메인 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 경쇄와 중쇄가 2-사슬 Fv 종에서의 것과 유사한 "이량체성" 구조로 회합될 수 있도록 가요성 펩티드 링커(linker)에 의해 공유결합으로 연결될 수 있다. 각각의 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원-결합 부위를 규정하는 것은 이러한 형상 내이다. 총괄적으로, 6개의 CDR이 항원-결합 특이성을 항체에 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)도, 비록 전체 결합 부위보다는 낮은 친화력이지만, 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 또한 함유한다. Fab' 단편은, 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기들이 부가되어 있어서 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올 기를 갖는 Fab'에 대한 본원에서의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 힌지 시스테인이 사이에 있는 Fab' 단편들의 쌍으로서 본래 생산되었다. 항체 단편들의 기타 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재하는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 리뷰를 위해, [Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참조한다.
용어 "디아바디(diabody)"는 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭한다. 동일한 사슬 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성하도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들은 또다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성하도록 강요된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO93/11161; [Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134]; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 충분하게 기술되어 있다. 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)가 [Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134]에 또한 기술되어 있다.
본원에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체들은 미량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어, 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 별개의 항체들의 혼합물이 아니라는 항체의 특성을 가리킨다. 특정 실시양태에서, 이같은 모노클로날 항체는 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 전형적으로 포함하고, 이때 표적-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터의 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 프로세스에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선별 프로세스는 하이브리도마(hybridoma) 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀(pool)과 같은 다수의 클론으로부터의 독특한 클론의 선별일 수 있다. 예를 들어, 표적에 대한 친화력 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양에서의 생산 개선, 생체내 면역원성 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해, 선별된 표적 결합 서열이 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체 또한 본 발명의 모노클로날 항체라는 것을 이해하여야 한다. 여러 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 여러 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 이의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체 제제는 전형적으로 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
수식어구 "모노클로날"은 항체들의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된다는 항체의 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법 (예를 들어, [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]; [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]; [Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]), 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지 디스플레이 기술 (예를 들어, [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)] 참조), 및 인간 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 모두를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생산하기 위한 기술 (예를 들어, WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; [Marks et al., Bio. Technology 10:779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368:812-813 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996)] 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)] 참조)이 예를 들어 포함되는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에서의 모노클로날 항체에는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 사슬(들)의 나머지 부분은 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이같은 항체의 단편이 명확하게 포함된다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).
비-인간 (예를 들어, 뮤린(murine)) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및/또는 능력이 있는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (도너 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 교체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 도너 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 정련시키기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 임의적으로, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. 추가적인 상세사항을 위해, [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 하기의 리뷰 문헌 및 이에 인용된 참고문헌을 또한 참조한다: [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)]; [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)]; [Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)].
"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고/하거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조용 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조된 항체이다. 이같은 기술에는 인간-유래 조합형 라이브러리, 예컨대 파지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 것 (예를 들어, [Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)] 및 [Hoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19:4133-4137 (1991)] 참조); 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주를 사용하는 것 (예를 들어, [Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조); 및 내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉(transgenic) 동물 (예를 들어, 마우스)에서 모노클로날 항체를 생성시키는 것 (예를 들어, [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255 (1993)]; [Bruggermann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993)] 참조)이 포함된다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 동물로부터의 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 제외한다.
"친화력 성숙된" 항체는 이의 하나 이상의 CDR 내에 하나 이상의 변경이 있어 이러한 변경(들)이 없는 어버이 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화력이 개선된 것이다. 한 실시양태에서, 친화력 성숙된 항체는 표적 항원에 대한 친화력이 나노놀 또는 심지어 피코몰이다. 친화력 성숙된 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산된다. [Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에 VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화력 성숙이 기술되어 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발이 [Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; [Schier et al. Gene 169:147-155 (1995)]; [Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; [Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)]; 및 [Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 기술되어 있다.
"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 자신이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 억제한다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소타입에 의해 변한다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화가 포함된다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체와 결합하는 것 (감마 수용체)이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (이러한 수용체들의 대립유전자 변이체 및 별법적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함한다. FcγRII 수용체에는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")가 포함되고, 이들은 주로 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인 내에 면역수용체 타이로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인 내에 면역수용체 타이로신계 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 ([Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 리뷰되어 있다. 추후에 확인될 것이 포함되는 기타 FcR이 본원에서의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 및 면역글로불린의 항상성의 조절을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 또한 포함한다. FcRn에의 결합을 측정하는 방법이 공지되어 있다. 인간 FcRn에 높은 친화력으로 결합하는 폴리펩티드의 생체 내에서의 인간 FcRn에 대한 결합 및 혈청 반감기를, 예를 들어, 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 또는 형질감염된 인간 세포주에서, 또는 Fc 변이체 폴리펩티드가 투여된 영장류에서 분석할 수 있다.
WO00/42072 (Presta)에 FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 항체 변이체가 기술되어 있다. 이러한 특허 공보의 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다. [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]를 또한 참조.
"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 이러한 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함된다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정한 세포독성 이펙터 세포 (예를 들어, 천연 킬러 (NK) 세포, 호중구, 및 대식 세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 면역글로불린이 이러한 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하여 이어서 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 지칭한다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현이 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 분석법, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 번호 6,737,056 (Presta)에 기술된 것을 수행할 수 있다. 이같은 분석법에 유용한 이펙터 세포에는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포가 포함된다. 별법적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어, [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전통적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적합한 서브클래스의 항체)에 결합하는 것에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어, [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기술된 바와 같은 CDC 분석법을 수행할 수 있다.
Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO99/51642에 기술되어 있다. 이러한 특허 공보들의 내용은 거명에 의해 본원에 명확하게 포함된다. [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 또한 참조.
용어 "Fc 영역-포함 폴리펩티드"는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 면역부착소와 같은 폴리펩티드를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 라이신 (EU 번호매김 시스템에 따른 잔기 447)이, 예를 들어, 폴리펩티드의 정제 동안, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc 영역이 있는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 K447이 있는 폴리펩티드, 모든 K447이 제거된 폴리펩티드, 또는 K447 잔기가 있는 폴리펩티드와 K447 잔기가 없는 폴리펩티드의 혼합물을 포함할 수 있다.
"세포독성 항체"는 자신의 표적 항원에의 결합 시 이펙터 기능을 수행할 수 있고/있거나 세포 사망을 유도할 수 있는 항체이다.
"면역접합체" 또는 "항체 접합체"는 하나 이상의 세포독성제에 접합된 항체를 지칭한다.
"소형 분자" 또는 "소형 유기 분자"는 분자량이 약 500 돌턴 미만인 유기 분자로 본원에서 정의된다.
"ABCC3-결합 올리고펩티드" 또는 "ABCC3에 결합하는 올리고펩티드" 또는 "ABCC3 폴리펩티드 결합 올리고펩티드"는 이러한 올리고펩티드가 ABCC3 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화력으로 ABCC3에 결합할 수 있는 올리고펩티드이다. 특정 실시양태에서, 관련되지 않은 비-ABCC3 단백질에 ABCC3-결합 올리고펩티드가 결합하는 정도는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 측정 시 ABCC3에 대한 ABCC3-결합 올리고펩티드의 결합의 약 10％ 미만이다. 특정 실시양태에서, ABCC3-결합 올리고펩티드의 해리 상수 (Kd)는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.1 nM이다.
"ABCC3-결합 유기 분자" 또는 "ABCC3에 결합하는 유기 분자" 또는 "ABCC3 폴리펩티드 결합 유기 분자"는 이러한 유기 분자가 ABCC3 표적화에서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화력으로 ABCC3에 결합할 수 있는, 본원에서 정의된 바와 같은 올리고펩티드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. 특정 실시양태에서, 관련되지 않은 비-ABCC3 단백질에 FGFR2-결합 유기 분자가 결합하는 정도는, 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 측정 시 ABCC3에 대한 ABCC3-결합 유기 분자의 결합의 약 10％ 미만이다. 특정 실시양태에서, ABCC3-결합 유기 분자의 해리 상수 (Kd)는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, 또는 ≤ 0.1 nM이다.
표적 폴리펩티드에 결합하는 임의의 분자의 해리 상수 (Kd)를 표면 플라즈몬 공명 분석법을 사용하여 편리하게 측정할 수 있다. 이같은 분석법은 약 10 반응 단위 (RU)의 고정된 표적 폴리펩티드 CM5 칩과 함께 25℃에서 BIAcore™-2000 또는 BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc. (Piscataway, NJ))을 사용할 수 있다. 간략하게, 공급자의 설명에 따라, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIAcore Inc.)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 표적 폴리펩티드를 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ㎍/㎖ (약 0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여, 약 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 표적 폴리펩티드의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, 결합 분자의 2배 계단 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ 트윈 20이 있는 PBS (PBST)에 주입한다. 회합 및 해리 센소그램(sensorgram)을 동시에 피팅함으로써 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (BIAcore Evaluation Software 버전 3.2)을 이용하여 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)가 koff/kon의 비율로서 계산된다. 예를 들어, [Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881] 참조. 항체의 온(on)-속도가 상기 표면 플라즈몬 공명 분석법에 의해 106 M-1s-1을 초과하면, 교반 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-Aminco 분광광도계 (ThermoSpectronic) 또는 흐름-정지가 장착된 분광광도계 (Aviv Instruments)와 같은 분광광도계에서 측정된 바와 같이, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에 PBS (pH 7.2) 내의 20 nM 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭(quenching) 기술을 사용하여 온-속도를 결정할 수 있다.
본원에서 사용되는 경우의 "표지"라는 단어는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 자체가 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 검출가능한 생성물을 초래하는 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매할 수 있다. 검출가능한 표지 역할을 할 수 있는 방사성핵종에는, 예를 들어, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, 및 Pd-109가 포함된다.
"단리된" 생물학적 분자, 예컨대 핵산, 폴리펩티드, 또는 항체는 이의 천연 환경의 하나 이상의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다.
II . 특정 실시양태의 설명
원발성 유방 종양은 유전자 발현 프로파일링에 의해 3가지 이상의 주요 서브타입으로 분류될 수 있고, 이러한 서브타입들은 환자 생존의 관점에서 예후 결과가 상이하다 (9). 내강형 유방암은 전형적으로 에스트로겐 수용체 양성이고, 다수의 상피 특이적 유전자의 대등한 발현, 비교적 양호한 예후, 및 표적화된 호르몬 요법에 대한 양호한 응답률을 특징으로 한다. HER2 양성 유방암은 HER2 종양유전자의 높은 수준의 유전자 증폭, 치료되지 않는 경우 비교적 불량한 예후, 및 HER2 표적화 모노클로날 항체인 트라스투주맵(Trastuzumab) (Herceptin, Genentech)으로부터의 상당한 임상 이점을 특징으로 한다 (3). 기저형 유방암은 전형적으로 HER2, ER 및 프로게스테론 수용체의 발현이 없고, 따라서 때때로 "삼중 음성" 종양으로 지칭된다 (10, 11). 기저형 유방암은 예후가 비교적 불량하고, 현재 어떠한 표적화된 요법에도 응답하지 않는 것으로 나타났다 (12). 이러한 서브타입들은 수술 전의 화학요법 계획에 대해 상이한 응답을 나타내지만 (13), 대체로 이러한 차이의 기초가 되는 약물 저항성 메커니즘은 아직 결정되지 않았다.
최근의 연구에서, 유방암 세포주의 대형 선집들이 인간 유방 종양의 유전적 및 게놈 변화 특성 중 다수를 반영하고, 따라서 분자적으로 이질적인 유방암들의 집단에 대한 모델 시스템으로 기능할 수 있음이 밝혀졌다 (14). 예를 들어, 세포들이 유전자 발현 프로파일링 서명을 기초로 기저형 및 내강형 서브타입으로 분류될 수 있고, 이들은 원발성 종양에서의 불량한 결과와 관련되는 고수준 증폭 및 결실 중 대부분을 유지한다 (14).
공통된 양상 및 유사한 예후 결과를 사용하는 서브타입으로의 유방암의 분자적 분류는 암 치료법을 개별화하려는 노력을 시작하기 위한 틀을 제공한다. 본 발명은 유방암 서브타입들이 항유사분열제에 대한 응답에서의 차이를 나타내고, 이때 기저형 서브타입이 가장 민감하다는 것을 실연한다. 이러한 차별적인 응답에 대한 한 메커니즘은 ABCC3 약물 유출 펌프의 증폭이고, 이는 내강형 및 HER2 증폭형 세포주의 부분집합에서는 관찰되었지만 기저형 세포주에서는 그렇지 않았다.
실시예에 기술된 바와 같이, 본 발명은 약리유전학 분석을 위한 모델로서 분자적으로 특성화된 유방암 세포주들의 패널을 활용하여, 2가지 항유사분열제 기반 치료제인 모노메틸-오리스타틴-E (MMAE) 및 파클리탁셀에 응답한 저항성 메커니즘 및 서브타입 차이를 확인하였다. MMAE는 암 치료법을 위한 여러 인간 임상 시험의 대상이었던 펜타펩티드 천연 생성물인 돌라스타틴 10에 구조적으로 관련되고, 튜불린 중합을 억제하고 따라서 세포 미세관을 탈안정화시킴으로써 강력한 항종양 활성을 나타낸다 (15). 항체에 의한 특이적 항원 인식을 통한 약물의 표적화된 전달이 표적을 발현하지 않는 조직은 독성을 면하게 하면서 강화된 화학요법 효능에 이를 것이라는 원리로 오리스타틴-모노클로날 항체 접합체가 개발되었다 (15). 파클리탁셀 및 관련 화합물인 도세탁셀은 미세관을 안정화시키는 항암 세포독성 약물이고, 유방암의 치료에서 널리 사용된다 (16).
실시예에 기재된 연구들을 기초로, 염색체 17의 영역 (17q21)의 증폭이 탁산 및 오리스타틴에 대한 시험관내 저항성과 강하게 관련되는 것으로 발견되었다. 증폭 영역에는 100개 이상의 유전자가 존재한다. 관련 유전자를 확인하기 위해, RNA 간섭 및 고집적(high content) 분석으로 구성된 비-편향 접근법을 사용하여, ABCC3 유전자의 증폭 및 부수적인 과발현이 파클리탁셀 및 MMAE에 대한 저항성 부여를 담당할 가능성이 가장 높은 것으로 나타났다. 이러한 앰플리콘이 원발성 유방 종양 내에 존재하고, 이는 HER2 증폭형 및 내강형 종양에서 공통적이지만 기저형 세포에서는 그렇지 않다는 것이 또한 나타났다 (도 6 및 9).
따라서, 본 발명의 한 양상은 암이 항유사분열제로의 치료에 대해 저항성일지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 ABCC3 유전자가 암 세포의 샘플에서 증폭되었는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. ABCC3 유전자의 증폭은 암이 항유사분열제에 대해 저항성임을 지시한다. ABCC3 유전자 증폭의 검출은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, ABCC3 유전자의 카피수가 암 세포의 샘플에서 증가되었는지 여부를 검출함으로써 ABCC3 유전자 증폭이 수행된다. 일부 실시양태에서, 카피수가 3 이상, 또는 별법적으로 4 이상, 또는 별법적으로 5 이상, 또는 별법적으로 7 이상, 또는 별법적으로 9 이상, 또는 별법적으로 10 이상이면 유전자가 증폭된 것이다.
유전자 카피수를 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해, 예를 들어, 형광 원위치 혼성화 (FISH), 서던 블롯, 면역조직화학 (IHC), 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 정량적 PCR (qPCR), 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR), 비교 게놈 혼성화, 마이크로어레이-기반 비교 게놈 혼성화, 또는 라이게이스 연쇄 반응 (LCR)에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, [Avison, M., Measuring Gene Expression, New York: Taylor & Francis Group, 2007], [Allison, D. B., et al, ed. DNA Microarrays and Related Genomics Techniques: Design, Analysis, and Interpretation of Experiments (Biostatistics), Boca Raton : Chapman & Hill/CRC, 2006]; [Hayat M. A., ed., Handbook of Immunohistochemistry and in Situ Hybridization of Human Carcinomas, Burlington: Elsevier Academic Press, 2004] 참조.
추가적인 실시양태에서, 암이 항유사분열제에 대해 저항성일지를 결정하는 방법은 ABCC3 유전자가 암 세포의 샘플에서 과발현되었는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. ABCC3 유전자의 과발현은 암이 항유사분열제에 대해 저항성임을 지시한다. ABCC3 과발현의 검출은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, ABCC3 유전자로부터의 mRNA 전사 수준을 결정함으로써 ABCC3 유전자 과발현이 검출된다. mRNA 전사 수준을 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 정량적으로 또는 정성적으로 결정할 수 있다. 또한 mRNA 전사 수준을 직접적으로 또는 mRNA로부터 생성된 cDNA의 수준을 검출함으로써 간접적으로 결정할 수 있다. mRNA 전사 수준을 결정하기 위한 예시적인 방법에는 PCR, 정량적 실시간 RT-PCR 및 혼성화-기반 분석법 (마이크로어레이-기반 분석법 및 필터-기반 분석법, 예컨대 노던(Northern) 블롯 포함)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, mRNA 전사 수준이 적합한 대조군 샘플과 비교하여 mRNA 전사에서의 적어도 3배, 5배, 7배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 또는 50배 증가이면 ABCC3 유전자가 과발현된 것이다.
또다른 실시양태에서, ABCC3 폴리펩티드 발현 수준을 결정함으로써 ABCC3 유전자의 발현이 검출된다. ABCC3 폴리펩티드 수준을 항체-기반 검출 방법이 포함되는 당업자에게 공지된 특정 방법에 의해 정량적으로 또는 정성적으로 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, 테스트 암 샘플에서 ABCC3 유전자 발현을 검출하는 것은 테스트 암 샘플을 항-ABCC3 항체와 접촉시키는 단계, 및 ABCC3 폴리펩티드에 대한 항-ABCC3 항체의 결합을 검출함으로써 테스트 암 샘플 내의 ABCC3의 발현 수준 (정량적 또는 정성적)을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, ABCC3 폴리펩티드에 대한 항-ABCC3 항체의 결합을 면역조직화학, 형광 활성화 세포 분류, 웨스턴(Western) 블롯, 방사선면역분석법, ELISA 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 검출할 수 있다. 특정 실시양태에서, ABCC3의 과발현은 적합한 대조군 샘플과 비교하여 ABCC3 폴리펩티드 수준에서의 적어도 3배, 5배, 7배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 또는 50배 증가를 의미한다.
바람직하게는 암 세포의 샘플, 또는 테스트 암 샘플은 암 종양으로부터 직접 취득된 세포를 포함하지만, 테스트 암 샘플은 전이성 암 세포, 혈중 종양 세포, 또는 암에서의 ABCC3 유전자의 증폭 또는 발현 상태가 확인되는 임의의 적절한 세포 샘플로 또한 구성될 수 있다. 테스트될 수 있는 암의 예로는 유방암, 난소암, 결장직장암, 전립선암, 편평세포 암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포 암, 위장관 암, 췌장암, 아교모세포종, 자궁경부암, 간암, 방광암, 간세포암, 결장암, 직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암, 간암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 백혈병 및 기타 림프증식성 장애, 다양한 유형의 두경부암. 및 항유사분열제를 사용하는 치료에 적절한 임의의 기타 암이 포함된다.
예를 들어, 정상 수준의 ABCC3을 발현하는 세포 또는 조직의 대조군 샘플에서의 ABCC3 발현 수준을 결정하고, 암에서의 ABCC3 발현 수준을 대조군 샘플에서의 ABCC3 발현 수준과 비교함으로써, 암에서의 ABCC3 과발현을 결정하기 위한 적합한 대조군이 생성될 수 있다. 별법적으로, ABCC3 과발현을 결정하는데 사용된 것과 동일한 테스트 암 샘플, 또는 ABCC3 과발현에 대해 테스트되는 동일한 암으로부터의 샘플에서 살림(housekeeping) 유전자 (예컨대 액틴 패밀리 구성원)의 발현을 결정함으로써 대조군이 생성될 수 있다. 살림 유전자는 ABCC3 유전자의 과발현을 결정하기 위한 비교 대조군으로서 작용한다.
따라서, ABCC3 증폭 및/또는 과발현의 검출은 암을 앓고 있는 환자의 암을 성공적으로 치료할 가능성이 가장 높은 치료법의 적합한 방법을 환자가 선택하도록 허용한다.
따라서, 본 발명의 한 양상은 항유사분열제-기반 화학요법에 대해 암 환자를 선택하는 방법을 제공한다. 암이 ABCC3의 증폭 또는 과발현을 나타내는 환자는 항유사분열 치료법에 대신하는 치료제를 추구하여야 하는지를 의사와 함께 결정하도록 이러한 정보를 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 환자로부터의 테스트 암 샘플에서 ABCC3 유전자가 증폭되었는지 여부를 검출하는 단계, 및 ABCC3 유전자의 증폭이 테스트 암 샘플에서 검출되지 않으면 환자를 항유사분열 약물-기반 화학요법에 대해 선택하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이러한 방법은 환자로부터의 테스트 암 샘플에서 ABCC3 유전자가 과발현되었는지 여부를 검출하는 단계, 및 ABCC3 유전자의 과발현이 테스트 암 샘플에서 검출되지 않으면 환자를 항유사분열 약물-기반 화학요법에 대해 선택하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 환자는 유방암 환자이다. 추가적인 실시양태에서, 환자는 Her2 양성 유방암에 걸린 환자이다. 유방암 (Her2 양성 유방암)에서의 HER2의 발현 또는 증폭은 HER2-음성, 에스트로겐-수용체-양성, 결절-양성 유방암에 걸린 환자와 비교하여 독소루비신으로의 애주번트(adjuvant) 치료 후 항유사분열제 파클리탁셀의 부가로부터의 강화된 임상 이점과 관련된다 (52). 그러나, HER2-양성 종양이 있는 여성 중 유의한 일부분이 이러한 치료로부터 생존 이점을 나타내지 못했고 (52), 이는 파클리탁셀 저항성 메커니즘이 일부 HER2 양성 유방 종양에 존재한다는 것을 시사한다. 항유사분열제에 대한 이러한 저항성은 항유사분열제에 접합된 항-Her2 항체, 예를 들어, 트라스투주맵-DM1 항체 접합체를 활용하는 치료 계획에 대해 특히 중요하다. 실시예에서 설명된 바와 같이, ABCC3의 과발현이 트라스투주맵-항유사분열제 접합체로의 치료에 대한 저항성과 관련된다. 역으로, siRNA로의 ABCC3 유전자 녹다운은 트라스투주맵-항유사분열제 접합체로의 치료에 대한 세포의 민감도를 증가시킨다. 따라서, 본 발명은 항-Her2 항체-항유사분열제 접합체로의 치료에 대해 Her2-양성 유방암 환자를 선택하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 환자로부터의 테스트 유방암 샘플에서 ABCC3 유전자가 증폭되었는지 여부를 검출하는 단계, 및 ABCC3 유전자의 증폭이 테스트 유방암 샘플에서 검출되지 않으면 환자를 항-Her2 항체-항유사분열제 접합체로의 치료에 대해 선택하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이러한 방법은 환자로부터의 테스트 유방암 샘플에서 ABCC3 유전자가 과발현되었는지 여부를 검출하는 단계, 및 ABCC3 유전자의 과발현이 테스트 유방암 샘플에서 검출되지 않으면 환자를 항-Her2 항체-항유사분열제 접합체로의 치료에 대해 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 환자가 Her2 양성 유방암에 걸린 환자인지 여부가 이미 알려지지 않은 경우에 이러한 정보를 결정하고, 따라서 항-Her2 항체 치료법으로의 치료에 대한 적절성을 결정하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 항-Her2 항체-항유사분열제 접합체는 트라스투주맵-항유사분열제 접합체, 예컨대 트라스투주맵-DM1 또는 트라스투주맵-MMAE이다.
본 발명은 환자의 암의 ABCC3 증폭 상태를 기초로 암 환자를 치료하는 방법을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 환자로부터의 테스트 암 샘플에서 ABCC3 유전자가 증폭되었는지 여부를 검출하는 단계 및 ABCC3 유전자의 증폭이 테스트 암 샘플에서 검출되지 않으면 환자에게 치료적 유효량의 항유사분열 약물-기반 화학요법을 투여하는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 이러한 방법은 환자로부터의 테스트 암 샘플에서 ABCC3 유전자가 과발현되었는지 여부를 검출하는 단계 및 ABCC3 유전자의 과발현이 테스트 암 샘플에서 검출되지 않으면 환자에게 치료적 유효량의 항유사분열 약물-기반 화학요법을 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 환자는 Her2 양성 유방암에 걸린 환자이고, ABCC3 유전자의 증폭 또는 과발현이 테스트 암 샘플에서 검출되지 않으면 항-Her2 항체-항유사분열제 접합체가 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-Her2 항체-항유사분열제 접합체는 트라스투주맵-항유사분열제 접합체, 예컨대 트라스투주맵-DM1 또는 트라스투주맵-MMAE이다.
또다른 실시양태에서, 환자의 암에서의 ABCC3 증폭 또는 과발현의 부재를 기초로 환자가 항유사분열 약물-기반 화학요법에 대해 선택되고, 치료적 유효량의 항유사분열 약물-기반 화학요법이 환자에게 투여된다. 한 실시양태에서, 선택된 환자는 Her2 양성 유방암에 걸린 환자이고, 항-Her2 항체-항유사분열제 접합체가 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-Her2 항체-항유사분열제 접합체는 트라스투주맵-항유사분열제 접합체, 예컨대 트라스투주맵-DM1 또는 트라스투주맵-MMAE이다.
본 발명의 또다른 양상은 변경된 약물 저항성과 관련된 유전자 증폭 변이를 확인하는 방법을 제공한다. 현재까지 약물 저항성 이해에 대해 지시된 대부분의 시험관내 프로파일링 노력은 유전자 발현 분석에 집중되었다. 본 발명은 고밀도 SNP 어레이 프로파일 (Affymetrix)의 분석을 통한 변경된 약물 민감도와 관련된 DNA 카피수 변경의 확인을 기술한다. 고밀도 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 어레이가, 유전자형확인(genotyping)에서의 이의 의도된 용도에 더하여, 인간 암에서 게놈 범위에 걸친 DNA 카피수 변화 및 이형접합성의 손실을 검출하는데 사용될 수 있는 것으로 최근의 연구에서 나타났다 (17). 이러한 어레이는 재발적으로 결실 또는 증폭된 염색체 영역을 정확하게 지적함으로써 종양 억제인자 및 종양유전자 유전자좌의 확인에서 적용되는 것으로 나타났다 (18).
본원에서 제시된 데이터는 이러한 어레이가 치료 약물의 활성을 조정할 수 있는 유전자가 존재하는 증폭된 영역을 확인하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 접근법의 주요 장점은 유전자 증폭 이벤트가 비교적 안정적이고, 궁극적으로 임상 시험으로부터의 보관소 샘플에 대해 분석될 수 있다는 것이다. 보관소 샘플에서의 유전자 증폭 이벤트를 검출하기 위한 한 특정한 적합한 분석법은 형광 원위치 혼성화 (FISH)이다. FISH 분석법은 이미 HER2 양성 MBC의 진단에서 일상적인 임상 실무의 일부분이고 (50), 현재 타르세바(Tarceva) 또는 에르비툭스(Erbitux)에 대한 응답의 가능한 바이오마커로서 EGFR 증폭을 검출하기 위한 진단 테스트로서 평가되고 있다 (51).
본 발명의 또다른 양상은 환자의 암이 ABCC3의 증폭 및/또는 과발현을 포함하는 환자에 대한 항유사분열제의 적합한 투약 수준을 결정하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 환자의 테스트 암 샘플에서 ABCC3이 증폭 및/또는 과발현되었는지 여부를 검출하는 단계 및 ABCC3이 증폭 또는 과발현되었으면 증가된 용량의 항유사분열제를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 암이 항유사분열제로의 치료에 대한 응답을 나타내는 양으로 항유사분열제의 용량이 증가된다. 일부 실시양태에서, 환자에게 투여되는 항유사분열제의 양은 환자의 암이 ABCC3 증폭 및/또는 과발현을 포함하지 않는 환자에게 투여되는 양의 적어도 1.2배, 또는 별법적으로 적어도 1.3배, 또는 별법적으로 적어도 1.5배, 또는 별법적으로 적어도 2배, 또는 별법적으로 적어도 2.5배, 또는 별법적으로 적어도 3배, 또는 별법적으로 적어도 5배, 또는 별법적으로 적어도 10배이다.
본 발명의 또다른 양상은 암 세포를 ABCC3의 길항제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 항유사분열제에 대한 암 세포의 저항성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, ABCC3 길항제는 ABCC3의 증폭 및/또는 과발현을 방지하고 이러한 증폭 및/또는 과발현에 의해 부여되는 약물 저항성을 감소시키는 역할을 한다. 또다른 실시양태에서, ABCC3 길항제는 ABCC3 활성을 억제하는 역할을 한다. 이러한 방법에서 유용한 길항제에는 ABCC3 항체, RNA 간섭 (RNAi)을 기초로 하는 ABCC3 길항제, 특히 안티센스 RNA, miRNA, siRNA, 및 shRNA, ABCC3 폴리펩티드 결합 올리고펩티드, 및 ABCC3 결합 유기 분자가 포함된다.
본 발명의 추가적인 양상은 환자에게 ABCC3의 길항제 및 항유사분열제를 투여하는 단계를 포함하는, 항유사분열제에 대해 저항성인 암에 걸린 환자를 치료하기 위한 조합 요법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 길항제는 ABCC3 항체 및 ABCC3에 결합하는 siRNA로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항유사분열제는 탁산, 메이탄시노이드 및 오리스타틴, 및 이들의 유사체 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 메이탄시노이드-항-Her2 항체 접합체, 예를 들어, 트라스투주맵-DM1과 같이 항유사분열제가 항체에 접합된다. 한 실시양태에서, 조합 요법은 ABCC3에 결합하는 siRNA 및 트라스투주맵-DM1로의 치료를 포함한다.
상기 언급된 이같은 조합 요법은 조합 투여 (2가지 이상의 치료제가 동일한 제형 또는 별도의 제형 내에 포함됨), 및 분리 투여를 포함하고, 분리 투여의 경우 ABCC3 길항제는 항유사분열제의 투여 전에, 이의 투여와 동시에, 및/또는 이의 투여 후에 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, ABCC3 길항제는 항-ABCC 폴리펩티드 항체이다. 예시적인 항체에는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적 및 이종접합체 항체가 포함된다.
폴리클로날 항체는 관련 항원 및 애주번트의 다중 피하 (sc) 또는 복강내 (ip) 주사에 의해 동물에서 바람직하게 생성된다. 면역화될 종에서 면역원성인 단백질에 관련 항원 (특히 합성 펩티드가 사용되는 경우)을 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 이관능성 또는 유도체화 작용제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통한 접합), 글루타르알데하이드, 숙신산 무수물, SOCl2, 또는 R1N=C=NR (식중, R 및 R1은 상이한 알킬기이다)을 사용하여, 항원이 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소 타이로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체를 생성시키는데 사용되는 동물이 트랜스제닉 동물일 수 있다. 특정한 이같은 실시양태에서, ABCC3을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 완전한 부재를 나타내어 ABCC3 발현이 없도록 동물이 조작될 수 있다 ("녹아웃(knockout)" 동물로 지칭됨). 이같은 동물의 생성 방법이 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, [Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992]; [Lowell et al., Nature 366:740-42, 1993]; [Capecchi, M. R., Science 244:1288-1292, 1989]를 참조한다. 특정 단백질 또는 펩티드에 대한 녹아웃 동물에서 이러한 단백질 또는 펩티드에 대해 항체를 생성시키는 것이 유리할 수 있는데, 이는 당업계에 주지된 바와 같이 항체의 생산 및/또는 수율을 감소시킬 수 있는 동물에서의 항-자가 반응이 일어나지 않아야 하기 때문이다.
예를 들어, 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체 (각각 토끼 또는 마우스에 대해)를 3배 용량의 프로인트(Freund) 완전 애주번트와 합하고, 이 용액을 다중 부위에서 피내 주사함으로써, 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 동물들을 면역화시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 애주번트 내의 펩티드 또는 접합체를 원래 양의 1/5 내지 1/10로 다중 부위에 피하 주사하여 동물을 부스팅(boosting)시킨다. 7일 내지 14일 후, 동물에서 채혈하여, 혈청을 항체 역가에 대해 분석한다. 역가가 정체기(plateau)에 도달할 때까지 동물을 부스팅시킨다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양에서 단백질 융합물로서 제조될 수 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적절하게 사용하여 면역 응답을 강화시킨다.
모노클로날 항체는 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 번호 4,816,567)에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 항-ABCC3 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체를 추가로 포함할 수 있다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편 (예컨대 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 항원-결합 하위서열(subsequence))이다. 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및 능력이 있는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종의 CDR로부터의 잔기 (공여자 항체)로 교체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)를 포함한다. 일부 경우에는, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 인간화 항체는 수용자 항체에서 또는 수입된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스(consensus) 서열의 것이다. 최적으로는, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]).
비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기로 지칭되고, 이는 전형적으로는 "수입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환함으로써, 윈터(Winter) 및 공동 연구원의 방법 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)])에 따라 인간화를 본질적으로 수행할 수 있다. 따라서, 이같은 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 전형적으로 인간화 항체는 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용되는 인간 가변 도메인 (경쇄 및 중쇄 모두)을 선택하는 것은 항체가 인간 치료 용도에 의도되는 경우 항원성 및 HAMA 응답 (인간 항-마우스 항체)을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류의 서열에 가장 근접한 인간 V 도메인 서열이 확인되고, 그 내부의 인간 프레임워크 영역 (FR)이 인간화 항체용으로 받아들여진다 ([Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993)]; [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987)]). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 영역을 사용한다. 여러 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 프레임워크를 사용할 수 있다 ([Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; [Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)]).
항원에 대한 높은 결합 친화력 및 기타 유리한 생물학적 성질을 유지시키면서 항체를 인간화시키는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해, 바람직한 방법에 따라, 어버이 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하는 어버이 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 프로세스에 의해 인간화 항체가 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 디스플레이들의 정밀검사로 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있으며, 즉, 자신의 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화력이 달성되도록 수용자 및 수입 서열로부터 FR 잔기들을 선택하고 조합시킬 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 수반된다.
다양한 형태의 인간화 항-ABCC3 폴리펩티드 항체가 구현된다. 예를 들어, 인간화 항체는 항체 단편, 예컨대 Fab일 수 있고, 이는 면역접합체를 생성하기 위해 하나 이상의 세포독성제(들)에 임의적으로 접합될 수 있다. 별법적으로, 인간화 항체는 무손상 항체, 예컨대 무손상 IgG1 항체일 수 있다.
인간화의 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화 시,내인성 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생산이 완전히 억제된다는 것이 기술되었다. 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 어레이를 이같은 생식계열 돌연변이체 마우스에게 전달하면, 항원 챌린지(challenge) 시 인간 항체가 생산될 것이다. 예를 들어, [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; [Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (모두 GenPharm); 5,545,807; 및 WO 97/17852 참조.
별법적으로, 파지 디스플레이 기술 ([McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)])을 이용하여, 면역화되지 않은 도너로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생산할 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자가 M13 또는 fd와 같은 필라멘트형 박테리오파지의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임(in-frame) 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트형 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질을 기초로 하는 선별로 이러한 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 또한 선별된다. 따라서, 파지는 B-세포의 성질을 일부 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고, 예를 들어, [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]에 리뷰되어 있다. V-유전자 절편의 다양한 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에서, 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합형 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 단리되었다. 본질적으로 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기술된 기술에 따라, 면역화되지 않은 인간 도너로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 어레이의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체가 단리될 수 있다. 미국 특허 번호 5,565,332 및 5,573,905를 또한 참조한다.
상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 또한 생성될 수 있다 (미국 특허 번호 5,567,610 및 5,229,275 참조).
특정 상황에서, 전체 항체보다 항체 단편을 사용하는 것이 유리하다. 단편의 더 작은 크기는 신속한 소거를 허용하고, 고형 종양에 대한 개선된 접근에 이를 수 있다.
항체 단편의 생산을 위하여 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 현재 이러한 단편들은 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편이 모두 대장균에서 발현되어 이로부터 분비될 수 있고, 따라서 다량의 이러한 단편들의 용이한 대량 생산을 허용한다. 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 항체 단편이 단리될 수 있다. 별법적으로, Fab'-SH 단편이 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편이 형성될 수 있다 ([Carter et al, Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편이 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편이 미국 특허 번호 5,869,046에 기술되어 있다. 항체 단편의 생산을 위한 또다른 기술이 당업자에게 명백할 것이다. 또다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458 참조. Fv 및 sFv는 불변 영역이 없는 무손상 결합 부위를 갖는 유일한 종이다; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적절하다. sFv의 아미노 또는 카르복시 말단에서 이펙터 단백질의 융합이 산출되도록 sFv 융합 단백질을 구축할 수 있다. [Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, 상기 문헌] 참조. 또한 항체 단편은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,641,870에 기술된 것과 같이, "선형 항체"일 수 있다. 이같은 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
이펙터 기능과 관련하여, 예를 들어, 항체의 항원-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)이 강화되도록, 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역에 도입함으로써, 이러한 영역 내에 사슬간 디술피드 결합이 형성되도록 할 수 있다. 이렇게 생성된 동종이량체 항체는 내재화 능력이 개선되고/되거나 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존적 세포형 세포독성 (ADCC)이 증가될 수 있다. [Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)] 및 [Shopes, B. J. Immunol., 148:2918-2922 (1992)] 참조. [Wolff et al., Cancer Research, 53:2560-2565 (1993)]에 기술된 바와 같은 이종이관능성 가교제를 사용하여 항-종양 활성이 강화된 동종이량체 항체를 또한 제조할 수 있다. 별법적으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 조작할 수 있고, 이에 의해 항체의 보체 용해 및 ADCC 능력이 강화될 수 있다. [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)] 참조. 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어, 미국 특허 5,739,277에 기술된 바와 같이 항체 (특히, 항체 단편) 내로 샐비지 수용체 결합 에피토프를 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 것을 담당하는 IgG 분자 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.
또다른 잠재적인 ABCC3 길항제는 안티센스 기술을 사용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구축물이고, 이때, 예를 들어, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적화된 mRNA에 혼성화하여 단백질 번역을 방지함으로써 mRNA의 번역을 직접적으로 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술을 사용하여 삼중-나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 제어할 수 있는데, 양쪽 방법 모두 DNA 또는 RNA에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합을 기초로 한다. 예를 들어, 본원의 성숙형 ABCC3 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩 부분을 사용하여, 염기쌍 약 10 내지 40개 길이의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인할 수 있다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사에 수반되는 유전자의 영역에 대해 상보적이도록 고안됨으로써 (삼중-나선 - [Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979)]; [Cooney et al,, Science, 241:456 (1988)]; [Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)] 참조), ABCC3 폴리펩티드의 전사 및 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 mRNA와 혼성화하여, mRNA 분자가 ABCC3 폴리펩티드로 번역되는 것을 차단한다 (안티센스 - [Okano, Neurochem., 56:560 (1991)]; [Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)]). 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되어 ABCC3 폴리펩티드의 생산을 억제할 수 있도록 상기 기술된 올리고뉴클레오티드가 또한 세포에 전달될 수 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 번역-개시 부위, 예를 들어 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 약 -10 위치와 +10 위치 사이로부터 유래된 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
소형 간섭 RNA (siRNA)는 표적 유전자의 발현을 감소시키는, 일반적으로 뉴클레오티드 30개 미만의 이중 가닥 RNA 분자이다. siRNA는 전통적인 길항제, 예컨대 소형 분자 또는 항체가 실패한 경우에 유전자 발현을 조정하는 연구에서 도구로서 유용한 것으로 증명되었다 ([Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003)]). 길이가 뉴클레오티드 21개 내지 23개인, 시험관 내에서 합성된 이중 가닥 RNA가 간섭 RNA (iRNA)로 작용할 수 있고, 유전자 발현을 특이적으로 억제할 수 있다 ([Fire A., Trends in Genetics 391;806-810 (1999)]). 이러한 iRNA는 표적 RNA의 분해를 매개함으로써 작용한다. 그러나, 이들은 길이가 뉴클레오티드 30개 미만이기 때문에, 세포 항-바이러스 방어 메커니즘을 촉발하지 않는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, siRNA는 ABCC3 코딩 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열 또는 이의 상보체의 일부분과의 핵산 서열 동일성이 적어도 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％이다.
본 발명의 ABCC3 폴리펩티드 결합 올리고펩티드는 본원에 기술된 바와 같은 ABCC3 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 올리고펩티드이다. ABCC3 폴리펩티드 결합 올리고펩티드를 공지된 올리고펩티드 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 제조 및 정제할 수 있다. ABCC3 폴리펩티드 결합 올리고펩티드는 일반적으로 적어도 약 5개의 아미노산의 길이이고, 별법적으로는 적어도 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개 또는 100개, 또는 그 이상의 아미노산의 길이이며, 이때 이같은 올리고펩티드들은 본원에 기술된 바와 같은 ABCC3 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있다. 주지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 ABCC3 폴리펩티드 결합 올리고펩티드들을 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드에 대해 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 주지되어 있는 것으로 인지된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 공개 번호 WO 84/03506 및 WO84/03564; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984)]; [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985)]; [Geysen et al., Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986)]; [Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987)]; [Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988)], [Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378]; [Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry. 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature. 352:624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8363], 및 [Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668] 참조).
이와 관련하여, 박테리오파지 (파지) 디스플레이는 대형 올리고펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 폴리펩티드 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 이러한 라이브러리의 구성원(들)을 확인하도록 하는 한 주지된 기술이다. 파지 디스플레이는 변이체 폴리펩티드가 박테리오파지 입자의 표면 상의 코트 단백질에 대한 융합 단백질로서 디스플레이되는 기술이다 ([Scott, J.K. and Smith, G.P. (1990) Science. 249: 386]). 파지 디스플레이의 활용은 선택적으로 무작위화된 단백질 변이체들 (또는 무작위로 클로닝된 cDNA들)의 대형 라이브러리가 표적 분자에 높은 친화력으로 결합하는 서열들에 대해 신속하고 효율적으로 분류될 수 있다는 사실에 의존한다. 파지 상의 펩티드 ([Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:6378]) 또는 단백질 ([Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry. 30:10832]; [Clackson, T. et al. (1991) Nature. 352:624]; [Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581]; [Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363]) 라이브러리의 디스플레이는 특이적 결합 성질이 있는 것에 대해 수백만 개의 폴리펩티드 또는 올리고펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다 ([Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668]). 무작위 돌연변이체의 파지 라이브러리를 분류하는 것은 다수의 변이체를 구축하고 증식시키기 위한 전략, 표적 수용체를 사용하는 친화성 정제 절차, 및 결합 강화의 결과를 평가하는 수단을 필요로 한다. 미국 특허 번호 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 및 5,663,143.
펩티드 라이브러리를 생성시키고 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 방법이 미국 특허 번호 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192 및 5,723,323에 또한 개시되어 있다.
바람직하게는, ABCC3 폴리펩티드 결합 소형 분자는 본원에 기술된 바와 같은 ABCC3 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합하는, 본원에서 정의된 바와 같은 올리고펩티드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. 공지된 방법을 사용하여 ABCC3 폴리펩티드 결합 유기 소형 분자를 확인하고 화학적으로 합성할 수 있다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). ABCC3 폴리펩티드 결합 유기 소형 분자는 일반적으로 크기가 약 2000 돌턴 미만이고, 별법적으로는 크기가 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 돌턴 미만이며, 이때 본원에 기술된 바와 같은 ABCC3 폴리펩티드에 결합, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 이같은 유기 소형 분자를 주지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 확인할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드 표적에 결합할 수 있는 분자에 대해 유기 소형 분자 라이브러리를 스크리닝하는 기술이 당업계에 주지되어 있는 것으로 인지된다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO00/00823 및 WO00/39585 참조). ABCC3 폴리펩티드 결합 유기 소형 분자는, 예를 들어, 알데하이드, 케톤, 옥심, 하이드라존, 세미카르바존, 카르바지드, 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민, N-치환 하이드라진, 하이드라지드, 알코올, 에테르, 티올, 티오에테르, 디술피드, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 우레아, 카르바메이트, 카르보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할로겐화물, 아릴 술포네이트, 알킬 할로겐화물, 알킬 술포네이트, 방향족 화합물, 헤테로고리형 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알코올, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 엔아민, 술폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 이소시아네이트, 술포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 산 클로라이드 등일 수 있다.
상기의 작용제들 중 임의의 것을 포함하는 제약 제형이 원하는 정도의 순도를 지니는 항체 또는 면역접합체를 임의적인 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 ([Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 수용액 또는 동결건조 또는 기타 건조 제형의 형태로 보관용으로 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌이 포함되는 항산화제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드); 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀, 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린이 포함되는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 생체내 투여용으로 사용될 제약 제형은 일반적으로 무균성이다. 이는 무균성 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 예를 들어 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀션 내에 작용제가 또한 포획될 수 있다. 이같은 기술이 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Oslo, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적절한 예로는 관심 작용제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로젤 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 디포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일을 초과하여 분자가 방출될 수 있게 하는 한편, 특정 하이드로젤은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출한다. 캡슐화된 작용제가 신체 내에 장기간 동안 유지되는 경우, 37℃에서 습도에 노출된 결과로 이들이 변성되거나 응집될 수 있어, 생물학적 활성의 손실, 그리고 항체의 경우에는 가능하게는 면역원성의 변화를 초래한다. 수반된 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 설프하이드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적합한 첨가제의 사용, 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 안정화가 달성될 수 있다.
항유사분열제
항유사분열제는 유사분열을 억제하거나, 방지하거나, 또는 다른 방식으로 파괴하는 임의의 화합물이다. 항유사분열제의 구체적인 예로는 탁산, 예컨대 파클리탁셀 및 도세탁셀; 메이탄시놀 및 방향족 고리 내에서 또는 메이탄시놀 분자의 또다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예컨대 다양한 메이탄시놀 에스테르, 및 DM1 및 DM4가 포함되는 메이탄시노이드; 돌라스타틴 10, 돌라스타틴 15, 및 오리스타틴, 예컨대 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 오리스타틴 F (MMAF); 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈블라스틴 및 빈크리스틴; 및 이들의 유사체 및 유도체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
탁산은 양쪽 모두 주목에서 유래된 항암 약물이다. 유럽형 주목에서 유래된 도세탁셀 (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)은 파클리탁셀 (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세관의 어셈블리를 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세관을 안정화시켜, 세포에서의 유사분열 억제를 초래한다.
메이탄시노이드는 세포가 세포 주기의 G2/M 단계에서 정지되게 하고 궁극적으로 세포 사망에 이르는, 강력한 항유사분열제인 튜불린-결합제이다. 메이탄시노이드는 동아프리카 관목 마이테누스 세라타(Maytenus serrata)에서 최초로 단리된 화합물인 메이탄신의 유도체이다 (미국 특허 번호 3,896,111). 이어서, 특정 미생물이 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 또한 생산한다는 것이 발견되었다 (미국 특허 번호 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체가 보고되어 있다. 미국 특허 번호 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 및 4,371,533, 및 [Kawai et al (1984) Chem. Pharm. Bull. 3441-3451] 참조.
오리스타틴은 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 오리스타틴 F (MMAF)이 포함되는, 돌라스타틴 10 (펜타펩티드 천연 생성물)의 유사체이다. 이러한 패밀리 내의 분자들은 튜불린 중합을 억제한다. 일반적으로, 독소루비신에 비해 활성이 100-1,000배 더 강력하다 ([Pettit, G. R., The dolastatins. Progress in the Chemistry of Organic Natural Products 70, 1-79, 1997]).
임의적으로 항유사분열제가 항체에 접합된다.
항체-작용제 접합체를 제조하기 위한 다수의 연결기가 당업계에 공지되어 있다. 항체-메이탄시노이드 접합체가 문헌에 광범위하게 기술되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020 또는 EP 특허 0 425 235 B1, 및 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)] 참조. 항체-작용제 접합체를 제조하는데 유용한 연결기로는 상기에서 확인되는 특허에 개시된 바와 같은 디술피드 기, 티오에테르 기, 산-불안정 기, 광-불안정 기, 펩티데이스-불안정 기, 또는 에스터레이스-불안정 기가 포함되고, 디술피드 및 티오에테르 기가 바람직하다.
다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드 (예컨대 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 메이탄시노이드 또는 기타 항유사분열제의 접합체를 제조할 수 있다. 특히 바람직한 커플링제로는 디술피드 연결을 제공하는 N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (SPP) 및 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP) ([Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]])가 포함된다.
링커는, 연결 유형에 따라, 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 통상적인 커플링 기술을 사용하여 하이드록실 기와의 반응에 의해 에스테르 연결이 형성될 수 있다. 반응은 하이드록실 기가 있는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록실 기로 변형된 C-15 위치, 및 하이드록실 기가 있는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 한 실시양태에서, 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 연결이 형성된다.
항유사분열제-항체 접합체의 예로는 트라스투주맵-DM1 (Genentech/ImmunoGen; 거명에 의해 전문이 본원에 포함된 미국 특허 7,097,840에 기술됨), 트라스투주맵-오리스타틴 (Genentech/Seattle Genetics), 칸투주맵(Cantuzumab) 메르탄신 (huC242-DM1, SB-408075) (ImmunoGen), BB-10901 (huN901 -DM1) (ImmunoGen), MLN2704(DM1) (Millennium Pharmaceuticals), 비바투주맵(Bivatuzumab) 메르탄신 (DM1) (Boehringer Ingelheim), huMy9-6-DM4 (AVE9633) (Sanofi-aventisc), huC242-DM4 (ImmunoGen), SGN-35 (모노메틸 오리스타틴) (Seattle Genetics), SGN-75 (모노메틸 오리스타틴) (Seattle Genetics), 및 CR011-vcMMAE (Curagen/Seattle Genetics)가 포함된다. [Lambert, J.M., et al, Current Opinion in Pharmacology, 5:543-549 (2005)]. US20050276812, WO2004110498, [Wul, A. M., and Senter, P. D., Nature Biotech 23:1137-1146 (2005)]를 또한 참조한다.
트라스투주맵-MCC-DM1 (T-DM1) (CAS 등록 번호 139504-50-0)의 구조식은 하기와 같다:
Figure 112010059244469-pct00001
[식중, Tr은 링커 모이어티(moiety) MCC를 통해 메이탄시노이드 약물 모이어티 DM1에 연결된 트라스투주맵이다] (US 5208020; US 6441163). 약물 대 항체 비율 또는 약물 로딩(loading)이 트라스투주맵-MCC-DM1의 상기 구조에서 p로 표시되고, 1 내지 약 8의 정수값 범위이다. 약물 로딩값 p는 1 내지 8이다. 트라스투주맵-MCC-DM1은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 및 8개의 약물 모이어티가 항체 트라스투주맵에 공유결합으로 부착된, 다양하게 로딩되고 부착된 항체-약물 접합체의 모든 혼합물을 포함한다 (US 7097840; US 2005/0276812; US 2005/0166993). 트라스투주맵은 뮤린 4D5 항체 (1990년 5월 24일에 부다페스트 조약 하에 <American Type Culture Collection> (12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20852)에 기탁된 ATCC CRL 10463)의 항원 결합 잔기 또는 뮤린 4D5 항체로부터 유래된 항원 결합 잔기가 있는 항체이다. 예시적인 인간화 4D5 항체에는 US 5821337에서와 같은 huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 및 huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®)이 포함된다.
트라스투주맵-DM1 (또는 T-DM1)은 HER2-과발현 암의 트라스투주맵-민감성 및 트라스투주맵-불감성 모델에서 효능이 있는 것으로 나타났다. HER2-과발현 유방암에 걸린 환자에서 T-DM1의 안전성 및 효능을 평가하기 위해 현재 임상 연구가 진행 중이다.
실시예
실시예 1 - 기술 및 분석법
세포주 및 생육력 실험
유방암 세포주 AU565, BT-474, BT-549, CAMA-1, DU4475, HCC1143, HCC1419, HCC1428, HCC2218, HCC70, Hs578T, KPL-1, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435S, MDA-MB-436, MDA-MB-453, MDA-MB-468, T-47D, UACC-812, ZR-75-1 및 ZR-75-30을 <American Type Culture Collection> (ATCC (Manassas, VA))로부터 수득하였다. 세포주 CAL-120, CAL-148, CAL-51, CAL-85-1, EFM-19, EFM-192A, EVSA-T, 및 MT-3을 <Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH> (DSMZ (Braunschweig, Germany))로부터 수득하였다. 모든 세포주를 10％ 소 태아 혈청 (Sigma (St. Louis, MO)), 비필수 아미노산 및 2 mmol/ℓ L-글루타민이 보충된 RPMI 1640 또는 DMEM에서 유지시켰다. 유방암 세포주로서 주석이 달렸지만, 분자적 및 유전적 기준을 기초로 실제로는 MDA-MB-435S는 흑색종 기원일 수 있고, MT-3은 결장직장 기원일 수 있다 (19, 20). 이러한 발견은 본 연구의 결론에 영향을 미치지 않는다.
MMAE 및 파클리탁셀 IC50 결정을 위해, 세포를 정상 성장 배지 내에 384웰 플레이트에 3000개의 세포/웰의 밀도로 4중으로 플레이팅하고, 하룻밤 동안 부착시켰다. 파클리탁셀 (Sigma) 또는 MMAE (Seattle Genetics (Seattle, WA))를 3배 단계 희석물 (파클리탁셀의 경우 최대 1 μM/ℓ 또는 MMAE의 경우 최대 0.1 μM/ℓ)을 기초로 10가지 농도로 첨가하였다.
셀타이터-글로(Celltiter-Glo) 발광 세포 생육력 분석법 (Promega (Madison, WI))을 사용하여 72시간 후에 세포 생육력을 측정하였다. 세포 생육력의 50％ 억제를 초래하는 약물의 농도 (IC50)이 4-파라메터 곡선 분석 (XLfit, IDBS 소프트웨어)으로부터 계산되었고, 최소 3회의 실험으로부터 결정되었다. 수행된 대다수의 실험에서 약물 처리에 응답하여 세포 생육력에서 50％ 억제를 나타내지 않은 세포주는 정의 상으로 IC50에 도달하지 않은 것으로 간주되었고, IC50이 >100 nM (MMAE) 또는 >1000 nM (파클리탁셀)인 것으로 열거된다. 도 6은 6가지 세포주에 대한 대표적인 세포 생육력 실험의 예를 제공한다. 세포주 EFM192A, NDAMB361, 및 BT474는 생물정보학 분석에서 각각의 작용제에 대해 저항성인 것으로 분류되었다. AU565, EFM19, 및 MDAMB468은 민감성인 것으로 분류되었다. 피팅된 곡선으로부터의 IC50 값이 차트에서 각각의 그래프의 오른쪽에 제시된다.
IC50이 달성되지 않은 EVSA-T 세포주의 ABCC3-과발현 클론에 대해, 본 발명가들은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc)에서 절반-최대 효과 농도 또는 EC50을 계산하였다. 도 5의 대조군 세포주는 실제로 빈 벡터로의 형질감염 후 유래된 EVSA-T의 클론이고, 제시된 특정 실험에서 IC50이 달성되었다.
유방 종양 샘플
145명의 독립적인 유방암 환자로부터의 원발성 유방 종양을 이용하여, 애질런트 어레이(Agilent Array) CGH 분석을 위해 게놈 DNA를 제조하였다 (21). 모든 종양이 신선하게 동결되었고, 종양 함량이 70％를 초과하는 것으로 발견되었으며, 모두 침윤성 관상 암종으로 분류되었다. 제넨테크(Genentech) 종양 은행으로부터의 61개의 추가적인 독립적인 원발성 유방 종양 샘플 상에서 ABCC3 FISH 연구가 수행되었다.
유전자 발현 마이크로어레이 연구
퀴아젠(Qiagen) RNAeasy 키트를 사용하여 준-전면성장(sub-confluent) 세포 배양물로부터 추출된 RNA 상에서 유방암 세포주의 유전자 발현 분석을 수행하였다. 애질런트 바이오애널라이저(Agilent Bioanalyzer) 2100 상에 샘플을 러닝(running)시킴으로써 RNA 품질이 확인되었고, 충분한 품질의 샘플을 어피메트릭스(Affymetrix) HGU133Plus_2.0 칩 (Santa Clara, CA) 상에서 프로파일링하였다. 상보적 RNA의 제조, 어레이 혼성화, 스캐닝 및 이어지는 어레이 영상 데이터 분석을 제조사의 특정 프로토콜을 사용하여 수행하였다.
유방암 세포주의 전체적인 자율(unsupervised) 계층적 클러스터링 분석을 위해, 유전자 발현 데이터를 필터링하여 세포주 간에 변이를 거의 나타내지 않은 프로브 셋트를 제거하였다. 간략하게, 샘플들에 걸쳐 5배 이상의 변이 (최대/최소 > 10) 및 250 이상의 절대 강도 차이 (최대/최소 > 250)를 나타내지 않은 프로브들을 계층적 클러스터링 분석에서 제외하였다. 데이터 예비-프로세싱은 유전자 발현값의 로그 변환 및 중앙값 센터링(centering)을 수반하였고, 이러한 예비-프로세싱 후 클러스터(Cluster) 및 트리뷰(TreeView) 소프트웨어를 사용하여 평균 연결 클러스터링을 수행하였다 (22).
SNP 어레이 및 애질런트 aCGH 카피수 연구
퀴아젠 DNAeasy 키트를 사용하여 준-전면성장 세포 배양물로부터 추출된 게놈 DNA 상에서 세포주 카피수 분석을 수행하였다. 각각의 세포주에 대해, 500 ng의 게놈 DNA를 진칩(Genechip) 100K 지도작성 어레이 (Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA))에 제조사의 설명서에 따라 혼성화시켰다. 이러한 어레이는 26 kb의 평균 마커 거리로 모든 인간 염색체 (Y 염색체 제외)로부터 유래된 116,000개를 초과하는 SNP 유전자좌에 대한 프로브 셋트를 함유한다 (23). 진 칩 오퍼레이팅 시스템(Gene Chip Operating System)으로 SNP 콜(call) 및 신호 정량을 수득하였다. 애질런트 인간 게놈 244A CGH 마이크로어레이 및 애질런트 피처(feature) 추출 소프트웨어를 제조사의 설명서에 따라 러닝시키고, 어피메트릭스 크로모솜 카피수 어낼리시스 툴(Affymetrix Chromosome Copy Number Analysis Tool) 3.0 (CNAT 3.0)로 각각의 SNP 프로브에 대한 혼성화 강도 (양쪽 대립유전자 강도의 합계)를 기초로 DNA 카피수의 게놈-스무딩(smoothed) 분석 (GSA_CN)을 계산하였다. 카피수 데이터를 GLAD 세분화(segmentation) 알고리즘으로 세분화하였다 (24).
maxT 절차의 버젼을 사용하여 매트랩(Matlab) 소프트웨어 (The MathWorks, Inc. (Natick, MA, USA))로 GSA_CN 카피수와 약물 민감도 사이의 관련을 확인하였다 (26). 각각의 약물에 대해, 각각의 SNP에 대해 검정 통계량을 계산하여, 민감성 세포주와 저항성 세포주에서의 로그-변환 카피수 간의 차이를 반영하였다. 통계량은 표준 t 통계값의 절대값으로서 계산되었고 (2개의 샘플, 이분산성), 단 민감성 클래스와 저항성 클래스 간의 평균 카피수 차이가 1.75배 미만인 SNP에 대해서는 0으로 설정되었다. 그후, 모든 SNP에 걸친 최대 검정 통계량의 귀무 분포(null distribution)를 민감성 표지의 10,000개의 임의 순열에서 추정하였다. 각각의 SNP에 대한 p-값이 최대 검정 통계량이 이러한 SNP에 대한 관찰된 통계량을 초과하거나 이와 동등한 순열의 분수로서 계산되었다. 생성된 p-값은 패밀리-양식(family-wise) 오류율을 조절하고, 테스트된 SNP의 개수를 고려한다.
정량적 RT PCR 에 의한 HER2 카피수 결정
상기 기술된 바와 같이 제조된 게놈 DNA에 ABI 프리즘(Prism) 7700 서열 검출 시스템 (Applied Biosystems (Foster City, CA))을 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. qRT-PCR을 Her2에 대한 CACTGTCTGCACCTTGCTTTG (서열 1) 및 GCTCTGCAGCTATTGAAAGAACAA (서열 2), 및 라인(Line)-1 반복 요소에 대한 AAAGCCGCTCAACTACATGG (서열 3) 및 TGCTTTGAATGCGTCCCAGAG (서열 4)의 프라이머를 사용하여 수행하였다. 라인-1은 인간 정상 세포와 신생물성 세포 간에 홑배수체 게놈 당 카피수가 유사한 반복 요소이다 (27). 정량은 인간 정상 게놈 DNA의 단계 희석물로부터의 표준 곡선을 기초로 하였다. 상대적인 표적 카피수 수준이 교정물로서의 정상 인간 게놈 DNA에 대해 또한 표준화되었다. [Kindich et al.] (28)에 기술된 바와 같은 식 E-[(CPtarget - Cpref)control - (CPtarget - Cpref)test]를 사용하여 라인-1 및 교정물과 비교하여 표적 유전자의 카피수 변화를 결정하였다. 정량적 PCR 반응에 대한 조건은 인비트로젠(Invitrogen)의 플래티눔(Platinum)® SYBR® 그린(Green) qPCR 수퍼믹스(SuperMix)-UDG w/ROX 패키지 삽입물 (카탈로그 번호 11744-500)에 기술된 바와 같았다.
형광 원위치 혼성화 ( FISH ) 분석
프로브
전체 ABCC3 유전자좌 및 인접 구역을 포함하는, 2개의 중첩 클론 CTD-2605A1 및 CTD-3006C13으로 구성된 박테리아 인공 염색체 (BAC) 콘티그(contig) ([USCS Genome Browser March 2006] 어셈블리를 기초로 함)가 FISH 실험을 위한 프로브로서 사용되었다. HER2/CEP17 (Pathvysion, Vysis/Abbott Laboratories (Des Plaines, IL)) 및 CEP17 (Vysis/Abbott Laboratories (Des Plaines, IL))에 대한 시판되는 프로브가 FISH 실험에 또한 사용되었다.
FISH 분석
기존에 기술된 바와 같이 (29), 0.1 ㎍/㎖ 콜세미드(Colcemid) (Invitrogen)와 함께 2-3시간 동안 인큐베이션하는 것에 이어서 KCl (0.075 M)에서의 삼투압 팽윤 및 메탄올:아세트산 (3:1)에서의 고정에 의해 세포를 세포유전학 분석에 대해 준비시켰다. BAC 클론으로부터의 DNA를 표준 방법에 의해 추출하였다.
추출된 BAC DNA를 직접적으로 스펙트럼 오렌지(Spectrum Orange), 스펙트럼 그린(Spectrum Green) (Vysis/Abbott Laboratories (Des Plaines, IL))로 또는 디'에틸아미노쿠마린 (DEAC) (Invitrogen)으로 바이시스(Vysis)의 틈 번역 키트(Nick Translation Kit) (Vysis/Abbott Laboratories)를 제조사의 설명서에 따라 사용하여 틈 번역에 의해 표지시켰다. 정상 인간 중기에 대한 FISH (Abbott Laboratories (Des Plaines, IL))에서 BAC 클론의 게놈 위치가 확인되었다. 약 300 ng의 표지된 프로브를 과량의 인간 Cot-1 DNA (Invitrogen) 및 초음파처리 연어 정자 DNA (Sigma)에서 침전시키고, FISH 실험을 위해 50％ 포름아미드, 10％ 덱스트란 설페이트, 및 2'SSC 혼성화 완충제 (Vysis/Abbott Laboratories (Des Plaines, IL))에 재현탁시켰다. 세포유전학 제제 및 포르말린-고정 파라핀-매립 (FFPE) 조직에 대한 FISH를 기존에 기술된 바와 같이 수행하였고 ([Pandita et al., 2004]), 이때 약간의 변형이 있었다. 56-60℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 시트로솔브(CitroSolv)의 3회 세정 (각각 5분)에 이은 알코올에서의 2회 세정에서 슬라이드를 탈파라핀화시켰다. 공기 건조 후, 슬라이드를 NaSCN의 1M 용액에서 30분 동안 80℃에서 인큐베이션하고, 펩신으로 처리하고 나서, 물 및 일련의 에탄올에서 추가로 세정하였다. 그후, 건조된 슬라이드를 프로브와 공동-변성시키고 (76℃, 6분), 하룻밤 동안 37℃에서 혼성화시켰다 (ThermoBrite; Vysis (Downers Grove, IL)). 혼성화 후의 세정 및 대비 염색을 기존에 기술된 것들과 유사한 방식으로 수행하였다. 슬라이드를 올림푸스(Olympus) BX61 현미경을 사용하여 가시화하고, FISHView 소프트웨어 (Applied Spectral Imaging (Vista CA))를 사용하여 분석하였다. 카피수 분석 및 HER2/ABCC3 대 CEP17 비율을 제조사의 설명서에 따라 수행하였다.
기능 확인 실험
어레이스캔(Arrayscan) VTI (Cellomics Inc (Pittsburgh, PA)) 상에서 고집적(high content) 스크리닝 분석법을 수행하였다. 다마콘 인코포레이티드(Dharmacon Inc)로부터 구입한 siRNA "스마트풀(Smartpool)" 올리고뉴클레오티드 및 올리고펙타민(Oligofectamine) 형질감염 시약을 사용하여 96웰 포맷으로 세포를 형질감염시켰다. 기능 연구에 대해 유전자들의 우선순위를 매기기 위해, R 프로그래밍 언어 (http://www.r-project.org)를 사용하는 양측(2-sided) 윌콕슨(Wilcoxon) 순위합 테스트를 수행하여, 17q21.3 앰플리콘의 카피가 4개 미만인 세포주와 비교하여 카피가 4개를 초과하는 세포주에서 유전자 발현에서의 유의한 차이가 있는 유전자를 확인하였다. 이러한 분석으로부터 판명된 유전자 ABCC3에 대한 차별적인 발현의 예인 ABCC3 (p=0.0053)이 도 3에서 제시된다. RNAi 실험에 대한 시약의 이용가능성과 조합된 이러한 분석으로 EFM-192A 세포주에서의 기능 연구를 위해 하기의 24개의 유전자가 선택되었다: ABCC3, COL1A1, CROP, EAP, EPN3, FLJ13855, FLJ20920, HOXB7, LOC201191, ITGB3, KIAA0924, KPNB1, LOC400604, LOC81558, MGC11242, MGC15396, NDP52, PDK2, PHB, PP1R9B, SLC35B1, SPOP, TOB1, WNT3. ABCC3 siRNA로의 추적 연구를 추가적인 세포주 ZR75-30, MDAMB-453 및 HCC-1428에서 수행하였다. 인간 게놈 내의 어떠한 서열에 대해서도 유의한 상동성을 나타내지 않은 비-표적화 대조군 (NTC) siRNA가 모든 RNAi 실험에서 음성 대조군으로서 사용되었다 (www.dharmacon.com의 기술 노트에 기술됨). 37℃에서의 48시간 또는 72시간 인큐베이션 후, 세포를 3.7％ 포름알데하이드에서 고정시키고, 0.1％ 트리톤(Triton) X-100에서 투과성이게 한 후, 항-포스포 히스톤 H3 (pH3, Upstate)의 1:500 희석물에 이어서 알렉사-플루오르(Alexa-fluor) 488 (Molecular probes) 염소 항-토끼 2차 항체의 1:250 희석물로 표지시켰다. 세포를 훼스트(Hoechst)-33258로 대비염색하여 핵이 확인되도록 한 후, 핵 pH3 면역형광에 대해 양성인 세포의 백분율 (유사분열 지수로 또한 공지됨) (30)을 셀로믹스(Cellomics)의 타켓 액티베이션(Target Activation) 소프트웨어를 사용하여 웰 당 1000개 이상의 세포에 대해 정량하였다. 모든 실험을 3회 이상 반복하였다. ABI 7900 상에서의 qRT-PCR (5 '프라이머 GATTCCAGCCGCTTCAGTT (서열 5), 3' 프라이머 CCTGGCTGTGCTCTACACCT (서열 6))을 수행하여, siRNA 풀이 대조군 siRNA에 비해 ABCC3의 90％ 녹다운을 초래하였음을 확인하였다.
ABCC3 과발현 실험을 위해, 전체 코딩 서열을 서열분석함으로써 CMV 프로모터 함유 벡터 pCMV5 (Invitrogen (Carlsbad, CA)) 내로 클로닝된 전장 ABCC3 cDNA를 확인하였다. 구축물을 EVSA-T 세포 내로 형질감염시키고, 1 ㎎/㎖ 제네티신 (Invitrogen (Carlsbad, CA))의 존재 하에서의 성장에 의해 안정적인 클론을 선별하였다. pCMV5-ABCC3, pCMV5 벡터 단독을 함유하는 세포주, 또는 어버이 EVSA-T 계통으로부터 유래된 cDNA 상에서의 qRT-PCR에 의해 안정적인 클론에서의 ABCC3의 과발현이 확인되었다. 본 보고서에서 기술된 모든 안정적인 세포주는 벡터 대조군 세포주 또는 어버이 세포주에 비해 적어도 25-35×를 초과하는 ABCC3 전사물을 발현하는 것으로 qRT-PCR 실험에서 결정되었다.
실시예 2 - 세포주들의 분자적 특성화
전체 mRNA로부터 제조된 cDNA 상에서 어피메트릭스 유전자 발현 프로파일링을 수행하였고, 44개의 유방암 세포주로부터의 DNA 상에서 어피메트릭스 100K SNP 어레이 프로파일링을 수행하였다. 세포주 패널에 걸쳐 11,000개의 가장 차별적으로 발현된 유전자로의 자율 분석을 사용하여, 유전자 발현을 기초로 세포주들을 내강형 및 기저형 서브타입으로 분류하였다 (도 11). 내강형으로 분류된 세포주들은 에스트로겐 수용체 알파 (ER), 및 GATA3, HNF3A, IGF1R 및 XBP1이 포함되는, ER에 의해 조절되는 다수의 표적 유전자를 높은 수준으로 발현하였다. 기저형으로 분류된 세포주들은 잘 설명되어 있는 기저 마커인 비멘틴, 카베올린, MFGE8 및 기저 사이토케라틴, 예컨대 KRT5 중 일부 또는 모두를 높은 수준으로 발현하였다 (31). HER2 종양유전자의 증폭이 세포주에서의 전체적인 유전자 발현 분류로부터 명백하지 않은 별도의 질환 서브타입을 명확하게 규정하기 때문에 (14), 모든 세포주에 대해 게놈 DNA 상에서의 qRT-PCR 및 라인-1 반복 요소에 대한 표준화에 의해 HER2 카피수를 결정하였다 (도 11). 이러한 분석에서 4를 초과하는 겉보기 카피수를 나타내는 세포주가 도 11에서 제시된 표에서 HER2 증폭형으로 제시된다. 도 11의 복합 분자 서브타입은 전반적인 유전자 발현 결과, 뿐만 아니라 HER2 카피수 분석 양쪽 모두로부터 유래된 분류이다. 이러한 발견은 기존의 보고 (14)와 일치하고, 유방암 서브타입을 규정하고 내강형, 기저형 및 HER2 증폭형 종양과 같은 서브타입들의 모델로서 어느 정도 대표적인 주요 전사 차이를 유방암 세포주들의 이러한 선집이 어느 정도 반영한다는 것을 시사한다. 세포주 패널에서의 카피수 획득 및 손실의 게놈 범위에 걸친 패턴은 종양에서 기술된 주요 카피수 변경 중 대다수 (예를 들어 MYC, CCND1, HER2 획득 및 p16, PTEN 손실)이 유방암 세포주에 존재한다는 것을 나타낸다. 서브타입 특이적 차이가 기술되어 있다 (32). 이러한 연구에 관련된 발견은 17q21.3에서의 증폭이 HER2 증폭형 및 내강형 세포주에서 공통적이지만 기저형 세포주에서는 그렇지 않다는 것이다.
실시예 3 - 항유사분열 약물에 대한 시험관내 민감도
31개의 유방암 세포주를 파클리탁셀 및 MMAE에 대한 시험관내 민감도에 대해 스크리닝하였다. 도 11은 모든 세포주에서 표준 루시페린 기반 생육력 분석법에서 세포 생육력의 50％ 억제에 필요한 농도로 정의되는, 각각의 화합물에 대한 IC50 값을 나타낸다. 특히, 세포주들의 패널에 걸쳐 각각의 작용제에 대한 상대적인 민감도 간에 유의한 상관관계가 있었다 (스피어맨(Spearman) 순위 상관 계수 rs = 0.55). 또한, 도 1은 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 순위합 테스트에 의해 결정시 기저형 유전자 발현 서명이 있는 세포주가 내강형 또는 HER2 증폭형 세포주보다 평균 IC50 값이 더 낮았고 각각의 작용제에 대해 더욱 민감성이었음을 나타낸다 (MMAE에 대해 P-값 = 0.002, 파클리탁셀에 대해 P-값 = 0.005)
실시예 4 - 시험관내 민감도와 상관되는 게놈 변경의 확인
파클리탁셀 또는 MMAE에 대한 민감도와 상관된 염색체 획득 또는 손실의 영역이 SNP 어레이 카피수 데이터의 지도 분석을 통해 확인되었다. 먼저, 세포주를 민감도 데이터를 기초로 민감성 (IC50 < 10 nM) 또는 저항성 (MMAE IC50 > 100nM, 파클리탁셀 IC50 > 1000nM) 군으로 분류하였다. 그후, maxT 알고리즘 (26)을 사용하여 약 115,000개의 SNP로부터의 데이터를 분석하였고, 게놈 범위에 걸친 유의성으로 평균 카피수가 민감성 클래스와 저항성 클래스 사이에 상이한 개별적인 SNP들이 확인되었다. 파클리탁셀의 경우에, 염색체 위치 44,303,217에서 시작하여 위치 44,724,301에서 종결되는 염색체 17 상의 SNP의 군 (17q21.21 내지 17q21.23)이 민감성 클래스와 저항성 클래스 간에 통계학적으로 유의한 카피수 차이를 나타냈다 (rs2411377에 대한 P-값 = 0.04). 동일한 군의 마커들이 카피수와 MMAE 민감도 간에 유의한 관련을 또한 나타냈다 (rs2411377에 대한 P-값 = 0.05). 도 2a는 염색체 17의 이러한 부분에서의 파클리탁셀 민감도와 게놈 DNA 카피수 간의 관계를 나타낸다. 파클리탁셀에 대해 저항성을 나타낸 유의한 개수의 세포주 (14개 중 8개)에서 이러한 영역 내에서의 유전자 증폭이 증가되었다 (다이아몬드로 지시됨). 분석에 의해 생성된 히트맵(heatmap)은 이러한 영역에서의 4 이상의 게놈 DNA 카피수를 나타냈다. 파클리탁셀에 대한 민감성을 나타낸 세포주들 중 어느 것에서도 이러한 영역에서의 게놈 DNA 카피수에서의 유의한 증가가 없었다. 도 2b는 MMAE 민감도에 대한 유사한 데이터를 나타낸다.
실시예 5 - 간격 내의 후보 유전자의 확인
<UC Santa Cruz Genome Browser> (http://genome.ucsc.edu)에 따르면 17q21.31에서 17q21.33까지의 염색체 영역은 약 100개의 발현된 전사물을 코딩한다. 증폭 영역 내의 기능적으로 관련된 유전자들이 mRNA 발현에서의 동반 증가를 나타내야 한다는 원리를 기초로, 이러한 목록이 증폭 시 유의한 과발현을 나타낸 24개의 유전자로 하향 필터링되었다: ABCC3, COL1A1, CROP, EAP, EPN3, FLJ13855, FLJ20920, HOXB7, LOC201191, ITGB3, KIAA0924, KPNB1, LOC400604, LOC81558, MGC11242, MGC15396, NDP52, PDK2, PHB, PP1R9B, SLC35B1, SPOP, TOB1, WNT3. 비-증폭 세포주에 비해 증폭 세포주에서의 후보 유전자 ABCC3의 유의적으로 더 높은 발현 (어피메트릭스 발현 프로브 셋트 208161_s_ 사용)의 예가 도 3에서 제시된다. 24개의 유전자를 기능 분석에 적용하여, 탁산 및 오리스타틴에 대한 저항성을 부여하는 것을 담당하는 유전자좌를 확인하였다.
실시예 6 - RNA 간섭에 의한 ABCC3 의 기능 확인
증폭 세포주에서 탁산 및 오리스타틴에 대한 저항성을 매개하는 것을 담당하는 유전자를 확인하기 위하여 RNA 간섭 전략을 사용하였다. 사용된 분석법은 파클리탁셀 또는 MMAE로 세포를 처리하면 유사분열 마커인 인산화 히스톤 H3의 존재에 의해 분석될 수 있는 M-단계에서의 세포 사이클 진행 차단을 초래한다는 사실을 이용하였다 (33). 히스톤 H3의 Ser10에서의 인산화는 M 단계 동안의 염색체 응축과 밀접하게 상관되고, pH3 염색에 대해 양성인 세포의 백분율 또는 유사분열 지수를 면역형광 분석법을 통해 결정할 수 있다. 저항성을 매개하는 유전자의 세포성 녹다운은 증폭이 있는 세포주의 파클리탁셀 및 MMAE에 대한 민감도를 증가시켜야 하고, 따라서 소정의 약물 농도에서 대조군으로 처리된 세포에 비해 정지된 세포의 축적 및 더 높은 유사분열 지수를 초래하여야 한다. 더 높은 유사분열 지수는 다른 분석법 (COB 및 MRL, 미공개 관찰)에 의해 결정된 생육력 및 증식에서의 감소와 상관되지만, 이러한 약물들의 항유사분열 효과의 더욱 특이적인 판독값이다. 24개의 후보 유전자 중 23개의 RNAi는 EFM-192A 세포에서 정지된 세포의 축적 및 증가된 유사분열 지수를 재현가능하게 초래하지 않았지만, ABCC3의 RNAi는 세포주 EFM-192A 및 ZR75-30에서 비-표적화 대조군 siRNA로의 대조군 처리에 비해 유사분열 지수에서의 2배 내지 3배 증가를 초래하였다 (도 4a-b). 대조적으로, ABCC3 RNAi는 비-증폭 세포주 HCC-1428 및 MDA-MB-453에서 유사분열 지수를 감지할 수 있을 정도로 변경시키지 않았다 (도 4c-d). 유사한 결과가 MMAE로 수득되었다.
실시예 7 - ABCC3 의 과발현이 시험관내 다중약물 저항성을 야기한다
ABCC3 증폭을 나타내지 않고 낮은 수준의 ABCC3 전사물을 발현하기 때문에 EVSA-T 세포를 ABCC3-과발현 세포주를 생성시키기 위한 모델로서 선택하였다. 3개의 독립적으로 유래된 세포주들이 ABCC3 전사물을 과발현하는 것으로 확인되었고, 이들을 ATP-기반 발광 분석법을 사용하여 파클리탁셀 및 MMAE에 대한 시험관내 민감도에 대해 스크리닝하였다. 이러한 실험에서, ABCC3 과발현 클론의 처리가 3일 분석법에서 세포 생육력의 50％ 감소를 초래하지 않아서, 절반-최대 응답을 초래한 농도 또는 EC50을 계산함으로써 민감도에서의 배수 변화를 평가하였다. 파클리탁셀로 처리된 벡터 대조군에 대한 EC50은 0.2 nM인 한편, ABCC3-발현 세포주에 대한 EC50 값은 각각 5 nM, 10 nM, 및 80 nM이었다. MMAE로 처리된 벡터 대조군에 대한 EC50은 0.05 nM인 한편, ABCC3-발현 세포주에 대한 EC50 값은 각각 1.5 nM, 12 nM, 및 90 nM이었다.
3개의 과발현 세포주 모두가 EC50 값을 기초로 파클리탁셀 및 MMAE에 대해 20배 이상 덜 민감성이었고, ATP-기반 발광 분석법에서 안정적인 벡터-단독 대조군 세포주와 비교하여 세포 성장의 현저하게 더 적은 억제를 또한 나타냈다 (도 5).
실시예 8 - ABCC3 의 증폭이 유방 종양에서 발생한다
세포주 100K SNP 어레이 데이터에서의 HER2 및 ABCC3을 포함하는 염색체 17의 영역의 분석은 ABCC3 앰플리콘이 HER2 증폭형 서브타입과 가장 통상적으로 관련되었고, 내강형 또는 기저형으로 분류된 세포주에서는 나타나지 않았음을 시사하였다.
ABCC3 증폭이 세포주 특이적 현상이 아니었음을 확실히 하기 위해, ABCC3 유전자좌에서의 카피수 데이터가 145개의 원발성 유방 종양으로부터의 DNA에 대한 애질런트의 어레이(Array) CGH (aCGH) 분석법을 사용하여 특성화되었다. (32)에 기술된 바와 같이 ER, PR 및 HER2의 발현 수준을 기초로 하는 예측기를 사용하여 이러한 종양 샘플들이 내강형, 기저형, 및 HER2 서브타입으로 또한 분류되었다. ABCC3 카피수 획득 (> 3.5 카피)이 HER2 증폭형의 25％ 및 내강형 종양의 11％에 존재하지만, 기저형 종양에는 존재하지 않았다.
실시예 9 - FISH 분석법
SNP 및 aCGH 어레이에 의해 관찰된 겉보기 카피수 획득의 세포유전학적 근거를 확인하기 위해, ABCC3 유전자좌에 스패닝(spanning)된 BAC 클론 (실시예 1 참조)을 사용하여 형광 원위치 혼성화 (FISH) 분석법이 개발되었고, 헤르셉트테스트(HerceptTest) (IHC 분석법, (35)에서 리뷰됨)를 기초로 HER2를 과발현하는 것으로 분류된 61개의 원발성 종양 및 선택된 세포주에 대해 FISH 분석이 수행되었다. 세포주들로부터의 FISH 결과는 SNP 어레이 및 qPCR 분석으로부터 수득된 데이터를 보강하였다. ABCC3 카피수가 상승되었을 것으로 SNP 어레이로부터 예측된 유방암 세포주 EFM-192A는 염색체 17 상의 HER2 및 ABCC3의 단일 카피를 유지하는 한편 다양한 염색체 내로의 단일 또는 다중 통합으로 균질 염색 영역 (HSR)으로 명시되는 ABCC3의 높은 수준의 증폭을 실제로 나타냈다. SNP 어레이 분석을 기초로 ABCC3에 대해 2배수체일 것으로 예측되는 세포주가 CEP17 및 ABCC3으로의 FISH 분석을 기초로 2배수체인 것으로 확인되었다. ABCC3 증폭에 대해 스크리닝된 61개의 HER2 양성 원발성 종양의 FISH 분석에서, ABCC3에서의 상승된 카피수가 HER2 양성 유방 종양들에서 공통적이라는 것이 확인되었다. 높은 수준의 유전자 증폭 (>2.2 비율의 ABCC3/CEP17)이 종양의 25％에서 나타난 한편, 종양의 추가적인 11％가 ABCC3에 대해 중간 정도의 증가를 나타냈다 (ABCC3의 3-7개 카피). 흥미롭게, 다수의 종양이 이질성의 증거를 나타내고, 2배수체 카피수의 ABCC3가 있는 세포와 함께 매우 높은 수준의 ABCC3 증폭이 있는 세포 양쪽 모두를 나타냈다.
실시예 10 - ABCC3 의 과발현이 DM1 에 대한 저항성을 야기한다
EVSA-T 세포를 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터로부터 ABCC3가 높은 수준으로 발현되는 ABCC3 함유 플라스미드로 안정적으로 형질감염시켰다. ABCC3의 과발현이 qRT-PCR에 의해 확인되었다. 그후, 3개의 과발현 클론 및 대조군 세포주를 유리 DM1에 대한 민감도에 대해 표준 세포 생육력 분석법에서 분석하였고, DM1에 대한 저항성에 이르는 ABCC3 과발현과 일관되게, 과발현 클론들이 대조군 세포주보다 DM1에 더욱 저항성이었음이 발견되었다 (도 7).
실시예 11- ABCC3 RNAi 가 MMAF 항체 접합체에 대한 응답을 강화한다
EFM192A 세포를 ABCC3 siRNA로 형질감염시키고, 약물 링커 시약 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-PAB를 통해 MMAF에 접합된 트라스투주맵 (Herceptin) (트라스투주맵-mc-vc-PAB-MMAF)으로 처리하였다. ABCC3 siRNA로 형질감염된 EFM-192A 세포는 대조군 siRNA로 형질감염된 세포보다 트라스투주맵-mc-vc-PAB-MMAF에 대해 더욱 민감성이었고, 이는 ABCC3 발현 수준이 이러한 작용제에 대한 민감도에 영향을 미칠 수 있음을 가리킨다 (도 8).
실시예 12- ABCC3 RNAi 가 유리 DM1 및 트라스투주맵 - smcc - DM1 접합체에 대한 응답을 강화한다
ABCC3 siRNA로 형질감염된 EFM-192A 세포가 대조군 siRNA (NTC)로 형질감염된 세포보다 유리 DM1 또는 트라스투주맵-smcc-DM1 접합체에 대해 더욱 민감성이었고, 이는 ABCC3 발현 수준이 이러한 작용제들에 대한 민감도에 영향을 미칠 수 있음을 가리킨다 (도 9a 및 9b).
실시예 13 - ABCC3 증폭 상태가 T- DM1 활성과 상관된다
T-DM1 제II상 (TDM4258G) 실험으로부터 수득된 샘플들에 대해 ABCC3 FISH 분석을 수행하여, HER2 증폭형 유방 종양에서의 T-DM1 활성에 대한 ABCC3 증폭의 효과를 탐구하였다. TDM4258G 실험은 HER2-양성 전이성 유방암 환자에게 IV 주입에 의해 투여된 T-DM1의 다중 기관에서의 개방형(open-label), 단일 병기(single- arm) 제II상 연구이다. 시험에 참여하는 환자들은 HER2-지시형 치료법에서 선행 진행을 나타냈다. 임상 시험으로부터의 포르말린-고정, 파라핀-매립 (FFPE) 보관소 종양 조직 샘플은 적합한 IRB 승인 및 환자 동의 하에 임상 연구 장소로부터 수득되었다.
실시예 1에 기술된 바와 같이 임상 시험 샘플에 대해 FISH 분석법을 수행하였다. 도 10은 ABCC3/CEP17의 비율에 의해 분류된 FISH 분석법의 분석으로부터의 데이터를 나타낸다. ABCC3/CEP17 비율이 1.8 이상인 샘플들이 ABCC3 증폭이 있는 것으로 간주되었다. 샘플이 ABCC3의 증폭을 나타내지 않은 환자의 80％ (12/15)가 T-DM1 치료에 대해 응답한 한편, 샘플이 ABCC3의 증폭을 나타낸 환자의 40％ (2/5)가 T-DM1 치료에 응답하였다. 이러한 분석은 ABCC3 증폭 상태가 T-DM1로의 치료에 대한 환자의 가능한 응답을 결정하는데 유용하다는 것을 가리킨다.
참고문헌
Figure 112010059244469-pct00002
Figure 112010059244469-pct00003
Figure 112010059244469-pct00004
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Figure 112010059244469-pct00006
본 발명이 이해를 명확하게 하기 위해 실례 및 예에 의해 일부 상세하게 기술되었지만, 이러한 설명 및 예가 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 간주되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 전문이 거명에 의해 명확하게 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. Lackner, Mark Amler, Lukas C. Cavet, Guy O'Brien, Carol Pandita, Ajay <120> GENETIC VARIATIONS ASSOCIATED WITH DRUG RESISTANCE <130> P4184R1 <140> PCT/US2009/036985 <141> 2009-03-12 <150> US 61/036874 <151> 2008-03-14 <150> US 61/054064 <151> 2008-05-16 <160> 6 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMER <400> 1 cactgtctgc accttgcttt g 21 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMER <400> 2 gctctgcagc tattgaaaga acaa 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMER <400> 3 aaagccgctc aactacatgg 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMER <400> 4 tgctttgaat gcgtcccaga g 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMER <400> 5 gattccagcc gcttcagtt 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> ARTIFICIAL SEQUENCE <220> <223> SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMER <400> 6 cctggctgtg ctctacacct 20

Claims (100)

  1. 환자로부터의 HER2 양성 전이성 유방암 테스트 샘플에서 ABCC3 유전자가 증폭되었는지 여부를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 ABCC3 유전자의 증폭을 검출하는 단계는 ABCC3 유전자의 카피수를 결정하는 것 또는 동일한 테스트 샘플 내에서 CEP17 유전자의 증폭값에 대비한 ABCC3 유전자의 증폭값을 결정하는 것을 포함하고, 이때 ABCC3 유전자의 카피수가 3 이상이거나 동일한 테스트 샘플 내에서 CEP17 유전자의 증폭값에 대비한 ABCC3 유전자의 증폭값이 1.8 이상이면 HER2 양성 전이성 유방암이 트라스투주맵과 N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)메이탄신(DM1)의 접합체, 트라스투주맵과 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF)의 접합체 및 트라스투주맵과 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE)의 접합체로부터 선택된 항유사분열제-항체 접합체로의 치료에 대해 저항성임을 지시하는 것인, 환자의 HER2 양성 전이성 유방암이 상기 항유사분열제-항체 접합체로의 치료에 대해 저항성인지 여부를 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, ABCC3 유전자의 카피수 또는 ABCC3 유전자의 증폭값이 형광 원위치 혼성화 (FISH), 서던 블롯(Southern Blot), 면역조직화학 (IHC), 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 정량적 PCR (qPCR), 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR), 비교 게놈 혼성화, 마이크로어레이-기반 비교 게놈 혼성화, 또는 라이게이스 연쇄 반응 (LCR)에 의해 결정되는 방법.
  3. ABCC3 항체 및 ABCC3에 결합하는 siRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 ABCC3의 길항제 및
    트라스투주맵과 N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)메이탄신(DM1)의 접합체, 트라스투주맵과 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF)의 접합체 및 트라스투주맵과 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE)의 접합체로부터 선택된, 치료적 유효량의 항유사분열제-항체 접합체
    를 포함하는, 트라스투주맵과 DM1의 접합체, 트라스투주맵과 MMAF의 접합체 및 트라스투주맵과 MMAE의 접합체로부터 선택된 항유사분열제-항체 접합체에 저항성인 HER2 양성 전이성 유방암에 걸린 환자를 치료하기 위한 제약 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 항유사분열제-항체 접합체가 트라스투주맵과 DM1의 접합체인 제약 조성물.
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