KR101873899B1

KR101873899B1 - 락토바실러스 살리바리우스 cjls1511, 상기 균 또는 이의 사균체를 포함하는 동물 사료 첨가제 조성물, 및 상기 사균체의 제조 방법

Info

Publication number: KR101873899B1
Application number: KR1020160101355A
Authority: KR
Inventors: 이중수; 김지은; 채경수; 김성훈; 지석우
Original assignee: 씨제이제일제당(주)
Priority date: 2016-08-09
Filing date: 2016-08-09
Publication date: 2018-07-03
Anticipated expiration: 2036-08-09
Also published as: BR112019002545A2; US20190216867A1; MY193328A; AU2017309095A1; US11382940B2; BR112019002545B1; JP2019524129A; AU2017309095B2; EP3498820A1; CN109563473B; WO2018030730A1; EP3498820A4; PH12019500264A1; CN109563473A; KR20180017489A; PH12019500264B1; JP6715386B2; RU2721127C1

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 균주 또는 이의 사균체를 포함하는 동물 사료 첨가제 조성물, 및 상기 사균체의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511, 상기 균 또는 이의 사균체를 포함하는 동물 사료 첨가제 조성물, 및 상기 사균체의 제조 방법 {LACTOBACILLUS SALIVARIUS CJLS1511, COMPOSITION FOR ADDING ANIMAL FEED COMPRISING THE SAME OR HEAT-KILLED BODIES THEREOF, AND METHOD FOR PREPARING THE HEAT-KILLED BODIES}

본 발명은 신규한 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511, 상기 균 또는 이의 사균체를 포함하는 동물 사료 첨가제 조성물, 및 상기 사균체의 제조 방법에 관한 것이다.

락토바실러스 속 (Lactobacillus sp.) 미생물은 동형 또는 이형발효를 하는 젖산 간균으로서 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있다. 락토바실러스 속 미생물은 장내 pH를 산성으로 유지시켜, 대장균(E. coli)이나 클로스트리디움(Clostridium)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라, 비타민 합성, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

락토바실러스속 미생물의 상기 특성에 이용하여 생균제 및 가축사료로 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 가축의 세균성 설사병은 증체율 감소와 폐사를 유발한다. 따라서, 이를 예방하여 가축의 생산을 높이고자 사료에 항생제를 첨가하는 것이 일반적으로 널리 행해져 왔다. 그러나, 항생물질에 대한 내성균의 출현과 축산물 내 잔류 항생물질 등의 문제 때문에 사료 내 항생물질의 사용을 규제하고 유기적인 가축 사양법이 강조되고 있는 추세이다(대한민국 특허 출원 공개 제1998-78358호)(McEwen and Fedorka-Cray, Antimicrobial use and resistance in animals, Clinical infectious Diseases, Volume 34, June 2002, pages S93-S106).

대한민국 특허 출원 공개 제1998-78358호

Clinical infectious Diseases, Volume 34, June 2002, pages S93-S106

이에, 본 발명의 일 양태에서, 가축의 사료로 사용시 동물의 증체를 개선할 수 있고, 동물의 면역력 혹은 항병력을 개선시키며, 동물의 장내 유해세균 증식을 억제할 수 있는 신규한 락토바실러스 속 (Lactobacillus sp.) 미생물을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 양태는, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 (Lactobacillus salivarius CJLS1511)(KCCM11829P) 또는 이의 사균체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양태는, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 또는 이의 사균체를 포함하는, 동물 사료 첨가제 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는, 본원에 기술된 동물 사료 첨가제 조성물을 포함하는 동물 사료에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는,

락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)를 배양하여 배양액을 제조하고,

상기 배양액을 70℃ 내지 160℃의 온도에서 가열하고,

상기 가열된 배양액을 10℃ 내지 60℃의 범위의 온도로 냉각하고,

상기 냉각된 배양액에서 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 사균체를 분리하는 것을 포함하는, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 사균체의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에 따른 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 또는 이의 사균체는 중성지방 분해능, 내독소 흡착능, 병원성 세균 생장 억제력 및 소화 효소 활성능이 우수하다.

본 발명의 일 양태에 따른 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 또는 이의 사균체를 포함하는 동물 사료 첨가제 조성물 또는 동물 사료는 동물의 증체를 개선하고 면역성 내지 항병력을 향상시킬 수 있다.

도 1은 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius) CJLS1511 균주 또는 이의 사균체의 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

본 발명의 일 양태는, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 (Lactobacillus salivarius CJLS1511)(KCCM11829P) 또는 이의 사균체에 대한 것이다.

본 발명자들은 육계의 소장 말단을 채취하여 멸균 증류수로 세척한 다음 0.001%의 브롬페니콜 퍼플(Bromphenicol purple, BCP)이 첨가된 MRS 배지에 도말하여 37℃에서 혐기 배양하였다. 여기서 유산균 생성 균주 50여 종을 선별하여 계대 배양한 다음 이 균주들을 이용하여 형태학적 분리 방법으로 간균 형태의 24종을 2차 분리하였다. 24종에 대한 항균활성 및 소화효소 활성 능력을 비교하여 10종을 3차 분리하였으며, 이 유산균 생성 균주의 내담즙성, 내산성 및 동물 장벽세포 흡착성을 측정하고, 당 발효, 병원성 세균 생장 억제력, 소화효소 활성능, 중성지방 분해능이 가장 우수한 균주 1종을 분리하였다.

상기 분리한 유산균 생성 균주를 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 (Lactobacillus salivarius CJLS1511)로 명명하고, 한국미생물보존센터에 2016년 4월 12일자로 기탁하였다(수탁번호: KCCM11829P).

상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511의 형태학적 및 생리학적 특성은 하기 표 1과 같다.

1. 형태학적 특징(MRS 고체배지에서 성장시켰을 때의 형태)
- 세포의 모양	간균
- 세포의 다형성(多形性)	없음
- 운동성	없음
- 아포 형성	없음
2. 생리학적 특징
- 그람 염색(Gram staining)	그람 양성(Gram positive)
- 카탈라아제(Catalase)	음성
- 옥시다아제(Oxidase)	음성
- 생육 온도 및 시간	37°C, 18~48시간
- 산소 요구도	통성혐기성

또한, 상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511는 도 1에 도시된 바와 같이 막대(rod) 형태를 가지며 포자를 형성하지 않는다. 상기 균주를 사균화하였을 때 세포벽 표면의 당단백질 활성에 의해 생균과 사균의 차이가 확인된다.

상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511의 생화학적 분석을 위해 API 키트로 분석한 결과, 하기 표 2에서와 같이 락토바실러스 살리바리우스 ATCC11741 혹은 KCCM 40210 표준 균주와 유사한 당 이용성을 가지는 것으로 동정되었고 16s rRNA 분석을 마크로젠에 의뢰하여 락토바실러스 살리바리우스 ATCC11741 (Lactobacillus salivarius ATCC11741) 혹은 KCCM 40210 표준 균주와 99% 유사한 분자생물학적 특성을 가지는 것으로 도 2와 같이 동정되었다.

락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511의 당 이용능 분석

No.	당종류	락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511
0	Temoin	-
1	Glycerol	-
2	Erythritol	-
3	D-arabinose	-
4	L-arabinose	-
5	D-ribose	-
6	D-xylose	-
7	L-xylose	-
8	D-adonito	-
9	Methyl-αD-xylopyranozide	+
10	D-galactose	+
11	D-glucose	+
12	D-fructose	+
13	D-mannose	-
14	L-sorbose	-
15	L-ramnose	-
16	D-ulcitol	-
17	Inositol	+
18	D-mannitol	+
19	D-sorbitol	+
20	Methyl-αD-manopyranozide	-
21	Methyl-αD-glucopyranozide	-
22	N-acetylglucosamine	+
23	Amygdalin	-
24	Arbutin	+
25	Asculin	-
26	Salicin	+
27	D-celobiose	-
28	D-maltose	+
29	D-lactose	+
30	D-mellibiose	+
31	D-saccharose	+
32	D-trehalose	+
33	Inulin	-
34	D-melesitose	-
35	D-rafinose	+
36	Amidon	-
37	Glycogen	-
38	Xylitol	-
39	Genthiobiose	-
40	D-turanose	-
41	D-lyxose	-
42	D-tagatose	-
43	D-fucose	-
44	L-fucose	-
45	D-arabitol	-
46	L-arabitol	-
47	Gluconate	-
48	2-ketogluconate	-
49	5-ketogluconate	-

상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)는 내산성, 내담즙성, 항균활성, 소화 효소 활성능 및 중성 지방 분해능이 뛰어나며 이를 동물 사료 또는 사료 조성물에 사용시 사료의 효율 및 동물의 증체를 효과적으로 개선할 수 있는 이점이 있다.

상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 사균체는 장내 유해세균과 경쟁적 부착저해능을 발휘하여 장내 세균총을 형성하는데 기여를 하며, 소장 내에서 사균체의 세포벽이 파괴되면서 용출된 세포벽 구성성분인 리포테이코산(lipoteichoic acid)이 장내 유해세균이 장점막에 정착하는 것을 방해할 수 있다. 또한 상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 사균체는 생균에 비해 소수성 및 응집성이 높아 병원성 미생물 및 내독소에 부착되어 항병력을 향상시킬 수 있는 이점이 있다. 나아가, 상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 사균체를 사료에 투여하여 동물에 급이하면 증체량 및 사료요구율 모두 향상시킬 수 있다.

락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 또는 이의 사균체는 보호제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보호제의 예로는 효모, 효모추출물, 단당류, 다당류, 전분류, 원당 및 정제당과 같은 설탕류 중 1종 이상일 수 있다. 구체적으로는 효모추출물, 덱스트로즈 및 원당으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 들 수 있다. 보호제를 이용하면 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 또는 이의 사균체를 외부 환경으로부터 보호하여 오염을 방지할 수 있고, 이의 유통기한을 연장하는 효과가 있다.

본 발명의 다른 실시예는, 상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 또는 이의 사균체를 포함하는 동물 사료 첨가제 조성물에 대한 것이다. 구체적으로 상기 동물 사료 첨가제 조성물은 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 사균체를 포함할 수 있다.

상기 동물 사료 첨가제 조성물은 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 부형제는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 부형제를 사용할 수 있다. 부형제로서는 예컨대 당류(예: 락토오스, D-만니톨, D-소르비톨, 수크로오스 등), 검류(예: 잔탄검, 구아검, 아라비아산검 등), 전분류(예 : 옥수수 전분, 감자 전분 등), 무기 염류(예: 인산 칼슘, 황산 칼슘, 침강 탄산 칼슘 등)등이 있다.

상기 동물 사료 첨가제 조성물은, 조성물 1g 당 상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 또는 이의 사균체가 1.0×10⁸ cfu 내지 1.0×10¹⁰ cfu로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 1.0×10⁸ cfu 내지 3.0×10⁹cfu로 포함하는 것일 수 있으며, 일 예에서 5×10⁸ cfu로 포함할 수 있다.

동물 사료 첨가제 조성물은 분말, 팰릿, 또는 입상 등의 형태일 수 있다. 동물 사료 첨가제 조성물 중 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 또는 이의 사균체의 함량은 0.1 중량% 내지 90 중량%의 범위, 구체적으로는 0.1 중량% 내지 70 중량%의 범위일 수 있다. 상기 범위로 조성물에 상기 균주 또는 이의 사균체를 포함하는 경우, 동물 사료 첨가제 조성물의 중성지방 분해능, 내독소 흡착능, 병원성 세균 생장 억제능 및 소화효소 활성능이 극대화될 수 있는 이점이 있다.

다른 양태에서, 상기 동물 사료 첨가제 조성물을 사용하여 제조된 동물 사료가 제공된다. 상기 동물 사료는 본 발명의 일 양태들에 따른 동물 사료 첨가제 조성물을, 통상적인 동물 사료와 혼합하여 제조된 것일 수 있다. 동물 사료 중 본원의 동물 사료 첨가제 조성물의 양은 동물 사료 중량을 기준으로 0.1 중량% 내지 1 중량%일 수 있다.

동물 사료는 특별히 제한되는 것은 아니며, 사육 동물용 사료일 수 있다. "사육 동물"이란 젖, 고기, 알, 털, 피혁, 깃털 등 인간에게 유용한 축산물 및 수산물을 생산하기 위한 동물 및 애완동물을 포함하는 의미이다. 구체적인 예로, 개, 소, 닭, 돼지, 말 등의 사육동물에 급이하기 위한 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 닭과 같은 가금류, 더욱 구체적으로 육계에 급이하기 위한 것일 수 있다.

동물 사료는 동물의 성장에 필수적인 탄수화물, 단백질, 지방, 비타민, 무기질 등의 성분들을 포함할 수 있다. 단백질로는 동물성 단백질 또는 식물성 단백질일 수 있으며, 예를 들어, 육분, 가금류분, 어분, 대두 단백질, 우유 단백질, 또는 글루텐 등일 수 있다. 상기 탄수화물로는, 곡류, 또는 콩류, 예컨데, 옥수수, 쌀, 밀, 보리, 오트, 대두 또는 이의 혼합물을 들 수 있다. 상기 지질로는 동물성 지질, 식물성 지질 또는 육류 등일 수 있다. 또는 상기 성분들 외에 동물 사료에 기능성을 부가하는 다른 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또는, 당, 염, 향신료, 조미료, 향미제 등이 혼입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예는, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)를 배양하여 배양액을 제조하고,

상기 배양액을 70℃ 내지 160℃의 온도에서 가열하고,

구체적으로, 상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)를 배양하여 배양액을 제조하는 단계는 한천 배지, 구체적으로 MRS배지일 수 있다. 상기 배양은 25℃ 내지 40℃에서 5시간 내지 48시간 배양, 구체적으로, 30℃ 내지 40℃에서 12시간 내지 36시간 배양, 보다 구체적으로는 35℃ 내지 40℃에서 20시간 내지 30시간 배양하여 배양액을 제조할 수 있다.

그 다음, 상기 배양액을 상기 배양액을 70℃ 내지 160℃의 온도에서 가열한다. 상기 가열은, 직접 가열 수단 혹은 간접 가열 수단을 이용할 수 있으나, 열 교환기와 같은 간접 가열 수단을 통해 이루어질 수 있다. 상기 가열은 구체적으로 80℃ 내지 150℃, 보다 구체적으로 90℃ 내지 120℃의 온도범위에서 수행될 수 있다. 상기 가열을 통해 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511을 불활성화 혹은 사균화할 수 있다.

상기 가열된 배양액을 이후 10℃ 내지 60℃, 구체적으로 20℃ 내지 50℃의 온도로 냉각하거나, 일 예에서는 4℃까지 급속 냉각할 수 있다. 상기 냉각은 10℃/min 내지 60℃/min, 구체적으로는 20℃/min 내지 50℃/min, 보다 구체적으로는 30℃/min 내지 40℃/min의 속도로 냉각될 수 있다. 그 다음, 상기 냉각된 배양액에서 사균체를 분리함으로써 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 사균체를 얻을 수 있다.

상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 사균체의 제조 방법은, 상기 분리된 사균체에 보호제를 혼합하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 이후 상기 사균체와 보호제의 혼합물을 분말화하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같이 보호제를 혼합하고 이 혼합물을 분말화함으로써, 사균체가 외부 환경으로부터 오염되는 것을 방지하고 사균체의 유통을 보다 용이하게 할 수 있는 이점이 있다.

상기 보호제는 특별히 제한되지 아니하나, 예를 들어, 효모, 효모추출물, 단당류, 다당류, 전분류, 원당 및 정제당과 같은 설탕류 중 1종 이상일 수 있다. 구체적으로는, 효모 추출물, 덱스트로즈 및 원당으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질을 사용할 수 있다.

상기 분말화는 동결건조, 분무건조 혹은 분무 응집을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 분무 건조를 이용할 수 있다. 분무 건조는 스프레이 드라이라고도 불리며, 열기류 중에 단번에 액체를 분무하여 순간적으로 액상의 건조물을 얻는 방법이고, 액체를 분무형상으로 하는 방법으로서는, 회전원반에 의한 원심분무와 압력 노즐에 의한 가압분무가 있다. 탈지유 등에 분무건조를 실시하기 위해서는, 이들 분무 방법을 채용한 공지의 분무건조 장치를 이용할 수 있다.

조작의 간편성을 고려하면 사균체와 보호제를 혼합하여 혼합물을 만든 다음, 이 혼합물을 물속에 현탁시킨 후, 수득한 현탁액을 분무 건조 처리하는데, 즉 열풍의 유입구 온도를 120∼200℃, 바람직하게는 130∼170℃로 하고 출구 온도를 30∼150℃, 바람직하게는 50∼100℃로 하여 분무 건조하는 것이 바람직하다. 보호제의 첨가량은 사균체의 중량 100 중량부를 기준으로, 0.1 중량부 내지 300 중량부, 구체적으로는, 0.1 중량부 내지 200 중량부일 수 있다.

일 예에서, 효모 또는 효모추출물의 첨가량은 0.04∼50 중량부, 바람직하게는 0.1∼10 중량부로 하는 한편, 단당류의 첨가량을 1∼100 중량부, 바람직하게는 10∼50 중량부로 하고, 설탕류의 첨가량을 0.2∼50 중량부, 바람직하게는 0.4∼10 중량부로 한다.

분말화 조작, 특히 분무 건조 조작에 있어서 물에 난용성인 탄산 칼슘 등의 생리학적으로 허용되는 무기 물질을 첨가제로 사용하면 조작이 용이해짐을 확인하였다. 이 경우, 첨가제 조성물 중 무기 물질의 양은 1∼99중량%, 구체적으로는 1∼90중량%, 보다 구체적으로는 1∼10 중량%이다. 일 예에서, 첨가제 조성물은 사균체 분말 0.05∼50 중량%, 바람직하게는 0.5∼20 중량%, 보다 바람직하게는 0.5∼15중량%을 포함하고, 무기물질 5∼80 중량%, 바람직하게는 5∼50%, 보다 바람직하게는 5∼20%을 함유한다.

첨가제 조성물 중에 사균체는 당해 조성물 1g 당 상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 또는 이의 사균체가 1.0×10⁸ cfu 내지 1.0×10¹⁰ cfu로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 1.0×10⁸ cfu 내지 3.0×10⁹cfu로 포함하는 것일 수 있으며, 일 예에서 5×10⁸ cfu로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 바람직한 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다.

여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.

실시예

실험예 1 내지 6

공지된 균주인 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210을 비교 균주로 하여, 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 균주의 안전성, 내산성, 내담즙성, 항균활성, 소화 효소 활성 및 중성지방 분해 활성을 아래와 같이 평가하였다.

실험예 1: 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 안전성 평가

락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 균주의 안전성을 평가하기 위하여 한국바이오벤처협회 단체표준에서 제시한 안전성 평가 시험법에 따라 용혈 현상 검사, 젤라틴 액화 반응 검사, 유해 대사산물(암모니아) 생성 확인 및 페닌알라닌 탈아민 검사를 수행하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

균주	항목
	젤라틴 액화 반응 검사	페닐알라닌 탈아민 검사	용혈 현상 검사	암모니아 생성
락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511	음성	음성	α-용혈, 안전함	음성

상기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)는 젤라틴 액화 반응 검사, 페닌알라닌 탈아민 검사 및 암모니아 생성 확인 검사에서 모두 음성을 나타내었고, 용혈 검사에서도 안전한 것으로 드러났다.

실험예 2: 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 내산성 평가

MRS 배지에서 사전 배양한 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 균주와 비교 균주인 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210 표준 균주에 대해 pH 2, 3, 7로 각각 조정한 MRS 용액으로 10^-6 배 희석하였다. 희석한 균액을 37℃에서 배양하면서 일정한 시간대별로 MRS agar 배지에 도말하여 48시간 동안 혐기적으로 배양한 후 콜로니 수를 측정하였다. 내산성 실험의 결과는 표 4에 나타내었다.

Strains	MRS broth (pH7)			MRS broth (pH2)			MRS broth (pH3)
	생균수 (CFU/mL)			생균수 (CFU/mL)			생균수 (CFU/mL)
	0 h	1 h	3 h	0 h	1 h	3 h	0 h	1 h	3 h
락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511	5.8 x 10⁸	6.0 x 10⁸	6.2 x 10⁸	5.8 x 10⁸	2.3 x 10⁵	2.0 x 10⁵	5.8 x 10⁸	3.5 x 10⁸	2.0 x 10⁸
락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210	6.4 x 10⁸	6.8 x 10⁸	8.6 x 10⁸	6.4 x 10⁸	2.0 x 10²	2.0 x 10²	6.4 x 10⁸	1.0 x 10⁸	5.0 x 10⁶

상기 표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511는 pH 2 내지 4에서 비교 균주인 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210 표준균주보다 생존 균수의 감소가 적어 내산성이 우수한 것으로 나타났다.

실험예 3: 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 내담즙성 평가

MRS 배지에서 사전 배양한 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 균주와 비교 균주인 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210 표준균주를 pH 4로 각각 조정 후, 담즙산액(Oxgall)을 각각 0%, 0.3%, 1% 가 되도록 농도를 맞춘 후, MRS 용액으로 10^-6 배 희석하였다. 희석한 균액을 37℃에서 배양하면서 일정한 시간대별로 MRS agar 배지에 도말하여 48시간 동안 혐기적으로 배양한 후 콜로니 수를 측정하였다. 균수를 측정한 결과는 표 5에 요약하였다.

Strains	MRS broth (pH4)			MRS broth (pH4 and Oxgall 0.3%)			MRS broth (pH4 and Oxgall 1%)
	생균수 (CFU/mL)			생균수 (CFU/mL)			생균수 (CFU/mL)
	0 h	1 h	3 h	0 h	1 h	3 h	0 h	1 h	3 h
락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511	2.4 x 10⁸	4 x 10⁸	5.6 x 10⁸	2.4 x 10⁸	4.0 x 10⁶	2.0 x 10⁴	2.4 x 10⁸	5.6 x 10⁵	5.2 x 10³
락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210	2.0 x 10⁸	2.0 x 10⁸	2.2 x 10⁸	2.0 x 10⁸	2.6 x 10⁵	2.0 x 10²	2.0 x 10⁸	2.0 x 10²	2.0 x 10²

상기 표 5로부터 알 수 있듯이, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511는 pH 4, 담즙산(Oxgall) 0.3% 및 1% 용액 모두에서 생존 균수의 수가 감소되었으나, 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210 표준균주에 비해 균수의 감소 정도가 훨씬 적어 동물 체내에서 담즙산이 분비되더라도 투여된 균주가 생육할 수 있음을 확인하였다.

실험예 4: 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 항균활성 평가

TSB(Tryptic soy broth) 배지(BD, USA)에 24시간 액체 배양된 3종의 병원균(E. coli K88, E. coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium KCCM 25922, Salmonella cholerasuis KCCM 10709)을 멸균된 면봉으로 균일하게 10^5~6 cfu/ml로 도말하였다.

도말 후 직경 4mm의 paper disc에 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511와 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210 표준균주를 각각 PBS 버퍼에 10⁹ cfu/mL로 희석 후 50㎕씩 분주하였다. 희석액이 paper disc 속으로 충분히 스며들 때까지 실온에 방치 다음 37℃에서 18시간 동안 호기 배양하였다. 여기서 상기 희석액은 배양 후 상층액에 대해 원심분리(3,000 × g, 10분) 후 PBS 버퍼를 이용해 3회 세척 후 사용한 균체만을 사용한 것이다. 저해환의 크기는 전체 투명환의 직경과 agar 홈의 직경의 차로 측정하였다. 그 결과는 표 6에 나타냈다.

Strains	E. coli K88	E. coli ATCC 25922	Salmonella typhimurium KCCM 25922	Salmonella cholerasuis KCCM 10709
락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511	++	++	++	+++
락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210	+	++	+	++
10~15 mm: +, 15~20 mm: ++, 21~25 mm: +++

상기 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511와 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210 표준 균주 모두 병원성 미생물에 대한 증식억제 작용을 나타내었지만, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511균주가 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210 표준균주에 비해 항균활성이 높은 것으로 확인되었다.

이러한 결과는 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511가 생성하는 대사산물에 의한 효과가 아닌 균체 자체에 의한 효과이기 때문에, 이를 가축에게 적용 시 유해 미생물 증식을 억제할 수 있음을 증명한다.

실험예 5: 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511( KCCM11829P )의 소화 효소 활성 평가

소화 효소 활성 실험은 탄수화물, 단백질, 인을 분해할 수 있는 효소를 가지고 있는 유산균인지 여부를 확인하기 위해 수행되었다.

프로테아제(protease)활성이 있는지 여부를 알기 위해서 MRS 한천 배지에 스킴 밀크(skim milk) 0.5(w/v)%를 첨가하였고, 셀룰라아제(cellulase) 활성이 있는지의 여부를 알기 위해서 MRS 한천배지에 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose)를 0.2(w/v)% 첨가하였으며, α-아밀라아제(α-amylase)활성이 있는지의 여부를 알기 위해서 MRS 한천배지에 옥수수 전분(corn starch) 0.2%(w/v)를 넣었으며, 파이타제(phytase) 활성을 알기 위해 파이테이트 칼슘염(Ca-phytate)을 0.5(w/v)% 첨가한 배지를 각각 제조하였다. 상기에서 제조된 각각의 배지에 분리된 균주들을 도말(streaking)한 다음, 24시간 배양한 후 관찰하였다.

α-아밀라아제와 셀룰라아제 활성은 24시간 배양한 배지에 2% 콩고 레드(congo red, Sigma, USA) 시약을 처리한 후, 1M 염화나트륨(Nacl)을 이용하여 세척(washing)한 다음, 색깔 여부에 의해 분해효소여부를 확인하였다. 또한, 프로테아제와 파이타제 활성 여부 판정은 투명환의 여부에 의해 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 기재하였다.

Strains	Protease activity	Phytase activity	Lipase activity	Cellulose activity	Amylase activity
락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511	+++	++	+	+++	+++
락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210	+	+	++	++	++
1~10 mm: +, 11~20 mm: ++, 21~30 mm: +++

상기 표 7로부터 확인할 수 있듯이, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511은 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210 표준균주에 비해 프로테아제 활성, 파이타아제 활성, 세룰로오스 분해 활성, 아밀라아제 활성 등의 소화효소 분해 활성이 높은 것으로 확인되었다.

이러한 결과는 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511를 가축에게 적용 시 사료의 효율을 개선시킬 수 있다는 것을 입증한다.

실험예 6: 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 중성지방 분해 활성 평가

락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511의 Bile salt hydrolase(이하 BSH) 활성을 조사한 결과, 2mM의 taurodeoxycholate hydrate(이하 TDCA, Sigma, USA)를 첨가한 MRS 고체배지에서 흰색침전을 생성하여 효소활성이 있음이 확인되었으며, TDCA 양성대조군 균주인 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210 표준균주의 침전과 비슷한 침전 양상을 보였다. 그러나 2mM 의 Sodium glycodeoxycholate(이하 GDCA, Sigma, USA)를 첨가한 배지에서는 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511균주의 경우 균이 잘 자랐으나, 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210 표준균주의 경우 침전을 보이지 않았으며, 균이 잘 자라지 못하였다. 그 결과를 하기 표 8에 기재하였다.

복합 담즙산/균주명	락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511	락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210
TDCA	O	O
GDCA	+	-

O: 침전 형성, X: 침전 형성하지 않음, +: 성장, -: 성장 못함

상기 표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511는 높은 답즙내성을 가지며 BSH 의 생산으로 중성지방을 분해할 수 있는 형태로 전환하여, 이를 동물에 적용 시 증체에 영향을 줄 수 있는 기능성 균주임이 확인되었다.

제조예 1

락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511와 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210 표준균주를 각각 MRS 한천 배지에 루프로 도말하고 37℃에서 48시간 배양하여 배양액을 제조하였다.

그 다음, 상기 배양액을 상기 배양액을 열교환기를 이용하여 100℃의 온도로 간접 가열하고, 이를 30~100L/min의 속도로 10℃까지 급속 냉각하였다. 급속 냉각된 배양액에서 사균체를 원심분리기(3,000 × g, 10분)를 통해 분리함으로써, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 사균체 및 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210를 사균체를 각각 제조하였다.

제조예 2

그 다음, 상기 배양액을 상기 배양액을 열교환기를 이용하여 100℃의 온도로 간접 가열하고, 이를 30~100L/min의 속도로 10℃까지 급속 냉각하였다. 급속 냉각된 배양액에서 사균체를 원심분리기(3,000 × g, 10분)를 통해 분리함으로써, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 사균체 및 락토바실러스 살리바리우스 KCCM 40210를 사균체를 각각 제조하고, 여기에 효모 추출물, 덱스트로즈 및 원당을 각각 혼합하였다. 상기 혼합물을 물속에 현탁시킨 후, 수득한 현탁액을 분무 건조하여 분말을 수득하였다. 이때, 즉 열풍의 유입구 온도는 150℃, 출구 온도는 100℃로 하여 분무 건조하였다. 보호제의 첨가량은 사균체의 중량 100 중량부를 기준으로, 효모추출물의 첨가량이 20 중량부, 덱스트로즈의 첨가량을 30중량부, 원당의 첨가량은 5 중량부로 하였다.

상기 제조예 1에서 제조된 사균체들에 대해, 소수성 및 응집성을 아래 기술된 방법으로 실험하였으며, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 사균체를 포함하는 기초사료와 이를 포함하지 않는 기초사료의 증체량 및 사료요구율을 비교하였다.

실험예 7: 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 ( KCCM11829P ) 생균과 사균의 소수성 및 응집성 평가

락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511생균과 사균의 소수성과 응집성 차이를 확인하기 위해, 자가응집반응과 동시응집반응을 평가하였다.

자가응집반응은 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511생균과 사균에 대해 OD₆₀₀이 0.5가 되도록 희석한 유산균 3mL에 1mL의 톨루엔을 첨가하여 90초 동안 vortex 하였다. 이후 37℃ water bath에서 1시간 방치한 뒤 톨루엔을 제거 후 수용액 층의 OD₆₀₀을 측정하였다.

동시응집반응은 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511생균과 사균에 대해 병원성 미생물(E. coli K88, Salmonella typhimurium KCCM 25922, Salmonella cholerasuis KCCM 10709)과 동량으로 혼합(병원성 미생물 : 생균 또는 사균 = 1:1(각1.5ml))한 3mL에 각각 1mL의 톨루엔을 첨가하여 90초 동안 vortex 하였다. 이후 37℃ water bath에서 1시간 방치한 뒤 톨루엔을 제거 후 수용액 층의 OD₆₀₀을 측정하였다.

소수성(%)은 100 x (초기 OD₆₀₀ - 1시간 OD₆₀₀)/초기 OD₆₀₀으로 계산하였다.

생균과 사균의 자가응집반응과 동시응집반응 결과는 하기 표 9에 기재하였다.

항목/병원성 균주		락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511
항목/병원성 균주		생균	사균체
자가응집반응		11%	23%
동시응집반응	E. coli K88	54%	64%
	Salmonella typhimurium KCCM 25922	45%	65%
	Salmonella cholerasuis KCCM 10709	30%	45%

상기 표 9로부터 알 수 있듯이, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 사균체의 자가응집반응과 동시응집반응 모두 생균보다 1.5배 정도 높은 것으로 나타났다. 미생물의 세포 외 소수성 및 응집성은 세포 표면 단백질의 특성이나 표면 구조에 영향을 받고, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 사균체는 도 1과 같이 표면 단백질 구조가 생균과 달라 소수성과 응집성이 증가하는 것으로 생각된다. 이로써, 내독소에 부착하여 항병력에 영향을 주는 기능성 균주로의 이용 가능성이 기대된다.

실험예 8: 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 ( KCCM11829P ) 사균체를 포함하는 사료와 일반 기초사료의 비교

이유 육계의 기초사료에 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 사균체 0.2%(w/w)를 투여한 사료와 이를 투여하지 않은 기초사료(대조군)에 대해, 통상의 사료 급이와 같이 29일간 급이하고 개시 평균 체중(g), 종료 평균 체중(g), 일당 증체량(g/d), 일당 사료 섭취량(g/d) 및 사료 요구율을 각각 측정하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

구분	대조군	락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 사균체 투여군
시험 마리수	150	150
개시 평균 체중(g)	38.48	38.47
종료 평균 체중(g)	1582.00	1690.24
일당 증체량(g/d)	53.23	56.96
일당 사료 섭취량(g/d)	78.76	79.48
사료 요구율	1.48	1.40

상기 표 10에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 사균체 투여군은 이를 투여하지 않은 대조군에 비하여 증체량 및 사료 요구율 모두 월등한 효과를 나타내었다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11829P

수탁일자 : 20160412

Claims

락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511 (Lactobacillus salivarius CJLS1511)( KCCM11829P)의 사균체.
락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 사균체를 포함하는, 동물 사료 첨가제 조성물.
삭제
제2항에 있어서, 상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 사균체가 동물 사료 첨가제 조성물 1g 당 1.0×10⁸ cfu 내지 1.0×10¹⁰ cfu로 포함되는, 동물 사료 첨가제 조성물.
제2항 또는 제4항에 있어서, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 사균체의 보호제를 추가로 포함하는, 동물 사료 첨가제 조성물.
제5항에 있어서, 상기 보호제가 효모, 효모추출물, 단당류, 다당류, 전분류, 설탕류 중 1종 이상인, 동물 사료 첨가제 조성물.
제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 동물이 육계인, 동물 사료 첨가제 조성물.
제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)의 사균체가 상기 동물 사료 첨가제 조성물의 중량 기준으로 0.1 중량% 내지 1 중량%인, 동물 사료 첨가제 조성물.
제8항에 따른 동물 사료 첨가제 조성물을 포함하는 동물 사료.
락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)를 배양하여 배양액을 제조하고,
상기 배양액을 70℃ 내지 160℃의 온도에서 가열하고,
상기 가열된 배양액을 10℃ 내지 60℃의 범위의 온도로 냉각하고,
상기 냉각된 배양액에서 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 사균체를 분리하고,
상기 분리된 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P)와 부형제를 혼합하는 것을 포함하며, 다만 상기 배양액은 동물 사료 첨가제 조성물에 포함되지 않는, 락토바실러스 살리바리우스 CJLS1511(KCCM11829P) 사균체를 포함하는 동물 사료 첨가제 조성물의 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 가열이 열교환기를 통해 간접 가열되는, 동물 사료 첨가제 조성물의 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 냉각이 10℃/min ~ 60℃/min의 속도로 냉각되는, 동물 사료 첨가제 조성물의 제조 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 분리된 사균체에 보호제를 혼합하는 것을 추가로 포함하는, 동물 사료 첨가제 조성물의 제조 방법.
제13항에 있어서, 상기 혼합된 사균체를 분말화하는 것을 추가로 포함하는, 동물 사료 첨가제 조성물의 제조 방법.
제13항에 있어서, 상기 보호제가 효모, 효모추출물, 단당류, 다당류, 전분류, 설탕류 중 1종 이상인, 동물 사료 첨가제 조성물의 제조 방법.