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KR101876725B1 - 전립선 암 환자의 혈중 순환 종양세포를 활용한 안드로겐 수용체 과발현 환자의 맞춤형 항암제 선별시스템 및 선별방법 - Google Patents

전립선 암 환자의 혈중 순환 종양세포를 활용한 안드로겐 수용체 과발현 환자의 맞춤형 항암제 선별시스템 및 선별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전립선 암 환자의 혈중 순환 종양세포(CTCs; circulating tumor cells)를 활용한 안드로겐 수용체(androgen receptor) 과발현(overexpression) 환자의 맞춤형 항암제 선별시스템 및 방법에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는 희소 세포 분리장치를 활용하여 안드로겐 수용체 과발현 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 시스템 및 방법에 관한 것이다.

Description

전립선 암 환자의 혈중 순환 종양세포를 활용한 안드로겐 수용체 과발현 환자의 맞춤형 항암제 선별시스템 및 선별방법 {The personalized anti-cancer agent screening system and process for androgen receptor overexpression patients using the circulating tumor cells derived on patients with the prostate cancer}
본 발명은 전립선 암 환자의 혈중 순환 종양세포(CTCs; circulating tumor cells)를 활용한 안드로겐 수용체(androgen receptor) 과발현(overexpression) 환자의 맞춤형 항암제 선별시스템 및 선별방법에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는 희소 세포 분리장치를 활용하여 안드로겐 수용체 과발현 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 시스템 및 방법에 관한 것이다.
전립선 암은 남성에서 발생하는 가장 흔한 암으로 서양에서는 암에 의한 남성 사망원인의 두 번째를 차지한다. 전립선 암은 전립선, 남성 생식계 내 샘(gland)에서 발달하는 암으로 혈청 전립선 특이 항원(antigen) 검사, 초음파 검사, 조직생검 등의 방법을 이용하여 진단할 수 있다. 그러나 조직생검은 전립선 암 환자로부터의 반복적인 채취가 어렵고, 한 번의 조직생검 후 일정시간의 회복기간을 필요로하기 때문에 환자에게도 육체적인 부담을 줄 뿐만 아니라 조직생검을 하기 전 다양한 검사로 인해 효율적이지 못한 문제점들이 있다. 따라서, 조직생검이 불가능한 환자 또는 반복적인 조직생검을 필요로 하는 환자를 위해 간단한 방법으로 폐암 진단을 가능하게 하는 검사 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다. 전립선 암의 통상적인 치료법은 수술, 방사선 요법, 호르몬 요법, 화학 요법, 양자선 요법(proton therapy), 또는 이들의 일부 조합이 치료에 적용될 수 있다.
대부분의 전립선 암은 안드로겐 의존형(AD; androgen-dependent)이다. 전립선 암 세포는 계속적인 증식을 하기 위해서 안드로겐을 필요로 한다. 안드로겐성 호르몬(androgenic hormones)은 DNA의 특정 부위와 상호작용하는 단백질 전사 인자인 안드로겐 수용체(AR: androgenic receptor)만을 경유해서 작용한다. 안드로겐 차단 요법(androgen suppression therapy)을 통한 테스토스테론의 외과적(고환 절제술) 또는 내과적(GnRH 작용제 또는 에스트로겐) 제거 시, 이에 대한 반응으로 전립선 암 세포의 급속한 세포 자살인 아폽토시스(apoptosis)가 유도된다. 양성 반응률은 전립선 특이 항원의 감소, 및 종양 체적의 안정화 또는 감소를 기준으로 약 86%이며, 양성 반응 이후에 남아있는 세포는 사멸하지 않는 경향을 보이는 증식 정지 기간이 진행된다. 안드로겐 호르몬을 차단한 지 18-36개월 이후 90%에서 전립선 암 증식이 재발하게 되며, 이 전립선 암 세포는 일관되게 안드로겐 비의존형(AI, androgen-independent) 또는 무반응형이 되고, 안드로겐-비의존적인 종양 증식이 뒤이어 이루어진다.
클러스테린(clusterin), 커스터센(Custirsen) 등 다수의 단백질이 안드로겐 제거를 수반하는 전립선 종양 세포에 의해 증가된 양으로 발현되는 것이 관찰되었다. 이들 단백질의 적어도 일부는 안드로겐 제거 시 관찰되는 아폽토시스 세포 사멸과 관련되는 것으로 추정된다. 그러나, 많은 단백질의 기능이 완전히 알려져 있지 않다. 클러스테린(황산화 당단백-2(SGP-2) 또는 TRPM-2로서도 알려짐)은 이 후자의 범주 내이다.
안드로겐 수용체 길항제(antagonist)는 안드로겐-안드로겐 수용체 결합, 안드로겐 수용체 전사 활성, 또는 세포질로부터 핵으로의 전좌(translocation) 등과 같은 안드로겐 수용체의 세포 수송을 비롯하여 안드로겐 수용체의 기능을 교란 혹은 감소시킴으로써 전립선 암 세포의 자극을 저감시킨다.
이와 관련하여 국제특허 제 2014052237호 (발명의 명칭: 비전이성 거세 저항성 전립선암 치료용 항안드로겐, 이하 종래기술 1이라고 한다.)는 4-[7-(6-시아노-5-트라이플루오로메틸피리딘-3-일)-8-옥소-6-티옥소-5,7-다이아자스피로[3.4]옥트-5-일]-2-플루오로-N-메틸벤즈아미드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 항안드로겐을 사용한 비전이성 거세 저항성 전립선 암의 치료 방법을 개시하고 있다.
상기 종래기술 1은 4-[7-(6-시아노-5-트라이플루오로메틸피리딘-3-일)-8-옥소-6-티옥소-5,7-다이아자스피로[3.4]옥트-5-일]-2-플루오로-N-메틸벤즈아미드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 항 안드로겐을 사용한 비전이성 거세 저항성 전립선 암의 치료 방법을 개시하고 있으나, 전립선 암 환자의 순환 종양세포를 활용하여 안드로겐 수용체 과발현 환자의 맞춤형 항암제 선별방법은 개시되어 있지 않다.
따라서 종래기술의 문제점을 해소하고자 안출된 본 발명은 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩을 활용하여 안드로겐 수용체 과발현 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하여 단기배양한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤 항암제를 선별하는 시스템 및 방법에 관한 기술을 제공하고자 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 희소 세포 분리장치를 활용하여 안드로겐 수용체 과발현 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리한 후, 항암제 반응 검사를 통하여 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별하는 시스템 및 방법에 관한 기술을 제공한다.
본 발명의 실시예에 있어서, 안드로겐 수용체(androgen receptor) 과발현(overexpression) 환자의 맞춤형 항암제 선별방법은 i) 안드로겐 수용체(androgen receptor) 과발현(overexpression) 환자의 혈액을 추출하는 단계, ii) 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포(CTC circulating tumor cells)를 분리하는 단계, iii) 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계, iv) 단기 배양된 혈중 순환 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계, v) 후보 항암제 반응을 분석하는 단계 및 vi) 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인별 맞춤형 항암제를 선별하는 단계일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 (iii) 단계에서의 단기 배양 기간은 7일 내지 14일일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 (iv) 단계에서의 후보 항암제는 암의 유전적 정보를 이용하여 선별되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 암의 유전적 정보는 암 특이적 SNP 분석결과, 암 특이적 일배체형(haplotype) 분석결과, 암 특이적 돌연변이 분석결과 및 암 특이적 유전자 마커(marker) 분석결과에서 선택된 하나 이상의 유전적 정보인 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 상기 (v) 단계는 (v-1) 혈중 순환 종양세포의 유전정보와 후보 항암제 반응정보를 분석하는 단계, (v-2) 상기 (v-1) 단계에서의 정보를 활용하여 정보 클러스터를 구축하는 단계, (v-3) 정보 클러스터를 데이터 마이닝 하는 단계 및 (v-4) 데이터 마이닝한 정보를 기초로 개인별 반응효과에 대한 알고리즘을 구축하는 단계일 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 실시예는 맞춤형 항암제 선별 시스템으로서, 안드로겐 수용체(androgen receptor) 과발현(overexpression) 환자의 혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하는 분리장치, 분리된 혈중 순환 종양세포를 배양하는 배양장치, 배양된 혈중 순환 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 반응검사 장치, 반응검사 장치의 검사결과를 분석하는 분석장치 및 분석장치에 의해 분석된 결과에 따라 맞춤형 항암제를 선별하는 선별장치일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 분석장치는 정량적 중합효소 연쇄반응 기기(q-PCR machine), 플레이트 리더기(plate reader), 멀티플렉스 리더기(multiplex reader) 및 공초점 현미경(confocal microscope) 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 분리장치는 혈중 순환 종양세포를 선택적으로 분리하는 기능을 가지는 사이즈 선택성 칩(chip)을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 사이즈 선택성 칩은 혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포를 주입하는 주입구, 말초혈액 단핵세포를 수송하는 제 1 도관, 제 1 도관의 내측에 장착되어 있고, 복수의 기공(pore)을 갖는 여과 망, 말초혈액 단핵세포 중 여과 망을 통과하여 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포가 배출되는 제 2 도관 및 제 2 도관을 통과한 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포를 수집하는 실린더를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 복수의 기공의 각각의 모양은 다각형 또는 원형 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 실시예에 있어서, 복수의 기공의 각각의 사이즈는 5.5 내지 8.5μm일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩을 활용하여 전립선 암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리한다는 제 1효과, 기존 조직생검에서 활용되지 못하거나 시행하지 못하였던 반복적이고 비침습적인 방법으로 개인 맞춤형 항암제 반응 검사를 가능하게 한다는 제 2효과, 기존 조직생검을 위해 요구되었던 다양한 검사 및 시술을 대체함으로써 비용절감 뿐만 아니라 환자의 몸 상태에 대한 부담을 덜어준다는 제 3효과, 내성을 가지는 전립선 암 환자에게 다양한 후보 항암제 중에서 최적의 개인 맞춤형 항암제를 선별함으로써 민감도 및 특이도를 향상시켜 전립선 암 치료율을 증가시킨다는 제 4효과, 체내에 선별 항암제 투여 시 치료반응을 모니터링 할 수 있으며, 치료 시 수반되는 시행착오와 위험성을 감소시킬 수 있다는 제 5효과, 전립선 암에 특이적인 항암제 반응 시 혈중 순환 종양세포의 강도를 통하여 항암제 반응 분석에 응용이 가능하다는 제 6효과를 갖는다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 안드로겐 수용체 과발현 환자를 위한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 보여주는 도면이다.
도 2는 안드로겐 수용체 과발현 환자의 유전정보를 이용한 개인 맞춤형 항암제를 선별방법을 보여주는 도면이다.
도 3은 맞춤형 항암제 선별 시스템을 보여주는 도면이다.
도 4는 맞춤형 항암제 선별 시스템의 분리장치 중 사이즈 선택성 칩을 나타낸 도면이다.
이하에서는 화학식, 반응식, 구체적인 실시예 및 실험예를 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결 (접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 실시예에서 안드로겐 수용체(androgen receptor) 과발현(overexpression) 환자의 맞춤형 항암제 선별방법은 i) 안드로겐 수용체(androgen receptor) 과발현(overexpression) 환자의 혈액을 추출하는 단계, ii) 상기 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포(CTC circulating tumor cells)를 분리하는 단계, iii) 상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계, iv) 상기 단기 배양된 혈중 순환 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계, v) 상기 후보 항암제 반응을 분석하는 단계 및 vi) 상기 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인별 맞춤형 항암제를 선별하는 단계일 수 있다.
도 1은 안드로겐 수용체 과발현 환자를 위한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 보여주는 도면이다. 도 1을 참조하여 보면, 맞춤형 항암제 선별을 하기 위해 우선, 암 환자로부터 혈액을 추출하는 단계(S10)를 실시한다. 채혈을 이용하여 질병을 진단하는 방법은 반복적이고 비침습적인 방법으로 조직생검 보다 간편하며, 기존 조직생검을 위해 요구되었던 다양한 검사 및 시술을 대체함으로써 비용절감뿐만 아니라 환자의 몸 상태에 대한 부담을 덜어준다는 시간적, 경제적 이점이 있다. 또한 채혈은 주사기 등을 이용하여 팔 또는 손등 등 채혈이 가능한 부위에서 정맥이 짚이는 부분(주정증피정맥, 요추피정맥, 척추피정맥 등)에 쉽게 채혈이 가능하므로, 1일 내지 30일 혹은 채혈한 당일에도 반복적인 채혈이 가능하다. 반복적이고 비침습적인 채혈은 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하는 과정이나 배양하는 과정에서 후보 항암제 반응검사를 실시하기에 충분한 개수의 혈중 순환 종양세포를 획득하지 못한 경우나 선별된 후보 항암제의 효과가 예상보다 좋지 않은 경우, 신속하게 다음 채혈을 통해 혈중 순환 종양세포를 획득하여 빠른 시간 내에 반복적인 후보 항암제 반응검사를 실시할 수 있는 이점이 있다.
혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하는 단계(S11)는 일정한 비중을 가지는 피콜(ficoll) 용액을 사용하는데, 이 피콜 용액은 부유 밀도 구배 원심분리 방법에 의해 혈액으로부터 적혈구(RBC; red blood cell)와 백혈구(WBC; white blood cell)가 제거된 말초혈액 단핵세포를 분리한다. 상기 말초혈액 단핵세포 중 혈중 순환 종양세포만을 선택적으로 분리하는 기능을 가지는 사이즈 선택성 칩을 활용하여 혈중 순환 종양세포를 분리할 수 있다.
또한, 피콜 용액을 사용하여 말초혈액 단핵세포를 분리하기 전, 전처리 과정을 수행할 수 있다. 전처리 방법의 일 예로서, (a) 혈액에 백혈구의 항체를 넣어 백혈구를 제거하는 단계, 또는 (b) 혈액의 적혈구를 용해하는 단계일 수 있으나, 이 전처리 과정은 생략할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 (iii) 단계에서의 단기 배양 기간은 7일 내지 14일일 수 있다. 혈액으로부터 분리된 혈중 순환 종양세포는 혈액 내 극소수의 종양세포를 획득한 것으로서, 종양세포를 단기 배양하는 단계(S12)를 거쳐 짧은 시간 내에 후보 항암제와의 반응검사를 실시할 수 있을 다량의 종양세포를 확보해야 한다. 종양세포를 단기 배양하는 기간은 7일 내지 14일이 적합할 수 있으나, 혈중 순환 종양세포는 암의 종류에 따라 증식속도가 다르고, 환자의 암 진행 정도와 환자의 상태에 따라 환자 혈액으로부터 획득할 수 있는 혈중 순환 종양세포의 개수가 다르기 때문에, 단기 배양기간을 7일 내지 14일로 제한하는 것은 아님을 명시한다. 나아가, 일반적으로 항암제 치료를 받는 경우 환자가 항암제를 처음 투약한 후 3주 정도를 항암치료의 일반적인 주기로 보는데, 이는 항암제의 독성이 커서 연속적으로 치료할 수 없기 때문이다. 따라서, 본 발명에 따른 선별방법에 따른 항암제가 환자에게 적합하지 않으면 1차 항암치료를 한 이후 2차 항암치료를 준비할 수 있도록, 배양 기간을 더 길게 설정할 수도 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 (iv) 단계에서의 후보 항암제는 암의 유전적 정보를 이용하여 선별되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 암의 유전적 정보는 암 특이적 SNP 분석결과, 암 특이적 일배체형(haplotype) 분석결과, 암 특이적 돌연변이 분석결과 및 암 특이적 유전자 마커 분석결과에서 선택된 하나 이상의 유전적 정보인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
암 환자의 정보는 유전적 정보 또는 임상정보가 될 수 있다. 암 환자의 정보로서 암의 유전형을 분석하여 수득한 SNP, 돌연변이, 일배체형, 전장 염기서열 등의 유전적 정보를 사용할 경우, 유전적 정보를 약물반응 데이터 베이스에 적용하여 유전적 정보에 상응하는 후보 항암제를 도출하는 방식으로 수행될 수 있다. 또한, 암의 유전적 정보를 수득하지 않고서 환자의 임상정보만을 사용할 경우에도 후보 항암제를 도출할 수 있는데, 구체적으로는 암의 발생부위, 암 특이적 유전자 마커 분석 결과, 전이 관련 정보, 환자의 증상정보 등의 임상정보를 암의 임상정보와 유전적 정보를 포함하는 데이터 베이스에 적용하여, 후보 항암제를 도출하는 방식으로 수행될 수 있다.
혈중 순환 종양세포의 단기 배양 후, 환자의 유전적 정보를 고려한 후보 항암제 군을 선별하고, 상기 후보 항암제군을 환자의 혈중 순환 종양세포와 반응시키는 단계(S13)를 수행한다. 이후, 후보 항암제 군의 반응결과를 분석하면서 항암 활성 효과 및 부작용 등 후보 항암제의 반응 분석 단계(S14)를 수행한다. 후보 항암제 반응검사의 결과를 토대로 후보 항암제를 비교 분석하여 개인 맞춤형 항암제 선별 단계(S15)를 수행한다. 개인 맞춤형 항암제란, 맞춤의학(tailored medicine)을 이용하여 결정되어 암이 발병한 개체에게 특이적으로 최적의 치료효과를 나타낼 수 있는 의약 조성물을 의미한다. 맞춤의학(tailored medicine)이란 맞춤의료(order-made medicine) 또는 환자 맞춤형 의학(personalized medicine)이라고도 하며, 환자 개인의 체질이나 환경을 개별적으로 조사하여, 여기에 적합한 치료법을 결정하는 방법 또는 치료하는 방법을 의미한다.
본 발명의 실시예에서 상기 (v) 단계는 (v-1) 상기 혈중 순환 종양세포의 유전정보와 상기 후보 항암제 반응정보를 분석하는 단계, (v-2) 상기 (v-1) 단계에서의 정보를 활용하여 정보 클러스터를 구축하는 단계, (v-3) 상기 정보 클러스터를 데이터 마이닝 하는 단계 및 (v-4) 상기 데이터 마이닝한 정보를 기초로 개인별 반응효과에 대한 알고리즘을 구축하는 단계일 수 있다.
도 2는 안드로겐 수용체 과발현 환자의 유전정보를 이용한 개인 맞춤형 항암제 선별방법을 보여주는 도면이다. 도 2를 참조하여 보면, 상기 분석단계는 혈중 순환 종양세포의 유전정보 분석 단계(S20) 및 혈중 순환 종양세포와 후보 항암제 간의 반응 분석하는 단계(S21)를 포함한다. 상기 정보들을 취합하여 정보 클러스터 구축 단계(S22) 및 상기 정보클러스터를 이용하여 데이터 마이닝(data mining) 단계(S23)를 수행한다. 데이터 마이닝이란 취합한 환자의 유전정보 및 혈중 순환 종양세포와 후보 항암제 간의 무수한 정보 가운데 숨겨져 있는 유용한 상관관계를 발견하여, 실행 가능한 정보를 추출하고 선별 결정에 이용하는 과정을 의미한다. 상기 상관관계를 발견하는 과정에서 혈중 순환 종양세포와 후보 항암제 간의 반응 효과에 따른 알고리즘 구축 단계(S24)를 수행할 수 있다. 본 발명에서의 알고리즘은 환자의 유전정보에 맞는 항암제를 선별하기 위하여 후보 항암제 중에 가장 적합한 항암제를 발견하기 위해 거치는 일련의 순서화된 절차를 의미한다.
개인 맞춤형 항암제 선별방법으로 도출된 결과 데이터를 축적하고, 축적된 데이터를 이용하면 암의 유전적 정보 데이터 및 환자의 임상정보 데이터의 상관관계를 분석할 수 있고, 상기 분석결과를 이용하여 이들 데이터 간의 연관성을 예측하는 알고리즘을 구축할 수 있다. 구축된 알고리즘은 개인 맞춤형 항암제 선별방법에 사용된 데이터와 상기 방법으로부터 도출된 데이터를 연계시킬 수 있으므로, 도축된 알고리즘을 이용하면 보다 용이하게 개인 맞춤형 항암제를 선별할 수 있다. 암의 유전적 정보, 환자의 임상정보 및 환자 맞춤형 항암제 정보 데이터 사이의 상관관계를 분석하여 구축된 알고리즘은 in vitro 및 in vivo 조건에서 추가적인 실험 없이 암의 유전적 정보 데이터 및 환자의 임상정보 데이터로부터 개인 맞춤형 항암제를 선별하는데 사용될 수 있으며, 알고리즘에 환자 데이터를 추가하여 갱신함으로써 개인 맞춤형 항암제 선별 성공률을 향상시킬 수 있다.
도 3은 맞춤형 항암제 선별 시스템을 보여주는 도면이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 실시예는 맞춤형 항암제 선별 시스템(200)으로서, 안드로겐 수용체 과발현 환자의 혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하는 분리장치(210), 상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 배양하는 배양장치(220), 상기 배양된 혈중 순환 종양세포에 상기 후보 항암제를 반응시키는 반응검사 장치(230), 상기 반응검사 장치의 검사결과를 분석하는 분석장치(240) 및 상기 분석장치에 의해 분석된 결과에 따라 맞춤형 항암제를 선별하는 선별장치(250)일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 분석장치는 정량적 중합효소 연쇄반응 기기(q-PCR machine), 플레이트 리더기(plate reader), 멀티플렉스 리더기(multiplex reader) 및 공초점 현미경(confocal microscope) 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다. 정량적 중합효소 연쇄반응 기기란 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 이용한 것으로 DNA 또는 RNA를 시간에 따라 모니터링하는 기기이다. 플레이트 리더기 및 멀티플렉스 리더기는 세포 수준의 반응을 미량으로 실행하고, 상기 변화를 감지하여 분석하는 기기이다. 공초점 현미경은 바늘구멍 조리개를 통해 여러 단면에 초점을 맞추는 현미경으로, 세포를 깊이감 있는 3차원 구조로 관찰할 수 있는 기기이다.
본 발명의 실시예에서 상기 분리장치는 혈중 순환 종양세포를 선택적으로 분리하는 기능을 가지는 사이즈 선택성 칩(chip)을 포함하는 것일 수 있다. 사이즈 선택성 칩은 혈액 세포의 크기 차이를 기반으로 하며 10분 이내에 약 90%의 회수율로 순환 종양세포를 포착할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 상기 사이즈 선택성 칩은 혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포를 주입하는 주입구, 상기 말초혈액 단핵세포를 수송하는 제 1 도관, 상기 제 1 도관의 내측에 장착되어 있고, 복수의 기공(pore)을 갖는 여과 망, 상기 말초혈액 단핵세포 중 상기 여과 망을 통과하여 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포가 배출되는 제 2 도관 및 상기 제 2 도관을 통과한 상기 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포를 수집하는 실린더를 포함하는 것일 수 있다.
도 4는 맞춤형 항암제 선별 시스템의 분리장치 중 사이즈 선택성 칩을 나타낸 도면이다. 도 4를 참조하여 보면, 혈액으로부터 분리한 말초혈액 단핵세포는 사이즈 선택성 칩의 주입구(211)로 주입되며, 제 1 도관(212)를 통해서 여과 망(213)까지 수송된다. 여과망(214)은 복수의 기공을 가지고 있는 얇은 그물로, 기공의 모양은 다각형 또는 원형이며, 기공의 크기는 5.5 내지 8.5μm일 수 있다. 말초혈액 단핵세포 중 혈중 순환 종양세포의 크기는 기공의 크기보다 크기 때문에 여과 망을 통과하지 못하고, 혈중 순환 종양세포 보다 크기가 작은 다른 세포들은 여과망 아래로 통과하여 제 2 도관(214)을 따라 실린더(215)로 모아져 폐기된다. 따라서 혈중 순환 종양세포는 여과망을 통과하지 않은 세포를 회수하여 사용한다.
본 발명의 실시예에서 상기 복수의 기공의 각각의 모양은 다각형 또는 원형 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
본 발명의 실시예에서 상기 복수의 기공의 각각의 사이즈는 5.5 내지 8.5μm일 수 있다. 기공의 크기가 5.5μm 보다 작을 경우 백혈구와 적혈구가 칩을 통과하지 못해 칩 상에 걸리게 되어 제거되지 못하고, 기공의 크기가 8.5μm 보다 클 경우에는 기공의 크기가 암 세포의 크기보다 커서 암세포가 칩을 통과하여 암세포를 선택적으로 회수할 수 없게 된다.
이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 기재한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아님을 명시한다.
[ 실시예 1]
사이즈 선택성을 가지는 칩 제작 단계
실험에서 사용되는 사이즈 선택성을 가지는 칩은 기공의 크기(pore-size)가 6.5μm로 형성되어 있어, 6.5μm 보다 작은 크기의 백혈구(WBC; white blood cell) 및 적혈구(RBC; red blood cell)는 칩을 통과시켜 제거하고, 6.5μm 보다 큰 사이즈의 암 세포는 칩 상에 걸리게 만들어 특정 사이즈를 선택적으로 회수할 수 있도록 고안한 마이크로 칩이다.
참고로, 사이즈 선택성을 가지는 칩의 세포 회수율을 확인하기 위해, 암 환자의 암세포를 10개, 100개, 1000개로 스파이킹(spiking)하여, 이를 칩으로 통과시켜 칩 상의 암세포의 회수율을 보는 실험을 수행하였다. 이의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
시료 스파이킹 세포 수 회수 된 세포 수 세포 회수율(%)
1 10 9 90
2 100 86 86
3 1000 850 85
칩의 세포 회수율을 계산한 결과, 약 80% 이상의 높은 세포 회수율을 보였으며, 회수된 세포들이 암세포 임을 다시 한번 확인하기 위해, 기존에 암 검정에서 사용되고 있는 CK(cytokeratin) 항체를 염색하여 확인한 결과, 모두 CK 양성으로 암 세포임을 확인하였다.
[ 실시예 2]
혈중 순환 종양세포 준비 단계
<폐암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포의 분리 방법>
1. 폐암 환자의 말초혈액을 추출하여 혈액 추출용 ACDA(acid citrate dextrose solution 'A') 튜브에 담는다.
2. 말초혈액과 동일 볼륨의 피콜(ficoll) 용액을 새로운 튜브에 담고, PBS(phosphate buffered saline, 인산완충식염수)로 희석시킨 말초혈액을 피콜 용액 층 위로 조심스럽게 옮긴다.
3. 400xg의 스피드로 상온에서 30분간 원심분리 한다.
4. 원심분리 후, 형성된 말초혈액 단핵세포 층을 새로운 튜브로 옮겨 담고, 제 3 버퍼(buffer)를 이용해 희석시킨다.
5. 사이즈 선택성을 가지는 칩을 고정대에 고정시킨 후, 제 4 버퍼를 이용하여 칩을 미리 적셔 놓는다.
6. 위 실험방법 5에서, 제 3 버퍼로 희석된 말초혈액 단핵세포를 칩으로 통과시킨다.
7. 세포의 회수율을 높이기 위해, 튜브에 남아있는 세포들을 제 3 버퍼로 헹군 후, 칩으로 통과시키는 과정을 반복 수행한다.
8. 칩으로부터 세포를 회수한다.
<혈중 순환 종양세포의 단기배양 방법>
회수한 칩에서 혈중 순환 종양세포를 분리한 후, 자동화 배양장치 TLI를 이용하여 2주간의 단기배양을 수행한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
200 : 개인 맞춤형 항암제 선별 시스템
210 : 분리장치
211 : 주입구
212: 제1도관
213 : 여과 망
214 : 제2도관
215 : 실린더
220 : 배양장치
230 : 반응검사 장치
240 : 분석장치
250 : 선별장치

Claims (11)

  1. i) 안드로겐 수용체(androgen receptor) 과발현(overexpression) 환자의 혈액을 준비하는 단계;
    ii) 상기 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포(CTC circulating tumor cells)를 분리하는 단계;
    iii) 상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계;
    iv) 상기 단기 배양된 혈중 순환 종양세포에 후보 항암제를 반응시키는 단계;
    v) 상기 후보 항암제 반응을 분석하는 단계; 및
    vi) 상기 분석된 후보 항암제 반응 정보를 활용하여 개인별 맞춤형 항암제를 선별하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 (iii) 단계에서의 단기 배양 기간은 7일 내지 14일인 것을 특징으로 하며,
    상기 (iv) 단계에서의 후보 항암제는 암의 유전적 정보를 이용하여 선별되는 것을 특징으로 하고,
    상기 암의 유전적 정보는 암 특이적 SNP 분석결과, 암 특이적 일배체형(haplotype) 분석결과, 암 특이적 돌연변이 분석결과 및 암 특이적 유전자 마커 분석결과에서 선택된 하나 이상의 유전적 정보인 것을 특징으로 하고,
    상기 (v) 단계는,
    (v-1) 상기 혈중 순환 종양세포의 유전정보와 상기 후보 항암제 반응정보를 분석하는 단계;
    (v-2) 상기 (v-1) 단계에서의 정보를 활용하여 정보 클러스터를 구축하는 단계;
    (v-3) 상기 정보 클러스터를 데이터 마이닝 하는 단계; 및
    (v-4) 상기 데이터 마이닝한 정보를 기초로 개인별 반응효과에 대한 알고리즘을 구축하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 i) 단계이후 및 상기 ii) 단계 이전에, 전처리 단계로서 a) 혈액에 백혈구의 항체를 넣어 백혈구는 제거하는 단계; 및 b) 혈액의 적혈구를 용해하는 단계를 추가로 포함하며,
    상기 ii)단계는 사이즈 선택성 칩(chip)을 이용하여 혈중 순환 종양세포를 분리하는 것을 포함하고,
    상기 사이즈 선택성 칩은,
    혈액으로부터 분리된 말초혈액 단핵세포를 주입하는 주입구,
    상기 말초혈액 단핵세포를 수송하는 제 1 도관,
    상기 제 1 도관의 내측에 장착되어 있고, 복수의 기공(pore)을 갖는 여과 망,
    상기 말초혈액 단핵세포 중 상기 여과 망을 통과하여 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포가 배출되는 제 2 도관, 및
    상기 제 2 도관을 통과한 상기 혈중 순환 종양세포를 제외한 세포를 수집하는 실린더를 포함하며,
    상기 복수의 기공의 각각의 모양은 다각형 또는 원형 중 어느 하나인 것을 특징으로 하고,
    상기 복수의 기공의 각각의 사이즈는 6.5μm인 것을 특징으로 하며,
    상기 사이즈 선택성 칩은 10분이내에 세포회수율이 90%인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 전립선 암 환자의 혈중 순환 종양세포를 활용한 안드로겐 수용체 과발현 환자의 맞춤형 항암제 선별방법.
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Science, Vol. 345, Issue 6193, Pages 216-220(공개일: 2014. 7. 11.) *
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