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KR101865899B1 - 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 진단키트 - Google Patents

결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 진단키트 Download PDF

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KR101865899B1
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Abstract

본 발명은 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 키트 및 검출 방법을 제공한다. 상기 키트 및 방법은 결핵균 및 비결핵균의 15 copies, 다제내성결핵균의 150 copies까지 검출할 수 있는 우수한 민감도를 갖으며, 유전자 증폭 장비의 호환이 가능하다. 또한, 한번의 PCR 반응으로 다양한 병원성 MTC 와 NTM 의 유전자를 동시에 검출 할 수 있으며, UDG (Uracil DNA Glycosilase) system을 도입하여 이전 PCR 산물에 의한 Carryover 또는 crossover contamination을 차단하여 교차오염을 최소화하였다.

Description

결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 진단키트{Diagnostic Kit for Simultaneously Detecting Mycobacterium complex, Non-tuberculosis Mycobacteria and Multidrug-resistant Tuberculosis}
본 발명은 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 진단키트에 관한 것이다.
결핵(TB, tuberculosis)은 전 세계적으로 거의 8백만 사례가 발생하는 질병으로, 해마다 2백만 명이 결핵으로 사망하는 치명적인 전염성 감염질환이다. 결핵의 원인균으로 잘 알려진 Mycobacterium tuberculosis complex(MTC)는 공기를 통해 감염되는 경우가 많아 폐 등의 호흡기관에서의 증상 발현이 많지만, 중추신경(수막염), 임파조직 혈류(속립결핵), 비뇨생식기, 뼈, 관절 등에도 감염하여 증상을 나타내는 전신 감염질환이다. 감염된 결핵균은 다양한 인체기관 세포내에 기생하며, 면역 시스템은 이를 숙주세포와 함께 공격함으로써 광범위한 인체 조직을 파괴/손상시키므로 방치하면 위중한 상태가 되어 사망에 이르기도 한다. 결핵균은 분열속도가 느려 약물처리를 해도 내성균 발생이 빈번하며, Non-tuberculosis mycobacteria(NTM; 비정형 결핵균)은 항결핵제의 내성이 있는 경우가 많아 항결핵제에 의한 치료효과가 떨어지므로, 결핵성 증상의 진단 처방시 감염 원인균의 정확한 동정이 매우 중요하다. 하지만, 기존의 항산성균(AFB; acid fastbacillus)의 염색법과 배양검사 균배양법은 검출 속도가 매우 느리고 정확한 감염균 감별이 어려운 실정으로, 검출 민감도와 특이도가 높으며 단시간 내에 정확한 결핵균 검출법 개발이 절실히 요구되고 있다.
핵산을 증폭하는 기술 중 하나인 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR법)을 이용한 분자진단법은 신속하면서 민감도가 높아 다양한 분자진단 제품개발을 위해 사용되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Schwaber MJ, Carmeli Y. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae: a potential threat. JAMA 2008;300:2911-3. CDC, Healthcare Infection 대조군 Practices Advisory Committee. Management of multidrug-resistant organisms in healthcare settings, 2006. Atlanta, GA: US Department of Health and Human Services, CDC, Healthcare Infection 대조군 Practices Advisory Committee; 2007. Srinivasan A, Patel JB. Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing organisms: an ounce of prevention really is worth a pound of cure. Infect 대조군 Hosp Epidemiol 2008;29:1107-9. Patel G, Huprikar S, Factor SH, Jenkins SG, Calfee DP. Outcomes of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infection and the impact of antimicrobial and adjunctive therapies. Infect 대조군 Hosp Epidemiol 2008;29:1099-106. Samra Z, Ofir O, Lishtzinsky Y, Madar-Shapiro L, Bishara J. Outbreak of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae producing KPC-3 in a tertiary medical centre in Israel. Int J Antimicrob Agents 2007;30:525-9. Calfee D, Jenkins SG. Use of active surveillance cultures to detect asymptomatic colonization with carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in intensive care unit patients. Infect 대조군 Hosp Epidemiol 2008;29:966-8. Yoo JS. Laboratory surveillance of Carbapenem resistants Enterobacteriaceae in Korea. Public health weekly reports KCDC. 2011;4(44) Walsh TR, Weeks J, Livermore DM, Toleman MA. Dissemination of NDM-1 양성 bacteria in the New Delhi environment and its implications for human health: an environmental point prevalence study. Lancet Infect Dis. 2011 11(5):355-62. Yoo js, Byeon J, Yang J, Yoo JI, Chung GT, Lee YS. High prevalence of extended-spectrum beta-lactamase and 플라스미드-mediated beta-lactamases in Enterobacteriaceae isolated from long-term care facilities in Korea. Diagn Microbiol Infect Dis. 2010;67(3):261-5. Rolain JM, Parola P and Cornaglia G. New Delhi Metallo bera-lactamase (NDM-1): towards a new pandemic Clin Microbiol Infect 2010; 16(12):1699-1701. 항결핵제의 혈중 약물 농도 측정법 개발 및 임상적 적용, 질병관리본부, 20 page.
본 발명자들은 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균을 동시에 검출할 수 있는 진단키트를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 신속하면서 민감도가 높은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 이용하여 한번의 PCR 반응으로 다양한 병원성 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균을 동시에 검출할 수 있는 진단키트를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균의 동시 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균의 동시 검출 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex) 검출용 세트;
(b) 서열목록 제4서열 내지 제8서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 및 제9서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열목록 제10열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 비결핵균(Non-tuberculosis mycobacteria) 검출용 세트;
(c) 서열목록 제11서열 및 제12서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제17서열 내지 제28서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 리팜피신(rifampicin) 내성 결핵균 검출용 세트;
(d) 서열목록 제13서열 및 제14서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제29서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 세트; 또는 서열목록 제15서열 및 제16서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제30서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 세트를 포함하는 이소니아지드(isoniazid) 내성 결핵균 검출용 세트; 및
(e) 서열목록 제31서열 및 제32서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제33서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 대조군 검출용 세트를 포함하는 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명자들은 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균을 동시에 검출할 수 있는 진단키트를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 신속하면서 민감도가 높은 중합효소연쇄반응을 이용하여 한번의 PCR 반응으로 다양한 병원성 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균을 동시에 검출할 수 있는 진단키트를 개발하였다.
본 발명은 중합효소연쇄반응을 이용하여 객체로부터 분리한 시료 내 병원성 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균의 존재 유무를 검출할 수 있는 진단 키트이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 결핵균은 마이코박테리엄 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리엄 보비스(M. bovis), 마이코박테리엄 아프리카넘(M. africanum), 마이코박테리엄 카네티(M. canetti), 마이코박테리엄 카프래(M. caprae), 마이코박테리엄 미크로티(M. microti), 마이코박테리엄 멍지(M. mungi), 마이코박테리엄 오리기스(M. orygis), 마이코박테리엄 피니페딜(M. pinnipedil) 및 마이코박테리엄 수리카태(M. suricattae)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 결핵균이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 결핵균은 마이코박테리엄 튜버큘로시스이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비결핵균은 마이코박테리엄 아비엄(M. avium), 마이코박테리엄 인트라셀룰라레(M. intracellulare), 마이코박테리엄 아브스세서스(M. abscessus), 마이코박테리엄 포튜이텀(M. fortuitum), 마이코박테리엄 첼로내(M. chelonae), 마이코박테리엄 칸사시(M. kansasii), 마이코박테리엄 고르도내(M. gordonae), 마이코박테리엄 스줄가이(M. szulgai), 마이코박테리엄 셀라텀(M. celatum), 마이코박테리엄 마리넘(M. marinum), 마이코박테리엄 논크로모제니쿰(M. nonchromogenicum), 마이코박테리엄 페레그리넘(M. peregrinum), 마이코박테리엄 테래(M. terrae), 마이코박테리엄 뮤코제니쿰(M. mucogenicum), 마이코박테리엄 스크로풀라슘(M. scrofulaceum), 마이코박테리엄 심모이데이(M. shimoidei), 마이코박테리엄 셉티컴(M. septicum), 마이코박테리엄 울세란스(M. ulcerans), 마이코박테리엄 제노피(M. xenopi), 마이코박테리엄 말모엔스(M. malmoense), 마이코박테리엄 해모피럼(M. haemophilum) 및 마이코박테리엄 제나벤스(M. genavense)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비결핵균이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 비결핵균은 마이코박테리엄 아비엄, 마이코박테리엄 아브스세서스, 마이코박테리엄 인트라셀룰라레, 마이코박테리엄 칸사시, 마이코박테리엄 고르도내, 마이코박테리엄 마리넘, 마이코박테리엄 첼로내, 마이코박테리엄 포튜이텀, 마이코박테리엄 스줄가이, 마이코박테리엄 테래, 마이코박테리엄 셀라텀, 마이코박테리엄 뮤코제니쿰, 마이코박테리음 스크로풀라슘, 마이코박테리엄 논크로모제니쿰, 마이코박테리엄 페레그리넘 또는 마이코박ㅌ리엄 심모이데이이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 다제내성결핵균은 리팜피신 내성 결핵균 또는 이소니아지드 내성 결핵균이다.
상기 리팜피신 내성 결핵균은 마이코박테리엄 튜버큘로시스의 RpoB 유전자의 돌연변이 균주이다. 구체적으로, 상기 RpoB 유전자의 아미노산 서열 중 아미노산 치환위치 및 치환되는 아미노산이 L511P, Q513L, Q513P, D516V, D516Y, S522L, H526D, H526Y, H526L, H526R, S531L, S531W 또는 L533P인 결핵균이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 리팜피신 내성 결핵균은 아미노산 서열 중 아미노산 치환위치 및 치환되는 아미노산이 L511P, D516V, D516Y, H526Y, S531L 또는 L533P인 결핵균이다.
상기 이소니아지드 내성 결핵균은 마이코박테리엄 튜버큘로시스의 KatG 또는 InhA 유전자의 돌연변이 균주이다. 구체적으로, 상기 KatG 유전자의 아미노산 서열 중 315번째 세린(serine)이 유전암호(genetic code) ACC 또는 ACA의 트레오닌(threonine)으로 치환되거나, 상기 InhA의 InhA 프로모터의 -15 위치의 시토신(cytosine)이 티민(thymine)으로 치환된 결핵균이다.
본 발명의 결핵균, 비결핵균 및 다재내성결핵균 동시 검출용 키트는 프라이머 및 프로브를 이용한 유전자증폭방식을 통해 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균을 검출한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머(primer)”는 핵산 가닥(템플레이트)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건 하에서, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재 시, 그리고 적합한 온도와 pH에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브(probe)"는 타겟 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다.
바람직하게는, 프로브 및 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍 시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 복수의 요소에 따라 결정될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링”또는 “프라이밍”은 템플레이트 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 템플레이트 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 일치하거나 일부 미스매치로 실질적으로 일치하는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 프라이머 및 프로브를 이용하여 중합효소연쇄반응 방식을 통해 결핵균, 비결핵균 및 다재내성결핵균을 동시에 검출한다.
상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
상기 중합효소연쇄반응은 다양한 DNA 중합효소가 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 '클레나우' 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 Taq DNA 중합효소 또는 Pfu DNA 중합효소를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 Taq DNA 중합효소를 포함한다.
본 발명의 키트는 중합효소연쇄반응 산물에 의한 캐리오버(carryover) 또는 크로스오버(crossover) 오염을 차단하기 위해 dUTP(deoxyuridine triphosphate) 및 UDG(Uracil DNA Glycosilase)를 추가적으로 포함 할 수 있다. UDG는 이전 증폭산물 DNA 주형가닥에 포함된 우라실(Uracil)을 인식하고 잘라내며, 잘려진 DNA 주형가닥은 더 이상 주형가닥으로의 역할을 상실하게 됨으로써 증폭반응이 일어나지 않게 된다. 본 발명은 dUTP 및 UDG를 사용함으로써 이전 증폭산물의 오염에 의한 증폭산물의 생성을 원천 차단하여, 이전 증폭생성물의 검사실 오염에 따른 위양성 결과를 배제하여 검사의 정확도를 향상시킨다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
본 발명의 키트는 실시간 중합효소연쇄반응 방식이다.
상기 실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링 할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치(threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.
먼저, interchelating 방법은 이중 가닥 DNA 결합 다이를 이용하는 방법으로, 비-서열 특이적 형광 intercalating 시약(SYBR 그린 I 또는 ethidium bromide)을 이용하여 비-특이적 증폭 및 프라이머-다이머 복합체를 포함하는 앰플리콘 생산을 정량하는 것이다. 상기 시약은 ssDNA와는 결합하지 않는다. SYBR 그린 I은 이중 가닥 DNA의 마이너 그루브(minor groove)에 결합하는 형광성 다이로, 용액 상에서는 거의 형광을 보이지 않지만 이중 가닥 DNA와 결합하면 강한 형광을 나타내는 시약(interchelator)이다(Morrison TB, Biotechniques., 24(6): 954-8, 960, 962(1998)). 따라서 SYBR 그린 I과 이중 가닥 DNA 간의 결합을 통해 형광을 방출하기 때문에 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. SYBR 그린 실시간 PCR은 앰플리콘 동정을 위해 융해점(melting point) 또는 해리 곡선(dissociation curve) 분석과 같은 최적화 과정을 동반한다. 정상적으로 SYBR 그린은 싱글플렉스(singleplex) 반응에 이용되지만, 융해곡선(melting curve) 분석이 동반되면 멀티플렉스(multiplex) 반응에 이용될 수 있다(Siraj AK, et al., Clin Cancer Res., 8(12): 3832-40(2002); 및 Vrettou C., et al., Hum Mutat., Vol 23(5): 513-521(2004)).
Ct(cycle threshold) 값은 반응에서 발생된 형광이 역치(threshold)를 넘어서는 사이클 수를 의미하며, 이는 초기 카피 수의 대수에 반비례한다. 그러므로, 특정 웰에 할당된 Ct 값은 반응에서 앰플리콘의 충분한 수가 축적된 사이클의 수를 반영한다. Ct 값은 ΔRn의 증가가 처음으로 검출된 사이클이다. Rn은 각 시점에서 PCR 동안 발생된 형광 시그널의 크기를 의미하며, ΔRn은 레퍼런스 다이의 형광 방출 강도로 나뉘어진 리포터 다이의 형광방출 강도(표준화된 리포터 시그널)를 의미한다. Ct 값은 LightCycler에서는 Cp(crossing point)로도 명명된다. Ct 값은 시스템이 로그-선형 단계(log-linear phase)에서 PCR 생산물의 지수성장과 관련된 형광 시그널의 증가를 검출하기 시작하는 시점을 나타낸다. 이 시기는 반응에 대한 가장 유용한 정보를 제공한다. 로그-선형 단계의 기울기는 증폭 효율(amplification efficiency, Eff)을 나타낸다(http://www.appliedbiosystems.co.kr/).
한편, TaqMan 프로브는 전형적으로 5'-말단에 형광물질(fluorophore) 및 3'-말단에 퀀처(quencher; 예컨대, TAMRA 또는 비-형광 퀀처(NFQ))를 포함하는 프라이머(예컨대, 20-30 뉴클레오타이드) 보다 더 긴 올리고뉴클레오타이드이다. 여기된 형광물질은 형광을 내기 보다는 근처의 퀀처에 에너지를 전달한다(FRET = Frster or fluorescence resonance energy transfer; Chen, X., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 94(20): 10756-61(1997)). 그러므로, 프로브가 정상인 경우, 어떠한 형광도 발생되지 않는다. TaqMan 프로브는 PCR 생산물의 내부 부위에 어닐링할 수 있도록 고안된다. 예를 들어, TaqMan 프로브는 서열목록 제1서열 및 제2서열에 의해 증폭되는 IS6110 유전자 절편의 내부서열로 고안될 수 있다.
TaqMan 프로브는 어닐링 단계에서 템플레이트 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브 상에 퀀처에 의해 형광발색이 억제된다. 연장 반응 시에 Taq DNA 폴리머라제가 갖는 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 템플레이트에 혼성화한 TaqMan 프로브가 분해되어 형광 색소가 프로브로부터 유리되면서 퀀처에 의한 억제가 해제되어 형광은 나타낸다. 이 때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다.
TaqMan 프로브에 결합되어 있는 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 형광성 물질 및 비형광성 물질을 포함한다.
본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다): Cy2TM(506), YOPROTM-1(509), YOYOTM-1 (509), Calcein(517), FITC(518), FluorXTM(519), AlexaTM(520), rhodamine 110(520), 5-FAM(522), Oregon GreenTM500(522), Oregon GreenTM488(524), RiboGreenTM(525), RhodamineGreenTM(527), Rhodamine 123(529), Magnesium GreenTM(531), Calcium GreenTM(533), TO-PROTM-1(533), TOTO1(533), JOE(548), BODIPY530/550(550), Dil(565), BODIPY TMR(568), BODIPY558/568(568), BODIPY564/570(570), Cy3TM(570), AlexaTM546(570), TRITC(572), Magnesium OrangeTM(575), Phycoerythrin R&B(575), Rhodamine Phalloidin(575), Calcium OrangeTM(576), Pyronin Y(580), RhodamineB(580), TAMRA(582), Rhodamine RedTM(590), Cy3.5TM(596), ROX(608), Calcium CrimsonTM(615), AlexaTM594(615), Texas Red(615), Nile Red(628), YO-PROTM-3(631), YOYOTM-3(631), R-phycocyanin(642), CPhycocyanin(648), TO-PROTM-3(660), TOTO3(660), DiD DilC(5)(665), Cy5TM(670), Thiadicarbocyanine(671), Cy5.5(694), HEX(556), TET(536), VIC(546), BHQ-1(534), BHQ-2(579), BHQ-3(672), BiosearchBlue(447), CAL Fluor Gold 540(544), CAL Fluor Orange 560(559), CAL Fluor Red 590(591), CAL FluorRed 610(610), CAL Fluor Red 635(637), FAM(520), Fluorescein(520), Fluorescein-C3(520), Pulsar 650(566), Quasar 570(667), Quasar 670(705) 및 Quasar 705(610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다.
적합한 리포터-퀀처 쌍(pairs)은 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH(Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 5'-말단은 Cy5, JOE, FAM 및 Cal Red 610으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되며, 3'-말단은 BHQ-1 또는 BHQ-2의 퀀처(quencher)로 변형될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제3서열은 5'-말단의 형광물질로 Cy5 및 3'-말단의 퀀처로 BHQ2를 이용하고, 본 발명의 서열목록 제10서열은 5'-말단의 형광물질로 JOE 및 3’말단의 퀀처로 BHQ1을 이용하며, 본 발명의 서열목록 제17서열 내지 제30서열은 5'-말단의 형광물질로 FAM, 3'-말단의 퀀처로 BHQ1을 이용하고, 본 발명의 서열목록 제33서열은 5'-말단의 형광물질로 Cal Red 610 및 3'-말단의 퀀처로 BHQ2를 이용한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균의 동시 검출 방법을 제공한다:
(a) 객체로부터 분리된 시료를 준비하는 단계;
(b) (ⅰ) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex) 검출용 세트; (ⅱ) 서열목록 제4서열 내지 제8서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 및 제9서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열목록 제10열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 비결핵균(Non-tuberculosis mycobacteria) 검출용 세트; (ⅲ) 서열목록 제11서열 및 제12서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제17서열 내지 제28서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 리팜피신(rifampicin) 내성 결핵균 검출용 세트; (ⅳ) 서열목록 제13서열 및 제14서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제29서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 세트; 또는 서열목록 제15서열 및 제15서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제30서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 세트를 포함하는 이소니아지드(isoniazid) 내성 결핵균 검출용 세트; 및 (ⅴ) 서열목록 제31서열 및 제32서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제33서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 대조군 검출용 세트를 이용하여 상기 시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.
본 발명의 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균의 동시 검출 방법은 객체로부터 분리된 시료를 대상으로 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시료는 객담, 소변, 위액흡인검체, 조직, 생검 검체, 체액, 혈액 또는 대변으로부터 분리한 DNA 시료이다. 따라서, 본 발명은 시료에서 추출한 DNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.
시료에서 DNA를 추출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)).
본 발명의 방법은 상기 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 키트를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 키트 및 검출 방법을 제공한다.
(b) 본 발명의 키트 및 방법은 결핵균 및 비결핵균의 15 copies, 다제내성결핵균의 150 copies까지 검출할 수 있는 우수한 민감도를 갖으며, 유전자 증폭 장비의 호환이 가능하다.
(c) 본 발명의 키트 및 방법은 한번의 PCR 반응으로 다양한 병원성 MTC 와 NTM 의 유전자를 동시에 검출 할 수 있으며, UDG (Uracil DNA Glycosilase) 시스템을 도입하여 이전 PCR 산물에 의한 Carryover 또는 crossover 오염을 차단하여 교차오염을 최소화하였다.
도 1은 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 진단키트를 이용하여 실험한 실시간 PCR 결과를 나타낸다.
도 2는 대조군 주형(플라스미드 DNA)을 이용한 결핵균 최소검출 한계 실험 결과를 나타낸다.
도 3은 대조군 주형(플라스미드 DNA)을 이용한 비결핵균 최소검출 한계 실험 결과를 나타낸다.
도 4는 대조군 주형(플라스미드 DNA)을 이용한 다제내성결핵균 최소검출 한계 실험 결과를 나타낸다.
도 5는 간섭물질에 의한 분석적 특이도 실험 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
결핵균/비결핵균/다제내성결핵균 (MTC/NTM/MDR)의 표준균주의 gDNA를 사용하여 분석적 특이도를 검증하고, 대조군 주형(control template)을 이용하여 분석적 민감도를 검증하였다.
본 개발 제품인 DiaPlexQTM 결핵균/비결핵균/다제내성결핵균 (MTC/NTM/MDR) 진단키트의 유효성을 증명하기 위하여 실험에 사용할 각 목표 검체에 대한 표준물질인 DNA 주형을 한국 결핵연구원으로부터 분양 받아 사용하였으며, 다음과 같다(표 1).
Types 검출 목표종 목적 유전자
Mycobacterium tuberculosis complex Mycobacterium complex (MTC)
(M.tuberculosis, M.bovis) 		IS6110
Non- tuberculosis mycobacteria (NTM)
(M. avium , M. intracellulare , M. abscessus, M. fortuitum,
M. chelonae , M. kansasii , M. gordonae, M. szulgai,
M. celatum , M. marinum, M. nonchromogenicum,
M. peregrinum , M. terrae, M. mucogenicum,
M. scrofulaceum , M. shimoidei, etc)		 16S rRNA
Rifampicin Resistance
(L511P, Q513L, Q513P, D516V, D516Y, S522L, H526D, H526Y, H526L, H526R, S531L, S531W, L533P)		 RpoB
Isoniazid Resistance
(S315T-ACC, ACA) / (InhA-15 Promotor C>T)		 KatG / InhA
한국 결핵연구원으로부터 분양 받은 DNA 주형을 이용한 개발키트의 유효성 검증을 위해, 성능시험 표준서에 기재된 방법에 따라 실시간 PCR법으로 실험을 진행하였다. 검출 여부는 PCR 반응 종료 후 증폭곡선을 통해 결핵균/비결핵균/다제내성결핵균의 유효성을 분석하였다.
실험 방법
본 실험은 결핵연구원으로부터 구매한 결핵균/비결핵균/다제내성결핵균 표준균주로부터 추출한 지노믹 DNA를 이용한 실험검증을 통해 DiaPlexQTM 결핵균/비결핵균/다제내성결핵균 (MTC/NTM/MDR) 진단키트를 검증 하고자 하였다. 실험은 2 batch로 생산된 제품을 대상으로 한 실험자에 의해 수행되었다.
1) Real-Time PCR법을 통한 결핵균/비결핵균/다제내성결핵균 유래 유전자형 분석
목표검체인 결핵균/비결핵균/다제내성결핵균의 검출을 위해, 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균에 특이적인 프라이머와 프로브를 설계하였으며, PCR 대조군으로 식물 유래 유전자를 검출할 수 있도록 설계하였다(표 2).
검출대상 프라이머 명 서열 (5' → 3‘ TM GC mer 서열목록
MTC MTC F CGTGGTCCTGCGGGCTTTGC 68 70 20 제1서열
MTC R GATGCACCGTCGAACGGCTG 66 65 20 제2서열
MTC 프로브 Cy5-CAAACTCGGCCTGTCCGGGACC-BHQ2 74 68 22 제3서열
NTM NTM F CGGAAAGGCCCCTTCGGGG 66 74 19 제4서열
NTM-KF1 GCAATCTGCCCTGCACACCG 66 65 20 제5서열
NTM-CF1-1 ACGGAAAGGCCCGCTTCGG 64 68 19 제6서열
NTM-CF1-2 GAACGGAAAGGCCCCTTTTTG 64 52 21 제7서열
NTM-MF1 GCGATCTGCCCTGCACAACG 66 65 20 제8서열
NTM R CCATCCCACACCGCAAAAGCTT 68 55 22 제9서열
NTM 프로브 JOE-CTGGGAAACTGGGTCTAATACCG-BHQ1 60 52 23 제10서열
MDR RpoB-F1 CGCAGACGTTGATCAACATC 60 50 20 제11서열
RpoB-R3 TGCACGTCGCGGACCTCC 62 72 18 제12서열
KatG-F3 TGGAAGAGCTCGTATGGCAC 62 55 20 제13서열
KatG-R3 TCGTAGCCGTACAGGATCTC 62 55 20 제14서열
InhA-F1 AGTGCGAAAGTTCCCGCCG 62 63 19 제15서열
InhA-R3 GGACTGAACGGGATACGAATG 64 52 21 제16서열
L511P 프로브 FAM-CCGGCCGAGCCAATTCATG-BHQ1 62 63 19 제17서열
Q513L 프로브 FAM-AGCTGAGCCTAGTCATGGACCA-BHQ1 68 54 22 제18서열
Q513P 프로브 FAM-AGCTGAGCGYGTTCATGGACCA-BHQ1 68 54 22 제19서열
D516V 프로브 FAM-AAGTCATGGTCCAGAACAACCC-BHQ1 66 50 22 제20서열
D516Y 프로브 FAM-AGTTCATGTACCAGAACAACCCG-BHQ1 68 47 23 제21서열
S522L 프로브 FAM-CAGTTGGGGTTGACCCGCAA-BHQ1 64 60 20 제22서열
H526D 프로브 FAM-TTGGCCGACAAGCGCCGACT-BHQ1 66 65 20 제23서열
H526Y 프로브 FAM-GGTAGACCTACAAGCGCCGAC-BHQ1 68 61 21 제24서열
H526L 프로브 FAM-TTGGCCCTCAAGCGCCGACT-BHQ1 66 65 20 제25서열
H526R 프로브 FAM-GAGGTGACCCGCAAGCGCC-BHQ1 66 73 19 제26서열
S531LW 프로브 FAM-AAGCGCCGACTGTKGGAGC-BHQ1 62 63 19 제27서열
L533P 프로브 FAM-CGACTGTCAGCGCCGGGGC-BHQ1 68 78 19 제28서열
S315T 프로브 FAM-CGATCACAACMGGCATCGAGGT-BHQ1 68 54 22 제29서열
InhA-15 프로브 FAM-CCCCGACAACCTATCATCGCG-BHQ1 68 61 21 제30서열
PCR 대조군 PCR 대조군 F CGACTCTGCTGAACTATTGCC 64 52 21 제31서열
PCR 대조군 R GCGACTACGATCTGCACTCC 64 60 20 제32서열
PCR 대조군 프로브 Cal Red 610- ACACCAGCTGATATAGGGCCATCAACAT-BHQ2 82 46 28 제33서열
2) PCR 혼합물 제조
냉동시약은 상온에서 녹인 후 원심 분리하여 사용하였다. 다음 사용 시약을 순서대로 넣어 혼합액을 제조하였다. 권장량의 DNA 보다 적은 양을 사용하였을 경우 PCR 대조군 피크(peak)가 증폭되지 않을 수 있으므로 권장량을 사용하도록 하였다(표 3).
구성 부피(㎕)
2X Multiplex Real-Time PCR Smart mix (with UDG) (TB/MDR) 10X EF-Taq 완충액(pH 8.8, without BSA)
10 mM dNTP mix(T+U, 각 25 mM)
UDG(1 U/㎕)
2M KCl
25 mM MgCl2
H-Taq(2.5 U/㎕)
50X ROX dye
Nuclease free water		 15
프라이머 & 프로브 Mixture (TB/MDR) 각 프라이머(또는 프로브) 100 pmole/㎕
spinacia oleracea 플라스미드 DNA(1 ng/㎕) 2 ㎕
Nuclease free water		 5
DNA 주형 sample 3 (Variable)
Nuclease free Water 7 (Variable)
총 반응 부피 30
3) PCR 조건
다음과 같은 동일 조건으로 PCR 을 진행 하였다(표 4).
No. 단계 온도 시간 사이클
1 UDG 반응 50˚C 3 분 1
2 초기 PCR 활성화 95˚C 15 분 1
3 변성 95˚C 30 초 45
4 어닐링 64˚C 1 분
4) Real-Time PCR 결과
DiaPlexQTM 결핵균/비결핵균/다제내성결핵균 (MTC/NTM/MDR) 진단키트를 사용하여 실험을 진행하였으며, 도 1은 PCR 후 증폭곡선 결과이다.
각 결핵균/비결핵균/다제내성결핵균에 따라 프로브에 태깅된 형광(결핵균 Cy5, 비결핵균 JOE/VIC, 다제내성결핵균 FAM, PCRC Cal Red 610/Texas Red)이 다르게 지정되어 있어 증폭 곡선으로 결핵균/비결핵균/다제내성결핵균을 확인 할 수 있다.
5) 검출 유효값(표 5)
MTC Ct값 NTM Ct값 MDR Ct값 PCRC Ct값 결과
≤40 ≥40 or No Ct ≥42 or No Ct ≤40 TB 양성
≤40 ≤40 ≥42 or No Ct ≤40 TB, NTM Coinfection
≤40 ≥40 or No Ct ≥42 or No Ct No Ct TB 양성
≥40 or No Ct ≤40 ≥42 or No Ct ≤40 NTM 양성
≥40 or No Ct ≤40 ≥42 or No Ct No Ct NTM 양성
≤40 ≥40 or No Ct ≤42 ≤40 TB,MDR 양성
≥40 or No Ct ≤40 ≤42 ≤40 NTM,MDR 양성
≤40 ≤40 ≤42 ≤40 TB, NTM, MDR Coinfection
≥40 or No Ct ≥40 or No Ct ≥42 or No Ct ≤40 음성
No Ct No Ct No Ct No Ct 재검
실험 결과
1) 분석적 특이도 확인
분석적 특이도를 확인하기 위해 결핵연구원으로부터 수급한 Mycobacterium tuberculosis, 16종 Non-tuberculosis mycobacterium (M. avium , M. intracellulare , M. abscessus , M. fortuitum , M. chelonae, M. kansasii , M. gordonae , M. szulgai , M. celatum , M. marinum , M. nonchromogenicum , M. peregrinum, M. terrae, M. mucogenicum , M. scrofulaceum , M. shimoidei), 8종 TB-MDR(rpoB L511P, D516V, D516Y, H526Y, S531L, L533P, KatG S315T, InhA-15 Promotor)로부터 추출한 지노믹 DNA 주형s를 BioRad 사의 CFX96 Real-Time PCR 장비로 특이적 및 비특이적 산물 생성을 확인하였다. 그 결과, Mycobacterium tuberculosis에서 결핵균이 증폭되는 것을 확인할 수 있었고, 16종의 Non-tuberculosis mycobacterium에서는 비결핵균이 증폭되는 것을 확인할 수 있었고, 8종의 TB-MDR에서는 결핵균과 다제내성결핵균의 증폭을 확인하였다. 그림 2의 양성 대조군은 중복감염이 됐을 경우를 가정해 결핵균, 비결핵균, 다제내성결핵균의 양성 대조군을 한 tube에서 동시 검출한 결과이며, 결핵균과 비결핵균, 다제내성결핵균이 모두 증폭되는 것을 확인할 수 있었다(표 6).
또한 다른 균에 의한 위양성을 확인하기 위해 Streptococcus agalactiae , Streptococcus gordonii , Streptococcus mitis , Streptococcus mutans , Streptococcus pyogenes , Candida albicans , Candida glabrata, Candida parapsilosis , Candida tropicalis, Trichosporon asahii , Trichosporon pullulans , Mycoplasma arginine , Mycoplasma fermentans , Mycoplasma orale , Mycoplasma pirum , Mycoplasma salivarium, Bacillus cereus , Bacillus subtilis 균주 등을 사용해 다른 균주에서도 증폭되는지 확인하였다. 그 결과 결핵균/비결핵균/다제내성결핵균에서만 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다. 검출 유효성을 증명하기 위하여 검출된 PCR 생성물을 T-벡터 클로닝 하여 자사 (솔젠트)의 염기서열분석팀에 염기서열분석 의뢰를 요청하였고 Solgent ASSA(Advanced System for Sequence Analysis Service, www.sequencing.co.kr),각각의 결과를 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLAST에서 확인한 결과, 육안 확인한 결과와 100% 일치하였다.
No. 검체 이름 실험 결과 Lane 검체 이름 실험 결과
1 Mycobacterium tuberculosis
Figure 112016082974517-pat00001

 2 Mycobacterium
Avium
Figure 112016082974517-pat00002
3 Mycobacterium
abscessus
Figure 112016082974517-pat00003

 4　 Mycobacterium
intracellulare
Figure 112016082974517-pat00004
5 Mycobacterium
kansasii
Figure 112016082974517-pat00005

 6　 Mycobacterium
gordonae
Figure 112016082974517-pat00006
7 Mycobacterium
marinum
Figure 112016082974517-pat00007

 8　 Mycobacterium
chelonae
Figure 112016082974517-pat00008
9 Mycobacterium
fortuitum
Figure 112016082974517-pat00009

 10 Mycobacterium
szulgai
Figure 112016082974517-pat00010
11 Mycobacterium
terrae
Figure 112016082974517-pat00011

 12 Mycobacterium
celatum
Figure 112016082974517-pat00012
13 Mycobacterium
mucogenicum
Figure 112016082974517-pat00013

 14 Mycobacterium
scrofulaceum
Figure 112016082974517-pat00014
15 Mycobacterium
nonchromogenicum
Figure 112016082974517-pat00015

 16 Mycobacterium
peregrinum
Figure 112016082974517-pat00016
17 Mycobacterium
shimoidei
Figure 112016082974517-pat00017

 18 rpoB
L511P
Figure 112016082974517-pat00018
19 rpoB
D516V
Figure 112016082974517-pat00019

 20 rpoB
D516Y
Figure 112016082974517-pat00020
21 rpoB
H526Y
Figure 112016082974517-pat00021

 22 rpoB
S531L
Figure 112016082974517-pat00022
23 rpoB
L533P
Figure 112016082974517-pat00023

 24 KatG
S315T
Figure 112016082974517-pat00024
25 InhA-15
Promotor
Figure 112016082974517-pat00025

 26 Rhodococcus equi
Figure 112016082974517-pat00026
27 Nocardia brasiliensis
Figure 112016082974517-pat00027

 28 Nocardia farcinica
Figure 112016082974517-pat00028
29 Nocardia otitidiscaviarum
Figure 112016082974517-pat00029

 30 Nocardia nova
Figure 112016082974517-pat00030
31 Pseudomonas aeruginosa
Figure 112016082974517-pat00031

 32 Nocardia brevicatena

33 Nocardia abscessus
Figure 112016082974517-pat00033

 34 Nocardia transvalenisis
Figure 112016082974517-pat00034
35 Aspegillus fumigatus
Figure 112016082974517-pat00035

 36 Bacillus cereus
Figure 112016082974517-pat00036
37 Bacillus subtilis
Figure 112016082974517-pat00037

 38 Candida albicans
Figure 112016082974517-pat00038
39 Candida glabrata
Figure 112016082974517-pat00039

 40 Candida parapsilosis
Figure 112016082974517-pat00040
41 Candida
tropicalis
Figure 112016082974517-pat00041

 42 Enterococcus fecalis
Figure 112016082974517-pat00042
43 Mycoplasma arginine
Figure 112016082974517-pat00043

 44 Mycoplasma fermentans
Figure 112016082974517-pat00044
45 Mycoplasma orale
Figure 112016082974517-pat00045

 46 Mycoplasma pirum
Figure 112016082974517-pat00046
47 Mycoplasma salivarium
Figure 112016082974517-pat00047

 48 Staphylococcus arlettae
Figure 112016082974517-pat00048
49 Staphylococcus caprae
Figure 112016082974517-pat00049

 50 Staphylococcus epidermidis
Figure 112016082974517-pat00050
51 Staphylococcus hominis
Figure 112016082974517-pat00051

 52 Staphylococcus lugdunensis
Figure 112016082974517-pat00052
53 Staphylococcus saprophyticus
Figure 112016082974517-pat00053

 54 Staphylococcus schleiferi
ssp.
Figure 112016082974517-pat00054
55 Staphylococcus sciuri
Figure 112016082974517-pat00055

 56 Staphylococcus simulans
Figure 112016082974517-pat00056
57 Streptococcus agalactiae
Figure 112016082974517-pat00057

 58 Streptococcus anginosus
Figure 112016082974517-pat00058
59 Streptococcus australis
Figure 112016082974517-pat00059

 60 Streptococcus bovis
Figure 112016082974517-pat00060
61 Streptococcus constellatus
Figure 112016082974517-pat00061

 62 Streptococcus criceti
Figure 112016082974517-pat00062
63 Streptococcus downei
Figure 112016082974517-pat00063

 64 Streptococcus dysgalactiae
ssp.
Figure 112016082974517-pat00064
65 Streptococcus equi
ssp.
Figure 112016082974517-pat00065

 66 Streptococcus ferus
Figure 112016082974517-pat00066
67 Streptococcus gallolyticus
Figure 112016082974517-pat00067

 68 Streptococcus gordonii
Figure 112016082974517-pat00068
69 Streptococcus lutentiensis
Figure 112016082974517-pat00069

 70 Streptococcus macacae
Figure 112016082974517-pat00070
71 Streptococcus mitis
Figure 112016082974517-pat00071

 72 Streptococcus mutans
Figure 112016082974517-pat00072
73 Streptococcus oralis
Figure 112016082974517-pat00073

 74 Streptococcus pasteuriaus
Figure 112016082974517-pat00074
75 Streptococcus pneumoniae
Figure 112016082974517-pat00075

 76 Streptococcus pyogenes
Figure 112016082974517-pat00076
77 Streptococcus ratti
Figure 112016082974517-pat00077

 78 Streptococcus salivarius
Figure 112016082974517-pat00078
79 Streptococcus sanuinis
Figure 112016082974517-pat00079

 80 Streptococcus uberis
Figure 112016082974517-pat00080
81 Trichosporon asahii
Figure 112016082974517-pat00081

 82 Trichosporon pullulans
Figure 112016082974517-pat00082
83 양성
대조군
Figure 112016082974517-pat00083

 84 음성
대조군
Figure 112016082974517-pat00084
85 NTC
Figure 112016082974517-pat00085

 - - -
표 7은 분석적 특이도의 Ct 값을 정리한 표이며, BioRad CFX96 Real-Time PCR 장비로 실험하였다.
No. MTC NTM MDR PCRC No. MTC NTM MDR PCRC
1 25.1 N/D N/D 20.1 44 N/D N/D N/D 20.0
2 N/D 25.2 N/D 20.2 45 N/D N/D N/D 19.9
3 N/D 24.9 N/D 20.2 46 N/D N/D N/D 20.1
4 N/D 24.1 N/D 20.1 47 N/D N/D N/D 20.1
5 N/D 23.5 N/D 20.0 48 N/D N/D N/D 19.8
6 N/D 24.4 N/D 20.0 49 N/D N/D N/D 20.1
7 N/D 23.1 N/D 20.1 50 N/D N/D N/D 20.1
8 N/D 24.1 N/D 20.1 51 N/D N/D N/D 20.1
9 N/D 24.7 N/D 20.2 52 N/D N/D N/D 20.2
10 N/D 24.2 N/D 20.1 53 N/D N/D N/D 20.1
11 N/D 25.6 N/D 20.0 54 N/D N/D N/D 19.9
12 N/D 23.5 N/D 20.0 55 N/D N/D N/D 20.0
13 N/D 24.1 N/D 20.1 56 N/D N/D N/D 20.0
14 N/D 23.6 N/D 20.1 57 N/D N/D N/D 20.0
15 N/D 25.6 N/D 20.2 58 N/D N/D N/D 20.0
16 N/D 23.8 N/D 20.1 59 N/D N/D N/D 19.8
17 N/D 23.4 N/D 20.1 60 N/D N/D N/D 20.2
18 22.2 N/D 33.2 20.1 61 N/D N/D N/D 20.1
19 22.6 N/D 31.5 20.1 62 N/D N/D N/D 20.0
20 22.5 N/D 31.7 20.2 63 N/D N/D N/D 19.9
21 20.7 N/D 34.1 20.1 64 N/D N/D N/D 20.0
22 22.2 N/D 33.2 20.0 65 N/D N/D N/D 20.1
23 21.8 N/D 30.1 20.0 66 N/D N/D N/D 20.0
24 22.1 N/D 29.9 20.1 67 N/D N/D N/D 20.1
25 22.3 N/D 29.8 20.1 68 N/D N/D N/D 20.1
26 N/D N/D N/D 20.0 69 N/D N/D N/D 20.3
27 N/D N/D N/D 19.9 70 N/D N/D N/D 20.2
28 N/D N/D N/D 20.2 71 N/D N/D N/D 20.1
29 N/D N/D N/D 20.0 72 N/D N/D N/D 20.0
30 N/D N/D N/D 19.8 73 N/D N/D N/D 20.2
31 N/D N/D N/D 20.0 74 N/D N/D N/D 20.1
32 N/D N/D N/D 20.1 75 N/D N/D N/D 20.0
33 N/D N/D N/D 20.0 76 N/D N/D N/D 20.3
34 N/D N/D N/D 19.8 77 N/D N/D N/D 20.0
35 N/D N/D N/D 20.1 78 N/D N/D N/D 20.1
36 N/D N/D N/D 20.1 79 N/D N/D N/D 20.0
37 N/D N/D N/D 20.3 80 N/D N/D N/D 20.0
38 N/D N/D N/D 20.1 81 N/D N/D N/D 20.1
39 N/D N/D N/D 20.0 82 N/D N/D N/D 19.8
40 N/D N/D N/D 20.2 83 N/D N/D N/D 20.1
41 N/D N/D N/D 20.1 84 19.7 19.5 23.4 20.1
42 N/D N/D N/D 20.0 85 N/D N/D N/D 20.2
43 N/D N/D N/D 20.0
2) 분석적 민감도 확인
최소 검출 한도를 결정하기 위하여 결핵균/비결핵균/다제내성결핵균 검출목표 서열을 포함하여 클로닝 한 플라스미드 DNA로 ABI 사의 7500 Real-Time PCR, Bio-Rad사의 CFX96 Real-Time PCR 장비를 사용하고, 시험 시약은 서로 다른 2 Lot를 사용하였으며, 6반복 실험을 실시하여 총 24반복 실험을 진행하였다. 민감도는 검체의 상태와 동일한 조건으로 실험하기 위하여 반응 당 10 ng 농도의 인간 gDNA에 MTC, NTM은 1.5X105 copies부터 1 copy까지 MDR은 1.5X106 copies부터 1 copy까지 순차적으로 희석한 검출목표 유전자를 스파이킹하여 수행하였다. 그 결과, MTC는 1.5 X 101 copies에서 100%로 검출되었고, NTM은 1.5 X101 copies에서 100% 검출되었고, MDR은 1.5 X 102 copies에서 100%로 검출되었다. MTC 1.5 X 101 copies 의 Ct value는 최소 34.9 ~ 최고 36.0으로 확인되었고, NTM 1.5 X 101 copies 의 Ct Value는 최소 34.8 ~ 최고 37.7로 확인되었고, MDR 1.5 X 102 copies 의 Ct value는 최소 37.8 ~ 최고 39.6으로 확인되었다. 따라서, 본 제품의 검출 민감도는 결핵균에서 약 15 copies, 비결핵균에서 약 15 copies, 다제내성결핵균에서 150 copies 까지 유전자를 검출 확인할 수 있다는 것을 증명하였고, 이 때의 Ct value는 MTC, NTM ≤ 40, MDR ≤ 42로 설정하였다. 각 검체 별 최소검출 한계는 아래 도 2, 3, 4와 표 8, 9, 10에 정리하였다. 검출 유효성을 증명하기 위하여 검출된 PCR 생성물을 T-벡터 클로닝 하여 자사 (솔젠트) 의 염기서열분석팀에 염기서열분석 의뢰를 요청하였고, Solgent ASSA(Advanced System for Sequence Analysis) Service, www.sequencing.co.kr,
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Claims (16)

  1. (a) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex) 검출용 세트;
    (b) 서열목록 제4서열 내지 제8서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 및 제9서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열목록 제10열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 비결핵균(Non-tuberculosis mycobacteria) 검출용 세트;
    (c) 서열목록 제11서열 및 제12서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제17서열 내지 제28서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 리팜피신(rifampicin) 내성 결핵균 검출용 세트;
    (d) 서열목록 제13서열 및 제14서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제29서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 세트; 또는 서열목록 제15서열 및 제16서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제30서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 세트를 포함하는 이소니아지드(isoniazid) 내성 결핵균 검출용 세트를 포함하는, 유전자 증폭 방식을 이용한 결핵균, 비결핵균 및 다제내성결핵균 동시 검출용 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 결핵균은 마이코박테리엄 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리엄 보비스(M. bovis), 마이코박테리엄 아프리카넘(M. africanum), 마이코박테리엄 카네티(M. canetti), 마이코박테리엄 카프래(M. caprae), 마이코박테리엄 미크로티(M. microti), 마이코박테리엄 멍지(M. mungi), 마이코박테리엄 오리기스(M. orygis), 마이코박테리엄 피니페딜(M. pinnipedil) 및 마이코박테리엄 수리카태(M. suricattae)로 구성된 군으로부터 선택되는 결핵균인 것을 특징으로 하는 키트.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 비결핵균은 마이코박테리엄 아비엄(M. avium), 마이코박테리엄 인트라셀룰라레(M. intracellulare), 마이코박테리엄 아브스세서스(M. abscessus), 마이코박테리엄 포튜이텀(M. fortuitum), 마이코박테리엄 첼로내(M. chelonae), 마이코박테리엄 칸사시(M. kansasii), 마이코박테리엄 고르도내(M. gordonae), 마이코박테리엄 스줄가이(M. szulgai), 마이코박테리엄 셀라텀(M. celatum), 마이코박테리엄 마리넘(M. marinum), 마이코박테리엄 논크로모제니쿰(M. nonchromogenicum), 마이코박테리엄 페레그리넘(M. peregrinum), 마이코박테리엄 테래(M. terrae), 마이코박테리엄 뮤코제니쿰(M. mucogenicum), 마이코박테리엄 스크로풀라슘(M. scrofulaceum), 마이코박테리엄 심모이데이(M. shimoidei), 마이코박테리엄 셉티컴(M. septicum), 마이코박테리엄 울세란스(M. ulcerans), 마이코박테리엄 제노피(M. xenopi), 마이코박테리엄 말모엔스(M. malmoense), 마이코박테리엄 해모피럼(M. haemophilum) 및 마이코박테리엄 제나벤스(M. genavense)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비결핵균인 것을 특징으로 하는 키트.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 리팜피신 내성 결핵균은 마이코박테리엄 튜버큘로시스의 RpoB 유전자 돌연변이 균주인 것을 특징으로 하는 키트.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 이소니아지드 내성 결핵균은 마이코박테리엄 튜버큘로시스의 KatG 또는 InhA 유전자 돌연변이 균주인 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 서열목록 제31서열 및 제32서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제33서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 대조군 검출용 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 키트는 실시간 PCR 방식인 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 다음의 단계를 포함하는 결핵균, 비결핵균 및 다재내성결핵균의 동시 검출 방법:
    (a) 객체로부터 분리된 시료를 준비하는 단계;
    (b) (ⅰ) 서열목록 제1서열 및 제2서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis complex) 검출용 세트; (ⅱ) 서열목록 제4서열 내지 제8서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 및 제9서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍, 및 서열목록 제10열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 비결핵균(Non-tuberculosis mycobacteria) 검출용 세트; (ⅲ) 서열목록 제11서열 및 제12서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제17서열 내지 제28서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 리팜피신(rifampicin) 내성 결핵균 검출용 세트; 및 (ⅳ) 서열목록 제13서열 및 제14서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제29서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 세트; 또는 서열목록 제15서열 및 제16서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제30서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 세트를 포함하는 이소니아지드(isoniazid) 내성 결핵균 검출용 세트를 이용하여 상기 시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 실시간 PCR 방식을 이용하여 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 시료는 객담, 소변, 위액흡인검체, 조직, 생검 검체, 체액, 혈액 또는 대변으로부터 분리한 DNA 시료인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 결핵균은 마이코박테리엄 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리엄 보비스(M. bovis), 마이코박테리엄 아프리카넘(M. africanum), 마이코박테리엄 카네티(M. canetti), 마이코박테리엄 카프래(M. caprae), 마이코박테리엄 미크로티(M. microti), 마이코박테리엄 멍지(M. mungi), 마이코박테리엄 오리기스(M. orygis), 마이코박테리엄 피니페딜(M. pinnipedil) 및 마이코박테리엄 수리카태(M. suricattae)로 구성된 군으로부터 선택되는 결핵균인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 비결핵균은 마이코박테리엄 아비엄(M. avium), 마이코박테리엄 인트라셀룰라레(M. intracellulare), 마이코박테리엄 아브스세서스(M. abscessus), 마이코박테리엄 포튜이텀(M. fortuitum), 마이코박테리엄 첼로내(M. chelonae), 마이코박테리엄 칸사시(M. kansasii), 마이코박테리엄 고르도내(M. gordonae), 마이코박테리엄 스줄가이(M. szulgai), 마이코박테리엄 셀라텀(M. celatum), 마이코박테리엄 마리넘(M. marinum), 마이코박테리엄 논크로모제니쿰(M. nonchromogenicum), 마이코박테리엄 페레그리넘(M. peregrinum), 마이코박테리엄 테래(M. terrae), 마이코박테리엄 뮤코제니쿰(M. mucogenicum), 마이코박테리엄 스크로풀라슘(M. scrofulaceum), 마이코박테리엄 심모이데이(M. shimoidei), 마이코박테리엄 셉티컴(M. septicum), 마이코박테리엄 울세란스(M. ulcerans), 마이코박테리엄 제노피(M. xenopi), 마이코박테리엄 말모엔스(M. malmoense), 마이코박테리엄 해모피럼(M. haemophilum) 및 마이코박테리엄 제나벤스(M. genavense)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비결핵균인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 상기 리팜피신 내성 결핵균은 마이코박테리엄 튜버큘로시스의 RpoB 유전자 돌연변이 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 9 항에 있어서, 상기 이소니아지드 내성 결핵균은 마이코박테리엄 튜버큘로시스의 KatG 또는 InhA 유전자 돌연변이 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 9 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 증폭은 서열목록 제31서열 및 제32서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열목록 제33서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 프로브를 포함하는 대조군 검출용 세트를 추가적으로 포함하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 삭제
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