KR101849703B1

KR101849703B1 - 간질의 치료에서 파이토칸나비노이드 칸나비디바린(ｃｂｄｖ)의 용도

Info

Publication number: KR101849703B1
Application number: KR1020127028091A
Authority: KR
Inventors: 벤자민 웰리; 클레어 윌리암스; 게리 스티븐스; 타카시 후타무라; 힐 토마스
Original assignee: 지더블유 파마 리미티드; 오쓰까 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 2010-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2031-03-30
Also published as: TWI583374B; AU2011234225B2; ZA201208141B; PH12012501902A1; BR112012024480A2; KR20130065646A; US10799467B2; AU2018217303A1; US12023305B2; EA036044B1; JP5918748B2; JP2013523708A; US20120004251A1; SG184236A1; US9125859B2; NZ602925A; US20150320698A1; AR080730A1; CN103025325B; EP3763361A1

Abstract

본 발명은 간질(epilepsy)의 치료에서 파이토칸나비노이드 CBDV (cannabidivarin), 및 파이토칸나비노이드 CBDV와 THCV(tetrahydrocannabivarin) 및 CBD(cannabidiol)의 조합의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 파이토칸나비노이드 CBDV와 표준 항간질 약물(standard anti-epileptic drugs, SAEDs)의 조합의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, SAED는 에토숙시미드(ethosuximide), 발프로에이트(valproate) 또는 페노바비탈(phenobarbital) 중 하나이다.

Description

간질의 치료에서 파이토칸나비노이드 칸나비디바린(ＣＢＤＶ)의 용도{USE OF THE PHYTOCANNABINOID CANNABIDIVARIN (CBDV) IN THE TREATMENT OF EPILEPSY}

본 발명은 간질(epilepsy)의 치료에서 파이토칸나비노이드 CBDV (cannabidivarin), 및 파이토칸나비노이드 CBDV와 THCV(tetrahydrocannabivarin) 및 CBD(cannabidiol)의 조합의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 파이토칸나비노이드 CBDV와 표준 항-간질 약물(standard anti-epileptic drugs, SAEDs)의 조합의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, CBDV는 나트륨 또는 칼슘 통로를 통해 작용하는 작용 메커니즘을 갖는 SAED, 더 바람직하게는

- 에토숙시미드(ethosuximide)에 의해 예시된 바와 같이, 저-역치(low-threshold) 또는 일시적인 신경 칼슘 전류(transient neuronal calcium currents)를 변화시키는; 또는

- 발프로에이트(valproate)에 의해 예시된 바와 같이, 고주파 신경 흥분 및 나트륨-의존성 활동 전위(action potential)를 감소시키고, 부가적으로 GABA 효과를 향상시킬 수 있는, SAED와 조합하여 사용된다:

대안적으로 CBDV는 페노바비탈(phenobarbital)에 의해 예시된 바와 같이, GABA의 저해(GABAergic inhibition)를 향상시키는 작용 메커니즘을 갖는 SAED와 조합하여 사용된다.

간질은 전세계 대략 5천만명의 사람에게 영향을 미치는 광범위한 질환을 나타내는 만성 신경 장애이다 (Sander, 2003). 신체 내부의 '엔도칸나비노이드' 계의 이해의 증진은 칸나비노이드계 의약품이 중추신경계에서 과흥분 (hyperexcitability)의 장애를 치료하는데 가능성을 가질 수 있다는 것으로 암시된다(Mackie, 2006, Wingerchuk, 2004, Alger, 2006).

칸나비스는 경련유발제(pro-convulsant) (Brust et al., 1992) 및 항경련제 (anticonvulsant) 효과 모두에 속하는 것으로 생각된다. 따라서, 칸나비노이드가 여전히 비차폐(unmasked)될 치료적 항경련제 또는, 반대로, 칸나비스의 기분전환 및 의약품 사용자에게 잠재적인 위험 인자를 나타내는지를 결정하는 것이 남아있다 (Ferdinand et al., 2005).

1975년에 Consroe 등은 발작을 제어하지 못하는 젊은 남성의 표준 치료법(페노바비탈 및 페니토인(phenytoin))의 사례를 기재하였다. 그가 사교적으로 칸나비스를 흡연하기 시작하였을 때, 그는 발작이 없었다. 그러나, 그가 칸나비스를 가지고만 있을 때에는 발작이 재발하였다. 이들은 '마리화나는 인간 간질에서 항경련 효과를 가질 수 있다'라고 결론을 내렸다.

Ng(1990)에 의한 연구는 이들의 첫 번째 발작 후 병원에 입원한 308명의 간질 환자의 많은 집단을 포함하였다. 이들은 발작하지 않은 294명의 환자의 대조 집단과 비교되었고, 칸나비스의 이용이 발작이 일어날 가능성을 감소시키는 것처럼 보였다는 것을 발견하였다. 그러나, 이 연구는 다른 방법 보다는 다소 '연구는 병원 입원 전에 건강 상태의 측정을 포함하지 않고 이들의 건강 상태의 차이는 이들의 약물 사용에 영향을 줄 수 있다'는 것처럼, '약한(weak)'으로 주장된 의학연구소 보고서(Institute of Medicine report)에서 혹평되었다.

3개의 대조 연구(controlled trials)는 칸나비디올의 항-간질 잠재성을 연구하였다. 각 칸나비디올을 전신성 대발작(generalised grand mal) 또는 병소 발작 (focal seizures)의 환자에게 경구 형태로 주었다.

Cunha 등 (1980)은 정통의학(conventional medication)으로 회복되지 않았던 16명의 대발작 환자에 관한 연구를 보고하였다. 이들은 200-300mg의 칸나비디올 또는 위약(placebo)으로 이들의 규칙적 약물 치료를 받았다. CBD를 수여받은 환자 중 3명은 완전한 개선, 2명은 부분적, 2명은 소수(minor)를 나타낸 반면, 1명은 변하지 않고 남아있었다. 단지 원하지 않은 효과는 가벼운 진정 작용(mild sedation)이었다. 위약을 수여받은 환자 중, 1명이 개선되었고, 7명은 변하지 않고 남아있었다.

Ames (1986)는 12명의 간질 환자가 표준 항간질 약물 외에 하루에 200-300mg의 칸나비디올을 받은 덜 성공적인 연구를 보고하였다. 발작 빈도에서 유의한 개선이 없는 것처럼 보였다.

Trembly 등 (1990)은 10개월 동안 하루에 900-1200mg의 칸나비디올을 받은 단일 환자와 함께 공개 연구(open trial)를 수행하였다. 이 단일 환자에서 발작 빈도는 현저하게 감소하였다.

CBD가 유익할 수 있다고 암시하는 공개본 외에, 이의 표준 치료법(페노바비탈 및 페니토인)에 반응하지 않는 5명의 시설 아동들에게 투여된 THC (tetrahydrocannabinol)의 보고서(Davis & Ramsey)가 있다. 한 명은 완전히 발작 소실되었고, 한 명은 거의 완전히 발작 소실되었으며, 다른 세 명은 전보다 더 악화되지 않았다.

WO 2006/054057에는 칸나비노이드 THCV(Tetrahydrocannabivarin)가 항간질로서 작용할 수 있다고 암시되었으며, 어떤 것은 Thomas 등 (2005)에 의해 확인되었다.

출원 WO 2007/138322는 CB1 및 CB2 수용체에서 반대 작용제(agonists)로 될 CBD를 나타내고, 이 화합물 및 CBDV를 포함하는 구조적으로 관련된 화합물을 암시하고, 이 수용체를 포함하는 광범위한 이상에서 치료적으로 유익할 수 있다. 더 상세하게는, 결과는 칸나비노이드 CBD가 랫트에서 체중을 감소시켰다는 것을 설명한다.

그러나, 칸나비노이드에 대한 다른 효과는 THC와 THCV의 구조적 유사성에도 불구하고 2개의 화합물은 CB1 수용체에서 매우 다르게 작용함으로써 프로필 칸나비노이드 유사체가 이의 펜틸 등가물로서 작용할 것이라고는 할 수 없다는 것을 나타낸다.

또한, 2007년에 Deshpande 등에 의한 연구는 CB1 길항제(antagonist) 리모나반트(rimonabant)가 경련유발제였다는 것을 확립하였고; 이 연구는 CB1 수용체의 길항작용이 간질성 활동(epileptic activity)을 야기하였다는 것을 입증하였다. 이 연구로부터 추론은 CB1 수용체의 길항제로서 작용하는 칸나비노이드가 항경련제로서 유용하지 않을 수 있으며; 정말로 이들이 이러한 이상을 악화시킬 수 있다는 것이다.

WO 2009/007697은 THCV 및 CBD 약학적 제형을 기재한다. 이러한 제형은 간질을 포함하는 많은 다른 유형의 질환에서 유용할 것으로 암시된다.

출원 WO 2007/083098은 신경보호 특성을 갖는 칸나비스 식물 추출물의 용도를 기재한다. THC 및 CBD를 함유하는 칸나비스 추출물은 의약품 분야에서 이의 순수한 상대물보다 더 효과적일 것으로 나타내었다.

출원 WO 02/064109는 칸나비노이드 THC 및 CBD가 사용된 약학적 제형을 기재한다. 출원은 이러한 칸나비노이드의 프로필 유사체도 제형에 사용될 수 있다는 상태로 계속한다. 이 출원이 쓰여졌기 때문에, THCV는 THC와 매우 다른 방법으로 작용하는 것으로 나타내었고, 따라서 칸나비노이드의 프로필 유사체는 이의 펜틸 상대물이 현재 유효하지 않은 것과 유사한 방법으로 작용할 수 있다고 가정하였다.

출원 GB0911580.9는 전신성 발작의 치료를 위한 THCV의 용도를 기재하고, CBD와 THCV의 조합의 용도도 기재한다.

그러나, 환자에서 환자로 변하는 발작 감수성(seizure susceptibility)으로 인해 부분적으로 40 이상의 인식할 수 있는 유형의 간질 증후군(epileptic syndrome)이 있으며(McCormick and Contreras, 2001, Lutz, 2004), 공격 (challenge)은 이러한 다양한 유형에 대한 효과적인 결과 약물이다.

신경성 활동(Neuronal activity)은 적당한 뇌 기능의 필요조건이다. 그러나, 신경성 활동의 흥분성 저해 평형(excitatory-inhibitory equilibrium)의 방해는 간질성 발작을 유도할 수 있다. 이러한 간질성 발작은 2개의 기본 종류로 분류될 수 있다:

a) 부분적 발작, 및

b) 전신성 발작.

부분적 발작은 특정 뇌 부분에서 생기고, 대부분 일반적으로 측두엽 (temporal lobes)(해마를 함유한)에 국소화되어 있는 반면, 전신성 발작은 부분적 발작의 이차 전신화로서 완전한 전뇌(entire forebrain)에서 나타난다(McCormick and Contreras, 2001 , Lutz, 2004). 간질 퇴치를 위한 세계연맹(International League Against Epilepsy)이 1969년 간질성 발작의 분류 체계를 공개할 때까지 부분적 및 전신성 발작 분류의 이 개념은 일반적인 관행이 되지 않았다(Merlis, 1970, Gastaut, 1970, Dreifuss et al., 1981).

또한, 간질 퇴치를 위한 세계연맹은 의식 상태의 존재 또는 손상에 따라, 이들을 간단하고 복잡하게 분리하는 부분적 발작을 분류하였다(Dreifuss et al., 1981).

또한, 연맹은 전신성 발작을 수많은 임상적 발작 유형으로 분류하였으며, 이들 중 몇몇 예는 하기에 개요를 설명하였다:

결신 발작(Absence seizures)은 종종 갑작스런 발병(sudden onset) 및 진행중인 활동의 중단을 갖는 것으로 발생한다. 또한, 말하기는 단 몇초 지속하는 발작과 함께 천천히 또는 방해된다(Dreifuss et al., 1981).

종종 "대발작(grand mal)"으로 알려진, 긴장성-간대성 발작(Tonic-clonic seizures)은 가장 빈번하게 마주치는 전신성 발작이다(Dreifuss et al., 1981). 이 전신성 발작 유형은 2개의 기(stage)를 가진다: 긴장성 근수축(tonic muscle contraction) 다음 경련성 운동의 간대성 기(clonic stage)로 후퇴한다. 환자는 다양한 기간 후에 발작 동안 무의식 상태로 남아있다.

"허약발생(drop attacks)"으로 알려진 무긴장성 발작(Atonic seizures)은 신체 내 특정 근육, 근육 군 또는 모든 근육에 근긴장(muscle tone)의 갑작스런 손실의 결과이다(Dreifuss et al., 1981).

간질성 발작의 발병은 장기간 건강 영향을 경험하는 환자와 함께 위협적인 삶일 수 있다(Lutz, 2004). 이러한 영향은 많은 형태로 나타날 수 있다:

- 정신 건강 문제 (예를 들어, 유년기(childhood)에 정상 글루타메이트 (glutamatergic) 시냅스 발달의 예방);

- 인지 결함(cognitive deficits) (예를 들어, 기억을 배우고 저장하는 해마에서 신경 회로 능력의 감소); 및

- 형태학적 변화(morphological changes) (예를 들어, 흥분세포독성 (excitotoxicity)의 결과로 내측 측두엽 간질(mesial temporal lobe epilepsy)을 나타내는 환자에서 해마의 CA1 및 CA3 영역에서 신경세포의 선택적 손실) (Swann, 2004, Avoli et al., 2005).

간질 또한 매우 긴 발작 소실 기간을 제외하면 대발작 또는 일상적인 일의 수행 불능 또는 차의 운전 불능의 원인으로 결과적 손상(consequential injury)(예를 들어, 두부외상(head injury))을 두려워하여 잠재적으로 사는 환자의 생활 양식에 매우 악영향을 미칠 수 있다는 점이 주목할 만하다(Fisher et al., 2000).

간질에서 CBD에 대한 중요한 효과에도 불구하고, 1980년대/1990년대 항-경련제의 분야에서 연구는 간질의 치료에 사용하기 위한 현재 승인된 많은 다른 후보물질을 중점적으로 다루었다. 이러한 약물은 아세토졸아미드(acetozolamide), 카바마제핀(carbamazepine), 클로바잠(clobazam), 클로나제팜(clonazepam), 에토숙시미드 (ethosuximide), 에슬리카바제핀 아세테이트(eslicarbazepine acetate), 가바펜틴(gabapentin), 라코사미드(lacosamide), 라모트리퀸(lamotriquine), 레베티라세탐(levetiracetam), 옥스카바제핀(oxcarbazepine), 페노바비탈(Phenobarbital), 페니토인(phenytoin), 프레가발린(pregabalin), 프리미돈(primidone), 루피나미드 (rufinamide), 소듐 발프로에이트(sodium valproate), 티아가빈(tiagabine), 토피라메이트(topiramate), 발프로에이트(valproate), 비가바트린(vigabatrin), 및 조니사미드(zonisamide)를 포함한다.

이들 중 몇몇의 작용 방법은 이해되고, 다른 것에 대해서는 알려져있지 않다. 몇몇의 작용 방법은 하기 표 1에 기술하였다: (조정된(Adapted from): Schachter SC. 발작의 치료. In: Schachter SC, Schomer DL, eds. 종합평가 (comprehensive evaluation) 및 간질의 치료. San Diego, CA: Academic Press; 1997. p. 61-74)

[표 1]

그러나, 20년 동안 간질의 치료를 위해 몇몇 20개의 다른 화합물의 도입에도 불구하고, 다양한 이유로 대안 약물이 필요하다:

i) 세계 인구의 1-2%는 간질로부터 고통받는다;

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/ppmc/articles/PMC1808496/);

ii) 이들 중 30%는 현재의 치료법으로는 다루기 힘들다; 그리고

iii) 또한 현재의 치료에서 현저한 운동 근육 부작용이 있다.

(http://en.wikipedia.org/wiki/Epilepsy)

예를 들어, 발프로에이트(valproate) 및 에토숙시미드(ethosuximide) 모두를 200 mg/kg 이상의 용량으로 랫트에게 주었을 때, 간질의 랫트 모델에서 250 mg/kg 이상의 용량으로 페노바비톤을 주었을 때와 마찬가지로, 현저한 운동 근육 및 다른 부작용(진정작용 포함하는)을 나타낸다.

간질의 in vivo 모델에 확립되고 광범하게 사용된 3개는 하기와 같다:

- 전신성 발작의 펜틸렌테트라졸-유도된 (pentylenetetrazole-induced, PTZ) 모델(Obay et al., 2007, Rauca et al., 2004);

- 측두엽(즉, 해마) 발작의 필로카르핀-유도된 모델(Pereira et al., 2007); 및

- 부분적 발작의 페니실린-유도된 모델(Bostanci and Bagirici, 2006).

이들은 인간의 치료 연구에 필수적인 발작 및 간질 모델의 범위를 제공한다.

본 발명의 목적은 간질의 치료에 사용하기 위한 신규한 항-경련제를 동정하는 것이다.

바람직하게는, 신규한 항-경련제는 현재의 약물 치료, 표준 항-간질 약물 (standard anti-epileptic drugs, SAEDs)에 의해 적당히 제공되지 않는 현재의 분야에서 효과적일 것이다.

바람직하게는, 신규한 항-경련제는 특히 운동 근육 부작용에 관한 한 현재의 SAEDs 보다 더 우수한 부작용 프로파일을 가질 것이다.

또한, 이러한 현재의 SAEDs의 몇몇 부작용에 대항하여 사용될 충족되지 않는 요구를 고심하고 및/또는 더 낮은 용량을 허여하는, 간질의 표준 치료법과 함께 효과가 있는 화합물이 바람직할 것이다.

정의

"파이토칸나비노이드(Phytocannabinoids)"는 자연에서 유래된 칸나비노이드이고 칸나비스 식물에서 발견될 수 있다. 파이토칸나비노이드는 분리된 칸나비노이드일 수 있고 또는 식물성 약물로서 존재할 수 있다.

"분리된 칸나비노이드(isolated cannabinoid)"는 칸나비스 식물로부터 추출되고 이차 및 중요하지 않은(minor) 칸나비노이드와 같은 모든 추가 성분 및 비-칸나비노이드 분획이 제거될 정도로 정제된 파이토칸나비노이드로서 정의된다.

"식물성 약물(botanical drug substance)" 또는 "BDS"는 보건 복지부(US Department of Health and Human Services), FDA 의약품 평가 연구센터(Food and Drug Administration Centre for Drug Evaluation and Research)에서 2000년 8월에 발간된, 천연물 의약품 규정(Guidance for Industry Botanical Drug Products Draft Guidance)에 정의된다: "하나 이상의 식물, 조류, 또는 미세 균류 (microscopic fungi)로부터 유래된 약물. 이것은 하나 이상의 하기 과정에 의해 식물성 원료로부터 제조된다: 분쇄(pulverisation), 달임(decoction), 짜내기 (expression), 수성 추출, 에탄올 추출 또는 기타 유사한 과정". 식물성 약물은 천연 자원으로부터 유래된 고도로 정제되거나 화학적으로 변형된 물질을 포함하지 않는다. 따라서, 칸나비스의 경우, 칸나비스 식물로부터 유래된 BDS는 고도로 정제된 약전 등급의 칸나비노이드를 포함하지 않는다.

본 발명에서 BDS는 2개 성분을 가진다고 생각된다: 파이토칸나비노이드-함유 성분 및 비-파이토칸나비노이드 함유 성분. 바람직하게는, 파이토칸나비노이드-함유 성분은 총 BDS의 50%(w/w) 이상을 포함하는 더 큰 성분이고, 비-파이토칸나비노이드 함유 성분은 총 BDS의 50%(w/w) 이하를 포함하는 더 작은 성분이다.

BDS 내 파이토칸나비노이드-함유 성분의 양은 총 추출물의 55% 이상, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 이상일 수 있다. 실제 양은 사용된 출발물질 및 사용된 추출방법을 따를 가능성이 높다.

BDS 내 "본질 파이토칸나비노이드(principle phytocannabinoid)"는 다른 파이토칸나비노이드의 양보다 더 높은 양으로 존재하는 파이토칸나비노이드이다. 바람직하게는, 본질 파이토칸나비노이드는 총 추출물의 40%(w/w) 이상의 양으로 존재한다. 더 바람직하게는, 본질 파이토칸나비노이드는 총 추출물의 50%(w/w) 이상의 양으로 존재한다. 더욱 더 바람직하게는, 본질 파이토칸나비노이드는 총 추출물의 60%(w/w) 이상의 양으로 존재한다.

BDS 내 본질 파이토칸나비노이드의 양은 바람직하게는 75% 이상의 파이토칸나비노이드-함유 분획, 더 바람직하게는 85% 이상의 파이토칸나비노이드-함유 분획, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상의 파이토칸나비노이드-함유 분획이다.

어떤 경우, 본질 파이토칸나비노이드가 CBDV 또는 THCVA인 경우 BDS 내 본질 파이토칸나비노이드의 양은 더 낮다. 여기서 파이토칸나비노이드의 양은 바람직하게는 55% 이상의 파이토칸나비노이드-함유 분획이다.

BDS 내 "이차 파이토칸나비노이드(secondary phytocannabinoid/s)"는 중요한 비율로 존재하는 파이토칸나비노이드이다. 바람직하게는, 이차 파이토칸나비노이드는 총 추출물의 5%(w/w) 이상, 더 바람직하게는 총 추출물의 10%(w/w) 이상, 더욱 더 바람직하게는 총 추출물의 15%(w/w) 이상의 양으로 존재한다. 몇몇 BDS's는 중요한 양으로 존재하는 둘 이상의 이차 파이토칸나비노이드를 가질 것이다. 그러나, 모든 BDS's가 이차 파이토칸나비노이드를 가지지는 않을 것이다. 예를 들어 CBG BDS는 이의 추출물에서 이차 파이토칸나비노이드를 가지지 않는다.

BDS 내 "중요하지 않은 파이토칸나비노이드(minor phytocannabinoid/s)"는 일단 본질 및 이차 파이토칸나비노이드가 확인되면 모든 파이토칸나비노이드 성분의 나머지로 기재될 수 있다. 바람직하게는, 중요하지 않은 파이토칸나비노이드는 총 추출물의 10%(w/w) 이하, 더 바람직하게는 총 추출물의 5%(w/w) 이하의 양으로 존재하고, 가장 바람직하게는 중요하지 않은 파이토칸나비노이드는 총 추출물의 2% (w/w) 이하의 양으로 존재한다.

일반적으로, BDS의 비-파이토칸나비노이드 함유 성분은 테르펜, 스테롤, 트리글리세라이드, 알칸, 스쿠알렌, 토코페롤 및 카로테노이드를 포함한다.

이들 화합물은 단독으로 또는 파이토칸나비노이드와 조합하여 BDS의 약리학에서 중요한 역할을 할 수 있다.

"테르펜 분획(terpene fraction)"은 중요할 수 있고, 테르펜의 유형으로 나누어질 수 있다: 모노테르펜 또는 세스퀴테르펜. 이들 테르펜 성분은 칸나비노이드와 유사한 방식으로 더 정의될 수 있다.

BDS 내 비-파이토칸나비노이드 함유 성분의 양은 총 추출물의 45% 이하, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% 이하일 수 있다. 실제 양은 사용된 출발물질 및 사용된 추출방법을 따를 가능성이 높다.

BDS 내 "본질 모노테르펜(principle monoterpene/s)"은 다른 모노테르펜의 양보다 더 높은 양으로 존재하는 모노테르펜이다. 바람직하게는 본질 모노테르펜은 총 테르펜 함량의 20%(w/w) 이상의 양으로 존재한다. 더 바람직하게는, 본질 모노테르펜은 총 테르펜 함량의 30%(w/w) 이상, 더욱 더 바람직하게는 총 테르펜 함량의 40%(w/w) 이상, 더욱 더 바람직하게는 총 테르펜 함량의 50%(w/w) 이상의 양으로 존재한다. 본질 모노테르펜은 바람직하게는 미르센(myrcene) 또는 피넨(pinene)이다. 어떤 경우, 2개의 본질 모노테르펜이 있을 수 있다. 이러한 경우, 본질 모노테르펜은 바람직하게는 피넨 및/또는 미르센이다.

BDS 내 "본질 세스퀴테르펜(principle sesquiterpene)"은 모든 다른 테르펜보다 더 높은 양으로 존재하는 세스퀴테르펜이다. 바람직하게는 본질 세스퀴테르펜은 총 테르펜 함량의 20%(w/w) 이상, 더 바람직하게는 총 테르펜 함량의 30%(w/w) 이상의 양으로 존재한다. 본질 세스퀴테르펜은 바람직하게는 카리오필렌 (caryophyllene) 및/또는 후물렌(humulene)이다.

세스퀴테르펜 성분은 "이차 세스퀴테르펜(secondary sesquiterpene)"을 가질 수 있다. 이차 모노테르펜은 바람직하게는 피넨이고, 바람직하게는 총 테르펜 함량의 5%(w/w) 이상의 양으로 존재하고, 더 바람직하게는 이차 테르펜은 총 테르펜 함량의 10%(w/w) 이상의 양으로 존재한다.

이차 세스퀴테르펜은 바람직하게는 후물렌이고, 바람직하게는 총 테르펜 함량의 5%(w/w) 이상의 양으로 존재하고, 더 바람직하게는 이차 테르펜은 총 테르펜 함량의 10%(w/w) 이상의 양으로 존재한다.

대안적으로, 식물성 추출물은 제로(zero) 칸나비노이드 식물 또는 CBG-없는 BDS로부터 얻어질 수 있는 바와 같이, 분리된 파이토칸나비노이드를 비-칸나비노이드 식물 분획에 도입함으로써 제조될 수 있다.

CBDV의 구조는 하기에 나타내었다:

파이토칸나비노이드는 칸나비노이드의 추출에 사용된 방법에 따라 중성(탈카복실화 형태) 또는 카복실산 형태로서 발견될 수 있다. 예를 들어, 카복실산 형태의 가열은 대부분의 카복실산 형태를 탈카복실화하여 중성 형태로 야기될 것이라는 것이 알려져 있다.

파이토칸나비노이드는 펜틸(5 탄소 원자) 또는 프로필(3 탄소 원자) 이형 (variant)으로서 발생할 수도 있다. 처음에 프로필 및 펜틸 이형은 유사한 성질을 가진다고 생각하였으나, 최근 연구는 이것이 사실이 아니라고 암시한다. 예를 들어, 파이토칸나비노이드 THC는 CB1 수용체 작용제임이 알려진 반면 프로필 이형 THCV는 거의 반대 효과를 가지는 것을 의미하는 CB1 수용체 길항제임을 발견하였다.

이것은 칸나비노이드 수용체 리간드에서 Pertwee (2000)에 의해 확인되었다: 식욕 억제(appetite suppression), 파킨슨병에 결린 환자의 L-도파 운동이상증 (dyskinesia)의 감소, 급성 정신분열증(acute schizophrenia)의 관리 및 알츠하이머병과 관련된 인지기억장애의 개선을 포함하는 CB1 수용체 길항제에 대해 잠재적인 치료 표적을 기재하는 미래 약물 발견 및 개발에 관련된 임상 및 신경약리학 고려사항. 이들 치료 표적 모두 식욕촉진 및 통증의 감소와 같은 CB1 수용체 작용제에 대해 암시된 것과 매우 다르다.

임상 개발을 위한 CBDV 제형은 CBDV BDS 또는 분리된 CBDV를 함유하는 경구 전달될 것으로 예상된다.

단위 용량은 치료될 간질의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다. 각 단위 용량은 1000mg보다 작거나 같은 CBDV를 포함할 수 있고, 얻어진 용량의 수 또한 환자의 필요조건을 맞추기 위해 달라질 수 있다.

발명의 간단한 개요

본 발명의 첫 번째 측면에 따르면, 간질 발작의 치료에 사용하기 위한 파이토칸나비노이드 CBDV를 제공한다.

간질의 MES 모델에서 CBDV는 CBD보다 상당히 훨씬 더 큰 항-경련 활성을 나타내었다.

본 발명의 두 번째 측면에 따르면, 간질 발작의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에서 파이토칸나비노이드 CBDV의 용도를 제공한다.

약제는 CBDV 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 제형일 수 있다.

본 발명의 세 번째 측면에 따르면, 파이토칸나비노이드 CBDV의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 간질 발작의 치료방법을 제공한다.

바람직하게는, 치료될 간질 발작의 유형은 전신성 발작 또는 측두엽 발작이다.

하나의 실시예에서, CBDV는 하나 이상의 치료적으로 효과적인 파이토칸나비노이드와 함께 사용된다.

바람직하게는, 하나 이상의 치료적으로 효과적인 파이토칸나비노이드는 THCV 및/또는 CBD이다.

하나의 실시예에서, CBDV는 분리된 형태이다.

추가 실시예에서, CBDV는 식물성 약물의 형태이다.

여전히 추가 실시예에서, CBDV는 표준 항-간질 약물과 조합하여 사용된다. SAED는 나트륨 또는 칼슘 통로를 통해 작용하는 작용 메커니즘을 갖는 것, 더 바람직하게는

- 에토숙시미드에 의해 예시된 바와 같이, 저-역치(low-threshold) 또는 일시적인 신경 칼슘 전류(transient neuronal calcium currents)를 변화시키는; 또는

- 발프로에이트에 의해 예시된 바와 같이, 고주파 신경 흥분 및 나트륨-의존성 활동 전위(action potential)를 감소시키고, 부가적으로 GABA 효과를 향상시킬 수 있는, 것과 조합하여 사용된다:

대안적으로 SAED는 페노바비탈에 의해 예시된 바와 같이, GABA의 저해 (GABAergic inhibition)를 향상시키는 작용 메커니즘을 갖는 것일 수 있다.

조합은 하기의 것 중 하나 이상으로 유익하게 나타날 수 있다:

a. 긴장성-간대성 발작의 발생률의 감소;

b. 환자가 발작 소실되는 시간의 양의 증가;

c. 발작의 발병 잠복 증가;

d. 발작의 전체 기간 감소;

e. 발작의 중증도 및 사망률(mortality) 감소; 및

f. SAEDs와 관련된 운동 근육 및 기타 부작용 (진정 작용 포함하는)의 감소.

따라서, 조합은 현재의 약물 치료에 면역성이 일반적으로 검토된 이상 (condition)의 치료에 특히 적합하다. 또한, 조합은 단독으로 사용될 SAED 보다 더 낮은 용량의 SAED's의 사용을 고려하여 나타날 것이다.

본 발명의 네 번째 측면에 따르면, 간질 발작의 치료에 사용하기 위한, 파이토칸나비노이드 함유 성분 및 비-파이토칸나비노이드 함유 성분을 포함하는 칸나비스 식물 추출물을 제공하고, 여기서 파이토칸나비노이드 함유 성분은 적어도 50% (w/w)의 칸나비스 식물 추출물을 포함하고 본질 파이토칸나비노이드로서 CBDV 및 이차 파이토칸나비노이드로서 CBD를 함유하고, 비-파이토칸나비노이드 함유 성분은 모노테르펜 분획 및 세스퀴테르펜 분획을 포함한다.

본 발명의 다섯 번째 측면에 따르면, 간질 발작의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에서, 파이토칸나비노이드 함유 성분 및 비-파이토칸나비노이드 함유 성분을 포함하는 칸나비스 식물 추출물의 용도를 제공하고, 여기서 파이토칸나비노이드 함유 성분은 적어도 50% (w/w)의 칸나비스 식물 추출물을 포함하고 본질 파이토칸나비노이드로서 CBDV 및 이차 파이토칸나비노이드로서 CBD를 함유하고, 비-파이토칸나비노이드 함유 성분은 모노테르펜 분획 및 세스퀴테르펜 분획을 포함한다.

바람직하게는, 칸나비스 식물 추출물은 THCV를 더 포함한다.

바람직하게는, 파이토칸나비노이드 함유 성분은 64-78% (w/w)의 칸나비스 식물 추출물을 포함한다.

바람직하게는, 파이토칸나비노이드 함유 성분은 총 파이토칸나비노이드 분획의 52-64% (w/w)의 CBDV, 총 파이토칸나비노이드 분획의 22-27% (w/w)의 CBD 및 총 파이토칸나비노이드 분획의 3.9-4.7% (w/w)의 THCV를 더 포함한다.

발명의 실시예는 수반하는 도면에 관하여 하기에 더 상세히 설명한다:
도 1은 CBDV가 PTZ-유도된 발작의 발병 및 발달에 미치는 영향을 나타낸다;
도 2는 CBDV가 발작의 중증도 및 사망률에 미치는 영향을 나타낸다;
도 3 A-C는 CBDV 및 에토숙시미드가 PTZ-유도된 발작에 미치는 영향을 나타낸다;
도 4 A-D는 CBDV 및 에토숙시미드가 PTZ-유도된 발작에서 발작의 발생률 및 사망률에 미치는 영향을 나타낸다;
도 5는 CBDV 및 발프로에이트가 PTZ-유도된 발작(발병 잠복 및 발작 기간)에 미치는 영향을 나타낸다;
도 6 A-B는 CBDV 및 발프로에이트가 PTZ-유도된 발작에서 발작의 중증도 및 사망률에 미치는 영향을 나타낸다;
도 7 A-D는 필로카르핀-유도된 발작(발작 중증도, 사망률, 발작 소실 및 발병 잠복)에서 다른 용량의 CBDV 단독의 효과를 나타낸다;
도 8 A-D는 다른 용량의 CBDV가 필로카르핀-유도된 발작(우발(episodes)의 수, 우발 중등도, 우발 잠복 및 우발 기간)에서 발작 우발에 미치는 영향을 나타낸다;
도 9 A-B는 필로카르핀-유도된 발작(중등도 및 사망률)에서 고용량 (200mg/Kg) CBDV 및 발프로에이트의 효과를 나타낸다;
도 10 A-B는 필로카르핀-유도된 발작(양측성 잠복(bilateral latency) 및 발생률)에서 고용량 (200mg/Kg) CBDV 및 발프로에이트의 효과를 나타낸다;
도 11 A-B는 필로카르핀-유도된 발작(긴장성-간대성 발생률(tonic clonic incidence) 및 기간)에서 고용량 (200mg/Kg) CBDV 및 발프로에이트의 효과를 나타낸다;
도 12 A-B는 필로카르핀-유도된 발작(중등도 및 사망률)에서 CBDV 및 페노바비탈의 효과를 나타낸다;
도 13 A-B는 필로카르핀-유도된 발작(발작 소실 및 발병 잠복)에서 CBDV 및 페노바비탈의 효과를 나타낸다;
도 14는 THCV BDS 및 70mg/kg PTZ가 초기 및 이후 발작 중증도에 미치는 영향을 나타낸다;
도 15는 THCV BDS 및 70mg/kg PTZ가 발작 기간 및 사망 시간에 미치는 영향을 나타낸다;
도 16은 THCV BDS 및 70mg/kg PTZ가 평균 중증도 점수에 미치는 영향을 나타낸다;
도 17은 THCV BDS 및 70mg/kg PTZ가 사망률에 미치는 영향을 나타낸다;
도 18은 THCV BDS 및 80mg/kg PTZ가 초기 및 이후 발작 중증도에 대한 잠복에 미치는 영향을 나타낸다;
도 19는 THCV BDS 및 80mg/kg PTZ가 발작 기간 및 사망 시간에 미치는 영향을 나타낸다;
도 20은 THCV BDS 및 80mg/kg PTZ가 평균 중증도 점수에 미치는 영향을 나타낸다;
도 21은 THCV BDS 및 80mg/kg PTZ가 사망률에 미치는 영향을 나타낸다;
도 22 A-D는 분리된 THCV와 함께 PTZ-유도된 발작 발달 및 기간을 나타낸다;
도 23 A-B는 CBD가 PTZ-유도된 발작에 미치는 영향을 나타낸다;
도 24는 비히클이 로타로드 수행(rotarod performance)에 미치는 영향을 나타낸다;
도 25는 CBDV가 로타로드 수행에 미치는 영향을 나타낸다.
도 1의 설명: A-C: 기간(s)에서 발작 발병(A), 간대성(B) 및 긴장성-간대성(C) 발작에 대한 잠복. 통계적 유의성은 ANOVA 및 사후 터키 검증(post hoc Tukey test)에 의해 평가되었고, p≤0.05는 두 경우에서 유의한 것으로 간주되었다. 결과는 ± S.E.M. (표준편차)로 나타내고, *는 p<0.05를 나타낸다.
도 2의 설명: A: 발작의 평균 중등도 (회색선), 또한 25^th 및 75^th 백분위수 (percentiles) (검정 가로선) 및 최대 및 최소 값 (각각 위 아래 오차 막대(error bar))을 나타낸다. B: 긴장성-간대성 발작이 발달된 각 군에서 동물의 비율. C: 죽은 각 군에서 동물의 비율. D: PTZ 투여 후 발작 소실된 각 군에서 동물의 비율. *, ** 및 ***은 각각 p≤0.05, 0.01 및 0.001을 나타낸다. A: ANOVA 및 사후 터키 검증에 의해 시험된 평균 결과. B-D: 이항통계검정(binomial statistics test)에 의해 시험된 백분율.
도 3의 설명: A: 발병 잠복 ± S.E.M. B: 중등도; 평균값은 붉은색으로 나타내고, 25^th 및 75^th 백분위수는 박스로 나타내고, 각 군에서 최대 및 최소는 오차 막대로 나타낸다. C: 발작 기간 ± S.E.M.
도 4의 설명: A: CBDV가 발작 소실된 동물의 비율에 미치는 영향 (%). B&C: CBDV가 간대성(B) 및 긴장성-간대성(C) 발작이 발달된 동물의 비율에 미치는 영향(%). D: CBDV가 사망률에 미치는 영향(%).
도 7의 설명: A: CBDV가 전체 발작 중증도에 미치는 영향. 회색선은 각 군의 평균 중증도를 나타내고, "박스"는 25^th 및 75^th 백분위수 범위로 나타내고, 오차 막대는 최대 및 최소로 나타낸다. B, C: CBDV가 사망률 백분율(B) 및 발작 소실된 동물의 백분율(C)에 미치는 영향. 발작 소실은 [1] 또는 [0]의 점수로 간주되었다. D: 발작 중등도 [2] 이상의 첫 번째 표시를 위한 몇 초안에 발병 잠복(± S.E.M).
도 8의 설명: A: 발작 우발의 평균 수(동물 당, 발작 경험한 동물만 포함됨). B: 실험군에서 모든 우발의 평균 중증도, 플롯의 설명에 대해 도 1(PILO) 참조. C: 몇 초 안에 첫 번째 우발(± S.E.M)에 대한 잠복. D: 실험군에서 모든 우발의 평균 기간 (± S.E.M).
도 14의 설명: 첫 번째 근간대성 경련(myoclonic jerk, FMJ)에 대한 평균 잠복 점수는 3.5 ± S.E.M을 나타낸다(n = 8-10).
도 15의 설명: 생존한 동물에서 발작의 평균 기간, 및 죽은 동물에서 첫 번째 발작 징후부터 사망까지의 시간은 실험군 내에서 죽은 동물의 비율에 따라 비히클 또는 저, 중간 또는 고 용량에 대해 ± S.E.M을 나타낸다(n = 3-10). ∫= 비히클 군은 사망하지 않았고, 그래서 값은 여기에 나타내지 않았다.
도 16의 설명: 모든 군(n = 10)에 대해 비히클 또는 저, 중간 또는 고 용량으로 처리된 동물군에 대한 평균 중증도 점수.
도 17의 설명: 모든 군(n = 10)에 대해 비히클 또는 저, 중간 또는 고 용량으로 처리된 동물에 대한 백분율로서 나타낸 사망률. ∫= 비히클 군은 사망하지 않았고, 따라서 값은 나타내지 않았다.
도 18의 설명: 첫 번째 근간대성 경련(FMJ)에 대한 평균 잠복 점수는 비히클 또는 저, 중간 또는 고 용량에 대해 3.5 ± S.E.M을 나타낸다(n = 7-10).
도 19의 설명: 생존한 동물에서 발작의 평균 기간, 및 죽은 동물에서 첫 번째 발작 징후부터 사망까지의 시간은 실험군 내에서 죽은 동물의 비율에 따라 비히클 또는 저, 중간 또는 고 용량에 대해 ± S.E.M을 나타낸다(n = 3-7).
도 20의 설명: 모든 군(n = 10)에 대해 비히클 또는 저, 중간 또는 고 용량으로 처리된 동물군에 대한 평균 중증도 점수.
도 21의 설명: 모든 군(n = 10)에 대해 비히클 또는 저, 중간 또는 고 용량으로 처리된 동물에 대한 백분율로서 나타낸 사망률.
도 22의 설명: A, B 및 C는 특정 군 내의 각 마커의 발생률에 따라 비히클 및 THCV-용량군(n=5-16)에 대해 80 mg/kg PTZ의 주사로부터 발작의 첫 번째 징후 (A); 근간대성 발작의 발달(B) 및 완전한 긴장성-간대성 발작(C) 까지의 평균 잠복을 나타낸다. D는 생존 후 발작 동물에서 발작의 평균 기간(s)을 나타낸다. 모든 값은 ± S.E.M이고, *는 비히클 군으로부터 유의한 차이를 나타낸다 (P<0.05; 만-휘트니 U 검정(Mann-Whitney U test)).
도 23의 설명: A: 비히클 및 CBD-투여된(1, 10, 100mg/kg CBD) 동물 (모든 군에 대해 n=15)에서 80mg/kg PTZ의 복강내(IP) 주사의 결과로 경험한 % 사망률. B: 80mg/kg PTZ의 복강내(IP) 주사의 결과로 긴장성-간대성 발작을 경험한 비히클 및 CBD-투여된(1, 10, 100mg/kg CBD) 동물의 %. *는 유의한 결과를 나타낸다 (P<0.01).
도 24의 설명: 소금물 및 2:1:17 크레모포:에탄올:소금물의 투여 후에 로타로드로부터 떨어지는 평균 잠복 ± S.E.M.
도 25의 설명: 25^th 및 75^th 백분위수(검정 박스) 및 최대 및 최소 값(오차 막대)을 갖는 로타로드(회색 막대)로부터 떨어지는 평균 잠복도 나타내었다.

하기 실시예 1 내지 5는 간질의 다른 모델에서 분리된 CBDV의 용도를 기재한다. 또한 실시예는 비-파이토칸나비노이드 함유 분획과 함께 이차 및 중요하지 않은 파이토칸나비노이드 외에 본질 칸나비노이드를 함께 포함하는 파이토칸나비노이드 BDS를 기재할 것이다.

실시예 1

해마 뇌 절편(hippocampal brain slices)에서 2개의 in vitro 간질양 (epileptiform) 모델에서 분리된 CBDV의 용도

해마 절편은 P>21 위스타 랫트(Wistar rats)로부터 날카롭게 생산되었으며, 활동은 다중전극기판(multi-electrode arrays, MEA)으로 기록하였다.

간질양 활동을 유도하기 위해, Mg²⁺를 제거하거나(Mg²⁺-없는 모델) 또는 100μΜ 4-아미노피리딘을 가하였다(4-AP 모델). 30분 후, 간질양 폭발 활동 (epileptiform burst activity)을 확립하였으며, CBDV를 누적적으로 가하였다(1, 10, 100μΜ; 각 30분).

CBDV가 간질양 폭발 진폭(epileptiform burst amplitude) 및 기간에 미치는 영향을 측정하였다(표 2.1).

전반적으로, ≥10μΜ 또는 100μΜ의 CBDV는 CBDV의 항-간질양 효과에 대해 가장 민감한 CA1 및 DG 영역 및 가장 덜 민감한 CA3를 갖는 양쪽 모델에서 폭발 기간 및 진폭을 유의하게 감소시켰다.

[표 2.1] CBDV가 Mg ²⁺ 없는 및 4-AP 모델에서 유도된 간질양 활동에 미치는 영향

결과는 평균±S.E.M 이고; 각각 * = p≤0.05 및 ** = p≤0.01, 윌콕슨 쌍 검정(Wilcoxon paired test).

5 랫트/모델로부터 결과, n=9-13 전극.

실시예 2

전신성 발작의 PTZ 모델에서 분리된 CBDV 의 용도

방법:

동물:

수컷 위스타 랫트 (P24-29; 75-1 10g)를 사용하여 전신성 발작의 PTZ 모델에서 파이토칸나비노이드 CBDV의 효과를 평가하였다. 동물을 실험 전에 시험 환경, 우리(cage), 주입 프로토콜 및 취급에 익숙하게 하였다. 동물은 먹이와 물을 자유로이 섭취하면서, 50% 습도에서 12시간 명암 주기(광원 0900)로 21℃의 방에서 수용되었다.

인간등가용량(human dose equivalent, HED)을 하기 식을 이용하여 측정할 수 있다:

HED = 동물 용량(animal dose) (mg/kg) × [동물 Km / 인간 Km]

랫트의 Km은 6이고, 인간의 Km은 37이다.

따라서, 랫트에서 200mg/Kg 용량은 대략 60Kg의 인간에 대해 약 2000mg의 인간의 일일 용량과 동등한 것으로 나타낼 것이다.

실험 설정( experimental setup )

5개의 뚜껑 달린 6L 펄스펙스 탱크(Perspex tanks)를 이들 사이의 칸막이가 있는 단일 벤치 위에 놓았다. 폐쇄 회로 텔레비젼(Closed-circuit television, CCTV) 카메라를 칸막이 위에 올려놓고 랫트의 행동을 관찰하였다. Sony Topica CCD 카메라(Bluecherry, USA)를 Brooktree digital capture cards (Bluecherry, USA)를 통해 저-소음 PC의 BNC 케이블을 통해 연결하였다. Zoneminder (http://www.zoneminder.com) 소프트웨어를 사용하여 랫트를 관찰하고, 레코딩을 시작과 종료하고, 비디오 파일을 다루었다. 사내 리눅스 스크립(In-house Linux scripts)을 사용하여 The Observer (Noldus Technologies)을 이용한 추가 오프라인 분석을 위해 비디오 화일을 적당한 포맷으로 암호화하였다.

PTZ 모델:

PTZ의 용량 범위(50-100mg/kg 체중)를 사용하여 발작의 유도를 위한 가장 바람직한 용량을 결정하였다(하기 참조). 그 결과, 80mg/kg의 용량을 복강내(IP; 0.9% 소금물 내 저장 용액 50mg/ml) 주입하여 CBDV를 선별하였다.

실험 프로토콜:

시험 날, 음성 대조군으로 칸나비노이드 비히클(2:1:17 에탄올:크레모포: 0.9% w/v NaCl 용액)의 대등한 부피로 주입된 동물과 함께 순수한 CBDV를 50, 100 및 200 mg/kg의 용량으로 복강내(i.p.) 주사를 통해 투여하였다. 1시간 동안 동물을 관찰한 다음, 이후 동물은 80mg/kg PTZ를 복강내 주사받았다. 음성 비히클 대조군을 칸나비노이드-투여된 피험자와 병행하여 수행하였다. PTZ를 복용한 후, 동물을 관찰하고 비디오로 녹화하여 발작의 중증도 및 다양한 발작 행동 유형의 잠복을 결정하였다(하기 in vivo 분석 참조). 발작의 마지막 징후 후 30분 동안 동물을 촬영한 다음, 이들의 우리로 갖다놓았다.

in vivo 분석:

실험 과정 동안 동물을 관찰하였으나, 모든 분석은 관찰자 행동 분석 소프트웨어(The Observer behavioural analysis software; Noldus, Netherlands)를 이용하여 기록된 비디오 화일로 오프라인 수행되었다. 발작 중증도 점수 시스템을 사용하여 피험자에 의해 경험된 발작의 수준을 결정하였다(Pohl & Mares, 1987). 발작의 모든 징후는 모든 동물을 위해 상세히 설명하였다.

[표 3.1] Pohl & Mares, 1987로부터 조정된 발작 중증도 점수 등급

PTZ의 주입으로부터 발작 발달의 특정 지표까지의 잠복:

PTZ의 주입으로부터 첫 번째 근간대성 경련(myoclonic jerk, FMJ; 1점) 및 "강직성 성분 및 신체 비틀림이 있는 간헐성 경련"에 이른 동물(3.5점) 까지의 잠복 (몇 초)을 기록하였다. FMJ는 발작성 활동의 발병의 지표이고, >90%의 동물은 3.5점으로 발달하였고, 그래서 더 중증의 발작의 발달의 우수한 마커이다. 결과는 실험군 내에서 평균±S.E.M로 나타낸다.

최대 발작 증증도:

이것은 하기 점수 등급을 기준으로 각 실험군에 대해 평균값으로 주어진다.

% 사망률:

실험군 내 죽은 동물의 백분율은 PTZ-유도된 발작의 결과이다. 긴장성-간대성 발작이 발달된(4점 및 5점) 동물의 대부분은 죽었고, 6점(사망)은 자동적으로 동물이 긴장성-간대성 발작을 경험하였다는 것을 의미하는 것에 주목하라.

발작 기간:

살아있는 동물 및 살아있지 않은 동물로 분리된 - 발작의 첫 번째 징후(일반적으로 FMJ)부터 발작의 마지막 징후까지 또는 죽은 피험자의 경우는 사망 시간까지의 시간. 이것은 각 실험군에 대해 평균±S.E.M로 주어진다.

통계:

잠복 및 중증도의 측정을 위해, 일원배치분산분석(one way analysis of variance, ANOVA)을 4개 군(비히클 및 50, 100 및 200mg/kg CBDV)에서 수행하여CBDV의 전체 효과를 탐색하였다 (p≤0.05 유의한 것으로 간주됨).

유의한 ANOVA 결과는 비히클 및 약물군 사이의 차이를 시험하기 위해 사후 터키 검증을 수행하였다 (터키 검증, p≤0.05 유의한 것으로 간주됨).

결과:

도 1은 80mg/kg PTZ의 투여로부터 발작 발병(도 1A); 간대성 발작의 발달(도 1B) 및 긴장성-간대성 발작의 발달(도 1C)까지의 잠복을 나타내는 발작의 발병 및 발달을 설명한다.

발작 발병의 잠복에 대한 CBDV의 유의한 효과가 관찰되었다(p=0.041; 도 1A); 이 측정은 비히클 단독(p=0.03)으로 수여받은 동물보다 200mg/kg CBDV를 수여받은 동물에서 유의하게 더 높았다.

간대성 발작의 잠복에 대한 CBDV의 거의-유의한 효과(p=0.055)가 관찰되었으며(도 1B); 비히클-처리된 동물(p=0.032)에 비해 200mg/kg CBDV 투여된 동물에서 유의하게 증가됨을 강조하였다.

비히클과 200mg/kg CBDV 군 사이의 평균값의 큰 차이에도 불구하고, 긴장성-간대성 발작의 잠복에 대한 전체 또는 어느 특정 용량에서의 CBDV의 유의한 효과 (p=0.055)는 관찰되지 않았다(도 1C); 이는 200mg/kg CBDV로 처리된 이러한 발작이 발달된 동물의 낮은 수에 기인한 것으로 생각된다.

또한, 다른 군에서 동물에 의해 경험된 발작의 중증도는 4가지 측정을 이용하여 평가되었다: 평균 중증도(도 2A); 긴장성-간대성 발작을 갖는 동물의 비율(가장 심각한 발작 유형; 도 2B); 및 사망률(도 2C) 및 최종적으로 PTZ 투여 후 발작 소실된 동물의 비율(도 2D).

발작 중증도에 대한 CBDV의 전체 유의한 효과가 있다(p=0.007; 도 2A); 200mg/kg CBDV로 처리된 동물은 비히클 단독 처리된 동물(p=0.014)보다 유의하게 더 낮은 평균 중증도를 가졌다.

이는 비히클-처리된 동물(15 중 8; 도 2B; p=0.01)에 비해 가장 심각한(긴장성-간대성) 발작(15 중 3)에 달하는 200mg/kg CBDV로 처리된 동물의 더 낮은 비율을 반영하였다.

이 유의한 효과는 100mg/kg CBDV로 처리된 동물(15 중 4 긴장성-간대성 발작; p=0.036)에서 유지되었으나, 50mg/kg는 그렇지 않았다.

100mg/kg 및 200mg/kg CBDV로 처리된 동물(각각 15 중 1 및 2)의 유의하게 더 낮은 비율은 비히클-처리된 군(15 중 8; 각각 p=0.002 및 <0.001; 도 2C)에 비해 사망하였다.

최종적으로, 200mg/kg CBDV로 처리된 동물의 유의하게 더 높은 비율은 비히클 군(15 중 1; p=0.003; 도 2D)에 비해 발작을 전혀 경험하지 않았다(15 중 5).

결론:

상기 결과로부터 CBDV는 항-간질 약물로 커다란 잠재성을 보임을 나타낼 것이다.

실시예 3

전신성 발작의 PTZ 모델에서 표준 항-간질 약물(SAEDs)과 함께 분리된 CBDV의 용도

방법:

상기 실시예 2에 기재된 바와 같이, SAED's 에토숙시미드 및 발프로에이트의 변화하는 용량을 200mg/kg의 용량의 분리된 CBDV와 조합하여 시험하였다.

결과:

도 3 및 4는 분리된 CBDV와 함께 SAED 에토숙시미드 (칼슘 통로를 통해 작동하는 약물)의 용도를 상세히 설명한다. 비록 두 성분의 조합이 발병 잠복을 증가시키고, 발작 기간을 감소시키고, 더 발작 소실 동물이 되고, 긴장성/간대성 발작을 감소시킬지라도, 두 성분 사이에 통계적으로 유의한 상호작용은 없다. CBDV는 사망률에 대해 발프로에이트와 유사한 결과를 얻었으나, CBDV는 현재의 간질 약물 발프로에이트보다 더 큰 정도로 간질의 중증도를 완화시킬 수 있었다.

도 5 및 6은 분리된 CBDV와 함께 SAED 발프로에이트 (나트륨 통로를 통해 작동하는 약물)의 용도를 상세히 설명한다. 비록 병용 투여의 상승 효과가 주목받지 않았을지라도, 병용-투여되었을 때, 발프로에이트 및 CBDV는 독립적으로 발병 잠복, 발작 중증도 및 사망률의 유의한 감소를 유도하였다.

양쪽 세트의 결과는 조합에서 이들의 용도에 이익을 나타낸다.

실시예 4

간질의 필로카르핀 모델에서 분리된 CBDV의 용도

방법:

비히클 단독 수여받은 동물과 함께 대등한 부피로 분리된 CBDV를 50, 100 및 200 mg/kg의 용량으로 표준 비히클(1:1:18 에탄올:크레모포: 0.9% w/v NaCl 용액)에서 복강내(i.p.) 주사하였다. 15분 후에, 메틸스코폴아민(1mg/kg; 필로카르핀의 말초 무스카린성 효과(peripheral muscarinic effects)의 감소)을 투여하고, 45분 후에 필로카르핀(380 mg/kg, IP)을 복강투여하였다.

결과:

도 7 및 8은 CBDV가 필로카르핀-유도된 발작에 미치는 영향을 상세히 설명한다. 관찰된 바와 같이, 더 낮은 용량의 CBDV(50 및 100 mg/kg)는 사망률을 감소시켰다.

실시예 5

간질의 필로카르핀 모델에서 표준 항-간질 약물(SAEDs)과 함께 분리된 CBDV의 용도

방법:

상기 실시예 4에 기재된 바와 같이, SAEDs 발프로에이트 및 페노바비탈을 200mg/kg의 용량의 분리된 CBDV와 함께 다양한 용량으로 사용하였다. 이들 두 약물은 다른 작용 메커니즘을 가지는 항-경련제의 대표적인 두 종류이다. 발프로에이트는 나트륨 통로를 통해 작용하고, 페노바비탈은 GABA의 저해를 향상시킨다.

결과:

도 9는 CBDV가 SAED 발프로에이트와 조합하여 사용되었을 때 얻어진 결과를 상세히 설명한다. 비록 CBDV만 독립적으로 사망률에서 유의한 감소를 일으키고 발프로에이트는 아닐지라도, CBDV와 발프로에이트 모두 발작 중증도에 독립적이고 긍정적인 효과를 발휘하였다. CBDV와 발프로에이트의 조합은 발작 잠복을 증가시키고 발작 발생률을 감소시켰다. 그러나, 이러한 결과는 통계적으로 유의하지 않았다.

도 10은 CBDV가 SAED 발프로에이트와 조합하여 사용되었을 때 얻어진 결과를 더 상세히 설명한다. 양측성 발작 발생률이 CBDV (특히 고용량의 발프로에이트 (250mg/kg)와 함께)에 의해 유의하게 감소되었다는 것을 보여준다.

도 11은 CBDV가 SAED 발프로에이트와 조합하여 사용되었을 때 얻어진 결과를 더 상세히 설명한다. CBDV가 모든 용량의 발프로에이트와 조합하여 사용되었을 때 긴장성/간대성 발생률 및 총 긴장성/간대성 기간이 감소하였고, 긴장성/간대성 발작과 함께 CBDV 상호작용(단독)이 통계적으로 유의하였다는 것을 보여준다.

도 12는 CBDV가 SAED 페노바비탈과 조합하여 사용되었을 때 얻어진 결과를 상세히 설명한다. 상기한 바와 같이, CBDV는 중증도를 유의하게 감소시키고 조합도 유의하다.

도 13은 CBDV가 SAED 페노바비탈과 조합하여 사용되었을 때 얻어진 결과를 더 상세히 설명한다. 비록 결과가 통계적 유의성을 설명하지 않았을지라도, 특히 페노바비탈의 더 낮은 용량 수준에서 발작 소실 동물 및 증가된 발병 잠복에서 증가하는 쪽으로 강한 경향이 있다.

실시예 6

칸나비노이드 식물성 약물의 분석

하기 실시예에 기재된 바와 같이, CBDV BDS는 CBDV 뿐만 아니라, 칸나비노이드 CBD 및 THCV를 포함한다. CBD 및 THCV는 항-경련 활성을 나타내고, CBDV 외에 CBD 및 THCV를 함유하는 CBDV 추출물은 특히 추출물이 매우 낮은 양의 THC만 가지고 있을 수 있는 것처럼, 분리된 CBDV보다 잠재적으로 더 관심을 끈다고 주어진 결과는 GB0911580.9에 기재되었다.

칸나비디바린(CBDV) 식물성 약물 분석

CBDV BDS는 CBDV-풍부 식물의 추출로부터 얻어질 수 있다. 이러한 화학다변종(chemovars)은 CBDV로서 이들의 칸나비노이드의 중요한 비율을 생성하기 위해 특별히 재배된다.

CBDV BDS는 칸나비노이드 없는 BDS에 분리된 CBDV를 가하여 제조될 수도 있다. 이러한 칸나비노이드 없는 BDS는 CBG BDS 또는 USO-31과 같은 제로 칸나비노이드 식물로부터 제조될 수 있다. CBG는 CBG BDS에 존재하는 주요한 칸나비노이드이기 때문에, 컬럼 크로마토그래피와 같은 기술 분야에 공지된 표준 기술을 이용하여 존재하는 CBG를 상대적으로 용이하게 제거하는 것이 가능하다. 각각의 화합물은 정제를 위해 제거될 수 있고, 나머지는 다시 모아 용매를 제거하여 선택된 화합물이 없는 BDS를 생산할 수 있을 정도로 BDS를 완전히 분획화할 수 있다.

CBDV 화학종(chemotype)은 가정된 B_D 및 A_PR 유전자 모두를 전달하는 식물의 재배로부터 생긴다.

B_D유전자는 CBD 분자의 고리 부분을 합성하는 식물을 설명하고, A_PR 유전자는 통상의 펜틸 사슬이 CBD에서 발견된 것과는 대조적으로 프로필 측쇄를 갖는 이 분자를 합성하는 식물을 설명한다.

하기 표 4.1에 기재된 바와 같이, CBDV 화학다변종을 재배하고 BDS를 분석하였다:

[표 4.1] 칸나비디바린 BDS 총량 및 범위

CBDV BDS의 총 파이토칸나비노이드 함유 분획은 대략 총 BDS의 41%를 포함한다. 변화량에 따라 이 분획은 ± 10% 내지 ± 50% 까지 변할 수 있다.

[표 4.2] 백분율 칸나비노이드에 의한 칸나비디바린 BDS

파이토칸나비노이드 함유 분획의 백분율로서 CBDV BDS 내 본질 파이토칸나비노이드의 양은 대략 58%이다. 변화량에 따라 이 분획은 ± 10% 내지 ± 50% 까지 변할 수 있다.

이 실시예에서, 기준(reference)은 독립적으로 '다른(other)' 칸나비노이드의 본질 또는 이차 성분으로 제조된다고 생각된다.

하기 THCV 추출물에 비해, CBDV BDS는 공지의 항-간질 파이토칸나비노이드 CBD 및 THCV를 상대적으로 많은 양으로 THC를 상대적으로 적은 양으로 포함한다는 결과는, BDS 형태의 CBDV의 용도가 간질에 대해 유망한 새로운 치료법일 것이라고 추론한다.

테트라히드로칸나비바린(THCV) 식물성 약물 분석

이차 칸나비노이드가 THC이고 다른 칸나비노이드에 비해 중요한 양으로 존재하는 바와 같이, 하기 표 4.3은 THCV BDS의 칸나비노이드 성분을 상세히 설명한다.

[표 4.3] 테트라히드로칸나비바린 BDS 총량 및 범위

THCV BDS의 총 파이토칸나비노이드 함유 분획은 대략 총 BDS의 74-90% (w/w)를 포함한다.

[표 4.4] 백분율 칸나비노이드에 의한 테트라히드로칸나비바린 BDS

파이토칸나비노이드 함유 분획의 백분율로서 THCV BDS 내 본질 파이토칸나비노이드의 양은 대략 71-87% (w/w)이다. 또한 THCV BDS는 대략 파이토칸나비노이드 함유 분획의 14.8-18% (w/w)로 존재하는 이차 칸나비노이드 THC를 가진다.

비-파이토칸나비노이드 함유 성분

파이토칸나비노이드 BDS의 비-파이토칸나비노이드 성분은 BDS's 약리학에서 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서 테르펜 프로파일을 하기에 분류하였다. 하기 표는 높은 파이토칸나비노이드를 함유하는 식물을 나타내는 CBD 화학다변종 (chemovar)의 테르펜 프로파일을 예시한다. 5개의 식물을 최근에 수확하고 증기 증류(steam distillation)를 이용하여 추출하였다. 본질 모노테르펜 및 세스퀴테르펜은 굵게 강조하였다.

[표 4.5] 총 테르펜 분획의 모노테르펜 백분율 양 및 범위

모노테르펜 함유 분획은 대략 총 테르펜 분획의 52-64% (w/w)를 포함한다.

[표 4.6] 모노테르펜의 모노테르펜 백분율 양

모노테르펜 분획의 백분율로서 모노테르펜 분획 내 본질 모노테르펜 미르센의 양은 대략 61-75% (w/w)이다. 또한 모노테르펜 분획은 모노테르펜 분획의 대략 16.3-20% (w/w)로 존재하는 이차 모노테르펜 피넨을 가진다.

[표 4.7] 총 테르펜 분획의 세스퀴테르펜 백분율 양 및 범위

세스퀴테르펜 함유 분획은 대략 총 테르펜 분획의 27-32% (w/w)를 포함한다.

[표 4.8] 세스퀴테르펜의 세스퀴테르펜 백분율 양

특허출원번호 PCT/GB2008/001837는 '제로 칸나비노이드' 식물의 생산을 기재한다. 이들 식물은 칸나비노이드를 생산하는 칸나비스 사티바 엘(Cannabis sativa L.) 식물로서 일반적으로 질적으로 유사한 테르펜 프로파일을 함유한 칸나비스 사티바 엘 식물을 생산하기 위하여 선택적 재배하여 여전히 어떠한 칸나비노이드가 없는 것을 생산하였다. 이들 식물들을 사용하여 실험 및 임상시험에서 유용한 대조 식물인 칸나비노이드-없는 식물 추출물을 생산할 수 있다. 식물에서 생산된 테르펜 프로파일의 분해는 하기 표에서 확인될 수 있다. 일차 모노테르펜 및 세스퀴테르펜은 굵게 강조하였다.

[표 4.9] 총 테르펜 분획의 모노테르펜 백분율 양 및 범위

모노테르펜 함유 분획은 대략 총 테르펜 분획의 65-79% (w/w)를 포함한다.

[표 4.10] 모노테르펜의 모노테르펜 백분율 양

제로 칸나비노이드 식물은 2개의 본질 모노테르펜을 포함하는 것으로 확인되었다: 피넨 및 미르센. 모노테르펜 분획의 백분율로서 모노테르펜 분획 내 본질 모노테르펜 미르센의 양은 대략 37-45% (w/w)이다. 또한 모노테르펜 분획의 백분율로서 모노테르펜 분획 내 본질 모노테르펜 피넨의 양은 대략 37-45% (w/w)이다.

실시예 7

전신성 발작의 PTZ 모델에서 CBDV ( BDS )의 용도

방법은 실시예 2에 기재된 바와 같다.

50 및 100 mg/kg의 CBDV의 용량이 산출된 4개의 용량으로 CBDV BDS를 투여하였다. 얻어진 결과를 하기 표 7.1에 상세히 설명한다.

[표 7.1]

상기 나타난 바와 같이, CBDV BDS는 발작-관련 사망률을 감소시키는 경향을 나타내었다.

SAEDs와 대조적으로, 분리된 CBDV 및 CBDV BDS 모두를 이용한 모든 실험에서, 동물은 어떠한 현저한 부작용을 나타내지 않았다. 이는 간질의 치료에서 매력있는 화합물을 단독 또는 조합으로 사용하기 위한 신규한 항-경련제를 제조한다.

실시예 8

간질의 모델에서 THCV ( BDS ), 분리된 THCV 및 분리된 CBD 의 용도

THCV BDS 및 분리된 THCV 및 CBD의 활성을 설명하는 결과는 비-칸나비노이드 분획 뿐만 아니라 CBD 및 THCV를 함유하는 CBDV 추출물의 가능성의 이익을 지지하여 하기에 나타내었다.

일반 방법은 실시예 2에 기재된 바와 같다.

결과:

THCV BDS는 THCV가 주요한 칸나비노이드인 화학다변종의 전체 추출물을 포함하였다. (즉, 추출물에서 총 칸나비노이드 함량의 80 중량%로 존재하는 주요 칸나비노이드이었다.). THC는 두 번째로 가장 효과적인 칸나비노이드이었고, 중요한 양으로 존재하였다. (즉, 총 칸나비노이드 함량의 10 중량% 이상, 약 16 중량%로 존재하였다.). 그리고 HPLC 분석으로 측정된 바와 같이, 총 칸나비노이드 함량의 2 중량% 이하를 함유하는 각각 동정된 다수의 중요하지 않은 칸나비노이드가 있었다. 이 추출물에서 THCV 대 THC의 비율은 약 5:1이다.

사실, THCV 함량은 추출물의 67.5 중량% 이었고, THC 함량은 추출물의 13.6 중량% 이었고, 전체에서 다른 동정된 칸나비노이드는 추출물의 약 3 중량%를 포함하고 나머지 16 중량%는 비-칸나비노이드를 포함하였다.

PTZ 예비 연구

칸나비노이드 효과의 연구 전에 최적의 용량을 결정하기 위하여, 랫트에서 PTZ 농도 (50-100mg/kg; 범위는 문헌에 존재함)에 의해 유도된 발작을 연구하였다.

- 50mg/kg 및 60mg/kg의 PTZ 용량은 거의 발작-유사 활동을 유도하지 않았다 (n=4).

- 70mg/kg의 PTZ 용량은 일반적으로 간대성 발작을 유도하였다(3.5점; 13 피험자 중 8).

- 80mg/kg의 PTZ 용량은 규칙적으로 긴장성-간대성 발작을 유도하였다(4점 및 5점; 10 피험자 중 6).

또한, PTZ의 반복 복용은 오랜 시간 동안 민감도를 증가시킴을 확인하였다; 따라서 PTZ을 미리 복용한 동물에 대해서는 실험하지 않았다.

THCV BDS가 PTZ-유도된 발작에 미치는 영향은 먼저 70mg/kg의 PTZ 용량에 대해 평가하였다. 하기 기재된 바와 같이, 이것은 일반적으로 심각한 발작 점수를 경험하지 않은 비히클 대조군을 산출하였다. 따라서, THCV BDS는 80mg/kg의 PTZ 용량에 대해서도 선별하였다. 80mg/kg의 PTZ에 노출된 비히클 대조 동물에 의해 경험된 증가된 발작 중증도는 항-경련 활성의 더 적당한 시험이었다고 생각되었다.

THCV BDS 가 적당하게 심각한 (70 mg / kg ) PTZ -유도된 발작에 미치는 영향

랫트에서 적당한 발작을 유도하는 것으로 알려진 PTZ의 농도(70mg/kg; 상기 예비 연구 참조)에 대한 3개 용량의 THCV BDS를 평가하였다. 사용된 THCV BDS의 저, 중간 및 고 용량은 0.37, 3.70 및 37.04mg/kg 이었고, 각각 0.25, 2.5 및 25mg/kg의 실제 THCV 용량을 산출하였다. 이들 용량은 PTZ-유도된 발작에 대한 순수한 THCV를 선별하기 위해 사용된 것의 THCV 함량과 일치하였다.

THCV BDS는 첫 번째 근간대성 경련의 잠복 또는 발작 중증도 척도에 대한 3.5점의 중증도 점수에 도달하는 잠복에 대해 어떠한 유의한 효과를 가지지 않았다 (도 14). 비록 이들 변수에 대한 값이 대조군에 비해 중간 및 고용량의 THCV BDS로 처리된 동물에 대해 더 높았을지라도, 이것은 유의성에 도달하지 못하였다(P>0.05)는 것을 유의해야 한다. 마찬가지로, 발작 기간에 대한 유의한 영향은 나타나지 않았다(도 15).

THCV BDS가 70mg/kg PTZ를 수여받은 동물에서 발작 중증도(도 16) 및 사망률 (도 17)에 미치는 영향은 단순한 패턴을 따르지 않았다. 비히클-단독으로 주사된 동물은 이 군에 대해 3.5점의 중간 중증도 점수를 초과하지 않았고, 동물은 사망하지 않았다(n=10).

반대로, 70mg/kg PTZ는 저용량의 THCV BDS로 주사된 동물의 50%에서 심각한 긴장성-간대성 발작 및 사망을 유도하였고, 4.75점의 중간 중증도 점수를 설명하였다. 중증도에서 이러한 증가는 유의하지 않았다. 그러나, 중간 및 고용량의 THCV BDS로 주사된 동물은 저용량에 노출된 동물보다 더 낮은 중간 중증도 점수 및 더 낮은 사망률을 나타내었다(도 16 및 17). 중간 및 고용량의 사망률은 비히클 군의 사망률보다 더 높았으나, 유의하지는 않았다(P>0.05; 도 17). 그러나, 평균 중증도 점수는 중간 & 고용량 사이와 동일하였다(도 16). 결과의 이 패턴은, THCV BDS를 대조(비히클-처리된) 동물에서 심각한 발작을 유도할 PTZ의 용량에 대해 선별된 실험의 세트를 더 필요로 하였음을 암시하였다.

THCV BDS 가 심각한 (80 mg / kg ) PTZ -유도된 발작에 미치는 영향

동일한 3개 용량의 THCV BDS가 80mg/kg의 PTZ에 의해 유도된 발작에 미치는 영향을 평가하였다. 80mg/kg이 비히클 대조군(P=0.009)의 70mg/kg 보다 더 심각한 발작을 유의하게 유도하였고, 각각 6점 또는 3.5점의 평균 발작 중증도 점수를 갖는다는 것은 언급할 가치가 있다. THCV BDS는 FMJ의 잠복 또는 3.5점의 중증도 점수에 대해 유의한 효과를 가지지 않았다(도 18). 마찬가지로, 발작 기간 동안 효과가 관찰되지 않았다(도 19).

저용량의 THCV BDS는 80mg/kg의 PTZ를 수여받은 동물에서 발작 중증도(도 20) 및 사망률(도 21) 모두를 감소시켰다. 저용량의 THCV BDS를 수여받은 동물은 비히클 대조군보다 더 낮은 평균 중증도 점수(6에 비해 3.5)를 가졌다. 그러나, 이 차이는 유의하지 않았다(P>0.5). 저용량의 THCV BDS 투여군 또한 비히클 대조군의 사망률의 절반 사망률을 가졌다(30% 대 60%).

중간 및 고용량의 THCV BDS로 처리된 군은 각각 6에 비해 4.75의 더 낮은 발작 중증도 점수(P>0.05 대 대조군), 및 60%에 비해 50%의 더 낮은 사망률을 가졌다.

In vivo 개요 및 결론

PTZ 모델에서 THCV BDS의 선별은 적당한 또는 심각한 PTZ-유도된 발작에 대하여 어느 유의한 항-경련제 또는 경련유발제를 가지는 것으로 나타나지 않았다. 그러나, 비히클 대조준에 비해, 심각한(80mg/kg PTZ) 발작의 유도 전에 저용량의 THCV BDS를 수여받은 동물에서 더 낮은 중증도 및 사망률 쪽으로 경향이 나타났다.

이러한 효과는 THCV BDS의 비-THCV 함량에 존재하는 다른 칸나비노이드 성분 (THC와 같은)의 더 높은 수준에 의해 더 높은 용량의 THCV BDS로 차폐되는 것이 가능하다. 더 높은 용량의 THCV BDS는 THCV의 어느 잠재적인 긍정적 효과를 반대할 수 있는 THC와 같은 비-THCV 함량의 증가하는 용량을 함유할 것이다.

분리된 THCV :

PTZ -유도된 발작에 대한 분리된 THCV 의 효과

저 (0.025 mg/kg), 중간 (0.25 mg/kg) 및 고 (2.5 mg/kg) 용량의 순수한 THCV는 PTZ-유도된 발작에 대한 이들의 효과에 대해 평가되었다. THCV BDS와 비교하기 위해, 다른 용량의 순수한 THCV를 사용하여 THCV BDS와 비교하는 것은 이 시점에서 언급할 가치가 있다. 하기 표 8.1 참조.

[표 8.1] PTZ 모델에서 사용된 THCV BDS 및 순수한 THCV 용량의 비교

용량의 효과적인 THCV 함량을 위해 값이 주어졌다 (따라서, THCV BDS의 실제 용량은 대략 1.5배 더 크다).

80mg/kg PTZ는 모든 4개의 실험군(군 당 n=16)의 동물에서 변화하는 중증도의 발작을 성공적으로 유도하였다. PTZ-유도된 발작은 비히클 단독 수여받은 동물의 44%의 사망을 야기하였다. 저, 중간 및 고 용량의 THCV를 수여받은 군은 모두 각각 41%, 33% 및 38%의 더 낮은 사망률을 나타내었다; 그러나, 이들 값은 비히클 군과 유의한 차이가 없었다 (p>0.05, 이항검정(binomial test)).

살아있는 동물의 발작 기간 뿐만 아니라, 발작의 첫 번째 징후, 및 사용된 발작 점수 척도에서 [3] 및 [5]의 점수의 잠복에 대한 평균 값은 도 22A-D에 기재하였다.

비히클 대조군에 비해 THCV를 수여받은 동물에서 발작-유사 행동(도 22A-D)의 첫 번째 징후의 증가된 잠복에 의해 나타난 바와 같이, 이후 발작이 시작되었다고 볼 수 있다.

발병의 지연은 가장 높은 용량의 THCV에서 유의하였다(p=0.02). 증가된 잠복을 나타내는 모든 THCV 용량을 갖는 [3] 및 [5] 점의 잠복(도 22B 및 22C)에 대해 유사한 패턴을 나타내었으며, 가장 높은 용량의 THCV에서 유의한 수준에 도달하였다 (각각 [3] 및 [5]에 대해 p=0.017 및 0.013).

또한, 실험기간 동안 살아있는 동물에서 PTZ-유도된 발작의 기간은 비히클 대조군에 비해 중간 용량의 THCV의 투여 후 유의하게 더 짧음을 관찰하였다(도 22D; p=0.03).

하기 표 8.2는 각 실험군에서 중간 발작 중증도의 값을 나타낸다.

[표 8.2] 발작 중증도 및 발생율

각 실험군에 대해 어느 발작 징후를 경험하지 못한 동물의 중간 최대 중증도 및 %가 주어졌다(각 값에 대해 n=16). *는 비히클 군으로부터 유의한 차이를 나타낸다(이항 유의성 검정, p<0.05).

비히클 대조 동물은 4.25의 중간 발작 중증도를 나타낸 반면, THCV를 수여받은 모든 군은 3.5의 중간 중증도 점수를 가졌다. 이 감소는 유의하게 다르지 않았다.

12.5% 비히클 대조 동물은 발작의 지표를 나타내지 않았고, 이들 동물은 PTZ 투여 후 발작을 발달시키지 않았다. 유의하게 더 높은 수의 동물(33.3%)은 0.25 mg/kg을 수여받은 군에서 발작의 징후를 나타내지 않았다 (표 5.2; p=0.031). 이 결과는 0.25 mg/kg의 THCV의 중간 용량이 발작의 발달에 대하여 보호하였음을 암시한다.

In vivo 개요 및 결론

고용량의 THCV가 잠복 값에 미치는 영향은 THCV가 발병 및 발작 발달 모두를 지연시킬 수 있음을 암시하고, 중간 용량이 중간(0.25 mg/kg) THCV 용량에서 발작의 발생률에 미치는 영향은 PTZ-유도된 발작에 대한 유의한 항경련 작용을 암시한다.

분리된 CBD :

THCV 외에, CBD 또한 PTZ 모델에서 선별되었다. 결과는 비히클 대조 동물에 비해 가장 심각한 발작의 사망률 및 발생률을 유의하게 감소시키는 것처럼, 이 모델에서 CBD(100mg/kg의 수준에서)가 항-경련제임을 강하게 나타낸다.

PTZ -유도된 발작에 대한 분리된 CBD 의 효과

비히클 단독 수여받은 동물과 함께 대등한 부피로 분리된 CBDV를 1, 10 및 100mg/kg의 용량으로 표준 비히클(1:1:18 에탄올:크레모포: 0.9% w/v NaCl)에서 복강내(i.p.) 주사하였다(각 군에 대해 n=15). 60분 후에, PTZ(80mg/kg; IP)을 복강투여하였다.

비히클 단독 수여받은 대조 동물의 46.7%는 PTZ 투여의 30분 이내에 사망하였다(도 20). 반대로, 100mg/kg의 CBD를 수여받은 동물의 6.7%만(15 중 1) 사망하였고, 표식을 가진 감소는 유의하게 증명되었다(p<0.001).

또한, 비히클 대조 동물의 53.3%와 비교하여 100mg/kg의 CBD를 수여받은 동물의 6.7%만 가장 심각한 발작(5점)을 경험하였고, 감소 또한 유의하였다(p<0.001; 도 20 in vivo).

분리된 THCV와 반대로, 발작 발달의 잠복에서 유의한 증가가 관찰되지 않았다. 그러나, 표식을 가진 유의한 감소는 PTZ-유도된 발작에 대한 현저한 항-경련 효과를 나타낸다.

In vivo 개요 및 결론

가장 심각한 발작의 사망률 수준 및 발생률에 대한 고용량(100mg/kg)의 CBD의 PTZ 모델에서 분리된 CBD의 선별 및 분석은 CBD가 PTZ-유도된 발작의 중증도를 희석할 수 있다고 암시한다.

전체 결론

3가지 연구로부터, 분리된 THCV 및 CBD는 전신성 발작, 특히 간대성/긴장성 발작에 대해 항-간질로서 유망함을 나타낸다. THC의 중요한 양을 포함하는 다른 칸나비노이드를 함유하는 THCV 풍부한 추출물로부터 생성된 결과는 THC가 THCV의 효과를 대항할 수 있고, 주요한 또는 우세한 칸나비노이드로서 THCV를 함유하는 칸나비노이드 추출물은 최소로 함유하거나, 또는 실질적으로 없으나, THC가 간질 치료에 바람직할 것이라고 암시한다. 또한, 순수한 CBD와의 결과는 THCV 및 CBD 모두를 중요한 양으로 함유하는 추출물은 최소, 또는 실질적으로 없으나, THC가 최적의 조합을 제공할 수 있다고 암시한다. 따라서, THC가 선택적이고 실질적으로 제거된(약간 백분율 이하의 수준) THCV 우세한 추출물을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 CBD가 명백하게 정의되고, THCV 및 CBD 모두 유의한 수준이나 THC의 유의하지 않은 수준을 갖는 추출물을 생성하기 위해 주요한 및 우세한 칸나비노이드(또한 THC의 낮은 수준과 함께)인 CBD 풍부 추출물과 함께 혼합될 수 있다. 이러한 추출물은 WO04/016277에 기재된 바와 같이 이산화탄소에 의한 추출로부터 생기는 다른 칸나비노이드 및 비-칸나비노이드 성분을 함유할 수 있고, 성분은 엔도칸나비노이드 시스템에서 "주위(entourage)" 효과를 지지할 수 있다.

복용량에 관하여, 랫트/인간 변환 계수(×6)는 적어도 600mg (및 대안적으로 400mg 및 800mg 사이)의 CBD 일일 용량, 및 THCV에 대해 적어도 1.5mg(중간) 및 바람직하게는 15mg(높은)을 암시한다.

파이토칸나비노이드 추출물을 사용할 경우, 낮은 또는 무시할 수 있는 수준의 THC 및 치료적 유효 수준의 THCV 및/또는 CBD를 갖는 추출물이 바람직하다.

실시예 10

간질의 최대 전기충격 발작( Maximal Electroshock Seizure , MES ) 모델에서 분리된 CBD 및 CBDV 의 항-간질 활성 사이의 비교

방법

시험 및 기준 화합물의 제조

이 연구에서 사용된 비히클은 2:1:17 (에탄올:크레모포: 0.9% w/v NaCl)이었다. 사용된 시험 화합물은 칸나비디올(CBD) 및 칸나비디바린(CBDV)이었다. 이들은 가장 높은 농도에서 용액으로 제조되었다; 이들을 에탄올에 용해시킨 다음, 상기 기재된 비율로 크레모포 및 0.9% NaCl을 조합하였다. CBD 또는 CBDV를 10ml의 부피/kg 체중으로 복강내 투여하였다. SAED 발프로익산(VPA)을 소금물에 용해시켰다.

시험 시스템

동물 종(Animal Species)/균주(Strain): 마우스/ICR, 미생물 등급: SPF, 공급처: SLC Japan, Inc. 성별: 수컷, 연령 (시험시): 5-7 주령, 동물의 수: 군 당 약 5 동물. 온도: 23±2℃, 습도: 60±10%, 조명 조건: 빛 기간을 위해 7 AM 에서 7 PM 까지, 어두운 기간을 위해 7 PM 에서 7 AM 까지. 음식 및 물: CRF-1 (Oriental Yeast Co, Ltd) 및 수돗물에 자유로이 접근.

실험 과정

각 실험 하루 전날, 각 시험군으로부터 무작위로 추출하여 마우스의 무게를 재었다. 실험날 아침에, 각 동물의 투여량을 계산하기 위해 체중을 측정하였다. 비히클, CBD, CBDV 또는 발프로익산 나트륨 염을 전기 자극 전 30분에 복강내 투여하였다. 마우스에서 최대 전기충격 발작(MES)은 귓바퀴(earlap) 전극을 통해 200 msec 동안 100 Hz의 펄스 주파수(pulse frequency)로 전달된 30 mA의 전류를 이용하여 자극제(UGO BASILE ECT UNIT 7801, Italia)에 의해 유도되었다. 마우스를 10초 동안 관찰하고, 긴장성 좌복부 신전(tonic hindlimb extension)의 발생률을 주목하였다.

통계학적 분석

모든 통계학적 분석은 SAS Software for Windows, Release 9.1 (SAS Institute Japan)을 이용하여 수행하였다. 각 군에서 수(좌복부 신전 또는 사망)의 차이를 양측 검정 피셔의 정확 검증(two-tailed Fisher's exact test)을 이용하여 평가하였다. p값이 0.05 이하일 경우, 차이는 통계적으로 유의하다고 간주하였다.

결과

비히클 군에서 동물은 거의 전기적 자극(200 msec 동안 30 mA)에 의해 유도된 좌복부 신전을 나타내었다. CBD(3-100 mg/kg IP)는 통계적 유의성과 함께 좌복부 신전의 발현을 저해할 수 없었다. 그러나, CBDV(100 및 200mg/kg IP)는 좌복부 신전의 발현을 유의하게 저해하였다. 한편, 350 mg/kg의 발프로익산은 비히클 군에 비해 통계적 유의성과 함께 좌복부 신전을 차단하였다. 표 10.1 및 10.2는 이들 결과를 상세히 설명한다.

[표 10.1] 마우스에서 CBD 및 VPA 가 MES -유도된 발작에 미치는 영향

각 군은 5 마우스로 이루어졌다. *=p<0.05, **=p<0.01 대 비히클 대조군 (피셔의 정확 검증)

[표 10.2] 마우스에서 CBDV 및 VPA 가 MES -유도된 발작에 미치는 영향

각 군은 10 마우스로 이루어졌다. *=p<0.05, **=p<0.01 대 비히클 대조군 (피셔의 정확 검증)

상기 결과로부터 나타난 바와 같이, 칸나비노이드 CBDV는 칸나비노이드 CBD 보다 간질의 MES 모델에서 항-경련제로서 더 큰 효능을 명백히 설명한다. CBDV의 효능이 SAED 발프로익산의 효능에 근접하는 것을 고려해볼 때, 이것은 SAEDs와 함께 발생하는 것으로 알려진 부작용을 생성하지 않는 항-경련제의 사용을 위한 명백한 경쟁자(contender)이다.

실시예 11

CBDV 가 선형 가속화 로타로드 시험에 의해 평가된 운동 근육 기능에 미치는 영향

방법

각 동물은 정해진 실험날에 CBDV(100 또는 200 mg/kg, 각 군에 대해 n=10) 또는 비히클(2:1:17 크레모포:에탄올:소금물 [n=12] 또는 소금물 [n=11])을 수여받았다. 실험날과 2일 휴식 기간을 구분하고 앞의 화합물의 제거를 고려하였다. 약물 투여의 순서는 표준 라틴 방격법(standard Latin square design)을 이용하여 무작위로 추출하였다.

CBDV 또는 비히클 투여 후 60분에, 동물을 300초 기간 동안 4 내지 40 rpm으로 속도를 증가시킨 선형 가속화 로타로드(Panlab/Harvard Apparatus, Holliston, USA) 위에 올려놓았다. 가속화 프로토콜을 사용하여, 수행에서 불균형의 향상 때문에 각 동물에 대해 얻어진 결과의 차이를 최소화하는, 로타로드의 습관화에 대한 필요를 제거하였다. 각 시험은 실험날 당 3개의 가속화 로타로드 생산량(runs)을 수행하는 각 동물과 함께, 동물을 로타로드로부터 떨어뜨릴 때 끝났다. 동물은 수행에서 피로-유도된 감소를 막기 위해 시험 사이에 5분 회복을 허용하였다. 로타로드로부터 떨어진 몇 초의 평균 잠복은 운동 근육 기능을 평가하기 위해 비히클 대조군과 CBDV 군 사이를 비교하였다. 2개의 다른 비히클 처리 사이의 운동 근육 기능에 대한 유의한 효과가 있었는지를 평가하기 위하여, 우리는 만-휘트니 U 검정 (Mann-Whitney U test)으로 결과를 얻었다. 이 분석에서 유의성의 부족은 시험 기간을 감소시킴으로써 비히클 군을 조합하는 것으로 허용할 것이다(즉, 각 랫트는 둘 보다 단지 하나의 비히클 처리 시험날 착수할 것이다.). 운동 근육 기능에 대한 CBDV 효과의 분석에 대해, 결과는 주인자로서 약물 농도와 함께 피험자 사이의 1-way ANOVA를 받았다. 모든 경우, P≤0.05는 유의한 것으로 간주되었다.

결과

비히클 처리의 분석: 도 24에 나타난 바와 같이, 소금물 및 2:1:17 크레모포:에탄올:소금물 처리된 동물 사이로 떨어지는 잠복에서 차이가 없었다(P=0.406). 따라서, 양쪽 비히클 군을 합쳐서 하나의 단일 비히클 군을 얻었다.

CBDV 효과의 분석: 도 25에 나타난 바와 같이, CBDV는 어느 용량의 비히클-투여된 동물에 비해 떨어지는 잠복에 관한 효과가 없었다(F2, 40=1.421, P=0.253;). 비히클 처리된 동물은 100mg/kg CBDV에서 86.6초 및 200mg/kg에서 110.0초에 비해, 평균 111.6초 동안 로타로드에 남아있었다.

결론

이들 결과는 가속화 로타로드에 의해 평가된 바와 같이, CBDV(100 및 200mg/kg)가 운동 근육 대조 또는 수행에 대해 유의한 효과가 없었다는 것을 보여준다. 로타로드는 랫트의 운동 근육 행동에 관한 약물의 효과를 시험한다. 페노바비탈과 같은 항-경련 약물은 동물이 운동 근육 대조에 관한 이들 약물의 알려진 부작용을 설명하는 로타로드에 관하여 남아있을 수 있는 시간의 감소를 생성한다고 알려져 있다.

따라서, 전신성 발작의 펜틸렌테트라졸 모델 및 측두엽 발작의 필로카르핀 모델에서, 상기 실시예에 설명된 항-경련 효과는, 운동 근육 부작용이 없는 발작 상태를 제어하는 파이토칸나비노이드 CBDV에 기인한다.

References

ALGER, B. E. (2006) Not too excited Thank your endocannabinoids. Neuron, 51 , 393-5.

AMES FR. (1986) Anticonvulsant effect of cannabidiol. South African Medical Journal 69: 14.

AVOLI, M., LOUVEL, J., PUMAIN, R. & KOHLING, R. (2005) Cellular and molecular mechanisms of epilepsy in the human brain. Prog Neurobiol.

BOSTANCI, M. O. & BAGIRICI, F. (2006) The effects of octanol on penicillin induced epileptiform activity in rats: an in vivo study. Epilepsy Res, 71 , 188-94.

BRUST, J. C, NG, S. K., HAUSER, A. W. & SUSSER, M. (1992) Marijuana use and the risk of new onset seizures. Trans Am Clin Climatol Assoc, 103, 176-81.

CONSROE, P.F., WOOD, G.C. & BUCHSBAUM, H. (1975) Anticonvulsant Nature of Marihuana Smoking. J.American Medical Association 234 306-307

CUNHA, J. M., CARLINI, E. A., PEREIRA, A. E., RAMOS, O. L, PIMENTEL, C, GAGLIARDI, R., SANVITO, W. L, LANDER, N. & MECHOULAM, R. (1980) Chronic administration of cannabidiol to healthy volunteers and epileptic patients. Pharmacology, 21 , 175-85.

DAVIS, M. I., RONESI, J. & LOVINGER, D. M. (2003) A Predominant Role for Inhibition of the Adenylate Cyclase/Protein Kinase A Pathway in ERK Activation by Cannabinoid Receptor 1 in N1 E-1 15 Neuroblastoma Cells. J.Biol. Chem., 278, 48973-48980.

DREIFUSS, F. E., BANCAUD, J., HENRIKSEN, O., RUBIO-DONNADIEU, F.PENRY, J. K. & SEINO, M. (1981) Proposal for revised clinical and electroencephalographic classification of epileptic seizures. Epilepsia, 22, 489-501.

FERDINAND, R. F., VAN DER ENDE, J., BONGERS, I., SELTEN, J. P., HUIZINK, A. & VERHULST, F. C. (2005) Cannabis-psychosis pathway independent of other types of psychopathology. Schizophr Res, 79, 289-95.

FISHER, R. S., VICKREY, B. G., GIBSON, P., HERMANN, B., PENOVICH, P., SCHERER, A. & WALKER, S. (2000) The impact of epilepsy from the patient's perspective I. Descriptions and subjective perceptions. Epilepsy Res, 41 , 39-51.

GASTAUT, H. (1970) Clinical and Electroencephalographical Classification of Epileptic Seizures. Epilepsia, 1 1 , 102-1 12.

LUTZ, B. (2004) On-demand activation of the endocannabinoid system in the control of neuronal excitability and epileptiform seizures. Biochem Pharmacol, 68, 1691-8.

MACKIE, K. (2006) Cannabinoid receptors as therapeutic targets. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 46, 101-22.

MCCORMICK, D. A. & CONTRERAS, D. (2001) On the cellular and network bases of epileptic seizures. Annu Rev Physiol, 63, 815-46.

MERLIS, J. K. (1970) Proposal for an International Classification of the Epilepsies. Epilepsia, 11, 114-119.

NG et al. (1990) Illicit drug use and the risk of new-onset seizures, American Journal of Epidemiology 132: 47-57.

OBAY, B. D., TASDEMIR, E., TUMER, C, BILGIN, H. M. & SERMET, A. (2007) Antiepileptic effects of ghrelin on pentylenetetrazole-induced seizures in rats. Peptides, 28, 1214-9.

PEREIRA, M. B., FREITAS, R. L, ASSIS, M. A., SILVA, R. F., FONTELES, M. M., FREITAS, R. M. & TAKAHASHI, R. N. (2007) Study pharmacologic of the GABAergic and glutamatergic drugs on seizures and status epilepticus induced by pilocarpine in adult Wistar rats. Neurosci Lett, 419, 253-7.

PERTWEE R. G., (2000) Cannabinoid receptor ligands: clinical and neuropharmacological considerations, relevant to future drug discovery and development. Exp. Opin. Invest. Drugs 9(7):

RAUCA, C, WISWEDEL, I., ZERBE, R., KEILHOFF, G. & KRUG, M. (2004) The role of superoxide dismutase and alpha-tocopherol in the development of seizures and kindling induced by pentylenetetrazol - influence of the radical scavenger alpha-phenyl-N-tert-butyl nitrone. Brain Res, 1009, 203-12.

SANDER, J. W. (2003) The epidemiology of epilepsy revisited. Curr Opin Neurol, 16, 165-70.

SWANN, J. W. (2004) The effects of seizures on the connectivity and circuitry of the developing brain. Ment Retard Dev Disabil Res Rev, 10, 96-100.

TREMBLY B. SHERMAN M. (1990) Double-blind clinical study of cannabidiol as a secondary anticonvulsant. Marijuana '90 International Conference on Cannabis and Cannabinoids. Kolympari, Crete, July 8-11 , 1990.

WINGERCHUK, D. (2004) Cannabis for medical purposes: cultivating science, weeding out the fiction. Lancet, 364, 315-6.

Claims

치료적 유효량의 파이토칸나비노이드(phytocannabinoid)인 칸나비디바린(cannabidivarin, CBDV)을 포함하는 전신성 발작 또는 측두엽 발작의 치료용 항-경련제.
삭제
제1항에 있어서, 상기 항-경련제는 CBDV외에, 하나 이상의 다른 파이토칸나비노이드를 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 파이토칸나비노이드가 칸나비디올(CBD; cannabidiol)인 것을 특징으로 하는 항-경련제.
제1항에 있어서, 상기 치료적 유효량은, 적어도 8.1 내지 32.4 mg/kg 범위의 투여량인 것을 특징으로 하는 항-경련제.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 CBDV는 분리된(isolated) 형태인 것을 특징으로 하는, 항-경련제.
제 1항에 있어서, 상기 CBDV는 제1 파이토칸나비노이드(principle phytocannabinoid)로서 식물성 약물(botanical drug substance, BDS) 형태인 것을 특징으로 하는 항-경련제.
제1항에 있어서, 상기 항-경련제는 표준 항-간질 약물(standard anti-epileptic drugs, SAEDs)과 조합하여 사용되는 것을 특징으로 하는 항-경련제.
제 9항에 있어서, 상기 표준 항-간질 약물은 나트륨 또는 칼슘 통로를 통해 작용하거나, 또는, GABA의 저해(GABAergic inhibition)를 향상시키는 작용 메커니즘을 갖는 것을 특징으로 하는 항-경련제.
제 10항에 있어서, 상기 표준 항-간질 약물은 나트륨 또는 칼슘 통로를 통해 작용하는, 및
- 저-역치(low-threshold) 또는 일시적인 신경 칼슘 전류(transient neuronal calcium currents)를 변화시키는; 또는
- 고주파 신경 흥분 및 나트륨-의존성 활동 전위(action potential)를 감소시키고, 부가적으로 GABA 효과를 향상시킬 수 있는, 작용 메커니즘을 갖는 것을 특징으로 하는 항-경련제.
제1항, 제3항, 제4항 및 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-경련제는 운동 근육 부작용을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는, 항-경련제.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제