KR101829978B1

KR101829978B1 - Ｂ 세포 백신 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101829978B1
Application number: KR1020160038286A
Authority: KR
Inventors: 김태규; 조현일; 신창애
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2016-03-30
Publication date: 2018-02-20
Anticipated expiration: 2036-03-30
Also published as: KR20170113961A

Abstract

본 발명은 B 세포 백신 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 보조자극분자를 과발현하는 유전자 변형된 B 세포를 통해 B 세포의 수명을 증가시켜, 장기간 나이브 CD8 T 세포를 자극할 수 있고, B 세포에서 CD70, OX40L 또는 4-1BBL과 더불어 CD40L 분자의 동시-발현을 통해 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료적 효과를 제공할 수 있다.

Description

Ｂ 세포 백신 및 이의 용도{B cell vaccine and use thereof}

본 발명은 보조자극분자를 발현하는 유전자 변형된 B 세포를 항원제시세포로 사용하여 항원특이 세포독성 T 세포(CTL) 반응을 유도하는 B 세포 백신 및 이의 용도에 관한 것이다.

세포독성 CD8 T 세포는 악성 세포를 근절하기 위한 면역계의 주요 효과기이기 때문에, 암 면역치료를 위한 전제조건은 종양 세포를 인식하고 파괴할 수 있는 종양-반응성 CD8 T 세포를 활성화하고 확장시키는 것이다. CD8 T 세포 활성화를 위해서는 동족 펩타이드-주조직 적합 복합체(pMHC) 클래스-I 분자에 대한 T-세포 수용체의 결합 및 항원제시세포(APCs), 예컨대, 수지상세포(DCs)에 의해 제공되는 추가적인 보조자극 신호가 필요하다. 높은 수준의 MHC 분자 및 보조자극분자를 발현하는 성숙한 DCs는 인 비트로 및 인 비보 둘 다에서 적당한 종양-반응성 CD8 T 세포 반응을 일으키고 증가시키는 효과적인 세포성 어쥬번트로 알려져 있다. 더욱이, 면역자극분자, 예컨대, 보조자극분자 및 사이토카인을 발현하기 위해 유전적으로 변형된 DCs는 인 비트로 및 인 비보에서 향상된 T-세포 반응을 나타냈다. 따라서, 항원-탑재된 DCs를 이용한 임상 실험은 다양한 종양에서 이미 연구되어 현재 암 면역치료 전략에서 주요 세포성 백신으로 선택되고 있다. DC-기반 세포성 백신은 암 환자에서 안전하고 확실히 면역원성이 있으나, 유의한 보호 면역이 획득되지는 않으며, 임상 적용을 위한 충분한 세포를 얻는 데 있어 한계가 있고, 세포성 어쥬번트로서 유전자 변형의 어려움으로 인해 상당한 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 면역치료를 위한 DCs의 대안으로 자가 조직 유래의 APCs의 믿을만한 공급원을 제공하기 위해, 활성화된 γδ T-세포를 나이브 T-세포의 점화(priming) 및 증식을 자극하는 효과적인 항원-제시능을 나타내는 전문적인 APCs의 대체 타입으로 제안한 바 있다. CD4 T-세포 역시 기능성 메모리 CD8 T 세포 반응을 불러일으키고, 인 비트로에서 확장된 CD4 T-세포에서 보조자극 CD80 및 4-1BBL의 발현이 인 비보에서 치료적 항종양 면역을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 염증성 사이토카인, CD40L 및 Toll-like receptor(TLR) 리간드를 처리하여 인 비트로에서 활성화된 B 세포가 인 비보에서 항원특이 CD4및 CD8 T 세포의 효과적인 확장 및 강력한 항종양 면역을 유도하기 위한 전도유망한 대체 APCs임을 보여주는 수많은 보고가 있었다. 다른 보고들에서는 종양 항원 및 불변의 NKT-세포 리간드(α-galactosylceramide)가 탑재된 B 세포가 NKT-세포 활성화와 함께 광범위한 입양 면역을 유도한다고 밝혔다. 특히, 선행 보고에서 보조자극분자, OX40L 및 4-1BBL를 인코딩하는 복수의 RNA로 유전자 변형된 B 세포, 사이토카인 IL-12 및 항원은 인 비트로에서 DCs 만큼 효과적으로 CD8 T 세포 증식을 상승적으로 증가시킴을 보여주었다. 더욱이, 최근 연구에서 B 세포는 종양-유래 자가포식체(autophagosome)에 의해 포획된 종양-특이 항원을 효율적으로 교차-제시할 수 있고, 이후에 효과적인 항종양 면역을 유도한다고 보고되어 있다. 그럼에도, 종양 모델에서 성숙된 DC 기능과 닮은 나이브 CD8 T 세포를 직접적으로 자극할 수 있는 유전자 변형된 B 세포를 이용한 세포성 백신은 개발된 바 없다.

이러한 측면에서, APCs에서 CD40L에 의한 CD40의 결합은 T-세포 점화 및 활성화를 위한 중요한 사건임이 밝혀져 있어 본 발명자들은 CD40L을 발현하기 위해 변형된 인 비트로-활성화된 B 세포가 항원특이 T-세포를 점화하고 확장하는 최상의 능력을 가지고 있을 것이라고 가정하였다.

Weixia Li et al., PLOS ONE, vol.8(1), e53564 (2013.01.09)

본 발명의 목적은 나이브 CD8 T 세포를 직접적으로 자극할 수 있는 유전자 변형된 B 세포 및 이의 면역치료제, 백신, 치료제로서의 약학적 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CD40L를 코딩하는 핵산; 및 OX40L, 4-1BBL 및 CD70으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현벡터로 형질전환되고, 외래 항원에 의해 감작된 B 세포를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 B 세포를 포함하는 면역치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 B 세포를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환 예방용 백신을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 B 세포를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 보조자극분자를 과발현하는 유전자 변형된 B 세포를 통해 B 세포의 수명을 증가시켜, 장기간 나이브 CD8 T 세포를 자극할 수 있고, B 세포에서 CD70, OX40L 또는 4-1BBL과 더불어 CD40L 분자의 동시-발현을 통해 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료적 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 다양한 조건에서 활성화된 B 세포에서 보조자극분자의 발현 결과를 나타낸 것으로, 도 1A는 다양한 조건에서 자극된 재조합 B 세포의 발현을 나타낸 그래프, 도 1B는 1일에 시험된 재조합 B 세포의 생존 세포 집단을 나타낸 그래프로 Annexin V 및 7-AAD를 이용한 염색에 의해 평가 및 플로우 사이토메트리에 의해 분석되며, 도 1C 및 D는 재조합 B 세포에서 최적 원심분리 시간과 다양한 MOI, 0.1 내지 1에 따라 CD40L 및 CD70을 인코딩하는 렌티바이러스의 적정 조사 결과, 도 1E는 배양 1일 후, B 세포에서 MHC 클래스 I 분자, MHC 클래스 II 분자, CD80, 4-1BBL, OX40L, CD70, CD40L 및 CD86의 표면 분자 발현의 플로우 사이토메트리 분석 결과이다. 이때 P 값은 1-way ANOVA test(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001)로 계산되었다.
도 2는 본 발명의 재조합 B 세포의 인 비트로 및 인 비보 항원제시능력 평가 결과를 나타낸 것으로, 도 2A는 재조합 B 세포에 의한 OT-1 세포의 증식 결과, 도 2B는 면역화 전 1일에 공통유전자혈통(CD45.1) 마우스에 OT-1(CD45.2) 세포를 주입한 결과, 도 2C는 5일 동안 OT-1(CD45.2) 세포에서 공동 배양된 재조합 B 세포의 사이토카인 프로파일의 평가 결과이다. P 값은 1-way ANOVA test(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001)로 계산되었다.
도 3은 본 발명의 재조합 B 세포의 보조자극분자의 발현 평가 및 CD8 T 세포 반응 평가 결과를 나타낸 것으로, 도 3A는 인 비트로 확장된 B 세포에 마우스 유래의 CD40L, CD70, OX40L, 4-1BBL 단독 또는 CD40L과 조합하여 재조합 렌티바이러스를 형질도입한 결과를 보여주며, 도 3B는 보조자극분자를 발현하는 Trp₂₁₈₀-펄스된 B 세포를 0일 및 7일에 마우스에 i.v. 면역화하고, 마지막 면역화 후 8일에 펩타이드-펄스된 EL4 (EL4/Trp₂₁₈₀) 및 펄스되지 않은 EL4(EL4)에 대해 IFN-γ ELISPOT 분석을 통해 비장에서 항원특이 CD8 T 세포의 비율을 평가한 결과를 보여주며, 도 3C는 상기 도 3B에서의 실험으로부터 계산한 IFN-γ 및 CD107a/b 이중-양성 CD8 T 세포의 총 수를 보여준다. P 값은 1-way ANOVA test(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)로 계산되었다.
도 4는 본 발명의 재조합 B 세포의 생존능 평가 결과로, 도 4A, B 및 C는 배양 후 1일, 3일에 Annexin-V 및 7-AAD로 염색하여 평가된 유전자 변형된 B 세포의 세포사멸 결과를 보여주고, 도 4D는 3일 후 유전자 변형된 B 세포의 mRNA로부터 세포사멸-관련 분자 BCL2, Bcl-xL 및 Bax의 RT-PCR 분석 결과를 보여준다. P 값은 1-way ANOVA test(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001)로 계산되었다.
도 5는 본 발명의 재조합 B 세포의 항종양 치료 효과를 나타낸 것으로, 도 5A는 단독 또는 CD40L 보조자극분자와 조합하여 형질도입된 B 세포-기반 백신의 항종양 효과를 보여주며, 도 5B는 재조합 B 세포로 백신 처리하고, PD-L1이 고갈된 마우스에서 종양 생장을 보여주며, 도 5C는 B6 마우스에 3×10⁵B16F10SK 세포를 피하접종하고, 재조합 B 세포를 백신 처리하고, PD-1 고갈을 위해, 면역화 후 0일, 1일 및 2일에 항-PD-1 항체를 복강내 주사하여 종양 생장을 평가한 결과를 보여준다. P 값은 2-way ANOVA test(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001)로 계산되었다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 CD40L를 코딩하는 핵산; 및 OX40L, 4-1BBL 및 CD70으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현벡터로 형질전환되고, 외래 항원에 의해 감작된 B 세포에 관한 것이다.

본 발명은 기존의 항원제시세포, 예컨대 수지상세포가 사람 말초혈액세포에서 소량 존재하고, 임상 적용을 위해 다량의 세포를 얻기 어려운 단점을 해소하기 대안으로 자기조직 유래의 항원제시세포의 기능을 수행하면서, 항원 특이적인 세포독성 T 세포 반응을 유도할 수 있는 복수의 보조자극분자로 유전자 변형된 B 세포(또는 재조합 B 세포)를 제공한다.

상기 재조합 B 세포는 CD40L를 코딩하는 핵산; 및 OX40L, 4-1BBL 및 CD70으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현벡터로 B 세포를 형질전환시켜 제조할 수 있다.

상기 재조합 B 세포의 형질전환에 사용하는 B 세포는 공지의 B 세포 분리 기술을 통해 얻을 수 있어 특별히 제한하지는 않으며, 일 구체예에 따르면, 마우스 비장에서 CD43을 사용하여 분리하고, 항-CD40 항체 및 IL-4의 존재에서 배양하여 얻을 수 있다.

상기 재조합 B 세포의 세포 생존능을 높이기 위해 형질전환 전 항-CD40 항체로 미리-활성화시킨 B 세포를 형질전환에 사용할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 미리-활성화시킨 B 세포를 사용하는 경우 보조자극분자의 발현 수준과 재조합 B 세포의 세포 생존능이 상대적으로 증가하였다(도 1 참조). 따라서, 보다 구체적으로, 상기 재조합 B 세포는 항-CD40 항체로 미리-활성화시킨 B 세포에 보조자극분자를 함유하는 발현벡터로 형질전환시키고, IL-4 존재 하에서 항-CD40 항체로 추가 활성화시켜 제조할 수 있다.

또한, 상기 재조합 B 세포의 항원제시능력을 확인하기 위해, 일 구체예에 따르면, OT-1 세포에 항원 펩타이드를 펄스하고, 재조합 B 세포와 배양한 경우, 단일 보조자극분자를 발현하는 B 세포와 배양된 OT-1 세포 대비 높은 세포 증식 지수를 나타낸다(도 2A 참조). 이는 상기 재조합 B 세포가 OT-1 세포에 대한 자극을 향상시켜 인 비트로에서 CD8 T 세포 증식에 유익함을 시사하는 결과이다. 다음으로, 인 비보에서 항원제시능력을 확인하기 위해, 일 구체예에 따르면, 마우스 모델에 OT-1/CD45.2 세포를 마우스에 접종하고, 재조합 B 세포로 면역화시킨 경우, 단일 보조자극분자를 발현하는 B 세포와 배양된 OT-1 세포 대비 우수한 CD8 T 세포의 수를 나타내어 인 비보에서도 항원특이 CD8 T 세포의 증식이 향상됨을 보여준다(도 2B 참조). 상기 재조합 B 세포의 사이토카인 프로파일을 평가한 결과, IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 발현 수준이 증가하였다(도 2C 참조).

또한, 상기 재조합 B 세포의 보조자극분자의 발현 수준을 비교하여 보면, 단일 보조자극분자로 형질전환된 B 세포 대비 복수의 보조자극분자로 형질전환된 B 세포에서 보조자극분자의 발현이 현저히 증가하여, 이들의 발현이 시너지하게 증가함을 알 수 있다(도 3A 참조). 상기 재조합 B 세포의 인 비보 항원특이 CD8 T 세포 반응의 유도능력을 확인하기 위해, 일 구체예에 따르면, 항원 펩타이드 펄스된 재조합 B 세포를 마우스 모델에 면역화시키는 경우, 항원특이적 인식이 확인되었고, DCs 만큼 효율적으로 항원특이 CD8 T 세포를 확장시킨다. 또한, 단일 보조자극분자로 형질전환된 재조합 B 세포로 면역화시키는 경우에 비해, 복수의 보조자극분자로 형질전환된 재조합 B 세포에서 더 높은 수준의 항원특이 CD8 T 세포 반응을 확인할 수 있다(도 3B 및 3C 참조).

또한, 인 비보에서 제공된 재조합 B 세포의 생존능을 확인하기 위해, 마우스 모델에서 실험한 결과, 단일 보조자극분자로 형질전환된 재조합 B 세포로 면역화시키는 경우에 비해, 복수의 보조자극분자로 형질전환된 재조합 B 세포에서 충동적인 세포 죽음이 예방되어 살아있는 세포 수가 높은 수준으로 유지되고, 이러한 결과는 CD40L이 도입된 B 세포에서 두드러져 CD40L과 함께 추가적인 보조자극분자를 발현하는 재조합 B 세포의 향상된 엑스 비보 세포 생명력을 입증하는 한편, 항-세포사멸과 관련된 BCL2, Bcl-xL 및 Bax 분자가 장기간 발현되는 것으로 보아 세포사멸이 억제되어 인 비보에서 장기간 생존이 가능한 것으로 보인다(도 4 참조).

또한, 상기 재조합 B 세포의 면역화에 의해 생산된 CD8 T 세포가 인 비보 치료적 효과를 나타내는지 알아보기 위해 정착된 종양이 형성된 마우스 모델에서 상기 재조합 B 세포로 면역화시킨 결과, 단일 보조자극분자로 형질전환된 B 세포는 DCs 백신보다 우수한 항종양 효과를 나타내고, 복수의 보조자극분자로 형질전환된 B 세포는 단일 보조자극분자로 형질전환된 B 세포보다 더 우수한 항종양 효과를 나타낸다(도 5A 참조). 또한, 공격형의 정착된 종양에서 CD8 T 세포와 함께 PD-1의 역할을 평가하기 위해 항-PD-L1 항체를 재조합 B 세포와 함께 투여한 경우, PD-1 봉쇄는 재조합 B 세포의 치료적 효능을 높였고, 항원특이 CD8 T 세포를 유의적으로 증가시킨다(도 5B 참조). 아울러, 상기 재조합 B 세포는 정착된 종양에 대해 종양 생장율 역시 감소시킬 수 있다(도 5C 참조).

본 명세서에서, 용어 "항원"은 당업계에서 잘 공지되어 있으며, 항체에 결합할 수 있는 모든 분자뿐만 아니라 에피토프, MHC 분자에 결합할 수 있는 항원의 펩타이드 단편, 및 면역원을 포함한다. 본 발명에서는 항원으로 종양 항원, 병원체 항원 또는 자가-항체(정상 또는 질환성) 등을 사용하나, 이에 제한하는 것은 아니다.

본 명세서에서, "B 세포를 어떤 물질로 감작(感作)시킨다"는 것은, B 세포를 그 물질과 반응시키는 것을 말하며, 바람직하게는, 상기 물질을 B 세포의 표면상에 직접적, 또는 간접적으로 제시시키는 것을 말한다. 본 명세서에서, 상기 물질은 항원을 의미하며, "외래 항원"은 세포 자체가 보유하지 않은 항원으로, 이러한 항원을 세포 내로 전달 내지는 접촉을 통해 감작될 수 있다. 상기 전달은 펄스(pulse) 에너지에 의한 전기천공, 형질주입(transfection) 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 접촉은 항원과 B 세포를 일정시간 배양하는 것일 수 있다.

예컨대, 전기천공은 2 내지 10 ms 동안 전계 강도 100 내지 150 Volts/mm 간격(gap width)(예, 4 mm 갭 동안 400 내지 600V)으로, 사각파 펄스를 이용할 수 있으나, 당업자 수준에서 적절히 조절할 수 있다.

상기 외래 항원은 종양 항원, 병원체 항원 또는 자가-항체일 수 있다.

상기 종양 항원은 종양 관련 항원(tumor associated antigen, TAA)으로 종양과 관련 있는 항원을 의미한다. 잘 알려진 TAA의 예로 오브알부민(Ovalalbumin), 서바이빈(survivin), gp75, gp1OO, MDM2, MART-1, MAGE-1, MAGE-3, 티로시나제, 텔로머라제, her-2/neu, α-1 페토단백질(fetoprotein), G250, NY-ESO-1 등을 포함한다. MHC 분자에 결합하는 TAA의 일부 펩타이드 단편의 서열은 Ova₂₅₇(SIINFEKL), tyrosinase-related protein 1₄₅₅(Trp1₄₅₅; TAPDNLGYA), Trp2₁₈₀(SVYDFFVWL), 및 gp100₂₅(gp100₂₅; EGSRNQDWL), MAGE 1 노나펩타이드(EADPTGHSY), MART-APL 펩타이드(LAGIGILTV), 천연 펩타이드(AAGIGILTV) 또는 PSA-1 펩타이드(FLTPKKLQCV)등을 포함한다. 추가적인 종양 관련 펩타이드 및 항원의 서열은 당업자들에게 공지되어 있다.

상기 종양 항원과 관련된 종양의 예로, 고형암, 액형 종양(liquid tumor), 혈액 종양, 신장 세포 암, 흑색종, 유방암, 전립선암, 고환암, 방광암, 난소암, 경부암, 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 신경모세포종(neuroblastoma), 신경교모세포종(glioblastoma), 망막모세포종, 백혈병, 골수종, 림프종, 간암, 선암, 육종, 악성 종양(carcinoma), 모세포종(blastoma) 등이 있다.

상기 병원체 항원은 질환을 초래하는 유기체 또는 바이러스뿐만 아니라 이들의 약독화된 유도체를 의미한다. 용어 병원체는 질환의 발생에 관여하는 임의의 바이러스 또는 유기체, 및 그의 약독화된 유도체를 의미한다. 이러한 병원체로는 박테리아, 원생동물, 곰팡이 및 바이러스 병원체, 예컨대 헬리코박터, 예컨대 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 살모넬라 균(Salmonella sp.), 시겔라 균(Shigella sp.), 엔터로박터 균(Enterobacter sp.), 캄필로박터 균(Campylobacter sp.), 다양한 마이코박테리아, 예컨대 마이코박테리움 레프레(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 브루셀라 균(Brucella sp.), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans), 스타필로코커스 균(Staphylococcus sp.), 예컨대 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 스트렙토코커스 균(Streptococcus sp.), 클로스트리디움 균(Clostridum sp.), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 플라스모디움 균(Plasmodium sp.), 레쉬마니아 균(Leishmania sp.), 트리파노조마 균(Trypanosoma sp.), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), C 형 간염 바이러스(HCV), 인간 유두종 바이러스(HPV), 사이토메갈로바이러스(CMV), HTLV, 헤르페스 바이러스(예, 1형 헤르페스 심플렉스 바이러스, 2형 헤르페스 심플렉스 바이러스, 코로나바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 및 엡스타인-바 바이러스), 유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, 소아마비 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스 또는 루벨라 바이러스 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

상기 자가-항체는 항핵항체, 항γ글로불린 항체, 자기혈구성분에 대한 항체 또는 자기장기에 대한 항체 등이 있으나 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 상기 자가-항체를 외래 항원으로 사용하는 경우, CD4 T 세포 백신은 강력한 항종양 면역을 유도할 수 있어, 정상조직에서 발현된 자가-항원에 대한 잠재적 면역 내성을 극복하는데 효과적일 수 있다.

용어, "보조자극분자(costimulatory ligand 또는 costimulatory molecule)"는 항원제시세포의 표면에 발현된 수용체-리간드 쌍과 T 세포 간의 상호작용에 참여하는 물질로, 사이토카인 유전자 발현과 증식 유도를 위해서는 휴지기 T 세포에 2 이상의 신호가 필요하며, 한 가지 신호는 특이성을 부여하는 신호로 MHC/펩타이드 복합체와 TCR/CD3 복합체의 상호작용에 의해 생성되며, 두 번째 신호는 항원 비특이적이고, "보조자극성" 신호라 한다. 이 신호는 대식세포 및 수지상세포 등 골수 유래 보조 세포에 의해 제공되는 활성으로 알려져 있다. 보조자극분자는 정상적인 생리 조건 하에서 필요한 보조자극 신호를 매개하여 나이브 T 세포의 완전한 활성화를 수행한다. 본 발명에서는 이러한 보조자극분자로 CD40L; 및 OX40L, 4-1BBL 또는 CD70 중 적어도 하나의 조합을 사용한다.

본 발명의 B 세포는 공지의 형질전환 기술을 이용하여 보조자극분자들을 B 세포에 도입하여 제조될 수 있다.

본 발명의 B 세포에 도입되는 "핵산"은 가장 광의적인 의미로 사용되며, 단일가닥(ss) DNA, 이중가닥(ds) DNA, cDNA, (-)-RNA, (+)-RNA, dsRNA 등을 포괄한다.

바람직하게는, 상기 CD40L을 코딩하는 핵산은 사람 또는 마우스 유래의 핵산 서열일 수 있다. 예컨대, SEQ ID NO: 1에 기재된 염기서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 OX40L을 코딩하는 핵산은 사람 또는 마우스 유래의 핵산 서열일 수 있고, 예컨대, SEQ ID NO: 2에 기재된 염기서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 4-1BBL을 코딩하는 핵산은 사람 또는 마우스 유래의 핵산 서열일 수 있고, 예컨대, SEQ ID NO: 3에 기재된 염기서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 CD70을 코딩하는 핵산은 사람 또는 마우스 유래의 핵산 서열일 수 있고, 예컨대, SEQ ID NO: 4에 기재된 염기서열일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

따라서, 구체적으로, 본 발명의 B 세포는 보조자극분자로, CD40L/OX40L, CD40L/4-1BBL, 또는 CD40L/CD70의 조합을 발현하는 것일 수 있다.

보조자극분자를 코딩하는 핵산으로 DNA를 선택하는 경우 발현 벡터에 삽입된 형태로 B 세포에 제공될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "벡터"는 자신에게 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 플라스미드란 추가의 DNA 분절을 결찰시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 유형으로는 추가적인 DNA 분절을 바이러스 게놈으로 결찰시킬 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 일부 벡터는 숙주세포로 도입될 때 이 숙주세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주세포로 도입될 때 숙주세포의 게놈으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태로 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 유형이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 서로 교환하여 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다. 바람직하게는, 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다.

형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 사람의 보조자극분자 CD40L, OX40L, 4-1BBL 및 CD70의 유전자에 대해 PCR 증폭을 통해 각각의 cDNA를 제조하고, 각각 렌티바이러스 벡터에 삽입하였다. 우선, CD40L cDNA가 삽입된 렌티바이러스와, OX40L, 4-1BBL 및 CD70 cDNA가 각각 삽입된 렌티바이러스를 B 세포에 동시-형질도입시켜 2종의 보조자극분자를 발현하는 B 세포를 생산하였다.

본 발명의 B 세포는 보조자극분자를 과발현하면서, 외래 항원에 감작되어 항원특이 T 세포 반응을 향상시키고, 외래 항원의 종류에 따라 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환 치료에 효과적이다.

따라서, 본 발명은 상기 B 세포를 포함하는 면역치료제를 제공한다.

본 발명에 따른 면역치료제는 면역 반응을 증가시키거나, 특정 질병, 감염 또는 질환의 치료 또는 예방에 바람직한 면역 반응의 일부를 선택적으로 상승시킬 수 있다.

이를 기반으로, 본 발명은 상기 B 세포를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환의 예방용 백신 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

예컨대, 상기 종양의 예로, 신장 세포 종양 흑색종 만성 림프성 백혈병 유방암, 폐암 전립선암, 난소암 또는 대장암 등이 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

바람직한, 병원체 감염으로 HIV, HCV 등이 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

바람직한, 자가면역질환으로, 전신성 홍반 낭창증 또는 루퍼스(Systemic lupus erythematosus: SLE), 류마티스성 관절염(Rheumatoid arthritis: RA), 류마티스열(Rheumatoid fever) 등이 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 항종양 효과의 개선을 위해 항-PD-L 항체를 추가로 포함할 수 있다. 항-PD-L 항체는 PD-1를 봉쇄하여 치료적 효능을 높이고, 종양의 생장율을 감소시키는 효과가 있다.

본 발명의 백신은 일회 투여함으로써 수행되는 면역화 방법과 연속 투여함으로써 수행되는 면역화 방법을 모두 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 인 비트로, 인 비보 또는 엑스 비보에서 진단적 또는 치료적 용도에 적합한 조성물을 이루는 활성성분 및 활성 또는 무활성 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충화된 염수 용액, 인간 혈청 알부민(HSA) 등의 혈청 알부민, 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카세인 등을 포함하는 단백질 부형제와 같이, T 세포와 혼용가능한 임의의 약학적 담체를 포함한다. 담체, 안정화제 및 보강제의 예는, Martin REMINGTON'S PHARM. SCI, 18^th Ed.(Mack Publ. Co., Easton (1995)) 및 the "PHYSICIAN'S DESK REFERENCE", 58nd Ed., Medical Economics, Montvale, NJ. (2004)를 참조한다. 용어 "담체"는 완충액 또는 pH 조정제를 포함할 수 있으며, 전형적으로 완충액은 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충액으로는 시트르산의 염, 아스코르브산의 염, 글루콘산의 염, 카본산의 염, 타르타르산의 염, 숙신산의 염, 아세트산의 염 또는 프탈산의 염 등의 유기산 염; 트리스, 트로메타민 하이드로클로라이드 또는 포스페이트 완충액을 포함한다. 추가적인 담체로, 폴리비닐피롤리돈, 피콜(폴리머 당), 덱스트레이트(예, 사이클로덱스트린, 예컨대 2-하이드록시프로필-쿼드러셔(quadrature), -사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 항산화제, 항-대전제, 계면활성제(예, "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80" 등의 폴리소르베이트), 지질(예, 인지질, 지방산), 스테로이드(예, 콜레스테롤) 및 킬레이트제(예, EDTA) 등의 폴리머성 부형제/첨가제를 포함한다. 빙결 방지제 또는 강하제도 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 적정 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 종양내, 동맥내(관절에서), 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 결절내(intranodal) 및 피하 경로와 같은 비경구 투여에 적합한 제형과 담체는 항산화제, 완충액, 정균제, 및 제형을 목적하는 수용자의 혈액과 등장으로 만들어 줄 용질, 및 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제, 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성의 멸균 현탁액을 포함한다. 정맥내 또는 복강 투여가 본 발명의 CD4 T 세포 백신의 투여에 바람직한 방법이다. 개체에게 투여된 세포의 투여량은 시간의 경과에 따라 개체에서 목적하는 유익한 치료적 반응을 달성하기에 유효한 양, 또는 암세포의 성장 억제에 유효한 양 또는 감염의 억제에 유효한 양이다. 예컨대, 주입 전에 개체로부터 혈액시료를 수득한 후 보관하여 후속적인 분석 및 비교에 사용하는 방식으로 실시될 수 있다. 일반적으로, 적어도 약 10⁴ 내지 10⁶ 및 전형적으로 1×10⁸ 내지 1×10¹⁰개의 세포를 70 kg의 환자에게 대략 60분 내지 120분에 걸쳐 정맥내 또는 복강내로 주입할 수 있다. 투여의 경우, 개체의 전반적 건강상태 및 체중을 고려하면서, 본 발명의 세포를 세포의 유형에 따른 LD-50(또는 기타 독성 측정 방법) 및 다양한 농도에서의 세포의 유형에 따른 부작용에 의해 결정된 비율로 투여한다. 투여는 한번 또는 여러 회 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 B 세포는, 세포독성제, 뉴클레오타이드 유사체 및 생물학적 반응 변형제를 포함하는 공지된 통상의 치료법을 사용하여 다른 특정 증상에 대한 치료를 보충할 수 있다. 유사하게, 생물학적 반응 변형제는 본 발명의 B 세포에 의한 치료에 선택적으로 추가될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 재조합 B 세포의 제조

(마우스, 세포주 및 펩타이드)

6주령된 암컷 C57BL/6(B6) 마우스는 Orient Bio (Seongnam, Kyunggi)에서 구입하였다. B6.SJL 공통유전자혈통 마우스(CD45.1) 및 OT-I TCR 유전자도입 마우스는 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)에서 얻었고, 무균 조건 하에서 가톨릭대학교 동물실험실에서 사육하였다. 동물 연구의 모든 과정은 서울 가톨릭대학교(Approval number: CUMS-2014-0085-01) 의과대학 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 제공받은 설치류 실험에 대한 가이드라인 및 정책, 및 실험 동물의 관리 및 이용에 대한 가이드, 실험동물 복지법에 따라 수행되었다.

EL4 및 B16F10SK 흑색종 세포는 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입하였다. 합성 펩타이드 Ova₂₅₇(SIINFEKL) 및 tyrosinase-related protein 2₁₈₀(Trp2₁₈₀; SVYDEFVWL)는 순도 >80%으로 A&A Labs(San Diego, CA)에서 구입하였다.

(B 세포 순도, 재조합 렌티바이러스 생산 및 형질도입)

보조자극분자를 인코딩하는 재조합 렌티바이러스는 293T 세포 및 Invitrogen(Carlsbad, CA)사의 리포펙타민 시약 2000을 이용하여 생산하였다. 렌티바이러스는 psPAX2 및 pMD2G를 이용하여 만들었다. 1일에, 7×10⁶293T 세포를 항생제가 없는 배지에서 10cm 배양접시에서 씨딩하였다. 1일 후, DNA 12㎍, psPAX2 8㎍, pMD2G 4㎍ 및 50㎍ 리포펙타민을 이용하여 렌티바이러스를 생산하였다. 4일에, 상등액을 수득하고, 4℃에서 저장하였다.

B 세포는 Miltenyi Biotec(Auburn, CA)사의 MACS 분리 키트로 항-마우스 CD43 마이크로비드를 이용하여 C57BL/6 마우스의 비장에서 >90%의 순도로 얻었다. 분리된 B 세포는 24-웰 플레이트에서 BioXcell(West lebanon, NH)사의 10㎍/mL의 항-CD40 항체 및 10ng/mL의 IL-4의 존재에서 2×10⁶/well로 18시간 동안 배양하였다. B 세포는 배양 배지에서 18시간 동안 자극을 준 후, 배양 배지를 버리고, 항생제가 없는 새로운 배지를 첨가하였다. B 세포에 재조합 렌티바이러스의 지시된 MOI를 형질도입하였다. 5㎍/mL의 폴리브렌의 존재에서 25℃에서 30분 동안 1800rpm에서 세포를 원심분리하고, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, B 세포를 배양 배지에서 18시간 동안 배양하였다.

(인 비트로 세포사멸 및 플로우 사이토메트리 평가)

인 비트로 세포사멸을 위해, B 세포는 Annexin-V 및 7-amino-actinomycin D(7-AAD) 염색으로 분석하였다. B 세포는 PerCP-Cyanine5.5-anti-mouse CD45R(B220), PE-anti-mouse CD154(CD40 ligand), APC-anti-mouse CD70, FITC-anti-mouse CD86, PE-anti-mouse CD274(PD-L1), FITC-anti-mouse MHC class II(I-A/I-E), FITC-anti-mouse CD80, PE-anti-mouse 41BBL, PerCP eFlour 710-anti-mouse CD70 및 APC-anti-mouse OX40L로 표지하였다. 사용된 세포를 고정하고, fluorescence-activated cell sorter(FACS) caliber에서 분석하였다.

B 세포로 백신 처리된 마우스의 비장세포를 둥근-바닥 96-웰 플레이트의 웰에 정치하였다. 펩타이드(Trp2180), Golgi-stop, Golgi-plug 및 APC-항 마우스 CD107a/b의 1:1 혼합물을 첨가하였다. 37℃에서 5% CO₂에서 5시간 동안 플레이트를 인큐베이션 하였다. 다음으로, 플레이트를 4℃에서 18시간 동안 인큐베이션 하였다. 비장세포를 PerCP-Cyanin5.5-anti mouse CD8a, PE-anti-mouse IFN-γ 및 FITC-anti-mouse MHC class II(I-A/I-E)로 표지하였다.

(면역 반응의 면역화 및 평가)

인 비보에서 면역 반응을 유도하기 위해, 2×10⁶의 수지상세포 및 항원 펩타이드와 함께 재조합 렌티바이러스가 형질도입된 B 세포를 마우스에 정맥주사하여 면역화시켰다. 마우스는 7일마다 2회 부스터 면역화를 받았다. CD8 T 세포가 종양 세포를 포함하는 항원특이 타겟을 인식할 수 있는지를 평가하기 위해, 비장에서 갓 분리된 CD8 T 세포를 이용하여 IFN-γ enzyme-linked immunosorbent spot(ELISpot) 분석을 수행하였다. 펩타이드-펄스 또는 펄스되지 않은 EL4 또는 B16 흑색종 세포를 APC로 사용하였다.

(RT-PCR을 이용한 세포 생존능 분석)

Qiagen(Valencia, CA)사의 RNeasy 키트를 이용하여 활성화된 B 세포에서 전체 RNAfmf 추출하고, Roche(Basel, Switzerland)사의 펄스트 스트랜드 cDNA 합성 키트를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 관심 있는 단백질의 발현은 다음의 프라이머를 이용하여 측정하였다:

BCL2:

정방향 프라이머: 5'- GCTACCGTCGTGACTTCGCAGA-3',

역방향 프라이머: 5'-GTGTGCAGATGCCGGTTCAGGT-3';

Bcl-xL:

정방향 프라이머: 5'- CGGAGAGCGTTCAGTGATCTAA-3',

역방향 프라이머: 5'- GATAGGTGGCCATCCAACTTGC-3';

Bax:

정방향 프라이머: 5'- CCACCAGCTCTGAACAGATCAT-3',

역방향 프라이머: 5'- TCCACGTCAGCAATCATCCTCT-3';

GAPDH:

정방향 프라이머: 5'- CAACTATTGGTGCTGGCACAAC-3',

역방향 프라이머: 5'- CTCGATCTTACAGCACAAGCCA-3'

열순환(Thermocycling) 프로그램은 다음과 같다: 95℃에서 4분; 95℃에서 30초, 62.8℃에서 30초 및 72℃에서 1분을 35 사이클; 및 72℃에서 10분 동안 마지막 연장 단계.

밴드의 강도는 Bio-Rad Laboratories(Hercules, CA)사의 Image Lab software에서 측정하였고, 각 샘플에 대해 GAPDH 밴드에 대한 mRNA 발현의 상대 값을 계산하였다.

(인 비트로/인 비보 증식 분석 및 사이토카인 생산의 측정)

Miltenyi Biotec사의 Macs αCD8-micobeads를 이용하여 OT-1 세포를 정제하였다. 인 비보 증식을 위해, 1×10⁵ OT-1 세포를 공통유전자혈통(CD45.1) 마우스에 정맥주사로 투여하였다. OT1-세포 주사 후 1일에, OVA₂₅₇ 펩타이드가 펄스된 2×10⁶의 유전자 변형된 B 세포를 마우스에 투여하였다. 포스트-백신 처리 5일에, 비장세포와 4㎍/mL의 OVA₂₅₇ 펩타이드를 18시간 동안 배양하고, αCD8 및 αCD45.2 Facs 항체를 이용한 세포내 IFN-γ 염색을 수행하였다.

인 비보 세포 생존 분석을 위해, 공통유전자혈통(CD45.1) 마우스에서 면역화 전 1일에 1×10⁵ OT-1(CD45.2) 세포를 투여하였다. 다음날, 2×10⁶의 유전자 변형된 B 세포를 공통유전자혈통(CD45.1) 마우스에 주사하였다. 포스트 주사 5일에, 비장세포를 염색하고 플로우 사이토메트리에 의해 CD8, CD45.2 및 IFN-γ에 대해 분석하였다.

2×10⁶의 B 세포를 OT-1 마우스 비장 유래의 정제된 CD8+ T 세포와 함께 24-웰 플레이트에서 공동 배양하였다. 3일 후, 상등액을 수확하고, -70℃에서 저장하였다. 상등액에서 사이토카인의 농도는 eBioscience(San Diego, CA)사의 ELISA 키트를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 측정하였다.

(치료적 항종양 효과의 평가)

제1차 면역화 전 3일에 각 B6 마우스의 뒤 옆구리에 1×10⁵ B16 종양 세포(마우스 당)를 피하 접종하였다. 7일 후, 마우스는 정맥 주사로 면역화를 받았다. 종양 생장은 실험 종점까지 칼리퍼를 측정하여 주당 2회 모니터링 하였다. 마우스는 종양 실험 후 35일에 희생시켰다. PD-1 발현이 고갈되도록, 면역화와 관련된 0, 2 및 4일에 200㎍의 항 PD-L1 항체를 각 마우스에 복강 투여하였다. 결과는 실험 종점까지 시간대별로 처리군마다 평균 종양 크기(mm² 면적)±SD로 나타내었다.

(통계 분석)

항원특이 CD8 T 세포의 수 및 종양 크기를 평가하기 위한 통계적 유의값은 1-way ANOVA tests 및 2-way ANOVA tests로 측정하였다. 결과는 적어도 2회 독립 실험에서 얻은 데이터의 대표값이다. 모든 분석 및 그래프는 GraphPad(San Diego, CA)사의 prism 5.01를 이용하여 수행하였다.

<실험예 1> 재조합 B 세포의 보조자극분자 발현 분석

활성화된 B 세포는 보조자극분자를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 효과적으로 형질도입된다. 본 발명자들은 B 세포(이후, 각각 CD40L-B 및 CD70-B 세포로 언급됨)의 유전자 변형을 위해 보조자극분자인 CD40L 및 CD70을 인코딩하는 재조합 렌티바이러스를 형질도입하기 위한 최적의 인 비트로 조건을 연구하였다. CD40 활성화의 영향을 확인하기 위해, B 세포는 렌티바이러스 형질도입 전에 항-CD40 항체의 유무에 따라 인큐베이션하고, 이어서 IL-4의 존재 하에서 항-CD40 항체의 유무에 따라 2일 동안 추가 배양하였다.

도 1A 및 1B에 도시된 바와 같이, 렌티바이러스 형질도입 후 B 세포에서 CD40 활성화는 효율적인 유전자 발현을 위해 훨씬 중요하나, 항-CD40 항체로 B 세포를 미리-활성화하는 것은 CD40L 및 CD70 발현 수준 및 인 비트로에서 유전자 변형된 B 세포의 세포 생존능을 확실히 증가시킨다. B 세포에서 렌티바이러스 형질도입 효능은 바이러스 투여량(도 1C) 및 원심분리 시간(도 1D)와 관련이 있으나, 폴리브렌은 B 세포에서 형질도입 효능에는 영향을 주지 않는다(미도시됨). 더욱이, CD40-활성화된(및 mock-형질도입된) B 세포는 보조자극분자 CD80, CD40L, CD70, OX40L 및 4-1BBL의 미비한 발현을 나타내어 렌티바이러스 형질도입 후 영향을 받지 않았다(도 1E).

<실험예 2> 재조합 B 세포의 증식 및 항원제시능력 평가

유전자 변형된 B 세포의 항원제시능력을 입증하기 위해, CFSE-표지된 OT-1 세포를 OVA₂₅₇ 펩타이드로 펄스한 후 CD40L 및 CD70 분자를 동시-발현하는 B 세포(CD70/CD40L-B-cells)를 포함하여 다양한 상태에 있는 B 세포와 5일 동안 공동 배양하였다. 또한, GFP-형질도입된 B 세포(GFP-B)를 대조군으로 사용하였다. 세포 증식은 플로우 사이토메트리로 측정하고, Modfit Lt software를 사용하여 분석하였다. 갓 분리된 CFSE-표지된 세포를 모세포로 사용하고, 그들의 동종성은 각 실험 초기에 확인하였다. 각 분열에서 세포의 비율은 그래프에 삽입된 대표 실험에서 얻었다. 즉, PI(증식 지수)는 모든 세대에서 세포의 총 합을 실험 초기에 보이는 모세포의 컴퓨터로 계산된 수로 나눈다.

단일 보조자극분자를 발현하는 B 세포(CD40L-B 및 CD70-B)와 함께 배양된 OT-1 세포는 GFP-B 세포와 비교하여 더 높은 세포 증식 지수를 나타냈다(PI = 34.1 및 28.7 대 15.8). 특히, CD70/CD40L-B 세포는 OT-1 세포의 자극을 향상시켜 B 세포에서 CD40L의 발현이 인 비트로에서 CD8 T 세포 증식에 유익함을 시사한다(도 2A).

다음으로, 공통유전자혈통 마우스 시스템을 이용한 보조자극분자-발현하는 B 세포에 의한 항원특이 CD8 T 세포 확장을 평가하였다. OT-I/CD45.2 세포(1×10⁵)를 공통유전자혈통 CD45.1 마우스에 주입하고, 이어서 다양한 상태에 있는 B 세포로 면역화하였다. 백신 처리 후 5일에, 대표 마우스에서 IFN-γ에 대한 세포내 염색을 통해 나타난 비장세포 내 항원특이 CD8 T 세포는 CD45.2-양성 세포를 수집하여 분석하였다. 도 2B의 컬럼에서 각 직사각형 게이트에서의 수는 모든 CD8 T 세포의 OVA257-특이 IFN-γ 생산 세포의 비율을 나타낸다. 오른쪽 컬럼에서의 수는 모든 OVA257-특이 IFN-γ 생산 세포 중 CD45.2-양성 OT-1 세포의 비율을 의미한다.

도 2B에 나타난 바와 같이, CD70/CD40L-B 세포의 백신뿐만 아니라 모든 B 세포 백신처리로 더 많은 수의 항원특이 CD8 T 세포를 산출하였고, 더불어 인 비보에서 항원특이 CD8 T 세포 증식을 나타냈다.

마지막으로, 유전자 변형된 B 세포와 OT-1 세포의 72시간 공동 배양 후 상등액에서 사이토카인 프로파일을 평가하였다. 사이토카인은 배양 상등액을 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다.

실험 결과, IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 수준은 GFP-B 세포를 포함하여 모든 공동-배양 상태에서 유의적으로 증가하여, B 세포에서 보조자극분자의 발현은 사이토카인 생산에 유익하였다. IL-4 분비는 같은 조건 하에서 검출되지 않았다(도 2C).

<실험예 3> 재조합 B 세포의 항원특이 CD8 T 세포 반응 유도 평가

보조자극분자의 발현을 향상시키기 위해 B 세포에 각각 CD40L-, CD70-, OX40L- 및 4-1BBL-코딩 렌티바이러스 단독(각각 CD40L-B, CD70-B, OX40L-B 및 4-1BBL-B-cells)을 형질도입 하거나, CD70-, OX40L- 및 4-1BBL-코딩 바이러스와 함께 CD40L-코딩 바이러스를 동시-형질도입(각각 CD70/CD40L-B, OX40L/CD40L-B 및 4-1BBL/CD40L-B-cells)하고, 형질도입된 B 세포의 표면 발현을 확인하였다.

도 3A에 나타난 바와 같이, B 세포에서 형질도입된 유전자 발현 수준은 Mock-B 세포와 비교하여 이후에 증가하였다(50%를 초과). 흥미롭게도, 형질도입된 유전자 발현 수준은 각각의 보조자극분자를 인코딩하는 조합 바이러스로 동시-형질도입된 B 세포에서 현저히 증가하였다. 아마도, 이중-형질도입된 보조자극분자에 의한 B 세포의 조화로운 보조자극 때문인 것 같다.

다음으로, 보조자극분자를 인코딩하는 렌티바이러스가 형질도입된 B 세포가 인 비보에서 항원특이 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는지를 평가하였다. 이를 위해, 보조자극분자를 발현하는 Trp₂₁₈₀-펄스된 B 세포를 0일 및 7일에 마우스에 i.v. 면역화하고, 마지막 면역화 후 8일에, 펩타이드-펄스된 EL4 (EL4/Trp₂₁₈₀) 및 펄스되지 않은 EL4(EL4)에 대해 IFN-γ ELISPOT 분석을 통해 비장에서 항원특이 CD8 T 세포의 비율을 평가하였다. 또한, 이로부터 IFN-γ 및 CD107a/b 이중-양성 CD8 T 세포의 총수를 계산하였다. 점화 백신 처리 후 15일에, 개별 마우스 유래의 비장세포는 CD107a/b의 세포 표면 이동 및 IFN-γ 염색을 위해 자극되었다.

도 3B 및 3C에 나타난 바와 같이, 항원특이 인식은 펩타이드-펄스된 타겟(EL4 세포)라는 증거이며, GFP-B 세포 백신 처리는 DC 백신 처리만큼 효율적으로 항원특이 CD8 T 세포를 확장시켰다. 단일 유전자 변형된 B 세포(CD40L-B, CD70-B, OX40L-B 및 4-1BBL-B cells) 백신 처리는 GFP-B 세포 백신처리에서보다 유의적으로 높은 IFN-γ 스팟(도 3B)와 용해 기능성을 갖는 Trp2₁₈₀-특이 CD8 T 효과기 세포(CD107a/b 유동: 도 2C)를 산출하였다. 특히, 다른 보조자극분자(CD70/CD40L-B, OX40L/CD40L-B 및 4-1BBL/CD40L-B)와 함께 CD40L을 함께 발현하는 B 세포가 투여된 마우스는 다른 상태의 B 세포 백신 처리에 의해 나타난 것과 비교하여 유의적으로 더 높은 수준의 Trp2₁₈₀-특이 CD8 T 세포 반응(용해 기능성을 가짐)을 가지고 있었다.

전체적으로, 이들 결과는 추가적인 보조자극분자를 발현하는 유전자 변형된 B 세포는 그들의 항원제시능력을 향상시키고, CD40L의 추가적인 발현은 인 비보에서 항원특이 T 세포를 자극하는 향상된 능력을 달성케 함을 시사한다.

<실험예 4> 재조합 B 세포의 생존능 평가

인 비보에서 주입된 항원제시세포의 불충분한 지속 시간으로 인해 항원특이 CD8 T 세포의 유도는 비효율적이다. B 세포에서 CD40L:CD40 상호작용은 그들의 생존뿐만 아니라 장기간 생존하는 혈장 세포 및 메모리 B 세포의 생성에 중요한 것으로 알려져 있다. 이러한 관점에서, 다양한 상태의 B 세포의 생존율을 분석하였다. 이를 위해, 배양 후 1일, 3일에 Annexin-V 및 7-AAD로 염색하여 평가된 유전자 변형된 B 세포의 세포사멸을 확인하였다. 결과는 Annexin-V/7-AAD 플로우 사이토메트리의 대표 실험을 나타낸다. 세포 계수는 CD70-및/또는 CD40L를 인코딩하는 렌티바이러스 형질도입 후 1일, 3일 및 5일 동안 시험되었다. 또한, 일 후 유전자 변형된 B 세포의 mRNA로부터 세포사멸-관련 분자 BCL2, Bcl-xL 및 Bax에 대해 RT-PCR 분석을 수행하였다. 밴드 강도는 Image Lab software에 의해 측정되고, mRNA 발현의 상대 값은 GAPDH 밴드와 비교하여 계산되었다.

실험 결과, B 세포에서 CD40L 단독 및 CD40L과 함께 CD70의 추가적인 발현은 GFP- 및 CD70-발현하는 B 세포에 비해 충동적인 세포 죽음을 예방하여(도 4A 및 4B), CD40L-발현하는 B 세포에서 더 많은 살아있는 세포 수를 유도하나 CD40L-부족한 B 세포의 수(GFP-B 및 CD70-B-cells)는 CD40L-나타내는 B 세포의 것보다 약 2-배 미만으로 감소하였다(도 4C). 세포 생존 연구 결과와 유사하게, CD40L의 B 세포로의 형질도입(CD40L-B 및 CD70/CD40L-B-cells)은 CD40L-부족한 B 세포와 비교하여 항-세포사멸 분자인 BCL2, Bcl-xL 및 Bax가 장기간 유지되었다(도 4D).

이들 결과는 CD40L을 발현하는 B 세포가 향상된 엑스 비보 세포 생명력을 보여주면서, 다양한 항-세포사멸 분자의 발현을 통해 세포사멸을 억제하여 인 비보에서 생존 이점을 달성케 함을 시사한다.

<실험예 5> 재조합 B 세포의 항종양 효능 평가

유전자 변형된 B 세포 백신 처리에 의해 생산된 CD8 T 세포가 3-일 정착된 종양에 대해 인 비보 치료적 항종양 효과를 나타낼 수 있는지를 평가하였다. 이를 위해, B6 마우스(그룹당 5마리)에 0일에 B16 세포를 피하접종하고, 3일 및 10일에 정맥주사로 유전자 변형된 B 세포로 백신 처리하였다. 백신 처리되지 않은 마우스(No vax) 및 항원-탑재된 DCs(DC)를 대조군으로 포함시켰다.

도 5A에 나타난 바와 같이, 단일 유전자 변형된 B 세포(CD40L-B, CD70-B, OX40L-B, 및 4-1BBL-B) 백신 처리는 DC 백신 처리보다 뛰어난 치료 효과를 완화시키는데, 이는 GFP-B 세포 백신 처리에 필적할만하였다. 반대로, CD40L 및 4-1BBL을 제외하고 다른 보조자극분자를 함께 발현하는 B 세포(CD70/CD40L-B 및 OX40L/CD40L)는 실질적으로 더 높은 항종양 효과를 가지고 있었다(CD70/CD40L 및 OX40L/CD40L 그룹에서 5마리 중 2마리가 종양을 거부하였다). 더욱이, CD70/CD40L-B 및 OX40L/CD40L-B 세포가 투여된 마우스의 생존은 90일 이상 유지되었다(미도시됨).

이어서, 공격형 정착된 종양에서 CD8 T 세포와 함께 참여할 수 있는 PD-1 봉쇄(항-PD-L1 항체 이용)의 역할을 평가하였다. 이를 위해, B16F10SK 세포를 B6 마우스에 피하주사하고(그룹당 5마리), 유전자 변형된 B 세포는 3일 및 10일에 정맥주사 하였다. 추가로, 마우스에 면역화 후 0일, 1일 및 2일에 항체를 고갈시키는 복강내 주사를 수행하였다. 백신 처리되지 않은 마우스(No vax)를 대조군으로 포함시켰다.

도 5B에 나타난 바와 같이, PD-1 봉쇄는 유전자-변형된 B 세포의 치료적 효능을 높였고, 항원특이 CD8 T 세포의 유의적인 증가가 관찰되었다(미도시됨).

종양 크기는 암 면역치료의 유효성에 영향을 줄 것이므로, 7-일 정착된 종양(3-5 mm 직경)에 대해 유전자-변형된 B 세포의 백신 처리의 치료적 이점을 평가하였다. 이를 위해, B6 마우스에 B16F10SK 세포를 0일에 피하접종하였다. 유전자 변형된 B 세포는 7일 및 14일에 정맥내로 백신 처리하였다. PD-1 고갈을 위해, 면역화 후 0일, 1일 및 2일에 항체를 고갈시키는 복강내 주사를 수행하였다. 백신 처리하지 않은 마우스(No vax)를 대조군으로 포함시켰다.

도 5C에 나타난 바와 같이, CD40L-발현하는 B 세포의 백신 처리는 대략 7일에 의한 종양 생장율의 중간 정도 감소하였다. 항-PD-L1 항체 단독 투여는 치료 효과를 완화시키나, B 세포 백신에 대해 PD-1 봉쇄를 추가하는 경우 비-조합 그룹과 비교하여 종양 생장을 중간 정도로 유의적으로 감소시키나, 종양 거부는 관찰되지 않았다.

전체적으로, 이들 결과는 추가적인 보조자극분자를 발현하는 유전자 변형된 B 세포의 백신 처리가 정상 조직에서 발현된 자가-항원에 대해 어떠한 잠재적 내성을 우회하는데 효과적이므로 정착된 종양에 대해 유의한 항종양 치료 효과를 유도함을 시사한다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> B cell vaccine and use thereof <130> P16U11C0465 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60 atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120 ctttttgctg tgtatcttca tagaaggttg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180 gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240 ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300 aacaaagagg agacgaagaa agaaaacagc tttgaaatgc aaaaaggtga tcagaatcct 360 caaattgcgg cacatgtcat aagtgaggcc agcagtaaaa caacatctgt gttacagtgg 420 gctgaaaaag gatactacac catgagcaac aacttggtaa ccctggaaaa tgggaaacag 480 ctgaccgtta aaagacaagg actctattat atctatgccc aagtcacctt ctgttccaat 540 cgggaagctt cgagtcaagc tccatttata gccagcctct gcctaaagtc ccccggtaga 600 ttcgagagaa tcttactcag agctgcaaat acccacagtt ccgccaaacc ttgcgggcaa 660 caatccattc acttgggagg agtatttgaa ttgcaaccag gtgcttcggt gtttgtcaat 720 gtgactgatc caagccaagt gagccatggc actggcttca cgtcctttgg cttactcaaa 780 ctctga 786 <210> 2 <211> 402 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggtatcac atcggtatcc tcgaattcaa agtatcaaag tacaatttac cgaatataag 60 aaggagaaag gtttcatcct cacttcccaa aaggaggatg aaatcatgaa ggtgcagaac 120 aactcagtca tcatcaactg tgatgggttt tatctcatct ccctgaaggg ctacttctcc 180 caggaagtca acattagcct tcattaccag aaggatgagg agcccctctt ccaactgaag 240 aaggtcaggt ctgtcaactc cttgatggtg gcctctctga cttacaaaga caaagtctac 300 ttgaatgtga ccactgacaa tacctccctg gatgacttcc atgtgaatgg cggagaactg 360 attcttatcc atcaaaatcc tggtgaattc tgtgtccttt ga 402 <210> 3 <211> 765 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggaatacg cctctgacgc ttcactggac cccgaagccc cgtggcctcc cgcgccccgc 60 gctcgcgcct gccgcgtact gccttgggcc ctggtcgcgg ggctgctgct gctgctgctg 120 ctcgctgccg cctgcgccgt cttcctcgcc tgcccctggg ccgtgtccgg ggctcgcgcc 180 tcgcccggct ccgcggccag cccgagactc cgcgagggtc ccgagctttc gcccgacgat 240 cccgccggcc tcttggacct gcggcagggc atgtttgcgc agctggtggc ccaaaatgtt 300 ctgctgatcg atgggcccct gagctggtac agtgacccag gcctggcagg cgtgtccctg 360 acggggggcc tgagctacaa agaggacacg aaggagctgg tggtggccaa ggctggagtc 420 tactatgtct tctttcaact agagctgcgg cgcgtggtgg ccggcgaggg ctcaggctcc 480 gtttcacttg cgctgcacct gcagccactg cgctctgctg ctggggccgc cgccctggct 540 ttgaccgtgg acctgccacc cgcctcctcc gaggctcgga actcggcctt cggtttccag 600 ggccgcttgc tgcacctgag tgccggccag cgcctgggcg tccatcttca cactgaggcc 660 agggcacgcc atgcctggca gcttacccag ggcgccacag tcttgggact cttccgggtg 720 acccccgaaa tcccagccgg actcccttca ccgaggtcgg aataa 765 <210> 4 <211> 582 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgccggagg agggttcggg ctgctcggtg cggcgcaggc cctatgggtg cgtcctgcgg 60 gctgctttgg tcccattggt cgcgggcttg gtgatctgcc tcgtggtgtg catccagcgc 120 ttcgcacagg ctcagcagca gctgccgctc gagtcacttg ggtgggacgt agctgagctg 180 cagctgaatc acacaggacc tcagcaggac cccaggctat actggcaggg gggcccagca 240 ctgggccgct ccttcctgca tggaccagag ctggacaagg ggcagctacg tatccatcgt 300 gatggcatct acatggtaca catccaggtg acgctggcca tctgctcctc cacgacggcc 360 tccaggcacc accccaccac cctggccgtg ggaatctgct ctcccgcctc ccgtagcatc 420 agcctgctgc gtctcagctt ccaccaaggt tgtaccattg cctcccagcg cctgacgccc 480 ctggcccgag gggacacact ctgcaccaac ctcactggga cacttttgcc ttcccgaaac 540 actgatgaga ccttctttgg agtgcagtgg gtgcgcccct ga 582

Claims

CD40L를 코딩하는 핵산; 및 OX40L을 코딩하는 핵산을 함유하는 발현벡터로 형질전환되고, 외래 항원에 의해 감작된 B 세포.
제1항에 있어서,
핵산은 DNA 또는 RNA인, B 세포.
제1항에 있어서,
CD40L를 코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 1에 기재된 것인, B 세포.
제1항에 있어서,
OX40L를 코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 2에 기재된 것인, B 세포.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
항원은 종양 항원, 병원체 항원 또는 자가-항체인, B 세포.
제1항의 B 세포를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환 치료용 면역치료제.
제1항의 B 세포를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환 예방용 백신.
제1항의 B 세포를 포함하는 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환 치료용 약학 조성물.
제10항에 있어서,
약학 조성물은 항-PD-L 항체를 추가로 포함하는, 종양, 병원체 감염 또는 자가면역질환 치료용 약학 조성물.