KR101818762B1

KR101818762B1 - 평활근세포로의 분화를 촉진하는 방법 및 이를 이용한 조성물

Info

Publication number: KR101818762B1
Application number: KR1020150100239A
Authority: KR
Inventors: 서원희
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2015-07-15
Filing date: 2015-07-15
Publication date: 2018-01-16
Anticipated expiration: 2035-07-15
Also published as: KR20170010135A

Abstract

본 발명은 평활근세포로의 분화를 촉진하는 방법 및 이를 이용한 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 출발 세포를 제공하는 단계; 및 출발 세포에서 FGF-12의 과발현을 유도하여 출발 세포를 분화 상태를 변경하는 단계; 및 출발 세포에서 평활근세포의 표현형(phenotype)을 확인하는 단계를 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화를 촉진하는 방법과 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물에 대한 것이다. 본 발명은 FGF-12를 단일 인자로 하여 미분화 상태의 줄기세포를 평활근세포로 분화 촉진하거나, 섬유아세포에서 평활근세포로의 전환분화를 촉진하는 데 매우 효과적이다.
본 발명은 FGF-12를 이용하여 다양한 출발 세포로부터 용이하고 효율적으로 평활근세포의 분화를 촉진할 수 있으므로, 평활근세포 퇴행성 질환을 위한 유전자 치료제 또는 세포 치료제를 개발하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

평활근세포로의 분화를 촉진하는 방법 및 이를 이용한 조성물{Methods to promote differentiation into smooth muscle cells and composition thereof}

본 발명은 평활근세포로의 분화를 촉진하는 방법 및 이를 이용한 조성물에 대한 것으로, 보다 상세하게는 출발 세포를 제공하는 단계; 및 출발 세포에서 FGF-12의 과발현을 유도하여 출발 세포의 분화 상태를 변경하는 단계; 및 출발 세포에서 평활근세포의 표현형(phenotype)을 확인하는 단-계를 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화를 촉진하는 방법과 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물에 대한 것이다.

평활근세포들은 심장을 제외한 대부분의 내장의 근육벽을 구성하며, 호르몬과 자율신경계의 조절을 받아 수축하고 이완하면서 이들 기관이 각각의 기능을 원활하게 수행할 수 있도록 하는 역할을 한다. 혈관에서 평활근세포는 혈관 중간층(medial layer)의 내벽을 형성하며, 성숙하고 안정된 혈관계가 발생하는데 매우 중요하다. 혈관을 구조적으로 지지하고, 혈류와 혈압을 조절하며, 혈관의 내구성과 탄성력에 필수적인 세포외 기질을 합성하고 분비한다. 또한 평활근세포들은 혈관이 손상되면 이를 회복하기 위하여 수축성은 감소하고 세포분열과 이동성이 증가한 재생 상태로의 적응적인 변화를 보이기도 한다. 따라서 평활근세포가 유전자 손상, 감염, 다른 질환 등의 선천적 또는 후천적인 이유로 기능이 손상되면 정상적인 생리 기능을 유지할 수 없게 된다. 따라서 평활근세포 퇴행성 질환의 치료를 위하여 평활근세포로의 분화를 효과적으로 촉진할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.

평활근세포의 분화나 평활근세포 특이적 유전자 발현 조절 기작의 구체적인 분자적 기작은 자세히 알려져 있지 않다. 인간의 분화만능 줄기세포나 유도만능 줄기세포로부터 레티노산(retinoic acid), 다양한 성장인자 또는 세포외 기질 등을 이용하여 평활근세포로 분화시키기 위한 시도들이 있어 왔으나, 균질한 평활근세포를 충분한 양으로 얻기에는 기술이 부족한 상황이다(Descamps et al., Vascul Pharmacol (2012) 56(5-6):267-79).

이에 본 발명자들은 효과적으로 평활근세포를 수득할 수 있는 방법에 대해서 연구하던 중, FGF-12가 과발현되면 줄기세포에서 평활근세포로 분화가 유도되며 또한 섬유아세포에서 평활근세포로의 전환분화가 유도되는 것을 관찰하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은

(a) 출발 세포를 제공하는 단계; 및

(b) 출발 세포에서 FGF-12의 과발현을 유도하여 출발 세포의 분화 상태를 변경하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 출발 세포에서 평활근세포의 표현형(phenotype)을 확인하는 단계를 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화를 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은

FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 출발 세포를 제공하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 출발 세포에서 평활근세포의 표현형(phenotype)을 확인하는 단계를 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여,

FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

(a) 출발 세포를 제공하는 단계; 및

이하 본 발명의 방법을 단계에 따라 설명한다.

본 발명은 (a) 출발 세포를 제공하는 단계를 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 ‘분화(differentiation)’는 세포의 구조나 기능이 변화하거나 특수화되는 현상을 의미한다.

‘평활근세포(smooth muscle cell, SMC)’는 평활근의 근육 세포를 의미한다. ‘평활근’은 가로무늬가 없는 근육으로 민무늬근이라고도 불리기도 한다. 척추동물에서 심장 이외의 내장의 근육벽, 즉 위장관, 호흡기의 기도, 혈관, 방광, 자궁 등의 내부 근육벽을 구성하는 근육은 모두 평활근으로 되어 있다. 평활근은 의식적으로 움직일 수 없으며, 평활근의 수축은 자율신경계에 의해 직접 조절되고, 호르몬의 영향을 받는다. 일반적으로 평활근은 발생 단계에서 중배엽(mesoderm)으로부터 근육발생(myogenesis) 과정을 통해 형성되지만, 대동맥(aorta)이나 폐동맥(pulmonary artery)과 같이 신경능선(neural crest)의 외배엽성 중간엽(ectomesenchyme)에서 유래하는 것도 있다.

본 발명의 평활근세포는 바람직하게는 혈관 평활근세포(vascular smooth muscle cell, VSMC)일 수 있다. 혈관 평활근세포는 혈관계의 구조를 형성하고, 신경계와 호르몬의 조절을 통해 수축 이완하여 혈압과 혈류를 조절한다. 분화된 평활근세포는 SM MHC(smooth muscle myosin heavy chain), SM22, 칼포닌(calponin), 평활근α-액틴(SMα-actin), 데스민(desmin) 등 평활근세포 특이적 수축성 단백질을 높은 수준으로 발현하며, 수축성을 갖는다.

본 발명에서 ‘출발 세포’는 본 발명의 방법에 따라 평활근세포로 분화 또는 전환될 대상이 되는 세포로서, 목적하는 평활근세포보다 미분화 상태 (undifferentiated)일 수도 있고, 세포의 형태와 기능이 특정된 분화 상태일 수도 있고, 최종적으로 분화된 상태(terminally differentiated)일 수도 있다. 최종 분화된 세포는 증식하지 않거나, 증식하더라도 한 종류의 세포로만 세포분열이 가능한 단분화능(unipotency)을 갖는다. 본 발명에서의 평활근세포보다 미분화 상태인 출발 세포는 줄기세포일 수 있으며, 줄기세포는 바람직하게는 만능줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있다. 본 발명에서 만능줄기세포는 바람직하게는 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포일 수 있으며, 성체줄기세포는 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다. 본 발명에서 특정적으로 분화되거나 최종 분화된 출발 세포는 섬유아세포일 수 있으며 바람직하게는 진피 섬유아세포일 수 있다. 또한 출발 세포는 자연적으로 발생한 세포일 수도 있고 유전자 변형된 세포일 수 있다. 출발 세포는 그 종류에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법에 따라 분리하거나 배양하여 제공할 수 있다.

본 발명은 (b) 출발 세포에서 FGF-12의 과발현을 유도하여 출발 세포의 분화 상태를 변경하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

상기 ‘출발 세포의 분화 상태를 변경하는 단계’는 출발 세포가 다른 종류의 세포로 분화, 변화 또는 전환될 수 있는 능력을 유도하거나 그 과정을 촉진시키는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 출발 세포에서 FGF-12를 과발현시킴으로써 출발 세포의 분화 상태를 변경하는 단계를 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 변화를 유도하거나 촉진하는 방법이다.

본 발명의 (b) 단계의 분화 상태를 변경하는 단계는 출발 세포의 분화를 진행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다.

상기‘출발 세포의 분화를 진행’하는 것은 출발 세포가 덜 특수한 상태에서 더욱 특수한 상태로 변하는 것을 의미한다. 이는 출발 세포가 분화하여 형성할 수 있는 성숙하고 완전한 최종 분화한 세포의 종류가 줄어드는 것, 즉 분화능(cell potency)이 제한되는 것을 의미할 수도 있다. 따라서 본 발명의 방법이 출발 세포의 분화를 진행함으로써 분화 상태를 변경하는 것일 때에는 출발 세포는 평활근세포보다 미분화 상태의 세포인 것을 의미한다. 평활근세포보다 미분화 상태의 세포는 평활근세포 외에 다른 종류의 세포로도 분화될 수 있는 세포이다.

상기 평활근세포보다 미분화 상태인 출발 세포는 줄기세포일 수 있다.

‘줄기세포(stem cell)’는 자기재생할 수 있고, 분화하여 무제한적으로 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성할 수 있는 세포를 뜻한다. ‘자기재생(self renewal)’은 미분화 상태를 유지하면서 세포 분열 주기를 반복하는 능력이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래(또는 전이(transit)) 세포로 분열될 수 있으며, 최종적으로는 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 분화된다. 본 발명에서의 줄기세포는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 인간에서 유래한 것일 수 있다.

본 발명에서의 줄기세포는 만능줄기세포일 수 있다.

‘만능줄기세포(pluripotent stem cell)’는 생체를 구성하는 세 가지 배엽, 즉 내배엽, 중배엽, 외배엽 모두로 분화할 수 있는 분화 만능성(pluripotency)을 지닌 줄기세포를 뜻한다. 일반적으로 배아줄기세포(embryonic stem cell), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPC 또는 iPCS), 배아생식세포(embryonic germ cell), 배아종양세포(embryonic carcinoma cell)가 만능줄기세포에 해당된다. 본 발명에서의 만능줄기세포는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 인간에서 유래한 것일 수 있다.

본 발명에서의 만능줄기세포는 바람직하게는 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포일 수 있다.

‘유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPC 또는 iPCS)’는 분화 만능성(pluripotency)이 없는 세포, 통상적으로는 성체의 체세포나 최종 분화 세포에 재프로그래밍(reprogramming) 인자라고 불리는 특정 유전자의 삽입 또는 과발현에 의해 인위적으로 분화 만능성이 유발된 만능줄기세포를 의미한다. 재프로그래밍 인자로서 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc의 네 종류의 전사인자들이 가장 일반적으로 이용된다.

‘배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC)’는 수정란이 착상하기 직전인 배반포기(blastocyst)의 내부세포 덩어리(세포내괴, inner cell mass)를 분리하여 체외에서 배양한 세포로, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 만능성(pluripotency)을 갖는다. 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체를 포함한다. ‘배아체(embryonic body 또는 embryoid body, EB)’는 부유 배양 상태에서 생성된 구형의 줄기세포의 덩어리를 의미하며, 잠재적으로 내배엽, 중배엽, 외배엽으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있어 조직특이적 분화 세포를 확보하기 위한 대부분의 분화 유도 과정에서 전구체로 이용된다.

또한 본 발명에서의 줄기세포는 성체줄기세포일 수도 있다.

‘성체줄기세포(adult stem cell)’는 성체의 조직이나 기관, 예를 들어 뇌, 골수, 말초혈액, 혈관, 근육, 피부, 치아, 심장, 위장, 간, 난소, 고환 등에서 발견되는 줄기세포로서, 해당 조직을 유지하고 손상을 복구하는 역할을 하는 줄기세포를 의미한다. 성체줄기세포는 신체 각 조직에 극히 소량으로만 존재하며, 일반적으로 분화가능한 세포의 종류가 해당 특정 조직을 구성하는 세포로 제한된 다분화능(multipotency)을 나타낸다. 성체줄기세포는 신경세포로 분화할 수 있는 신경줄기세포(neural stem cell), 혈액세포로 분화할 수 있는 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 뼈, 연골, 지방, 근육 등으로 분화할 수 있는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 간세포로 분화할 수 있는 간줄기세포(hepatic stem cell)일 수 있으나 여기 제한되지는 않는다. 본 발명의 성체줄기세포는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 인간에서 유래한 것일 수 있다.

본 발명에서의 성체줄기세포는 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있다.

‘중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)’는 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell)라고 불리기도 하며, 중배엽 유래의 세포로 분화할 수 있는 다분화능(multipotency)을 갖는 줄기세포이다. 골세포(osteocyte), 연골세포(chondrocyte), 힘줄세포(tendinocyte), 지방세포(adipocyte), 근육세포(myocyte), 섬유아세포(fibroblast) 등으로 분화될 수 있다. 본 발명의 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 태반, 양수, 양막, 골수, 지방, 근육, 피부, 말초혈 등의 조직에서 유래한 것일 수 있으며 여기 국한되는 것은 아니다. 바람직하게는 인간의 골수에서 유래한 중간엽 줄기세포일 수 있다.

한편 상기 (b) 단계에서의 출발 세포의 분화 상태를 변경하는 단계는 출발 세포를 평활근세포로 전환분화되도록 하는 것일 수도 있다.

‘전환분화(transdifferentation)’는 분화된 한 종류의 세포가 다른 종류의 분화된 세포로 전환하는 과정으로, 하나의 성숙한 체세포가 전분화능(pluripotency)의 상태 또는 전구세포(progenitor cell) 등의 중간 단계를 거치지 않고 다른 종류의 성숙한 체세포로 전환되는 것을 의미한다. ‘체세포’는 DNA 등의 유전물질을 다음 세대로 직접 전이시키지 않는, 난자나 정자가 아닌 세포를 의미하며, 일반적으로 특정 체세포가 다른 종류의 체세포로 분화될 가능성은 매우 제한적이거나 없다.

따라서 본 발명의 방법이 출발 세포의 분화 상태를 전환분화를 통해 변경하는 것일 때에는 출발 세포는 세포의 종류와 기능이 특정된 분화 상태의 세포일 수도 있고, 최종 분화된 상태일 수도 있다. 최종 분화된 세포는 증식하지 않거나, 증식하더라도 한 종류의 세포로만 분열할 수 있는 단분화능(unipotency)을 갖는다.

본 발명의 방법이 전환분화를 통해 출발 세포의 분화 상태를 변경하는 것일 때의 출발 세포는 섬유아세포일 수 있다.

‘섬유아세포(또는 섬유모세포, fibroblast)’는 결합조직의 구조를 형성하고 지지하는 세포외 기질과 콜라겐과 엘라스틴 등 섬유 단백질을 합성하고 분비하는 세포이다. 발생 중 원시 중간엽(primitive mesenchyme)에서 유래하며 동물의 결합 조직에서 가장 흔하게 존재하는 세포이고, 상처 치유(wound healing)에도 매우 중요하다. 섬유아세포는 존재하는 조직이나 활성 상태에 따라 다양한 형태를 보이는데, 활성화 상태를 섬유모세포(fibroblast), 비활성 상태를 섬유세포(fibrocyte)로 부르기도 한다. 본 발명에서의 섬유아세포는 포유류에서 유래한 것일 수 있고, 인간에서 유래한 것일 수 있다.

본 발명에서의 섬유아세포는 바람직하게는 진피 섬유아세포(dermal fibroblast)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간의 진피 섬유아세포일 수 있다. 진피 섬유아세포는 대식세포(macrophage), 지방세포(adipocyte)와 함께 피부 진피층(dermis)의 주요 구성 세포이다. 진피 섬유아세포는 다른 조직의 섬유아세포와는 달리 잘 증식하지 않으며, 일단 발생이 끝나면 상처나 손상 등 외부 자극이 없는 상태에서 다른 종류의 세포로 변할 가능성도 매우 낮은 것으로 알려져 있다.

본 발명의 방법은 (b) 출발 세포에서 FGF-12의 과발현을 유도하여 출발 세포의 분화 상태를 변경하는 단계를 포함하는 방법이다.

본 발명에서 ‘FGF-12’는 섬유아세포 성장인자 12(fibroblast growth factor 12)를 의미하며, FGF12, FGF12B, FHF1 등으로 불리기도 한다. FGF-12는 다른 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)들과 서열과 구조가 유사하지만, N-말단의 분비 신호 서열(N-terminal secretion signal seqeunce)이 없어 세포 외부로 분비되지 않고 주로 핵이나 세포질에 존재하며, 세포 표면의 FGF 수용체를 활성화시키지 않는 등 생화학적으로 구분되는 특징이 있다. 때문에 섬유아세포 성장인자 유사인자(FGF homologous factor, FHF)로 분류되기도 한다. 인간 FGF-12의 mRNA 서열 또는 아미노산 서열은 NM_021032.4(FGF 12 isoform 1, mRNA), NP_066360.1(FGF 12 isoform 1, protein), NM_004113.5(FGF 12 isoform 2, mRNA), NP_004104.3(FGF 12 isoform 2, protein) 등의 Genebank accession number로 공지되어 있다.

본 발명의 FGF-12는 바람직하게는 인간의 FGF-12일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.

본 명세서에서 용어 ‘단백질’은 ‘폴리펩타이드(polypeptide)’ 또는 ‘펩타이드(peptide)’와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.

본 발명의 FGF-12는 이의 기능적 동등물을 포함한다. ‘기능적 동등물’이란, 본 발명의 FGF-12의 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 본 발명의 FGF-12와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. ‘실질적으로 동질의 생리활성’이란, 출발 세포에서 발현되었을 때, 평활근세포로의 분화 또는 전환을 유도하고 촉진할 수 있는 활성을 의미한다.

상기 기능적 동등물은 본 발명의 FGF-12의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다: 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황 함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 FGF-12의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 단백질의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 FGF-12의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 FGF-12의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 단백질의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 단백질 또는 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 발명의 (b) 단계에서 출발 세포에서 FGF-12의 과발현을 유도하는 것은 FGF-12를 암호화(coding)하는 폴리뉴클레오티드로 출발 세포를 형질전환시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다.

본 발명의 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 ‘폴리뉴클레오티드(polynucleotide)’또는 ‘핵산’은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.

상기 출발 세포를 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 것은 당업계에 공지된 세포의 형질전환을 위한 적절한 폴리뉴클레오티드 전달 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 출발 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 생체외 형질감염, 주입 또는 미량주입 방법, 전기천공법(electroporation), 열충격법(heat shock), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO₄) 침전법, 염화칼슘(CaCl₂) 침전법, 실리콘 탄화물 위스커(silicon carbide whiskers), 탄화규소 섬유와 함께 진탕처리, 초음파 처리(sonication), 리포좀을 이용한 형질감염, 수용체 매개 형질감염, 아그로박테리아(Agrobacteria) 매개된 형질전환, 폴리에틸글리콜(polyethylenglycol)에 의한 침전법, 폴리에틸렌이민(polyethylenimine) 또는 덱스트란 설페이트를 이용한 방법, 리포펙타민, 미세입자 충격, 입자 총 충격법(particle gun bombardment) 등의 방법이 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명에서의 형질전환은 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 발현 벡터에 의해 매개되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 ‘발현(expression)’은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미하며, ‘재조합 발현 벡터’란 적합한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. ‘작동가능하게 연결된(operably linked)’이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. ‘발현조절서열(expression control sequence)’이란 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 재조합 벡터는 당업계에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

따라서 본 발명의 재조합 발현 벡터는 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와, 출발 세포에서 FGF-12를 발현하기 위한 필수적인 발현조절서열을 모두 포함하고 이들이 작동가능하게 기능적으로 연결된 유전자 작제물이다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 재조합 발현 벡터 제작시 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커 및/또는 복제 기원(replication origin)을 포함하고 있을 수 있으며, 또한 상기 발현 벡터는 필요에 따라 발현조절서열, 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열,리더 서열 등을 포함하며, 출발 세포 또는 평활근세포의 형질을 나타내고 확인하기 위한 리포터(reporter) 또는 마커(marker) 유전자의 서열 등을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기한 발현조절서열과 기타 부가 기능을 위한 서열들은 필요에 따라 출발 세포 또는 평활근세포에 특이적인 것으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명에서 재조합 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 아비폭스바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 바람직하게는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 아데노바이러스벡터인 pAdEasy-1 벡터를 사용하였다.

본 발명의 방법이 재조합 바이러스 벡터를 매개로 출발 세포를 형질전환시키는 것일 때에는 다음과 같은 단계를 포함하는 방법에 따라 출발 세포에서 FGF-12의 과발현을 유도할 수 있다.

(i) FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 발현조절서열이 FGF-12가 출발 세포에서 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 단계; 및

(ii) 상기 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 FGF-12 발현 재조합 바이러스를 제조하고 분리하는 단계; 및

(iii) 상기 FGF-12 발현 재조합 바이러스를 출발 세포에 감염시키는 단계; 및

(iv) 상기 바이러스 감염된 출발 세포에서 FGF-12가 과발현되도록 추가 배양하는 단계.

상기 (iv) 단계의 추가 배양하는 단계는 출발 세포, 형질전환에 사용한 재조합 바이러스 벡터, 바이러스의 종류 등에 따라 출발 세포에서 평활근세포로 유도되는데 충분한 양의 FGF-12가 발현될 때까지 적절하게 실시할 수 있다. 바람직하게는 6일 내지 14일 정도 추가 배양할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 FGF-12의 염기서열이 포함된 pAdEasy-1 벡터를 포함하는 아데노바이러스를 이용하여 출발 세포를 감염시켰으며, 출발 세포가 생쥐 배아줄기세포인 경우에는 바이러스 감염 후 배아체를 형성하는 과정을 포함하여 10일 내지 14일 동안 추가 배양하였고, 출발 세포가 인간 진피 섬유아세포 또는 인간 골수유래 중간엽 줄기세포인 경우에는 바이러스 감염 후 6일 동안 추가 배양하였다.

본 발명은 (c) 상기 (b) 단계의 출발세포에서 평활근세포의 표현형(phenotype)을 확인하는 단계를 포함하는 출발세포로부터 평활근세포로의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다.

상기 평활근세포의 표현형은 다른 세포와 구분되는 평활근세포 특이적인 표현 형질로서, 평활근세포 특이적인 구조나 형태, 평활근세포 특이적인 유전자 조합의 발현 양상일 수도 있고, 호르몬이나 외부 자극에 대한 평활근세포 특이적인 반응, 예를 들면 아세틸콜린 수용체 작용제(agonist)에 의한 세포 수축 반응 등의 기능적인 형질일 수도 있다. 이 외에 평활근세포 특이적인 표현 형질로 공지되어 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 출발 세포가 평활근세포 특이적 표현 형질의 획득했는지의 여부는 특정 평화근세포 표현형에 대하여 출발세포와 양성 대조군 세포, 그리고 음성 대조군 세포를 비교대조하여 판단할 수 있다. 양성 대조군 세포로는 평활근세포를 사용할 수 있으며, 음성 대조군 세포로는 바람직하게는 형질전환되지 않은 출발 세포 또는 FGF-12를 암호화하는 염기서열을 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 출발 세포일 수 있다.

평활근세포 특이적인 유전자의 발현 수준을 측정할 때에는 해당 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정할 수 있다. mRNA 발현의 측정은 당업계에서 통상적인 발현 수준 확인 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 분석 방법의 예로 역전사중합체연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA:RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩(microarray chip), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 단백질의 발현 수준 측정 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 실시예에서는 FGF-12의 염기서열을 포함하는 아데노바이러스(Ad-FGF12)로 감염된 출발 세포에서의 myocardin, SRF, α-SMA, SM22α, smoothelin, SM-MHC 등의 유전자의 발현 수준을 RT-PCR, 웨스턴 블랏팅, 면역조직화학염색 등의 방법으로 확인하였다. 또한 바이러스 감염되지 않은 출발 세포(untreated), LacZ(β-galactosidase)의 염기서열을 포함하는 아데노바이러스로 감염된 출발 세포(Ad-LacZ)를 음성대조군으로 또는 인간 대동맥 평활근세포(HASMC)를 양성대조군으로 하여 비교하였다. 평활근세포 특이적으로 발현되는 유전자들에 대해서는 다음의 문헌들을 참고할 수 있다: Miano J. J Biomed Res (2010) 24(3): 169-80; Mack P. Arterioscler Thromb Vasc Biol(2011), 31(7):1495-1505.

본 발명의 다른 일실시예에서는 Ad-FGF12로 감염된 출발 세포의 수축성 표현형(contractile phenotype)을 콜라겐 젤 수축 실험(collagen gel contraction assay)를 이용하여 측정하였다. 세포들을 콜라겐과 함께 배양하여 세포-콜라겐의 덩어리(polymer)를 형성하도록 하고, 평활근세포의 수축 유도 물질인 콜린유사제제(cholinomimetic)인 카바콜(carbacol)를 이용한 자극 전후의 세포-콜라겐 덩어리의 크기의 변화를 비교하여 수축성을 확인하였다.

상술한 본 발명의 방법은 본 발명의 실시예에 구체적으로 나타나 있다.

본 발명의 일실시예에서는 Ad-FGF12로 감염된 생쥐 배아줄기세포로부터 형성된 배아체에서 바이러스 감염 후 10일째에 myocardin, α-SMA, SM22α, smoothelin 등 평활근세포 특이적 유전자의 발현이 현저히 증가한 것을 실시간 RT-PCR로 확인하였다. 또한 바이러스 감염 후 14일째의 배아체에서 α-SMA의 발현이 뚜렷하게 증가한 것을 면역형광염색법으로 관찰하였다. 즉 FGF-12의 과발현으로 인해 배아줄기세포로부터 평활근세포로의 분화가 촉진되는 것을 알 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 Ad-FGF12로 감염된 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에서 바이러스 감염 후 6일째에 α-SMA의 발현이 뚜렷하게 증가한 것을 면역형광염색법으로 확인하였다. 즉 FGF-12의 과발현으로 인해 중간엽줄기세포로부터 평활근세포로의 분화가 촉진되는 것을 알 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 Ad-FGF12로 감염된 인간 진피 섬유아세포에서 바이러스 감염 후 6일째에 α-SMA의 발현이 증가한 것을 면역형광염색법으로 확인하였으며, SRF, α-SMA, SM22α, smoothelin, SM-MHC의 발현이 현저하게 증가한 것을 RT-PCR로 확인하였다. 또한 FGF-12를 과발현하는 인간 진피 섬유아세포들은 콜라겐 젤 수축 실험에서 인간 대동맥 평활근세포와 유사한 정도의 수축성을 보였다. 즉 FGF-12의 과발현으로 인해 섬유아세포로부터 평활근세포로의 전환분화가 촉진되는 것을 알 수 있다.

마지막으로, 본 발명은 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물을 제공한다.

상기 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 출발 세포에서 발현가능하도록 발현조절서열과 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터에 포함된 것일 수 있으며, 바람직하게는 재조합 발현 벡터는 바이러스 재조합 발현 벡터일 수 있다.

따라서 본 발명은 출발 세포에서 FGF-12의 과발현을 유도하여 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화 또는 전환을 촉진하는 방법과 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 FGF-12를 하나의 분화 인자로 하여 줄기세포를 평활근세포로 용이하게 분화 촉진하는데 효과적이다. 또한 미분화 상태의 줄기세포 뿐 아니라 섬유아세포에서도 같은 방법으로 평활근세포로의 전환분화를 촉진하는데 효과적이다.

도 1은 아데노바이러스 감염시킨 인간 대동맥 평활근세포(HASMC)에서 평활근세포 분화에 관련된 전사인자들이 발현되는 양상을 보여주는 웨스턴 블랏 실험 결과를 나타낸다. β-actin은 로딩 콘트롤이다.
도 2는 아데노바이러스 감염시킨 생쥐 배아줄기세포(mESC)에서 FGF-12가 발현되는 양상을 보여주는 RT-PCR 실험 결과를 나타낸다. GAPDH는 로딩 콘트롤이다.
도 3은 아데노바이러스 감염시킨 mESC로 이루어진 배아체(embryonic body)에서 평활근 액틴이 발현되는 양상을 보여주는 면역형광염색 현미경 사진을 나타낸다. 붉은색은 평활근 액틴, 푸른색은 DAPI를 나타낸다. 도면상 흰 가로막대로 표시된 scale bar의 크기는 200μm이다.
도 4는 아데노바이러스 감염시킨 mESC로 이루어진 배아체(embryonic body)에서 평활근세포 마커 유전자들이 발현되는 양상을 보여주는 RT-PCR 실험 결과를 나타낸다. * p < 0.05
도 5는 아데노바이러스 감염시킨 인간 진피 섬유아세포(HDF)에서 평활근 액틴이 발현되는 양상을 보여주는 면역형광염색 현미경 사진을 나타낸다. 붉은색은 평활근 액틴, 푸른색은 DAPI를 나타낸다. 도면상 흰 가로막대로 표시된 scale bar의 크기는 200μm이다.
도 6은 아데노바이러스 감염시킨 HDF에서 평활근세포 마커 유전자들이 발현되는 양상을 보여주는 RT-PCR 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 아데노바이러스 감염시킨 HDF의 수축성을 확인하기 위한 콜라겐 젤 수축 실험 결과를 나타낸다. * p < 0.05
도 8은 아데노바이러스 감염시킨 인간 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)에서 평활근 액틴이 발현되는 양상을 보여주는 면역형광염색 현미경 사진을 나타낸다. 붉은색은 평활근 액틴, 푸른색은 DAPI를 나타낸다. 도면상 흰 가로막대로 표시된 scale bar의 크기는 200μm이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실험 방법 >

세포 배양

인간 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF; ScienCell Research Laboratories)와 골수유래 중간엽 줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BM-MSC; Lonza)는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM; Invitrogen)으로 배양하였다. 인간 대동맥 혈관 평활근세포(primary human aortic vascular smooth muscle cell, HASMC; ScienCell Research Laboratories)는 평활근세포 성장 배지(smooth muscle growth medium, SMGM; ScienCell Research Laboratories) 또는 기본 배지(basal medium)로 배양하였다. 생쥐 배아줄기세포(murine embryonic stem cell, mESC; D3, ATCC)는 mESC 배지를 이용하여 배양하였다. 분화 유도를 위해서는 mESC는 영양세포 세포가 없는 상태에서(feeder-free condition) LacZ(Ad-LacZ) 또는 FGF12 (Ad-FGF12)를 암호화하는 아데노바이러스로 7시간 동안 감염시켰다. 감염된 mESC는 세척하고, 15% FBS와 2× 생쥐 백혈병억제인자(mouse leukemia inhibitory factor, mLIF)를 첨가한 배지로 교환해주었다. mESC는 표준적인 hanging drop 방법으로 배아체(embryonic body)로 결집되도록 한 뒤, mLIF를 포함하지 않는 mESC 배지로 배양하였다. 배아체는 hanging drop에서 2일 동안 배양하고 젤라틴으로 코팅한 세포 배양 접시로 ?グ秉? 14일째 까지 계속 배양하였다. HDF와 BM-MSC는 LacZ(Ad-LacZ) 또는 FGF12(Ad-FGF12)를 암호화하는 아데노바이러스로 7시간 동안 감염시킨 후, 세척하고, 새 배지에서 72시간 동안 추가 배양하였다. 세포들은 fibronectin으로 코팅한 세포 배양 접시에서 10% FBS를 첨가한 DMEM으로 6일 동안 배양하였다.

면역형광염색

세포들은 항-평활근 액틴 1차 항체(α-SMA; Sigma)와 형광표지된 2차 항체(Molecular Probes)로 염색하였다. 세포핵은 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 염색하였다. 염색한 세포는 형광현미경(Nikon, Melville)으로 관찰하였다. 도시된 면역형광염색 사진은 세 번 반복한 별개의 실험 결과를 대표하는 것이다.

역전사중합효소 연쇄반응

역전사중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 위한 세포나 조직의 전체 알엔에이(total RNA)는 Trizol reagent(Invitrogen)를 이용하여 분리하였다. 전체 알엔에이로부터 해당 유전자 특이적 프라이머와 Superscript first-strand synthesis kit(Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하고, PCR로 30-35 사이클 증폭하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 로딩 콘트롤로 이용하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)은 SYBR-Green PCR master mix(Applied biosystems)와 StepOnePlus™ Real Time PCR System(Applied Biosystems)을 이용하여 실시하였다. 데이터는 △△Ct 방법에 따라 분석하고, GAPDH에 대하여 표준화하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머는 표 1에 기재하였다.

아데노바이러스 제작

인간의 FGF-12 cDNA를 pShuttle-CMV 벡터에 서브클로닝(subcloning)하고, pAdEasy-1 벡터(Qbiogene)를 이용하여 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 제작하였다. 실험에 사용한 재조합 아데노바이러스는 ViraQuest Inc. 사에서 제작 분리하였다.

웨스턴 블랏

세포 용해물(lysate)은 SDS-PAGE로 분리하고, 단백질 밴드는 블랏으로 옮겼다. 블랏은 myocardin(Sigma), serum response factor(SRF; Abcam), MRTF-A(Santa Cruz Biotechnology), MRTF-B(Santa Cruz biotechnology), b-actin(Santa Cruz biotechnology) 등 적절한 1차 항체와 horseradish peroxidase 결합된 2차 항체로 반응시켰다. 항체와 반응한 단백질 밴드는 화학발광시약(chemiluminescent reagent; Amersham Biosciences)으로 확인하였다.

콜라겐 젤 수축 실험

콜라겐 젤 수축 실험(collagen gel contraction assay)를 위한 세포는 1×10⁵ cell/100ml SMCM basal medium(ScienCell)의 최종 밀도로 2mg/ml의 콜라겐 젤 용액(collagen gel solution; BD biosciences)에 분산시켰다. 세포/콜라겐 혼합물은 12웰 배양접시에서 넣고 중합화 반응(polymerization)이 일어날 때까지 37℃에서 배양하였다. 세포 수축 반응을 유도하기 위하여 카바콜(carbachol, 5μM; Sigma)을 포함하거나 포함하지 않는 SMCM basal medium(ScienCell)을 첨가하고, 그 직후 콜라겐 젤을 배양접시 표면으로부터 떼어내었다. 콜라겐 젤의 크기는 CCD 카메라와 NIH Image 소프트웨어로 측정하였다. 세포를 포함한 콜라겐 젤의 수축 정도는 카바콜 첨가 후 2시간 째의 젤의 크기를 초기 젤의 크기로 나눈 수치로 판단하였다.

< 실시예 1>

FGF -12에 의한 평활근세포 전사인자 발현 증가

FGF-12가 혈관 평활근세포 분화에 중요한 전사인자들의 발현을 유도할 수 있는지 알아보았다.

인간 대동맥 평활근세포(HASMC)를 FGF-12 유전자를 포함하는 아데노바이러스(Ad-FGF) 또는 LacZ 유전자를 포함하는 아데노바이러스(Ad-LacZ)로 감염시키고, 평활근세포 계열의 분화에 중요한 전사인자 단백질의 발현 양상을 웨스턴 블랏으로 관찰하였다.

도 1에서 나타난 것과 같이, Ad-FGF12로 감염된 인간 평활근세포에서는 바이러스 감염하지 않거나 Ad-LacZ로 감염된 인간 평활근세포들에 비해 MYOCD,SRF 그리고 MRTF-A의 발현이 크게 증가한 것을 확인하였다.

< 실시예 2>

FGF -12 과발현에 의한 생쥐 배아줄기세포의 평활근세포로의 분화

HASMC와는 달리 FGF-12를 원래 발현하지 않는 배아줄기세포에서 FGF-12를 과발현시키는 경우에도 평활근세포 분화에 중요한 전사인자가 발현되어 평활근세포로의 분화를 유도할 수 있는지 알아보았다.

생쥐 배아줄기세포(mESC)를 바이러스 감염시키지 않거나, Ad-LacZ 또는 Ad-FGF12 아데노바이러스로 감염시키고, 각각의 배아줄기세포의 FGF-12 발현 여부를 RT-PCR로 확인하였다(도 2). 각각의 배아줄기세포들이 배아체(embryonic body)로 결집되게 하고, 배아체의 자생적 분화(spontaneous differentiation)가 일어나도록 LIF를 포함하지 않는 배지에서 10일 또는 14일 동안 배양하였다. 분화가 진행 중인 배아체에서 평활근세포의 대표적인 마커 유전자들이 발현되는 양상을 면역형광염색(도 3)과 RT-PCR(도 4)로 확인하였다. 도 4의 RT-PCR의 mRNA 발현 수준은 각 유전자에 대하여 다섯 번 반복 실험한 결과의 평균을 배양 전(Day O) 바이러스 처리하지 않은 배아줄기세포에 대한 상대값으로 표시한 것이다.

도 2의 RT-PCR 결과에서 나타난 바와 같이, 바이러스 감염시키지 않거나 Ad-LacZ로 감염시킨 생쥐 배아줄기세포에서는 FGF-12의 mRNA가 전혀 감지되지 않았으나 Ad-FGF12로 감염시킨 생쥐 배아줄기세포에서는 FGF-12의 mRNA가 과발현되고 있음을 확인하였다.

도 3의 면역화학염색 사진에서 나타난 바와 같이, Ad-FGF12로 감염시킨 배아줄기세포로부터 형성된 배아체들은 배양 10일째와 14일째에 모두 α-평활근세포 액틴(α-SMA)을 높은 수준으로 발현하였으며, 바이러스 감염하지 않거나 Ad-LacZ로 감염시킨 배아줄기세포의 배아체에 비교하여 평활근세포 액틴의 수준이 뚜렷하게 높게 발현되고 있음을 알 수 있었다.

도 4의 RT-PCR 결과는 Ad-FGF12로 감염된 배아줄기세포로부터 형성된 배아체들이 도 3에서 관찰한 α-SMA를 포함하여 MYOCD, SM22α그리고 Smoothelin 등의 평활근세포 분화 마커 유전자들을 과발현하고 있음을 보여준다. 바이러스 감염시키지 않거나 Ad-LacZ로 감염시킨 줄기세포의 배아체에서도 배양 10일째에 평활근세포 분화 마커 유전자가 낮은 수준으로 발현되지만, 이들에 비하여 FGF-12를 발현하는 배아체들의 평활근세포 마커 유전자 발현량은 현저하게 높았으며, 통계적으로 유의한 큰 차이를 나타내었다.

위와 같은 실험 결과들은 FGF-12를 발현하지 않는 배아줄기세포에서 FGF-12를 과발현함으로써 평활근세포로의 분화를 효과적으로 촉진시킬 수 있음을 보여준다.

< 실시예 3>

FGF -12 과발현에 의한 인간 진피 섬유아세포의 평활근세포로의 전환분화

FGF-12를 거의 발현하지 않는 섬유아세포(fibroblast)에서 FGF-12를 과발현시키는 경우에도 평활근세포로의 전환분화(transdifferentiation)를 유도할 수 있는지 알아보았다.

인간 진피 섬유아세포(human dermal fibroblast)는 바이러스 감염시키지 않거나, Ad-LacZ 또는 Ad-FGF12 아데노바이러스로 감염시키고 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 6일 동안 추가 배양한 뒤, 평활근세포로의 분화 여부를 평활근세포 마커 유전자 발현 여부(<실시예 3-1>)와 세포의 수축성 정도(<실시예 3-2>)로 확인하였다.

< 실시예 3-1>

인간 진피 섬유아세포에서의 평활근세포 마커 유전자 발현 유도

섬유아세포에서의 FGF-12의 과발현이 평활근세포로 전환분화를 유도할 수 있는지를 평활근세포 마커 유전자의 발현 양상을 통해 알아보았다.

평활근 액틴(α-SMA)에 대한 면역형광염색(도 5)과 평활근 마커 유전자(SM-MHC, SRF, Smoothelin, α-SMA, SM22α)에 대한 RT-PCR(도 6)로 확인하였다. RT-PCR 실험에는 섬유아세포 외에 기본배지에서 3일간 배양한 인간 대동맥 평활근세포(HASMC)를 양성 대조군으로 포함하였다.

도 5의 면역형광염색 사진에서 나타나듯이, 바이러스 감염시키지 않은 섬유아세포나 Ad-LacZ로 감염시킨 섬유아세포에서는 평활근 액틴이 거의 감지되지 않았으나, Ad-FGF-12로 감염시킨 섬유아세포에서는 매우 높은 수준으로 평활근 액틴을 발현하는 것을 확인하였다.

도 6의 RT-PCR 결과에서도 Ad-FGF12로 감염시킨 섬유아세포에서 SM-MHC, SRF, Smoothelin, α-SMA, SM22α등의 다양한 평활근세포 마커 유전자를 과발현하고 있음을 확인하였다. 바이러스 감염시키지 않은 섬유아세포나 Ad-LacZ로 감염시킨 섬유아세포들은 평활근세포 분화 마커 유전자들을 발현하지 않거나 극히 낮은 수준으로만 발현하지만, Ad-FGF12로 감염시킨 섬유아세포는 평활근세포(HASMC)와 유사한 수준으로 발현하고 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 3-2>

인간 진피 섬유아세포에서의 수축성 표현형 발현 유도

섬유아세포에서 FGF-12를 과발현하여 평활근세포에 필수적인 수축성 표현형을 유도할 수 있는지 여부를 혈관수축을 일으키는 카바콜(carbacol)을 이용한 콜라겐 젤 수축 실험(도 7)으로 확인하였다.

바이러스 감염시키지 않거나 감염시킨 섬유아세포들을 콜라겐 젤 안에 포함되도록 하고, 카바콜 또는 PBS를 포함하는 기본 배지 안에서 배양하고 젤의 수축 정도를 평가하였다(도 7에서 카바콜과 PBS에 해당하는 결과는 각각 흰색 막대와 검정색 막대로 표시함). 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 젤의 수축 정도는 기본 배지에서 배양 2시간 경과 후의 젤의 크기를 초기 젤의 크기로 나눈 수치를 네 번 반복한 실험의 평균으로 표시하였다. 섬유아세포 외에 인간 대동맥 평활근세포(HASMC)를 양성 대조군으로 포함하였다

도 7의 콜라겐 젤 수축 실험 결과는 FGF-12를 과발현하는 섬유아세포가 평활근세포와 유사한 수축성을 갖는 것을 보여주고 있다. 바이러스 감염하지 않거나 Ad-LacZ 감염시킨 섬유아세포는 PBS 또는 카바콜로 자극한 콜라겐 젤의 크기에 차이가 없어 수축성이 거의 없는 것으로 나타났다. 한편 Ad-FGF12로 감염시킨 섬유아세포는 카바콜 자극에 의해 자극 전 보다 콜라겐 젤의 크기가 약 25% 감소하였으며, PBS 처리한 젤에 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 즉, FGF-12의 과발현으로 인해 섬유아세포가 카바콜 자극에 의한 수축성 표현형을 새로 획득하게 된 것을 알 수 있다.

위와 같은 <실시예 3>의 결과들은 FGF-12를 과발현함으로써 섬유아세포가 평활근세포의 마커 유전자들을 발현할 뿐 아니라, 기능적으로도 수축성을 띠는 평활근세포로의 전환분화를 효과적으로 촉진하는 것을 보여준다.

< 실시예 4>

FGF -12 과발현에 의한 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 평활근세포로의 분화

인간 줄기세포에서 FGF-12를 과발현시켜 평활근세포로의 분화를 유도할 수 있는지 알아보았다.

인간 골수유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)는 바이러스로 감염시키지 않거나 Ad-LacZ 또는 Ad-FGF12로 감염시키고, 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 6일 동안 배양하고, 평활근세포의 마커인 α-SMA의 발현 여부를 면역형광염색(도 8)으로 확인하였다.

도 8에서 알 수 있듯이, 바이러스 감염하지 않거나 Ad-LacZ로 감염시킨 중간엽 줄기세포에서는 α-SMA를 거의 발현하지 않았으나, Ad-FGF12로 감염시킨 중간엽 줄기세포에서는 α-SMA가 매우 높은 수준으로 발현되고 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 인간 중간엽 줄기세포에서 FGF-12를 과발현함으로써 평활근세포로 효과적으로 뷴화시킬 수 있음을 알 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 FGF-12를 단일 분화 인자로 하여 다양한 출발 세포로부터 평활근세포의 분화 또는 전환을 촉진할 수 있는 방법과 조성물을 제공한다. 본 발명을 이용하여 평활근세포를 용이하고 효율적으로 생산하여 제공할 수 있다. 따라서 본 발명은 대동맥류(aortic aneurysm), 마판증후군(Marfan syndrome) 등 평활근세포의 기능 이상 또는 퇴행을 동반하는 질환에서 효과적으로 평활근세포를 재생시킬 수 있는 유전자 치료제(gene therapy) 또는 세포 치료제(cell therapy)를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Methods to promote differentiation into smooth muscle cells and composition thereof <130> NP15-0072 <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens FGF-12 isoform 1 <400> 1 Met Ala Ala Ala Ile Ala Ser Ser Leu Ile Arg Gln Lys Arg Gln Ala 1 5 10 15 Arg Glu Ser Asn Ser Asp Arg Val Ser Ala Ser Lys Arg Arg Ser Ser 20 25 30 Pro Ser Lys Asp Gly Arg Ser Leu Cys Glu Arg His Val Leu Gly Val 35 40 45 Phe Ser Lys Val Arg Phe Cys Ser Gly Arg Lys Arg Pro Val Arg Arg 50 55 60 Arg Pro Glu Pro Gln Leu Lys Gly Ile Val Thr Arg Leu Phe Ser Gln 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Phe Leu Gln Met His Pro Asp Gly Thr Ile Asp Gly Thr 85 90 95 Lys Asp Glu Asn Ser Asp Tyr Thr Leu Phe Asn Leu Ile Pro Val Gly 100 105 110 Leu Arg Val Val Ala Ile Gln Gly Val Lys Ala Ser Leu Tyr Val Ala 115 120 125 Met Asn Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr Ser Ser Asp Val Phe Thr Pro Glu 130 135 140 Cys Lys Phe Lys Glu Ser Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val Ile Tyr Ser 145 150 155 160 Ser Thr Leu Tyr Arg Gln Gln Glu Ser Gly Arg Ala Trp Phe Leu Gly 165 170 175 Leu Asn Lys Glu Gly Gln Ile Met Lys Gly Asn Arg Val Lys Lys Thr 180 185 190 Lys Pro Ser Ser His Phe Val Pro Lys Pro Ile Glu Val Cys Met Tyr 195 200 205 Arg Glu Pro Ser Leu His Glu Ile Gly Glu Lys Gln Gly Arg Ser Arg 210 215 220 Lys Ser Ser Gly Thr Pro Thr Met Asn Gly Gly Lys Val Val Asn Gln 225 230 235 240 Asp Ser Thr <210> 2 <211> 732 <212> DNA <213> Homo sapiens FGF-12 isoform 1 (NM_021032: 827-1558) <400> 2 atggctgcgg cgatagccag ctccttgatc cggcagaagc ggcaggcgag ggagtccaac 60 agcgaccgag tgtcggcctc caagcgccgc tccagcccca gcaaagacgg gcgctccctg 120 tgcgagaggc acgtcctcgg ggtgttcagc aaagtgcgct tctgcagcgg ccgcaagagg 180 ccggtgaggc ggagaccaga accccagctc aaagggattg tgacaaggtt attcagccag 240 cagggatact tcctgcagat gcacccagat ggtaccattg atgggaccaa ggacgaaaac 300 agcgactaca ctctcttcaa tctaattccc gtgggcctgc gtgtagtggc catccaagga 360 gtgaaggcta gcctctatgt ggccatgaat ggtgaaggct atctctacag ttcagatgtt 420 ttcactccag aatgcaaatt caaggaatct gtgtttgaaa actactatgt gatctattct 480 tccacactgt accgccagca agaatcaggc cgagcttggt ttctgggact caataaagaa 540 ggtcaaatta tgaaggggaa cagagtgaag aaaaccaagc cctcatcaca ttttgtaccg 600 aaacctattg aagtgtgtat gtacagagaa ccatcgctac atgaaattgg agaaaaacaa 660 gggcgttcaa ggaaaagttc tggaacacca accatgaatg gaggcaaagt tgtgaatcaa 720 gattcaacat ag 732 <210> 3 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens FGF-12 isoform 2 <400> 3 Met Glu Ser Lys Glu Pro Gln Leu Lys Gly Ile Val Thr Arg Leu Phe 1 5 10 15 Ser Gln Gln Gly Tyr Phe Leu Gln Met His Pro Asp Gly Thr Ile Asp 20 25 30 Gly Thr Lys Asp Glu Asn Ser Asp Tyr Thr Leu Phe Asn Leu Ile Pro 35 40 45 Val Gly Leu Arg Val Val Ala Ile Gln Gly Val Lys Ala Ser Leu Tyr 50 55 60 Val Ala Met Asn Gly Glu Gly Tyr Leu Tyr Ser Ser Asp Val Phe Thr 65 70 75 80 Pro Glu Cys Lys Phe Lys Glu Ser Val Phe Glu Asn Tyr Tyr Val Ile 85 90 95 Tyr Ser Ser Thr Leu Tyr Arg Gln Gln Glu Ser Gly Arg Ala Trp Phe 100 105 110 Leu Gly Leu Asn Lys Glu Gly Gln Ile Met Lys Gly Asn Arg Val Lys 115 120 125 Lys Thr Lys Pro Ser Ser His Phe Val Pro Lys Pro Ile Glu Val Cys 130 135 140 Met Tyr Arg Glu Pro Ser Leu His Glu Ile Gly Glu Lys Gln Gly Arg 145 150 155 160 Ser Arg Lys Ser Ser Gly Thr Pro Thr Met Asn Gly Gly Lys Val Val 165 170 175 Asn Gln Asp Ser Thr 180 <210> 4 <211> 546 <212> DNA <213> Homo sapiens FGF-12 isoform 2 (NM_004113: 247-792) <400> 4 atggagagca aagaacccca gctcaaaggg attgtgacaa ggttattcag ccagcaggga 60 tacttcctgc agatgcaccc agatggtacc attgatggga ccaaggacga aaacagcgac 120 tacactctct tcaatctaat tcccgtgggc ctgcgtgtag tggccatcca aggagtgaag 180 gctagcctct atgtggccat gaatggtgaa ggctatctct acagttcaga tgttttcact 240 ccagaatgca aattcaagga atctgtgttt gaaaactact atgtgatcta ttcttccaca 300 ctgtaccgcc agcaagaatc aggccgagct tggtttctgg gactcaataa agaaggtcaa 360 attatgaagg ggaacagagt gaagaaaacc aagccctcat cacattttgt accgaaacct 420 attgaagtgt gtatgtacag agaaccatcg ctacatgaaa ttggagaaaa acaagggcgt 480 tcaaggaaaa gttctggaac accaaccatg aatggaggca aagttgtgaa tcaagattca 540 acatag 546 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Human FGF12 forward <400> 5 agcttggttt ctgggactca 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Human FGF12 reverse <400> 6 ctcttctgag atgagtttct gctc 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Human a-SMA forward <400> 7 agcgacccta aagcttccca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Human a-SMA reverse <400> 8 catagagaga cagcaccgcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Human SM22 forward <400> 9 ggagcagtgg gtgcatttca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Human SM22 reverse <400> 10 tgcactagcc aagtcatccg 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Human SM-MHC forward <400> 11 atgaggccac ggagagcaac ga 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Human SM-MHC reverse <400> 12 ccattgaagt ctgcgtctcg a 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Human SRF forward <400> 13 ccagtgtgtg ggggagattc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Human SRF reverse <400> 14 aaccccgaca tttggtctcc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Human smoothelin forward <400> 15 tgcaaaccaa gaccttctcc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Human smoothelin reverse <400> 16 tccagcttct caatcatggc 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Human GAPDH forward <400> 17 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Human GAPDH reverse <400> 18 gaagatggtg atggatttc 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Mouse a-SMA forward <400> 19 gtgcctatct atgagggcta 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Mouse a-SMA reverse <400> 20 gccatctcat tttcaaagtc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Mouse SM22 forward <400> 21 caagactgac atgttccaga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Mouse SM22 reverse <400> 22 tgggctttct tcataaacca 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Mouse MYOCD forward <400> 23 agttgtcacc tccttctgtg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Mouse MYOCD reverse <400> 24 atccataggg gaattcagat 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Mouse smoothelin forward <400> 25 gccatgattg agaagctaga 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Mouse smoothelin reverse <400> 26 gaggagaagt tctggatgtc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Mouse GAPDH forward <400> 27 atgactccac tcacggcaaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Mouse GAPDH reverse <400> 28 atgatgaccc ttttggctcc 20

Claims

(a) 분리 또는 배양된 세포로부터 출발 세포를 제공하는 단계; 및
(b) 출발 세포에서 FGF-12의 과발현을 유도하여 출발 세포의 분화 상태를 변경하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 출발 세포에서 평활근세포의 표현형(phenotype)을 확인하는 단계를 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화를 촉진하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 분화 상태를 변경하는 단계는 출발 세포의 분화를 진행하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 출발 세포는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 줄기세포는 만능줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 만능줄기세포는 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 분화 상태를 변경하는 단계는 출발 세포의 전환분화(transdifferentiation)를 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 출발 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 섬유아세포는 진피 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 FGF-12는 서열번호 1 또는 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 FGF-12의 과발현을 유도하는 것은 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 출발 세포를 형질전환시킴으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 형질전환은 FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 발현벡터에 의해 매개되는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 재조합 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 아비폭스바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
FGF-12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 출발 세포로부터 평활근세포로의 분화 촉진용 조성물.