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KR101818705B1 - 약물이 충전된 히알루론산 가교물 하이드로겔 및 이의 이용 - Google Patents

약물이 충전된 히알루론산 가교물 하이드로겔 및 이의 이용 Download PDF

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KR101818705B1
KR101818705B1 KR1020150102572A KR20150102572A KR101818705B1 KR 101818705 B1 KR101818705 B1 KR 101818705B1 KR 1020150102572 A KR1020150102572 A KR 1020150102572A KR 20150102572 A KR20150102572 A KR 20150102572A KR 101818705 B1 KR101818705 B1 KR 101818705B1
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hyaluronic acid
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김혜민
염준석
황병우
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포항공과대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 약물을 담지한 생체적합성 히알루론산 가교물 하이드로겔, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 방법에 관한 것으로 하이드로겔에서의 약물 방출을 통해 질병을 치료할 수 있다.

Description

약물이 충전된 히알루론산 가교물 하이드로겔 및 이의 이용 {Cross-linked hyaluronic acid hydrogel encapsulating therapeutic drugs and uses thereof}
본 발명은 약물을 담지한 생체적합성 히알루론산 가교물 하이드로겔, 이를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 방법에 관한 것으로 하이드로겔에서의 약물 방출을 통해 질병을 치료할 수 있다.
약물 전달용 하이드로겔은 장기적인 약물 전달을 필요로 하는 질환의 치료 목적으로 사용되어 왔다. 대표적인 예로 상처 치유 드레싱, 당뇨병 치료를 위한 인슐린 분비 하이드로겔, 관절염 치료제, 안질환 치료제, 폐 및 뇌질환 치료제 등으로 응용되어 왔다. 하이드로겔은 세포 외 기질과 비슷한 특성을 가져 독성이 낮고 시간이 지남에 따라 자연 분해될 수 있기 때문에 특정 약물을 장기간 투여해야 하는 다양한 질환에 응용되고 있다.
히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등에 많이 존재하며, 우수한 생체적합성을 갖기 때문에, 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질, 점안제, 주름 개선제 등의 의료 및 의료 용구나 화장품 용도로 널리 사용되고 있다. 그러나 히알루론산 그 자체는 체내에서 수시간에 불과한 짧은 반감기를 나타내어 적용에 한계가 있어, 가교결합을 통해 반감기(체내 지속성)를 증대시키려는 연구가 진행되어 왔다. 예컨대, 디비닐술폰, 비스할라이드, 포름알데히드 등과 같이 작용기가 두 개인 화합물을 가교제로 사용하여 가교결합된 히알루론 유도체를 합성한 예가 여러 문헌에 보고되었으며, 이러한 제법을 기반으로 한 다양한 제품들이 피부 연조직 증강용 충전제(dermal filler)로 시판되고 있다.
예를 들어, 미국 특허 제4,582,865호는 디비닐술폰(DVS)을 가교제로 사용하여 가교된 히알루론 유도체를 개시하고 있으며, 이의 하이드로겔 형태가 Hylaform®의 상품명으로 시판되고 있다. 그러나, 시판 제품의 낮은 생체 지속성의 문제를 해결할 필요가 있다.
미국특허등록 제4,582,865호(1986. 04. 15)
본 발명은 생체적합성이 뛰어나고 체내에서 오래 지속될 뿐만 아니라, 약물을 충전하여 조직 증강에 활용 가능하며 약물을 방출할 수 있는 치료용 히알루론산 가교물 하이드로겔, 이를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법을 제안하고자 한다.
이에, 본 발명의 하나의 목적은 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 약물 전달용 조성물로서, 상기 약물은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 약물이 결합되어 있지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것인, 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 약물 전달용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 레티노산이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며, 상기 레티노산은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 레티노산이 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것인, 피부 재생 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 덱사메타손이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며, 상기 덱사메타손은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 덱사메타손이 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것인, 관절염 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 비스테로이드 항염증제가 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며, 상기 비스테로이드 항염증제는 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 비스테로이드 항염증제가 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것인, 염증 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 구현예는 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 약물 전달용 조성물로서, 상기 약물은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 약물이 결합되어 있지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것인, 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는, 히알루론산 또는 히알루론산의 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide) 염을 제조하는 단계, 상기 히알루론산 및 약물을 유기 용매 존재 하에 반응시켜, 히알루론산 및 약물의 접합체를 수득하는 단계, 및 상기 히알루론산 및 약물의 접합제를, 수성 용액 내에서, 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제 및 히알루론산과 반응시켜, 히알루론산 가교물 하이드로겔을 수득하는 단계를 포함하는, 상기 약물 전달용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는, 레티노산이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며, 상기 레티노산은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 레티노산이 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것인, 피부 재생 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는, 덱사메타손이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며, 상기 덱사메타손은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 덱사메타손이 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것인, 관절염 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는, 비스테로이드 항염증제가 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며, 상기 비스테로이드 항염증제는 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 비스테로이드 항염증제가 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것인, 염증 치료용 조성물에 관한 것이다.
이에, 본 발명의 구체예에 대하여 보다 상세히 설명한다.
용어, '히알루론산(Hyaluronic acid, HA)'은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로서, 하기 식 1로 표현되는 반복단위를 갖는 고분자를 지칭하며, 히알루론산의 염 또는 유도체 형태를 모두 포함하는 의미로 사용된다.
[식 1]
Figure 112015070272389-pat00001
상기 식 1에서, m 은 한 분자당 단위체 수를 나타내는 것으로서 1 이상의 정수이고, 바람직하게는 10 내지 10,000의 정수일 수 있다.
본원에서 히알루론산은, 상기 식 1의 기본 구조를 기반으로 하여, 시스타민을 포함하는 아민기, 카르복실기, 알데하이드기, 바이닐그룹, 치올기, 알릴옥시그룹, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트(N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS) 등의 기능기가 도입된 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, HA-디아미노부탄(HA-diaminobutane), HA-헥사메틸렌디아민(HA-hexamethylenediamine), HA-시스타민(HA-cystamine), HA-알데하이드(HA-aldehyde), HA-아디픽산 디하이드라지드(HA-Adipic Acid Dihydrazide, HA-ADH), HA-2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드(HA-2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride), HA-스페르민(HA-Spermine), HA-스페르미딘(HA-spermidine), HA-SPDP, HA-NHS 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 히알루론산은, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 형태로 제공될 수 있다. 일예로, 히알루론산의 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide) 염 형태(HA-TBA)로 제공될 수 있으며, 이는 접합하고자 하는 약물이 불수용성 약물인 경우 특히 바람직하다. 하기 식 2는 히알루론산의 TBA 염(HA-TBA)의 구조를 나타낸다.
[식 2]
Figure 112015070272389-pat00002
상기 식 2에서, n은 한 분자당 단위체 수를 나타내는 것으로서 1 이상의 정수이고, 바람직하게는 10 내지 10,000의 정수이다.
상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 이에 제한되지 않으나, 분자량이 5,000 내지 4,000,000 달톤(Da), 10,000 내지 4,000,000 달톤, 또는 20,000 달톤 내지 3,000,000 달톤인 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 히알루론산에 접합되는 약물의 종류나 목적에 따라 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다. 또한, 상기와 같은 범위의 분자량을 가짐으로써 약물 전달을 위한 접합체에 적합하게 사용될 수 있다.
용어, '하이드로겔'은 물을 분산매로 하는 겔을 의미하는데, 하이드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3 차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하거나 하여 형성될 수 있다.
본원에서, 약물은 수용성 약물 및 불수용성 약물을 모두 포함하며, 그 구성의 한정이 없이 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 약물은 피부재생 치료제, 관절염 치료제, 또는 염증 치료제의 효능을 갖는 것일 수 있다.
일 예로, 피부재생 효과를 가지는 레티노산(retinoic acid), 주름 억제 효과를 가지는 클로스트리디움 보툴리늄 독소(Clostridium botulinum toxin), 관절염을 포함한 염증 치료효과를 가지는 덱사메타손(dexamethasone)을 포함하는 스테로이드(steroid)제 및 비스테로이드 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory drug, NSAID)을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한 바람직하게는 상기 약물은, 각 질병에서 유효한 히알루론산 가교물 하이드로겔의 투여량과 상기 약물의 유효 투여량을 고려할 때, 히알루론산 전체 단위체에 대해 0.1 내지 70 몰%, 더욱 바람직하게는 1 내지 50 몰% 로 도입될 수 있다.
상기 약물은, 히알루론산과의 접합을 용이하게 하기 위하여, 시스타민기를 포함한 아민기, 카르복실기, 알데하이드기, 바이닐기, 치올기, 알릴옥시그룹, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트(N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS) 등의 기능기가 도입된 형태로 제공될 수 있다.
본원에서 제공하는, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 상기 약물은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 약물이 결합되어 있지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함할 수 있다. 또한, 상기 약물은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되는 이외에, 추가적으로, 히알루론산 단위체 간의 가교결합 부위(예를 들어, 가교제)에 결합될 수 있다.
또한, 본원에서 제공하는, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 가교되지 않은 히알루론산 단위체를 포함할 수 있다.
본원에서 제공하는, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 바람직하게 5 내지 35%의 가교율을 가지며, 더욱 바람직하게는 10 내지 20%의 가교율을 가질 수 있다. 가교율이 5% 미만인 경우에는 히알루론산 내 가교 결합에 관여하지 않은 미반응 카르복실기(-COOH)의 비율이 높아짐으로써 분해효소인 히알루로니다제(Hyaluronidase)에 의해 분해되기 쉽기 때문에 원하는 정도의 생체 지속성을 얻을 수 없는 문제가 발생할 수 있다. 가교율이 35%를 초과하는 경우에는 약물 전달에 유용한 정도의 팽윤성 및 점탄성을 나타내기 어려우며, 생체 내 분해 후 잔여 가교제의 함량이 높아져 염증반응 등을 일으킬 가능성이 커지는 등 생체 적합성이 낮은 문제가 발생할 수 있다. 상기 바람직한 범위의 가교율을 갖는 경우, 팽윤성 등의 물성, 생체 지속성 및 양호한 생체적합성을 동시에 나타낼 수 있다.
또한, 상기 가교율은 전체 히알루론산 함량에 대한 가교에 참여한 히알루론산 함량의 백분율을 의미하는 것으로, 전체 히알루론산에 대한 가교제의 사용 비율을 조절함으로써 쉽게 조절할 수 있고, 가교율의 측정은 당업계에서 공지된 분석법 예를 들면, NMR 분석 및 TNBS assay(Habeeb, A.F.S.A., Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem.,1966. 14: 328-33 참조)을 통해 용이하게 시행할 수 있다.
가교결합은 분자 간에 일어날 수도 있고, 분자 내에서 일어날 수도 있다. 히알루론산의 카르복실기는 히알루론산 분해효소인 히알루로니다제가 히알루론산을 인식하는 데에 관여하는 중요한 기로서, 본 발명의 히알루론산 가교물은 히알루론산의 카르복실기가 가교에 사용됨으로써 생체 내에 투입시 분해효소에 의한 히알루론산 분해가 최소화되어 생체 지속성이 증대될 수 있다. 또한 카르복실기의(-)전하는 조직 증강에 크게 기여하는 하이드로겔의 팽윤성 등의 물성에 영향을 미칠 수 있다.
본 발명에서 제공하는, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 바람직하게 pH가 5.0 ~ 6.5이며, 더욱 바람직하게 6.0 ~ 6.5일 수 있다. pH가 6.0 ~ 6.5인 경우, 매우 우수한 점탄성 및 팽윤성을 나타내어 약물 전달용 조성물, 치료제, 연조직 보강 및 기능증진제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
가교제로 알킬렌디아민을 사용하는 경우, 상기 알킬렌디아민 화합물은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌디아민 화합물로서, 바람직하게는 C3-C7 알킬렌디아민, 보다 바람직하게는 C4-C6 알킬렌디아민, 가장 바람직하게는 C6 알킬렌디아민(헥사메틸렌디아민)을 사용할 수 있으며, 히알루론산 반복 단위의 3.5 내지 80 몰%, 바람직하게는 10 내지 30몰%, 가장 바람직하게는 10 내지 25몰%로 사용할 수 있다.
바람직한 일예로, 본원에서 제공하는, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 하기 식 3으로 표시될 수 있다.
[식 3]
[HA]m-C(O)-NH-R1-NH-C(O)-[HA-약물 접합체]n
(상기 식에서, HA는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염을 나타내고, R1은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기이며, m 및 n은 각각 10,000 내지 4,000,000의 정수이다).
또한, 가교제로 디아민 쿠커비투[n]릴을 사용할 수 있다. 상기 디아민 쿠커비투[n]릴 화합물은 n개의 글리코우릴이 모여 형성된 호박 모양의 속이 빈 분자로, 글리코우릴의 수에 따라 다양한 크기의 쿠커비투[n]릴에 두 개의 아민기가 도입된 유도체이다. 이 때 글리코우릴의 수를 나타내는 n은 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 4 내지 12의 정수일 수 있다. 바람직하게는 쿠커비투[6]릴에 두 개의 아민기가 도입된 유도체일 수 있다.
바람직한 예로는, -O-(CH2)n-S-(CH2)m-NH의 화학식 구조로 n=1~20, m=1~20에 해당하는 두 개의 작용기가 도입된 쿠커비투[6]릴 유도체, 또는 n=3, m=2에 해당하는 두 개의 작용기가 도입된 쿠커비투[6]릴 유도체가 히알루론산 반복 단위의 2 내지 50 몰%, 바람직하게는 5 내지 30몰%, 가장 바람직하게는 7 내지 15몰%로 사용될 수 있다.
바람직한 일예로, 본원에서 제공하는, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 하기 식 4로 표시될 수 있다.
[식 4]
[HA]m-C(O)-NH-R1-S-R2-O-CB[n]-O-R2-S-R1-NH-C(O)-[HA-약물 접합체]n
(상기 식에서, HA는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염을 나타내고, CB[n]는 쿠커비투[n]릴(cucurbit[n]uril, 이 때 n은 4 내지 12의 정수), R1은 C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기이며, R2은 C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기이고, m 및 n은 각각 10,000 내지 4,000,000의 정수이다).
또한, 가교제로 비스 에폭사이드를 사용할 수 있다. 예를 들어, 비스 에폭사이드는 부탄다이올 다이글라이시딜 에테르를 사용할 수 있으며, 히알루론산 반복 단위의 3.5 내지 80몰%, 바람직하게는 10 내지 30몰%, 가장 바람직하게는 10 내지 25몰%로 사용할 수 있다.
바람직한 일예로, 본원에서 제공하는, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 하기 식 5로 표시될 수 있다.
[식 5]
[HA]m-C(O)-O-CH2-C(OH)-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-C(OH)-CH2-O-C(O)-[HA-약물 접합체]n
(식에서, HA는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염을 나타내고, m 및 n은 10,000 내지 4,000,000의 정수이다).
상기에 기재한, 식 3 내지 식 5로 표시한, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔에서, 히알루론산의 카르복실기는 히알루론산 분해효소인 히알루로니다제가 히알루론산을 인식하는 데에 관여하는 중요한 작용기이다. 본 발명의, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 히알루론산의 카르복실기가 가교에 사용됨으로써 생체 내에 투입시 분해효소에 의한 히알루론산 분해가 최소화되어 생체 지속성이 증대된다. 또한 카르복실기의(-) 전하는 조직 증강에 크게 기여하는 하이드로겔의 팽윤성 등의 물성에 영향을 미친다.
또한, 약물 변형체로 시스타민기가 도입된 약물을 사용한 경우 글루타치온이 많은 환경에서 이황화결합(disulfide bond)의 분해에 의한 약물 방출이 일어나 체내에서 다량의 약물을 효율적으로 전달할 수 있다.
또한, 본원의, 약물이 충전된 히알루로산 가교물 하이드로겔은, 약물의 효능에 따라 관절염 치료제, 항염증제, 피부재생 치료제 등을 우수한 생체적합성을 유지하며 장기간 지속적으로 전달할 수 있으므로 이러한 특성을 이용하여 피부재생 치료제, 관절기능 개선제로서도 유용하게 사용될 수 있다.
이에, 본 발명의 일 예는, 레티노산이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며, 상기 레티노산은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 레티노산이 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것인, 피부 재생 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 예는, 덱사메타손이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며, 상기 덱사메타손은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 덱사메타손이 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것인, 관절염 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 예는, 비스테로이드 항염증제가 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며, 상기 비스테로이드 항염증제는 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고, 상기 비스테로이드 항염증제가 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것인, 염증 치료용 조성물을 제공한다.
다음으로, 본 발명의 일 실시예에 따른, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔의 제조 방법을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 일 구체예는, (a) 히알루론산 또는 히알루론산의 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide) 염을 제조하는 단계, (b) 상기 히알루론산 및 약물을 유기 용매 존재 하에 반응시켜, 히알루론산 및 약물의 접합체를 수득하는 단계, 및 (c) 상기 히알루론산 및 약물의 접합제를, 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제 및 히알루론산과 반응시켜, 약물이 결합된 히알루론산 가교물을 수득하는 단계, 및 (d) 상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물을 수용액에서 수화시켜 히알루론산 가교물 하이드로겔을 수득하는 단계를 포함하는, 약물 전달용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 단계 (a)는 히알루론산 또는 히알루론산의 TBA염(HA-TBA)을 제조하는 단계이다.
상기 히알루론산은, 시스타민을 포함하는 아민기, 카르복실기, 알데하이드기, 바이닐기, 치올기, 알릴옥시그룹, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트(N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 이루어진 군에서 선택되는 기능기가 도입된 것일 수 있다.
상기 HA-TBA의 제조는 양이온 교환수지를 이용하여 진행할 수 있다. 구체적으로, 상기 HA-TBA의 제조는, 양이온 교환수지에 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)를 반응시키는 단계, 및 상기에 히알루론산을 첨가하여 하기 식 2의 히알루론산의 TBA염을 수득하는 단계에 의해 수행될 수 있다.
[식 2]
Figure 112015070272389-pat00003
(상기 식 2에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.)
상기 양이온 교환수지는 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드와 반응하여, TBA-OH의 양이온을 교환할 수 있는 것이면, 그 구성의 한정이 없이 사용될 수 있다.
바람직하게는 상기 양이온 교환수지는 Dowex 50WX2-200, Dowex 50WX4-400, Dowex 50WX2-100, Dowex 50WX2-400, Dowex 50WX8-100, Dowex 50WX8-200, Dowex 50WX8-400로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. 상기와 같은 양이온 교환수지를 HA-TBA 형성에 사용하는 경우, HA의 카르복실기에 있던 Na+ 이온을 TBA 이온으로 교환하여 HA-Na를 HA-TBA로 변환시킬 수 있는 점에서 유리하다.
상기 단계 (b)는 히알루론산 및 약물을 유기 용매 존재 하에 반응시켜, 히알루론산 및 약물의 접합체를 수득하는 단계이다.
상기 약물은, 시스타민을 포함하는 아민기, 카르복실기, 알데하이드기, 바이닐기, 치올기, 알릴옥시그룹, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트(N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 이루어진 군에서 선택되는 기능기가 도입된 것일 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산-약물 접합체의 제조 방법을 대략적으로 나타낸 것이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 수용액 상에서 히알루론산을 TBA-OH와 반응시켜 HA-TBA를 형성하고, 상기 HA-TBA 및 기능기가 도입된 약물을 반응시켜 히알루론산-약물 접합체를 생성할 수 있다. 대표적인 약물 변형체로 도 1a는 HA-TBA 및 아민기가 도입된 약물을 반응시켜 히알루론산-약물 접합체를 생성하는 과정을, 도 1b는 HA-TBA 및 시스타민기가 도입된 약물을 반응시켜 히알루론산-약물 접합체를 생성하는 과정을 나타내었다. 도 1b와 같이 시스타민기가 도입된 약물을 사용하는 경우, 글루타치온이 많은 환경에서 이황화결합의 분해에 의해 약물이 방출될 수 있어 체내에서 다량의 약물을 효율적으로 전달할 수 있다.
약물이 불수용성일 경우, 상기 HA-TBA의 카르복실기, 및 기능기가 도입된 불수용성 약물을 반응시켜, 히알루론산-약물 접합체를 제조하는 단계는 유기 용매 상에서 진행할 수 있다.
상기 유기 용매는 HA-TBA 및 약물 변형체를 용해시킬 수 있는 것이면, 구성의 한정이 없이 사용될 수 있으며, 구체적으로, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
또한, 상기 히알루론산은, 약물과 반응하기 전에, 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포니움 헥사플로로포스페이트(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate, BOP), 1, 3-디시클로헥실카르보디이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC), 1, 3-다이아이소프로필카보다이이미드(1,3-Diisopropylcarbodiimide, DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC)와 같은 1-알킬-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드류, 1-에틸-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-(trimethylammonio)propyl) carbodiimide, ETC)와 같은 1-알킬-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드류, 및 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드(1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide, CMC)와 같은 1-사이클로알킬-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드 등의 수용성 카르보디이미드의 카르보디이미드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 활성제를 첨가하여 활성화시킬 수 있다.
또한, 히알루론산과 약물을 반응시킴에 있어서, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 1-hydroxybenzotriazole), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt, 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt, 1-hydroxy-7-azabenzotriazole), N-히드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS, Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide), O-(1H-벤조트리아졸-1-y)-N,N,N',N'-테트라메틸유로니움테트라플루오로보레이트(TBTU, O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate), N, N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine, DIPEA) 및 2,2,6,6,-테트라메틸피페리딘(2,2,6,6-tetramethylpiperidine)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 첨가하는 것을 추가하여 반응시킬 수 있다.
상기 단계 (c)는 상기 히알루론산 및 약물의 접합제를, 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제 및 히알루론산과 반응시켜, 약물이 결합된 히알루론산 가교물을 수득하는 단계 이다.
일 예로, 상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물을 수득하는 단계는, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재 하에서 히알루론산 및 약물의 접합제를 히알루론산 및 가교제(예를 들어, 알킬렌디아민 또는 디아민 쿠커비투[n]릴)과 반응시키는 것을 포함할 수 있다.
카르복실기 활성화제로서는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)와 같은 1-알킬-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드들; 1-에틸-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드(ETC, 1-ethyl-3-(3-(trimethylammonio)propyl) carbodiimide)와 같은 1-알킬-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드들; 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드(CMC, 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide)와 같은 1-사이클로알킬-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드 등의 수용성 카르보디이미드의 카르보디이미드를 사용하며, 보다 바람직하게는, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)를 사용하고, 히알루론산 1몰당 몰비로 1 내지 5배로 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
펩티드 결합 촉진제로서는 예를 들면, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 1-hydroxybenzotriazole), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt, 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt, 1-hydroxy-7-azabenzotriazole), N-히드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS, Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide), O-(1H-벤조트리아졸-1-y)-N,N,N',N'-테트라메틸유로니움테트라플루오로보레이트(TBTU, O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate), N, N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine, DIPEA) 또는 2,2,6,6,-테트라메틸피페리딘(2,2,6,6-tetramethylpiperidine) 등을 사용할 수 있고, 바람직하게 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)를 사용하고, 히알루론산 1몰당 몰비로 1 내지 5배로 사용하라 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응은 통상 수성 용액, 예를 들어 물에서 수행될 수 있다. 또한, 상기와 같이 제조된 가교물의 pH에 따라 물성에도 변화가 있으며, pH를 조정하여 각기 다른 물성의 가교물을 제조할 수 있다. 또한, 사용한 HA의 분자량에 따른 농도를 조절하여 하이드로겔의 분해율을 조절할 수 있다. 또한 바람직하게 HA의 농도는 3% 이하로 사용하며, 3% 초과시, 적은 양의 가교제 첨가에도 불구하고 건조된 하이드로겔이 생성되어 부서지기 쉬운 문제가 발생할 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 약물이 결합된 히알루론산-헥사메틸렌디아민 가교물의 제조 방법을 대략적으로 나타낸 것이다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 히알루론산의 카르복실기와 알킬렌디아민 화합물의 아민기가 아미드 결합을 통하여 가교가 일어남을 알 수 있다. 가교결합은 분자 간에 일어날 수도 있고, 분자 내에서 일어날 수도 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 약물이 결합된 히알루론산-디아민 쿠커비투[6]릴 가교물의 제조 방법을 대략적으로 나타낸 것이다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 히알루론산의 카르복실기와 디아민 쿠커비투[6]릴의 아민기가 아미드 결합을 통하여 가교가 일어남을 알 수 있다. 가교결합은 분자 간에 일어날 수도 있고, 분자 내에서 일어날 수도 있다.
또한, 상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물을 수득하는 단계는, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재 하에서 히알루론산 및 약물의 접합제를 히알루론산 및 가교제(예를 들어, 알킬렌디아민 또는 디아민 쿠커비투[n]릴)과 반응시키는 것을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 비스 에폭사이드 화합물은 부탄다이올 다이글라이시딜 에테르를 사용할 수 있으며, 히알루론산 반복 단위의 3.5 내지 80 몰%, 바람직하게는 10 내지 30몰%, 가장 바람직하게는 10 내지 25몰%로 사용할 수 있다. 상기 반응은 통상 수성 용액, 예를 들어 물에서 수행될 수 있다. 또한, 사용한 HA의 분자량에 따른 농도를 조절하여 하이드로겔의 분해율을 조절할 수 있다. 또한 바람직하게 HA의 농도는 3% 이하로 사용하며, 3% 초과시, 적은양의 가교제 첨가에도 불구하고 건조된 하이드로겔이 생성되어 부서지기 쉬운 문제가 발생할 수 있다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른, 약물이 결합된 히알루론산-비스 에폭사이드 가교물의 제조 방법을 대략적으로 나타낸 것이다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 염기 환경에서, 히알루론산의 카르복실기와 부탄다이올 다이글라이시딜 에테르의 에폭사이드가 에스터 결합을 통하여 가교가 일어남을 알 수 있다. 가교결합은 분자 간에 일어날 수도 있고, 분자 내에서 일어날 수도 있다.
상기 단계 (d)는 상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물을 수용액에서 수화시켜 히알루론산 가교물 하이드로겔을 수득하는 단계이다.
위에서 제조된 약물이 결합된 히알루론산 가교물은 생리학적으로 적합한 수용액으로 수화시켜 하이드로겔을 제조할 수 있으며, 이 때, 생리학적으로 적합한 수용액으로는 생리식염수가 바람직하며, 히알루론산-알킬디아민 가교물에 대해 20 내지 30(부피비)의 비율로 생리학적으로 적합한 수용액에 수화시켜 하이드로겔을 제조하는 것이 바람직하다.
일 구체예로, 약물로 레티노산을 사용하는 경우, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 약물 전달용 조성물의 제조방법은, (a) 히알루론산의 TBA 염을 제조하는 단계, (b) 상기 히알루론산의 TBA 염에, 아민기가 도입된 레티노산을 유기 용매 존재 하에 반응시켜, 히알루론산 및 레티노산의 접합체를 수득하는 단계, (c) 상기 히알루론산 및 레티노산의 접합제를 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제 및 히알루론산과 반응시켜, 레티노산이 결합된 히알루론산 가교물을 수득하는 단계, 및 (d) 상기 레티노산이 결합된 히알루론산 가교물을 수용액에서 수화시켜 히알루론산 가교물 하이드로겔을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 구체예로, 약물로 덱사메타손을 사용하는 경우, 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 약물 전달용 조성물의 제조방법은, (a) 아민기가 도입된 히알루론산의 TBA 염을 제조하는 단계, (b) 상기 히알루론산의 TBA 염에, 덱사메타손 또는 이의 염을 유기 용매 존재 하에 반응시켜, 히알루론산 및 덱사메타손의 접합체를 수득하는 단계, (c) 상기 히알루론산 및 덱사메타손의 접합제를, 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제 및 히알루론산과 반응시켜, 덱사메타손이 결합된 히알루론산 가교물을 수득하는 단계, 및 (d) 상기 덱사메타손이 결합된 히알루론산 가교물을 수용액에서 수화시켜 히알루론산 가교물 하이드로겔을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 약물을 충전한 히알루론산 및 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴, 비스 에폭사이드 가교물의 하이드로겔은 생체 적합성 및 팽윤성 등 조직증강에 필요한 물성이 우수하고 생체 내에서 오래 지속될 수 있어 질환에 필요한 약물을 장기 지속적으로 전달하고 그 교환횟수를 줄일 수 있는 유리한 효과를 나타낼 수 있다.
도 1a는 히알루론산-테트라부틸 암모니움 복합체(HA-TBA) 와 아민기가 도입된 약물(Drug-NH2)을 반응시켜 히알루론산-약물 접합체를 합성하는 과정 및 합성된 접합체 구조에 대한 예시를 나타낸다.
도 1b는 히알루론산-테트라부틸 암모니움 복합체(HA-TBA)와 시스타민기가 도입된 약물(Drug-cystamine)을 반응시켜 히알루론산-약물 접합체를 합성하는 과정 및 합성된 접합체 구조에 대한 예시를 나타낸다.
도 2는 히알루론산-약물 접합체의 알킬렌디아민 가교물 하이드로겔의 합성과정 및 합성된 가교물 구조에 대한 개략도이다.
도 3a는 본 발명의 히알루론산-약물 접합체의 디아민 쿠커비투[6]릴 가교물의 합성과정 및 합성된 가교물 구조에 대한 개략도이다. 도 3b는 도 3a의 디아민 쿠커비투[6]릴 가교물에 하나 이상의 아민이 도입된 약물을 혼합하여 약물을 충전하는 과정에 대한 개략도이다.
도 4는 본 발명의 히알루론산-약물 접합체의 비스 에폭사이드 가교물 하이드로겔의 합성과정 및 합성된 가교물 구조에 대한 개략도이다.
도 5a는 제조예 1의 히알루론산-레티노산 접합체의 합성과정 개략도를 나타낸 것이다. 도 5b는 제조예 1에 따른 히알루론산-레티노산 접합체의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6a는 제조예 2의 히알루론산-덱사메타손 접합체의 합성과정 개략도를 나타낸 것이다. 도 6b는 제조예 2에 따른 히알루론산-덱사메타손 접합체의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 제조예 3의 약물이 충전된 히알루론산 하이드로겔의 개략도를 나타낸 것이다.
이하, 발명의 다양한 실시예에 대해 설명하기로 한다. 다만, 이는 발명의 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 발명의 권리 범위가 제한되는 것은 아니다.
제조예 1: 히알루론산-레티노산 접합체의 합성 및 분석
히알루론산-레티노산 접합체를 합성하기 위하여 레티노산의 아민 유도체를 합성하였다. 레티노산(0.33 mmol), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(Benzotriazole-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate, BOP)(1.2 mmol), 하이드록시벤조트리아졸(Hydroxybenzotriazole, HOBt)(1.2 mmol)를 10mL 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹이고 10분간 교반하였다. 상기 혼합물에 다이아미노헥세인(diaminohexane, DAH)(3.33 mmol)을 첨가하고 2일 동안 반응시켰다. 1 M NaCl 수용액으로 반응을 종결하고 상기 용액을 과량의 100 mM NaCl 수용액에 1일, 과량의 증류수에 3일 동안 투석하였다. 투석한 결과물을 동결 건조하고 높은 순도의 결과물을 얻기 위하여 메탄올과 클로로포름 6:4 혼합액을 이동상으로 사용하여 실리카 컬럼으로 정제하였다.
한편, HA-TBA를 합성하기 위하여 Dowex 50WX-8-400 ion-exchange resin(12.5 g)을 250 mL의 증류수로 3회 세척한 후, 상기 Dowex resin에 테트라-n-부틸 암모니움 하이드록사이드(tetra-n-butyl ammonium hydroxide, TBA-OH)(24.5 mL)를 넣어 30분간 반응 후, 필터를 통해 여과하였다. 히알루론산(HA)(MW=200kDa) 1 g을 100 mL의 증류수에 녹인 후, 상기의 DOWEX-TBA resin(10 g)을 첨가해 3시간 동안 반응시켰다. 상층액을 0.45 μm 필터로 걸러 3일간 동결건조 시켜 HA-TBA 유도체를 얻었다.
이후, 상기 HA-TBA 유도체를 5 mg/ml로 DMSO에 녹인 후, HA 단위체 몰수당 4몰배의 BOP과 HOBt를 첨가하고 30분간 교반(stirring)하였다. 이후 상기 레티노산 아민 유도체와 다이아이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine, DIPEA)을 HA 단위체 몰수당 1몰 넣어주어 2일 동안 반응시켰다. 상기 반응 용액에 같은 부피의 1 M NaCl 수용액을 첨가하여 반응을 종결시키고 해당 용액을 과량의 100 mM NaCl 수용액에 1일, 과량의 증류수에 3일 동안 투석시킨 후 3일간 동결건조 시켜 히알루론산-레티노산 접합체를 얻었다. 상기 반응의 반응과정 및 화학식을 도 5a에 나타내었다.
실험예 1. 히알루론산-레티노산 접합체의 NMR 분석
1-1) 분석 방법
제조예 1에 따라 얻어진 히알루론산-레티노산 접합체(HA-RA)를 1H-NMR(DPX500 또는 DPX300, Bruker, Germany)로 분석하였다. 제조예 1에 따라 얻어진 히알루론산-레티노산 접합체의 1H-NMR 스펙트럼을 도 5b에 도시하였다.
1-2) 분석 결과
도 5b에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 1에 따라 얻어진 히알루론산-레티노산 접합체의 1H-NMR 스펙트럼에서는 히알루론산의 피크(peak) 외에도, 레티노산의 피크가 나타났다. 특히 d = 1.15, 1.3, 1.6, 2.1의 피크는 레티노산에 의한 것이다. 정량분석을 위해 d = 1.85 ~ 1.95 ppm의 히알루론산의 아세토아미도 관능기의 메틸 공명(methyl resonance of acetamido moiety of HA)을 내부표준(internal standard)으로 정했다. 제조예 1 에 따른 히알루론산- 레티노산 접합체 내의 약물 함량은 d = 1.85 ~ 1.95 ppm의 피크 면적과 d = 1.15 ppm의 피크 면적을 비교해서 구했다. 1H-NMR 스펙트럼 분석을 통해 히알루론산-레티노산 접합체의 합성을 확인할 수 있었다.
제조예 2: 히알루론산-덱사메타손 접합체의 합성 및 분석
히알루론산-덱사메타손 접합체를 합성하기 위하여 히알루론산의 아민 유도체를 합성하였다. 분자량 200 kDa의 히알루론산 100 mg을 10 ml의 증류수에 녹이고 헥사메틸렌디아민(hexamethylene diamine, HMDA)를 첨가하였다. 상기 용액의 pH를 4.8로 맞추고 30분 동안 교반하여 안정화시켰다. HA 단위체 1몰당 4몰의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC)와 1몰의 N-히드록시설포숙신이미드(Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS)를 첨가한 후 pH를 4.8로 맞추고 10분 동안 반응시켰다. 이후 반응을 종결시키기 위하여 pH를 7로 높이고 상기 용액을 과량의 100 mM NaCl 수용액에 2일, 25% 에탄올에 1일, 과량의 증류수에 2일 동안 투석하였다. 투석한 결과물은 동결 건조하였다.
한편, 히알루론산 아민 유도체의 테트라부틸 암모니움 염(HA-HMDA/TBA)을 합성하기 위하여 Dowex 50WX-8-400 ion-exchange resin(1,25 g)을 25 mL의 증류수로 3회 세척한 후, 상기 Dowex resin에 TBA-OH(2.45 mL)를 넣어 30분간 반응 후, 필터를 통해 여과하였다. 히알루론산의 아민 유도체(HA-HMDA)(MW=200kDa) 100 mg을 10 mL의 증류수에 녹인 후, 상기의 DOWEX-TBA resin(1g)을 첨가해 3시간 동안 반응시켰다. 상층액을 0.45 μm 필터로 걸러 3일간 동결건조 시켜 HA-HMDA/TBA 유도체를 얻었다.
이후, 상기 HA-HMDA/TBA 유도체 20 mg을 5mg/ml로 DMSO에 녹인 후, HA에 도입된 아민 1몰당 2몰의 트라우트 반응물(Traut's reagent)을 넣고 30분 동안 교반하였다. 상기 용액에 덱사메타손 메실레이트(dexamethasone mesylate)를 아민기의 2몰배 넣고 상온에서 2일 동안 반응시켰다. 이후 상기 용액을 과량의 DMSO에 1일, 100mM NaCl 수용액에 2일, 25% 에탄올에 1일, 과량의 증류수에 2일 동안 투석시킨 후 3일간 동결건조 시켜 히알루론산-덱사메타손 접합체를 얻었다. 상기 반응의 반응과정 및 화학식을 도 6a에 나타내었다.
실험예 2. 히알루론산-덱사메타손 접합체의 NMR 분석
1-1) 분석 방법
제조예 2에 따라 얻어진 히알루론산-덱사메타손 접합체(HA-dexa)를 1H-NMR(DPX500 또는 DPX300, Bruker, Germany)로 분석하였다. 제조예 2에 따라 얻어진 히알루론산-덱사메타손 접합체의 1H-NMR 스펙트럼을 도 6b에 도시하였다.
1-2) 분석 결과
도 6b에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 2에 따라 얻어진 히알루론산-덱사메타손 접합체의 1H-NMR 스펙트럼에서는 히알루론산의 피크(peak) 외에도, 덱사메타손의 피크가 나타났다. 특히 d = 0.5 ~ 1의 피크는 덱사메타손에 의한 것이다. 정량분석을 위해 d = 1.85 ~ 1.95 ppm의 히알루론산의 아세토아미도 관능기의 메틸 공명(methyl resonance of acetamido moiety of HA)을 내부표준(internal standard)으로 정했다. 제조예 2 에 따른 히알루론산-덱사메타손 접합체 내의 약물 함량은 d = 1.85 ~ 1.95 ppm의 피크 면적과 d = 0.75 ppm의 피크 면적을 비교해서 구했다. 1H-NMR 스펙트럼 분석을 통해 히알루론산-덱사메타손 접합체의 합성을 확인할 수 있었다.
제조예 3: 히알루론산-헥사메틸렌디아민(HA-HMDA) 가교물 하이드로겔의 제조
분자량 약 200 kDa의 히알루론산과 제조예 1에서 제조한 히알루론산-레티노산 접합체를 3 질량%로 완전히 증류수에 녹인 후 카르복실기와의 반응으로 가교를 이루기 위해 헥사메틸렌디아민(HMDA)을 첨가하였다. HMDA은 HA의 반복단위의 72 몰%로 첨가하였다. 카르복실기의 활성제인 EDC와 HOBt를 HA 반복단위의 1.4배의 양으로 증류수에 녹인 후 상기 HA와 HMDA의 혼합액에 첨가하였다. HA-HMDA 가교물의 완전한 가교반응을 위해 상기 혼합용액을 37℃에서 1시간 동안 반응을 시켰다. 제조된 하이드로겔의 pH는 5.0-5.5이었다. 그 후, 제조된 HA-HMDA 하이드로겔을 미리 세척해둔 투석막(7kDa의 분자량 컷-오프)으로 밀봉하여 0.01 M PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)에 24시간 동안 투석하여 잔류 EDC, HOBt 및 HMDA를 제거하였다. HA-HMDA 가교물 하이드로겔 제조 과정의 개요도를 도 2에 도시하였고 이와 같이 제조된 하이드로겔 구조의 개략도 및 합성된 하이드로겔의 사진을 도 7에 도시하였다. 제조된 HA-HMDA 하이드로겔의 가교도는 8-9% 이었다.

Claims (22)

  1. 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하는 약물 전달용 조성물로서,
    상기 약물은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고,
    상기 약물이 결합되어 있지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것이며.
    상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 가교율이 5 내지 35%인, 약물 전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 분자량이 5,000 내지 4,000,000 달톤(Da)인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약물은 피부재생 치료제, 관절염 치료제, 스테로이드제, 또는 비스테로이드 항염증제인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 약물은 레티노산(retinoic acid), 덱사메타손, 또는 클로스트리디움 보툴리늄 독소(Clostridium botulinum toxin)인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약물 또는 히알루론산은, 아민기, 카르복실기, 알데하이드기, 바이닐기, 치올기, 알릴옥시그룹, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트 및 N-하이드록시숙신이미드로 이루어진 군에서 선택되는 기능기가 도입된 것인, 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 하기 식 3으로 표시되는 것인, 조성물.
    [식 3]
    [HA]m-C(O)-NH-R1-NH-C(O)-[HA-약물 접합체]n
    (상기 식에서, HA는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염을 나타내고, R1은 히드록시, C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기이며, m 및 n은 각각 10,000 내지 4,000,000의 정수이다).
  8. 제1항에 있어서, 상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 하기 식 4로 표시되는 것인, 조성물.
    [식 4]
    [HA]m-C(O)-NH-R1-S-R2-O-CB[n]-O-R2-S-R1-NH-C(O)-[HA-약물 접합체]n
    (상기 식에서, HA는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염을 나타내고, CB[n]는 쿠커비투[n]릴(cucurbit[n]uril, 이 때 n은 4 내지 12의 정수), R1은 C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기이며, R2은 C1-C6 알킬, 또는 C1-C6 알콕시로 치환되거나 비치환된 C3-C10 알킬렌기이고, m 및 n은 각각 10,000 내지 4,000,000의 정수이다).
  9. 제1항에 있어서, 상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 하기 식 5로 표시되는 것인, 조성물.
    [식 5]
    [HA]m-C(O)-O-CH2-C(OH)-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-C(OH)-CH2-O-C(O)-[HA-약물 접합체]n
    (식에서, HA는 카르복실기 하나를 제외한 히알루론산 또는 그의 염을 나타내고, m 및 n은 10,000 내지 4,000,000의 정수이다).
  10. 레티노산이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며,
    상기 레티노산은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고,
    상기 레티노산이 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것이며,
    상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 가교율이 5 내지 35%인, 피부 재생용 약학 조성물.
  11. 덱사메타손이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며,
    상기 덱사메타손은 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고,
    상기 덱사메타손이 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것이며,
    상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 가교율이 5 내지 35%인, 관절염 치료용 약학 조성물.
  12. 비스테로이드 항염증제가 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔을 포함하며,
    상기 비스테로이드 항염증제는 히알루론산의 카르복실기 위치에 결합되어 있고,
    상기 비스테로이드 항염증제가 결합되지 않은 카르복실기 간에는 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제에 의해 형성된 가교를 포함하는 것이며,
    상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 가교율이 5 내지 35%인, 염증 치료용 약학 조성물.
  13. 히알루론산 또는 히알루론산의 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide) 염을 제조하는 단계,
    상기 히알루론산 및 약물을 유기 용매 존재 하에 반응시켜, 히알루론산 및 약물의 접합체를 수득하는 단계, 및
    상기 히알루론산 및 약물의 접합제를, 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제 및 히알루론산과 반응시켜, 약물이 결합된 히알루론산 가교물을 수득하는 단계, 및
    상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물을 수용액에서 수화시켜 히알루론산 가교물 하이드로겔을 수득하는 단계를 포함하며,
    상기 약물이 결합된 히알루론산 가교물 하이드로겔은, 가교율이 5 내지 35%인, 제1항의 약물 전달용 조성물을 제조하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 히알루론산의 TBA염의 제조는,
    양이온 교환수지에 TBA-OH(Tetra-n-butyl ammonium hydroxide)를 반응시키는 단계, 및
    상기에 히알루론산을 첨가하여 하기 식 2의 히알루론산의 TBA염을 수득하는 단계에 의해 수행되는 것인, 방법.
    [식 2]
    Figure 112015070272389-pat00004

    상기 식 2에서, n은 50 내지 10,000의 정수이다.
  15. 제13항에 있어서, 상기 유기 용매는 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO), 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF), 디메틸아세트아미드(dimethylacetamide), N-메틸-2-피롤리돈(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP), 및 헥사메틸포스포아미드(hexamethylphosphoramide, HMPA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 약물 또는 히알루론산은, 아민기, 카르복실기, 알데하이드기, 바이닐기, 치올기, 알릴옥시그룹, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디치오)프로피오네이트(N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 이루어진 군에서 선택되는 기능기가 도입된 것인, 방법.
  17. 제13항에 있어서, 히알루론산 및 약물의 접합체를 수득하는 단계 이전에, 히알루론산에 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포니움 헥사플로로포스페이트(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris(dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate, BOP), 1, 3-디시클로헥실카르보디이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 및 1, 3-다이아이소프로필카보다이이미드(1,3-Diisopropylcarbodiimide, DIC) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 활성제를 첨가하여 활성화시키는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  18. 제13항에 있어서, 히알루론산 및 약물의 접합체를 수득하는 단계는, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 1-hydroxybenzotriazole), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt, 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt, 1-hydroxy-7-azabenzotriazole), N-히드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS, Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide), O-(1H-벤조트리아졸-1-y)-N,N,N',N'-테트라메틸유로니움테트라플루오로보레이트(TBTU, O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate), N, N-디이소프로필 에틸아민(N,N-diisopropyl ethylamine, DIPEA) 및 2,2,6,6,-테트라메틸피페리딘(2,2,6,6-tetramethylpiperidine)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 첨가하는 것을 추가하여 반응시키는 것을 포함하는 것인, 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 히알루론산 가교물 하이드로겔을 수득하는 단계는, 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재 하에서 히알루론산 및 약물의 접합제를 히알루론산 및 알킬렌디아민 또는 디아민 쿠커비투[n]릴과 반응시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 히알루론산 가교물 하이드로겔을 수득하는 단계는, 염기 환경 하에서 히알루론산 및 약물의 접합제를 히알루론산 및 비스 에폭사이드와 반응시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  21. 제13항에 있어서,
    히알루론산의 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide) 염을 제조하는 단계,
    상기 히알루론산의 TBA 염에, 아민기가 도입된 레티노산을 유기 용매 존재 하에 반응시켜, 히알루론산 및 레티노산의 접합체를 수득하는 단계,
    상기 히알루론산 및 레티노산의 접합제를 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제 및 히알루론산과 반응시켜, 레티노산이 결합된 히알루론산 가교물을 수득하는 단계, 및
    상기 레티노산이 결합된 히알루론산 가교물을 수용액에서 수화시켜 히알루론산 가교물 하이드로겔을 수득하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  22. 제13항에 있어서,
    아민기가 도입된 히알루론산의 TBA(Tetrabutylammonium hydroxide) 염을 제조하는 단계,
    상기 히알루론산의 TBA 염에, 덱사메타손 또는 이의 염을 유기 용매 존재 하에 반응시켜, 히알루론산 및 덱사메타손의 접합체를 수득하는 단계, 및
    상기 히알루론산 및 덱사메타손의 접합제를, 알킬렌디아민, 디아민 쿠커비투[n]릴 및 비스 에폭사이드로 이루어진 군에서 선택되는 가교제 및 히알루론산과 반응시켜, 덱사메타손이 결합된 히알루론산 가교물을 수득하는 단계, 및
    상기 덱사메타손이 결합된 히알루론산 가교물을 수용액에서 수화시켜 히알루론산 가교물 하이드로겔을 수득하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
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