KR101800366B1 - 혈장내 유리무세포 DNA(cfDNA)를 이용한 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 상기 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

혈장내 유리무세포 DNA(cfDNA)를 이용한 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트{Composition for detecting mutations of epidermal growth factor receptor gene and kit comprising the same using cfDNA in plasma}

본 발명은 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상피세포 성장인자 수용체 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물, 상기 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트에 관한 것이다.

암이란 다양한 원인에 의해 세포의 분열과 사멸 간의 균형이 파괴됨으로써 계속적인 분열과 증식에 의해 발생한 비정상적인 세포의 집단을 의미하며, 종양 또는 신생물이라고도 한다. 일반적으로 장기, 백혈구, 뼈, 림프절 등을 포함한 100 가지 이상의 신체의 여러 부분에 발병하며, 주변조직으로 침윤하는 현상 및 다른 기관으로 이동하는 전이를 통해 심각한 증상으로 발전한다.

암의 치료제는 지속적으로 개발되고 있어, 현재 임상에서 사용되는 각종 암에 대한 치료제는 수십 가지에 이르고 있다. 하지만 현재까지도 임상의들은 두 가지의 어려움을 겪고 있는데, 첫째는 치료제가 치료 효과를 나타내기까지는 몇주 정도의 시간이 소요되고 개개 환자들에게 효과가 있는 치료제를 미리 알 수가 없다는 것이다. 즉, 항암제의 치료 효과는 며칠 내에 판정할 수 있는 것이 아니라 수주에 걸쳐서 서서히 나타나기 때문에 처방된 약물이 효과가 없다고 판단하기까지는 오랜 시간이 걸린다는 것이다. 그 후 치료 효과가 부적절하다면 다른 종류의 치료제로 변경을 고려하는데, 결국 치료 개시 시기에 임상의가 환자에게 적절한 치료제를 선택하지 못하였다면, 그만큼 효과적인 치료에 이르는데, 시간이 그만큼 지체하게 되며, 병의 진행, 재발 및 예후에 치명적인 영향을 미치게 된다.

두 번째 어려움은 치료제에 치료 반응을 보이지 않는 환자가 다수 존재하는 점이다. 예를 들어, 유방암 치료제인 라파티닙(lapatinib)은 HER2 단백질의 수치가 높고 (HER2 양성) EGRF 단백질의 수치가 낮은 경우에 치료효과가 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 그러나 전이성의 HER2 음성 유방암은 라파티닙에 반응을 하지 않아 라파티닙이 효과가 없는 것으로 드러났다. 이러한 연구결과를 참고하면, 일단 유방암 환자들은 치료를 받기 전에 정확한 검사를 통하여 HER2 음성인지 혹은 양성인지를 확실히 밝혀야 적절한 치료를 선택할 수 있음을 알 수 있다.

따라서, 치료제에 대한 치료반응과 그 부작용을 미리 예측할 수 있다면, 환자에게 맞는 약물을 미리 선별하여 약물을 잘못 선택함으로 인하여 생기는 치료 탈락(dropout)률을 낮추고 약물의 순응도를 높일 수 있을 것이다. 또한 약물의 효과가 나타나기까지 걸리는 시간과 환자가 겪을 지도 모르는 부작용의 위험을 피해 갈 수 있을 것이다.

한편, EGFR은 erbB 수용체 부류의 단백질 티로신 인산화효소의 일종이다. 성장 인자 리간드, 예컨대 표피 성장 인자 (EGF: epidermal growth factor) 결합시, 상기 수용체는 또 다른 EGFR 분자와 동종 이량체를 형성할 수 있거나, 또는 또 다른 부류 구성원, 예컨대 erbB2(HER2), erbB3(HER3), 또는 erbB4(HER4)와 이종 이량체를 형성할 수 있다.

erbB 수용체의 동종 및/또는 이종 이량체의 형성은 세포내 도메인에서 중요 티로신 잔기의 인산화를 결과로 생성하고, 세포 증식 및 생존에 관여하는 많은 세포내 신호 전달 경로의 자극을 유도한다. erbB 부류 신호 전달의 탈조절은 증식, 침윤, 전이, 혈관형성 및 종양 세포 생존을 조장하며, 그리고 폐암, 두경부암 및 유방암을 비롯한 많은 인간 암에서 기술되어 있다.

그러므로, erbB 부류가 항암 약물 개발을 위한 합리적인 표적을 대표하고, 제피티닙(IRESSA™), 엘로티닙(TARCEVA™)을 비롯한, EGFR을 표적하는 다수의 제제가 현재 임상적으로 이용될 수 있다. 2004년에는 EGFR에서 활성화 돌연변이가 비소세포 폐암(NSCLC: non-small-cell lung cancer)에서 제피티닙 요법에 대한 반응과 상관관계가 있다는 것이 보고되었다(Science [2004] Vol.304, 1497-500 및 New England Journal of Medicine [2004] Vol. 350, 2129-39). 가장 일반적인 EGFR 활성화 돌연변이인 L858R 및 delE746_A750은 야생형(WT: wild type) EGFR에 비하여 소분자 티로신 키나제 억제제, 예컨대 제피티닙 및 엘로티닙에 대한 반응성과 관련이 있는 점이 알려져 있다. 궁극적으로, 제피티닙 또는 엘로티닙을 사용하는 요법에 대한 획득 내성이 예를 들면 게이트키퍼 잔기 T790M의 돌연변이에 의해 발생하는데, 상기 돌연변이는 임상적으로 내성을 띠는 환자 중 50%에서 검출되는 것으로 보고된 바 있다.

이와 같이, EGFR 돌연변이의 존재는 제피티닙 또는 엘로티닙과 같은 EGFR 키나아제 저해제에 반응하는 약물 감수성의 강력한 예측인자로 작용하므로, 최적의 치료적 접근을 위해 EGFR 돌연변이의 효과적이고 신속한 검출 방법이 요구된다.

한편, 대부분의 암은 시기와 빈도의 차이는 있지만, 이웃 조직에 침투하고 림프관 또는 혈관을 통해 이동하여 종양세포가 다른 곳에 자리 잡아 퍼지는 전이 현상이 일어날 수 있다. 전이는 암으로 인한 사망의 90%를 차지하는데 침투와 전이는 매우 복잡한 과정이며, 그것의 유전적-생화학적 요인은 아직 잘 알려지지 않았다. 암 전이는 크게 림프성 전이와 혈액성 전이로 구분하고 있는데, 원발부위에서 먼 장기로의 전이는 대부분 혈액성 전이로 일어난다고 알려져 있다. 암 환자에게서 전이가 발생하면 어느 부위에 암 세포가 정착하여 증식하고 있는지 진단하기 어려울 뿐만 아니라 혈액을 통해 전신으로 암 세포가 빠르게 퍼질 수 있어 병의 예후가 매우 좋지 못하다. 따라서, 암 환자 또는 암의 1차적인 치료가 완료된 환자에서 암의 전이 또는 재발을 방지하기 위해서는 지속적인 모니터링이 필요하며, 이러한 모니터링은 환자의 삶의 질을 침해하지 않는 한도에서 최대한 간단하고 신속하게 수행될 필요성이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

이에, EGFR 돌연변이를 간편하고 신속하게 검출하여, EGFR 관련 암 환자의 약물치료 전략을 선택하거나, 암의 전이 또는 재발을 방지하기 위한 모니터링 수단으로 이용할 필요성이 있고, 본 발명자들은 EGFR 유전자의 돌연변이를 검출하는 시스템, 특히 환자의 혈액 내 cfDNA에 적용시키기 적합한 프라이머/프로브 세트를 발굴하고, 이에 적합한 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트와 본 발명의 조성물 중 일부 프라이머/프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 18 내지 23, 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 31, 36 내지 38로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 15 내지 17, 24 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 28, 29, 32 내지 35로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 하나이상 선택된 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 EGFR 저해제에 대한 치료 반응성 (responsiveness) 예측을 위한 것일 수 있다. 2004년, EGFR에서의 돌연변이가 비소세포 폐암(NSCLC: non-small-cell lung cancer)에서 제피티닙 요법에 대한 반응과 상관관계가 있다는 것이 보고 (Science [2004] Vol.304, 1497-500 및 New England Journal of Medicine [2004] Vol. 350, 2129-39)된 이래로 많은 관련 EGFR 돌연변이가 확인되었다. 상기 EGFR 저해제는 바람직하게는 엘로티닙 (erlotinib), 제피티닙 (gefitinib) 또는 아파티닙 (Afatinib) 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다 .

본 발명에서 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명에서 “프로브”는 정량적 PCR에 이용되는 taqman probe의 일종으로 디자인된 것이다. 바람직하게는 프로브에는 형광 물질 (HEX, VIC, FAM dye)를 부착하였으며, 모든 프로브의 3'쪽에는 ??쳐 (quencher)로 BHQ1이 이용될 수 있다. TaqMan probe는 일반적으로 5‘ 말단을 형광 물질로, 3’ 말단을 quencher 물질로 tagging한 oligonucleotide이며, TaqMan probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridization하지만, probe의 3‘ 말단에 quencher가 있기 때문에 빛을 주어도 형광을 발하지 못하지만, 다음 과정인 extension step에서 Taq DNA polymerase가 가지고 있는 5’→3‘ exonuclease 활성에 의해, 주형에 hybridization한 TaqMan probe가 분해되면 형광물질이 probe로부터 분리되어 quencher에 의한 억제가 해제되고 형광을 발하게 되는 원리에 의해서 PCR 반응에 따른 형광이 정량적으로 발하게 된다.

본 발명에서의 게놈 DNA 유전자 변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는 게놈 DNA 유전자 변이에 특이적인 프라이머 및 프로브는 PCR 반응 용액 및 표준 PCR 반응 용액에 대해서 동일한 서열로 사용되며, 각각 독립적으로 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 18 내지 23, 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 31, 36 내지 38로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 15 내지 17, 24 내지 27로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트, 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 28, 29, 32 내지 35로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

PCR 반응 여부의 측정은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으나, 리포터 형광 염료 및/또는 ??쳐 (quencher) 형광 염료로 표지된 프로브를 사용한 광학적 정량 분석 시스템에 의해서 측정될 수 있으며, 바람직하게는 각 미분화된 작은 방울 각각의 PCR 반응에 대한 형광값을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다.

구체적으로 프로브에 FAM, HEX, VIC 형광염료 (형광물질) 또는 EvaGreen 형광염료가 결합된 형태를 사용하였으므로 이들에 대한 형광을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 이와 같은 과정은 상용의 검출장치 (예를 들어, biorad사의 Droplet Reader)에 의해서 수행될 수 있으며, 해당 장치내에서 각각의 샘플의 droplet 형광 신호를 각각 감지 및 positive와 negative droplet의 수를 세어 자동으로 분석까지 완료될 수 있다.

이 때 검출을 위해서 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브 및 표준 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브는 각각 상이한 형광물질과 결합되어 있을 수 있다.

한편, 본 발명은 본 발명의 프라이머/프로브 세트를 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.

본 발명이 상기 키트는, background (noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 야생형 서열을 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 서열에 non-specific 하게 binding 하지 못하도록 디자인 한 oligomer (blocker)를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 바람직하게는 본 발명의 프라이머/프로브 세트를 이용한 PCR 반응에 의한 EGFR 유전자의 돌연변이의 검출에 이용될 수 있다. 본 발명의 키트는 PCR 이나 이의 검출에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.

아울러, 본 발명의 키트는 RUO (research use only) 또는 IVD (investigation use only) 키트일 수 있다. IVD 키트에는 IVD-CDx 키트도 포함된다.

한편, 본 발명은 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 18 내지 21, 23 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 31, 36 및 39로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 15 내지 17 및 40으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 32 내지 35 및 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 qPCR (quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법에 사용되는 것이다.

본 발명의 키트에 적용가능한 주형은 EGFR의 돌연변이 검출이 필요하며, PCR 반응이 가능한 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 본 발명의 키트는 FFPE (formalin fixed parafin embedded) 조직에서 분리된 DNA 또는 상기 조직 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA, 또는 혈액에서 분리된 cfDNA(cell-free DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

인간 혈장에서 순환하는 cfDNA는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 연구되고 있다. cfDNA의 혈류 방출과 관련된 정확한 기전은 불확실하지만, 아마도 세포자살, 세포괴사 및 세포로부터의 능동적인 방출이 종합적으로 작용하는 것으로 보인다. 혈관을 통해 순환하는 cfDNA는 잠재적으로 유용한 바이오마커이다. DNA 수준과 단편화 패턴은 진단 및 예후 예측 목적으로 흥미로운 가능성을 제시한다. 특히 환자의 혈액에서 간단히 검출할 수 있다는 점에서 삶의 질을 크게 훼손하지 않고 간편하고 신속하게 바이오마커를 검출할 수 있다는 유용성이 있다.

생검 후 환자에게서 얻은 조직은 통상적으로 포르말린(포름알데히드) 등에 의해서 고정화한다. 고정화한 생물학적 샘플은 일반적으로 탈수시키고, 파라핀 등의 고체 지지체에 포매하며, 이렇게 제조된 시료를 FFPE 시료라고 한다. FFPE 시료 상의 핵산, 특히 DNA는 고정된 세포에 존재하고, 단편화 되어 있거나 포르말린에 의해 교차 결합되어 있으므로 파라핀을 제거하고 고정된 세포를 용해하여 DNA를 비롯한 핵산을 세포 내에서 용출시킬 필요가 있다.

본 발명에 있어서 용어 “파라핀”은 형태학적, 면역조직화학적 및 효소조직화학적인 해석을 포함하는 모든 해석에 있어서 사용되는 생체시료의 포매 매체를 포괄적으로 말하는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서의 파라핀은 석유계 파라핀 왁스 단체(單體)여도 되고, 당해 석유계 파라핀 왁스를 기제(基劑)로 하여, 포매 매체의 품질향상 등의 목적으로 첨가될 수 있는 모든 다른 성분을 포함한 것이어도 된다. 여기서, 석유계 파라핀 왁스는 석유에 유래하는 상온에서 고형인 탄화수소류의 혼합물을 말한다.

일반적으로 FFPE 처리된 암 환자의 검체 시료를 회전식 미세톱 (rotary microtome)으로 5~10μm 의 두께로 절단한 다음 상용의 FFPE 용 핵산 분리 키트 또는 이를 활용하는 장치를 통해 DNA를 포함하는 핵산을 분리할 수 있다. FFPE에서 핵산을 분리하는 키트/장치는 예를 들어 지멘스 사의 Tissue Preparation System 및 이와 관련된 시약 (VERSANT tissue preparation reagents)을 들 수 있다.

아울러, 본 발명의 키트는 혈액에서 분리된 CTC (circulating tumor cell)에서 분리된 DNA 또는 상기 CTC 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로 할 수 있다. CTC는 악성 종양 환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포이다. CTC가 암전이 과정에서 중요한 역할을 하기 때문에 CTC는 암의 연구, 진단 등에 있어서 매우 중요하게 여겨지고 있으나, 말초혈액 내 순환종양세포 존재 수가 매우 드물어, 수백만 개 이상의 정상 혈구세포에 섞여 있는 수십 개 이하의 종양세포를 검출할 수 있는 정도의 민감도가 요구되는 검출 시스템이 필요하다.

본 발명에서 치료 반응성은 암은 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 그의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 억제된다면 치료제에 대해서 "반응성"이라고 정의할 수 있다. 암의 성장은 다양한 방식으로 측정될 수 있고, 예를 들어, 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현이 측정될 수 있다. 아울러, 상기 “반응성”에는 유의미한 생존곡선상의 생존시기의 증가를 나타낼 수도 있다.

암은 성장률이 치료제와 접촉하지 않은 그의 성장과 비교해서 치료제와 접촉한 결과로서 매우 낮은 정도로 억제되거나 억제되지 않는다면 치료제에 대해서 "비반응성"이다. 위에서 언급된 바와 같이, 암의 성장은 다양한 방식으로 측정될 수 있고, 예를 들어, 종양의 크기 또는 그 종양 유형에 적합한 종양 마커의 발현이 측정될 수 있다. 비반응성의 척도는 환자의 삶의 질, 전이도 등을 비롯하여 종양의 성장 크기를 넘는 추가의 기준을 이용해서 평가될 수 있다.

암 치료제에 대한 치료 반응성으로 EGFR (epidermal growth factor receptor)의 저해제에 대한 치료 반응성일 수 있으며, 이에 따라 본 발명의 암은 폐암, 유방암, 방광암, 위암일 수 있다.

EGFR은, 종양유전자(oncogene)인 erbB 또는 ErbB1의 단백질 산물이다. erbB 또는 ErbB1은 수많은 암 발생에 있어 중요 인자로 알려진 원발암유전자(protooncogenes)인 ERBB 군의 하나이다. 폐암을 포함하여, 유방암, 방광암, 위암 등에서 EGFR의 발현이 증가되는 것이 관찰되었다.

폐암, 유방암, 방광암, 위암 등의 상피세포암을 치료하기 위하여 다양한 EGFR 표적 약물이 개발되었으며, 특히 제피티닙(Gefitinib)(AstraZeneca UK Ltd., 상표명 "IRESSA"), 엘로티닙(Erlotinib)(Genentech, Inc. & OSI Pharmaceuticals, Inc., 상표명 "TARCEVA")와 아파티닙(Afatinib)(Boehringer Ingelheim GmbH corp., 상품명 “GIOTRIF”)이 대표적인 약물이다. 제피티닙과 엘로티닙은 퀴나졸린계 화합물로서, EGFR의 티로신 키나제 활성을 저해하여 인산화를 억제함으로써 세포성장을 막는다.

본 발명의 시료에서 분리되는 핵산은 바람직하게는 게놈 DNA이며, 더 바람직하게는 돌연변이를 보유하고 있을 것으로 추정되는 게놈 DNA이다.

본 발명의 조성물 또는 키트는 바람직하게는 자동화 또는 반자동화된 방법의 EGFR 돌연변이 검출에 이용될 수 있다. 상기에서 자동화는 샘플 (시료)의 투입; 추출, 분리, 반응이 완료된 기재 (예를 들어, 튜브, 플레이트)의 재배치 또는 이동; 시약, 버퍼의 스톡 (stock)에의 투입, 보충; 장비의 유지관리를 제외한 전부 또는 대부분 과정이 인간 이외의 수단 (예를 들어, 로봇)을 통해서 이루어지는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물 또는 키트는 EGFR 유전자의 돌연변이의 검출에 있어서 각 시료에 대해서 우수한 돌연변이 검출능을 보였으며, 이는 종래의 비교 제품에 비해서도 더 우수한 것이었다.

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990); Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997); Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987); De Andres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995); Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996); T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)).

본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 목적으로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트의 구성(MMX 1 내지 4)을 나타낸 것으로, 각 MMX에 포함되는 프로브 및 검출 가능한 EGFR 변이의 종류를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트의 분석적 민감도를 측정하기 위해 돌연변이율을 희석하여 키트의 민감도를 직선성으로 수행한 결과이다.(A: MMX 1, B: MMX 2).
도 3은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트의 분석적 민감도를 측정하기 위해 돌연변이율을 희석하여 키트의 민감도를 직선성으로 수행한 결과이다.(A: MMX 3, B: MMX 4).
도 4는 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트가 42종의 EGFR mutation site를 검출할 수 있는지 여부를 확인한 결과인 동시에 각 MMX에 포함되는 EGFR mutation site에만 검출함을 보인 결과이다(A: MMX 1, B: MMX 2).
도 5는 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트가 42종의 EGFR mutation site를 검출할 수 있는지 여부를 확인한 결과인 동시에 각 MMX에 포함되는 EGFR mutation site에만 검출함을 보인 결과이다(A: MMX 3, B: MMX 4).
도 6은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트를 이용하여 reference FFPE DNA에서 돌연변이를 검출한 결과이다(A: exon 19 E746-A750 del 검출, B: L858R 검출, C: T790M 검출, D: G719S 검출).
도 7은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트를 이용하여 임상환자 중 한명(환자 5, patient #5)의 cfDNA로부터 EGFR 변이를 검출한 결과를 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트를 이용하여 임상환자 9명의 cfDNA로부터 EGFR 변이를 검출한 결과 및 FFPE로부터 EGFR 변이를 검출한 결과를 정리하여 비교한 결과표이다(A: 결과 비교표, B: ddPCR 결과 데이터)
도 9는 임상검체인 FFPE 샘플을 이용하여 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트와 기허가 제품인 Cobas® EGFR kit(Roche Molecular Diagnostics)의 동등성을 ddPCR을 통해 평가한 결과이다(A: MMX1, B: MMX2).
도 10은 임상검체인 FFPE 샘플을 이용하여 본 발명의 프로브 및 프라이머를 포함하는 EGFR 변이 검출 키트와 기허가 제품인 Cobas® EGFR kit(Roche Molecular Diagnostics)의 동등성을 ddPCR을 통해 평가한 결과이다(A: MMX3, B: MMX4).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

혈장에서 cell free DNA (cfDNA)의 분리

혈장 cfDNA는 순환 핵산 제조 키트 (QIAGEN)를 제조사의 권고안에 따라 사용하여 분리하였다. 환자의 혈액을 3000rpm에서 10분동안 원심분리하여, 세포 파편을 조심하면서 혈장 1ml 를 15 ml 튜브로 이동시켰다. 이 샘플에, 용해 완충액 800 ㎕와 재구성한 프로테아제 K 100 ㎕를 혼합하였다. 짧게 볼텍싱한 후, 튜브를 60℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 결합 완충액 1.8ml을 샘플에 혼합한 다음, 짧게 볼텍싱 한 후, 얼음에 5분간 반응시킨다. 순환 핵산 키트에 구비된 진공 연결관을 진공 펌프에 장착 시킨 후, 컬럼과 통과 분획 튜브를 진공 연결관의 상부에 결합시켰다. 통과 분획 튜브에 샘플을 집어 넣고, 진공펌프를 가동시켜 컬럼 안의 샘플을 통과시켰다. 컬럼을 씻어주기 위하여 세척 용액 700㎕를 통과 분획 튜브에 넣고, 다시 진공펌프를 가동시켜 컬럼을 세척하였다. 통과 분획 튜브와 진공 연결관은 버리고, 필터를 새로운 콜렉션 튜브에 결합시켰다. 컬럼 안의 세척용액을 완전히 제거 하기 위하여 14000rpm으로 3분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 컬럼을 새로운 콜렉션 튜브에 결합시키고 56℃에서 10분간 컬럼을 건조시켰다. 컬럼을 새로운 1.5ml 마이크로 튜브로 옮기고, 컬럼의 중앙에 용출완충액 50㎕를 넣고, 실온에서 1분간 인큐베이션 시켰다. 그 이후 14000rpm으로 실온에서 1분간 원심분리 하여 DNA샘플을 용출 시켰다. 사용하기 전까지 4℃에 저장하거나 또는 장기간 보관하는 경우에는 -70℃에서 동결시켰다.

<실시예 2>

표준 물질 벡터의 제작

디자인된 프라이머와 프로브를 검증하기 위해, 그리고 ddPCR 수행에 필요한 표준물질을 만들기 위해 표준 물질 벡터 (mini-clone으로 명명)를 제작하였다. mini-clone의 제작과정은 먼저 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간, 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp을 합성하였다. 합성된 DNA 단편은 pIDTSmart Amp 벡터의 universal link sequence 사이에 삽입하고, 제작된 clone은 대장균 DH5α 세포에 형질전환 (transformation) 시켰다.

circular form 또는 super-coiled form으로 존재하는 표준물질 벡터를 선형화시켜 ddPCR (droplet digital PCR) 시 효율을 극대화시키기 위하여 표준물질 벡터에 제한효소를 처리하였다. 표준물질 벡터 (Miniclone DNA) ClaI 제한효소를 37도씨에서 30분간 반응 후, 반응산물을 정량 후 -20도씨에서 사용 전까지 보관하였다.

본 발명에서의 검출 대상의 PCR 증폭 후의 수준은 대상 시료에 따라 전체적으로 차이가 있을 수 있으므로 돌연변이에 특이적인 프라이머/프로브에 의한 증폭여부의 판별을 위한 기준이 필요하다. 표준 물질 벡터는 이를 위한 것으로 게놈 DNA 유전자 변이를 포괄하는 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드가 통상의 벡터에 형질전환된 것을 이용할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 표준 물질 벡터는 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간, 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp을 합성하여 pIDTSmart Amp 벡터에 삽입하여 사용할 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 표준 물질 벡터는 EGFR의 각각 exon에서 돌연변이가 일어난 구간, 즉 probe 위치를 가운데로 하여 약 300bp의 DNA 단편을 포함하는 벡터일 수 있으며, 이는 대장균 등의 숙주세포에 형질전환하여 증폭, 추출 후 사용될 수 있다. 더 바람직하게는 본 발명의 표준 물질 벡터는 엑손 18의 경우, EGFR 유전자 (genbank accession no. NG_007726) 의 159701에서 160100번째 염기에서 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드, 엑손 19의 경우, EGFR 유전자의 160501에서 160900번째 염기에서 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드, 엑손 20의 경우, EGFR 유전자의 167101에서 167500번째 염기에서 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드, 엑손 21의 경우, EGFR 유전자의 177551에서 177930번째 염기에서 100 내지 350 bp의 폴리뉴클레오티드 DNA 단편을 pIDTSmart Amp 벡터에 삽입한 것일 수 있다.

<실시예 3>

프라이머/프로브 디자인 및 선발

폐암 관련 유전자인 EGFR의 바이오 마커를 개발하기 위해 cosmic번호 (http://cancer.sanger.ac.uk)를 기반으로 하여 돌연변이 위치를 확인하였다. 유전자의 exon별 프라이머를 primer3 프로그램을 사용하여 EGFR-21을 제외한 나머지는 forward가 intron부분과 overlapping될 수 있도록 디자인하였다. 이 때, 프라이머의 Tm값은 58~60℃로 하였으며 GC%는 40~60%로 디자인하였다.

프로브는 조건을 충족하는 것들을 선별하여 taqman probe로 디자인하였다. 5‘ wild type 프로로브에는 HEX/FAM reporter fluorescence를 부착하였으며, 5’ mutant probe에는 FAM dye를 부착하여 이후에 증폭 여부를 검출가능하도록 하였다. 모든 프로브의 3' 쪽에는 quencher로 BHQ1를 사용하였다. EGFR exon 18, 19, 20, 21번에 각각 3, 12, 6, 3개의 프로브들을 디자인하여 합성하였다. 본 발명자들에 의해 디자인된 프로브는 allele specific을 갖고 있으며 대부분의 프로브들이 cosmic 번호를 가지고 있었다.

한편, background(noise)를 줄이기 위해 돌연변이 위치에 상응하는 야생형 시퀀스를 이용하여 돌연변이 검출용 프로브가 야생형 시퀀스에 non-specific하게 결합하지 못하도록 blocker oligomer를 제작하였다.

디자인된 프라이머(표 1)와 프로브(표 2), blocker oligomer(표 3)의 정보는 다음과 같다.

<실시예 4>

프라이머 및 프로브의 돌연변이 검출능

ddPCR 장비로 QX200™ Droplet digital PCR system (Bio-RAD, USA)을 이용하였다. 샘플 준비로는 MMX1, MMX2, MMX3, MMX4 mixture가 있는 8-strip PCR tube에 20 ul씩 분주하였고 각 tube에 Ultrapure Water (NTC), Positive control (PC), 환자 검체로부터 추출한 template DNA 를 1ul씩 넣었다. 상기 MMX1, MMX2, MMX3 및 MMX4 mixture에 대한 정보는 하기 표 4에 기재하였다. 또한, 각 MMX에 포함된 프라이머 및 프로브에 대한 구체적인 정보를 하기 표 5 및 표 6에 나타내었다.

8-Strip PCR tube cap을 닫고 Vortexing 한 후 Spin down 하였고 실온에서 10분간 Incubation 하였다. 준비된 샘플은 Droplets Generation 단계로 8-Channel Electronic Pipette을 이용하여 8-Strip PCR Tube 에서 20ul를 취하여 Cartridge의 sample well에 Loading하였다. Droplet generation Oil을 70ul씩 Cartridge의 Oil loading well에 Loading 한 후 Droplet Generator Gasket의 위아래를 구분하여 장착하고 QX200™ Droplet Generator넣어 작동시켰다. Droplet generation 과정에서 만들어진 Droplet을 8-Channel multi-pipet을 이용하여 40ul를 96 well plate로 옮겨 준 후 Pierceable Foil Heat Seal (BIO-RAD, 181-4040)의 붉은색 선이 아래로 가도록 plate위에 덮고 PX1™ PCR Plate Sealer (180℃, 5초 sealing)에 넣고 Sealing 하였다. PCR reaction Veriti 96-Well Thermal Cycler를 이용하였고 PCR 반응이 끝난 후 반응된 증폭된 PCR산물을 FAM과 HEX로 구분하여 Reading 하게 하였다. 결과산물은 Bio-RAD 가 제공하는 QuantaSoft® sofware으로 수행하였다.

한편, 상기 표 4에 기재한 MMX 1 내지 4가 각각 검출할 수 있는 EGFR mutation site를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 EGFR 변이 검출 키트(이하 “EGFR IVD 키트”라 함)는 상기 MMX 1 내지 4을 모두 포함하고 있으며, 각각의 구성들은 EGFR 42개의 mutation site를 검출할 수 있음을 보여주고 있다. 이들은 또한 FAM과 HEX로 mutation을 구분할 수 있다. 예를 들어, 도 1의 MMX1에서 19 del 은 FAM으로 sample의 quality를 측정하기 위해 wild type HEX probe를 이용하였다. 따라서 각각 FAM과 HEX로 mutation의 종류를 구분하였다.

또한 기존 논문에 발표된 자료를 근거로 하여 EGFR tyrosine kinase inhibitor 약재들(엘로티닙, 제피티닙, 아파티닙)의 약효 발현과 관련된 mutation site를 표시하였으며 붉은색은 약에 대해 저항성을 보이는 EGFR 변이를 나타낸 것이며 노란색은 약에 효과를 보이는 EGFR 변이를 나타내고 있다.

<4-2> EGFR 돌연변이 검출능

상기 표 4에 기재된 EGFR IVD 키트의 성능을 검증하기 위해 negative control (NC)인 Non template control (NTC), positive control (PC)로 Human genomic DNA (Promega corp, USA)을 사용하였고 실험 샘플로는 표준물질인 40개의 miniclone을 사용하였다. 표준물질 40개를 사용한 이유는 EGFR kit가 42개의 mutation site를 검출할 수 있지만 이 중 3개의 사이트는 동일한 sequencing을 포함하고 있기 때문이다.

상기 EGFR 변이 검출 키트 민감도를 특정하기 위해 각각의 miniclone들은 PC로 사용된 gDNA와 spiking하여 1, 0.5, 0.1 및 0.02%가 되게 희석하였다.

이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, MMX 1 내지 4가 혼합된 PCR mixture를 사용하여 민감도를 측정한 결과, 24개의 mutation site에서는 0.02% 까지의 높은 민감도를 보였으며, 나머지 16개의 mutation site는 0.1%에서 검출이 되었다.

즉, 상기 EGFR IVD 키트의 최소 검출농도가 0.1 내지 0.02%임을 알 수 있었다.

<실시예 5>

EGFR IVD 키트의 돌연변이 검출 시험

본 발명의 EGFR IVD 키트가 EGFR 엑손 18 내지 21의 42개 mutation site를 검출할 수 있는지 알아보기 위해 40개의 표준물질을 이용하였으며 또한 cancer의 특징 중의 하나인 heterozygote을 감안하여 miniclone을 wildtype인 gDNA와 50%로 spiking 하여 샘플을 준비하였다. 본 시험에 사용된 DNA양은 12 ng/sample 이며 모든 40개의 샘플들은 MMX1 내지 4와 각각 반응시켜 ddPCR을 수행하였다.

이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, MMX 1 내지 4가 각각 검출할 수 있는 EGFR 변이들만 검출되었으며, 프로브를 포함한 mixturer간의 교차반응은 보이지 않았다. 도 3에서, NTC와 gDNA를 기준으로 cut-off를 설정하여 그 위로 나온 푸른색이나 녹색 droplet들이 검출되면 변이가 검출된 것이며, 도 3에서 각각의 푸른색 또는 녹색 droplet이 의미하는 변이의 종류를 도 1에 기재한 clone number로 표시하였다.

<실시예 6>

EGFR IVD 키트를 이용한 reference FFPE DNA에서 돌연변이 검출

본 발명의 EGFR IVD 키트는 ddPCR에 적용이 가능하다. 한편, ddPCR의 장점은 qPCR과 달리 절대 정량이 가능하다는 것이다. 즉, 넣어준 DNA양을 genome equivalence (GE) 전환하여 DNA copy수를 계산할 수 있다. 따라서 정확한 mutation frequency를 갖고 있는 FFPET (Horizon, UK)를 사용하여 EGFR IVD kit의 성능을 증명하기 위해 ddPCR을 수행하였다.

Multi plex로 exon 19del, L858R, T790M 그리고 G719S를 포함하고 있는 Horizon reference FFPET를 사용하였고 기존에 있던 mutant frequency 뿐만 아니라 더 정확한 정량분석을 위해 각각 1/2로 희석하여 실험을 수행하였다.

이에 대한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 실험 결과가 예상했던 카피수와 거의 일치하여 ddPCR based EGFR IVD kit가 매우 정확도가 높음을 증명하였다. 즉, 도 6의 X축이 FFPE 샘플의 tumor 함량을 나타내며, 그래프의 Y축이 본 발명의 EGFR IVD 키트로 검출한 돌연변이의 카피수를 나타낸다. 1000GE backgroud는 1000 copy를 의미하므로 각각의 FFPE 샘플이 포함하는 tumor %와 거의 일치하는 카피수를 본 발명의 EGFR IVD 키트가 검출해내고 있다는 것을 알 수 있다.

상기한 결과를 통해, 카피수를 정량적으로 알 수 있는 reference FFPE로 각 해당하는 mutation frequency에 따라 EGFR IVD 키트는 반 정량적(semi-quantitation)으로 EGFR 돌연변이 분석이 가능한 키트라는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 7>

cfDNA 또는 FFPE 샘플을 이용한 결과 비교

혈액에서 cfDNA를 분리하여 ddPCR로 분석한 것과 같은 환자에서 얻은 FFPE 샘플을 이용하여 PNA 기법과 sanger sequencing 방법으로 수행 했을시 결과를 비교하였다. 즉, 상기 EGFR IVD 키트의 성능실험 중 Plasma에서 추출한 cfDNA를 검출할 수 있는지를 보기 위해 IRB로 협약된 지역병원에서 전이 (4기) 또는 재발 (병기없음)인 환자로부터 혈액을 채취하였다. 이미 병원에서는 이 환자들의 조직(FFPE)을 이용하여 PNA 또는 sequencing으로 검사하였으나 정확한 검사결과를 비교하기 위해 blind test로 진행하였다.

채취한 혈액은 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 1ml 정도의 plasma에서 QIAamp Circulating Nucleic acid kit를 이용하여 cfDNA를 분리하였다. 분리된 cfDNA는 평균 0.7ng/ul의 농도이며 본 발명에 따른 EGFR IVD 키트로 검출하기 위해 이중 3ul를 사용하였다. 이는 본 발명에 따른 EGFR IVD 키트는 약 2ng의 샘플량에서도 EGFR 변이 검출이 가능하다는 것을 보여주고 있다.

이에 대한 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 9명의 임상환자 샘플을 EGFR IVD 키트로 테스트해본 결과 cfDNA에서 검출된 EGFR 변이는 FFPE sample에서 검출된 EGFR 변이 결과와 일치하였다. 즉, 본 발명에 따른 EGFR IVD 키트는 FFPE sample에서 뿐만 아니라 환자의 혈액에서 분리한 cfDNA에서도 EGFR 돌연변이의 검출이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

뿐만 아니라, 기허가 받은 기존의 EGFR kit들은 한 반응 당 약 25~50 ng을 요구하지만 본 발명의 EGFR IVD 키트는 일반적으로 3 ng 또는 적게는 1.5 ng의 샘플에서도 EGFR 변이를 검출 할 수 있으므로 cfDNA에서 EGFR 변이를 검출하기에 적합한 키트임을 알 수 있다.

<실시예 8>

기허가 받은 제품과의 동등성 평가

IRB가 협약된 병원으로부터 임상샘플을 얻어 EGFR IVD kit의 성능을 증명하기 위해 기허가 받은 제품인 Cobas® EGFR kit(Roche Molecular Diagnostics)과 동등성 평가를 위해 ddPCR을 수행하였다.

이에 대한 결과를 도 9 및 하기 표 7에 나타내었다.

도 9와 관련하여, X축은 샘플로 NTC, gDNA, PC 및 환자 샘플들이며 gDNA (negative control)를 기준으로 cut-off를 하면 그 이상으로 보이는 형광은 positive로 검출된 것으로 간주할 수 있다.

MMX1에서 초록색 표시는 샘플의 quality를 측정하는 것으로 PCR 반응 유뮤를 판단하며, MMX1에서 FAM 표시가 나는 샘플들은 exon 19del mutant를 나타내고 MMX2의 HEX는 T790M이 검출된 환자를 의미한다.

도 9 및 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, Cobas® EGFR kit로 검출하였을 때 exon 19 del 변이로 검출된 환자샘플을 이용하였으며, EGFR IVD 키트로 실험을 수행한 결과 모든 샘플에서 Cobas® EGFR kit로 검출 결과와 동일하게 exon 19 del mutation으로 검출되는 것을 확인하여, EGFR IVD 키트의 정확도가 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 프라이머/프로브 세트는 암 환자 예후의 치료제에 대한 반응성 예측, 진단뿐만 아니라 암의 전이 또는 재발에 대한 예측이 가능하므로 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 목적으로 유용하게 사용할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

<110> Gencurix Inc. 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ccctccagat gcgaagcc 18 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C36-R1) <400> 8 cagccgatgc aaggg 15 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C36-F18) <400> 9 atctgcctca catgcctc 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C36-R16) <400> 10 tttgtgttcc atgccata 18 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C36-F17) <400> 11 ccacactaat tgacgtgcc 19 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C36-R14) <400> 12 ggtggaaatt ggtgaggc 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C44-F1) <400> 13 acaccgcagc aattatgtca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer(C44-R1) <400> 14 tgcctcatgc cttctgcatg 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP2-2) <400> 15 tcaaagtgct aatttccggt gc 22 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP3-3) <400> 16 aaaagatcaa agtatgcagc tccg 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP4-3) <400> 17 aaaagatcaa agtgctgaat tccg 24 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP22-1) <400> 18 catgcctatc aaggaatcga aagcca 26 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP31-1) <400> 19 ccgtcatgct caagtatctc cgaaagcca 29 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP33-1) <400> 20 ccgtcgctaa tgcaattccg aaagccaaca 30 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP20) <400> 21 cgctatcaag gaaatgcaag ccaaca 26 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP26) <400> 22 ttccaattgc tatcaaggtt gctt 24 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP28) <400> 23 tcccgtcatg ctcgcaacat ctccga 26 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP15-) <400> 24 ttcccgtcgc 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Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP40-2) <400> 33 tggacaaccc atgccacgtg t 21 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP41) <400> 34 cgtggacggt aacatggacg tgt 23 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP42-2) <400> 35 caattgtgga cagcgtgg 18 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP45) <400> 36 cacaatgctt gggcgggcca a 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP46) <400> 37 ccaaacagat gctgcggaag a 21 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP47) <400> 38 gattttggat gcgccaaact gctg 24 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP47-3) <400> 39 ttttgggcgt gccccaaact g 21 <210> 40 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP29) <400> 40 agagaagcaa cccactcgat gtgagttt 28 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(EP46-3) <400> 41 tggccaacca cagctgggtg 20 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(E-ex19-B1) <400> 42 cgtcgctatc aaccggaatt aagagaagca 30 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(E-ex21-B1) <400> 43 gattttgggc tgccgccaaa ct 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe(E-ex18-B1) <400> 44 aagtgctggg ccctccggtg 20

Claims (18)

1. i) 서열번호 9의 정방향 프라이머, ii) 서열번호 10의 역방향 프라이머, iii) 서열번호 13의 정방향 프라이머, iv) 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 v) 서열번호 31, 36 및 39 로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하며, 혈액에서 분리된 무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA)를 주형으로 하고, qPCR (quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법에 사용하는 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 EGFR 유전자 돌연변이 검출은 EGFR 저해제에 대한 치료 반응성 (responsiveness) 예측을 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 EGFR 저해제는 엘로티닙 (erlotinib), 제피티닙 (gefitinib) 및 아파티닙 (Afatinib)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 형광물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 형광물질은 HEX(hexachlorofluorescein), FAM(fluorescein amidite), EverGreen dye로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
   
6. 제1항의 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 RUO (research use only) 키트.
   
7. 제1항의 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 IVD (investigation use only) 키트.
   
8. 서열번호 9의 정방향 프라이머, 서열번호 10의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 31, 36 및 39로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하며, 혈액에서 분리된 무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA)를 주형으로 하고, qPCR (quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법에 사용하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 키트.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 43의 블로커 올리고머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 3의 정방향 프라이머, 서열번호 4의 역방향 프라이머, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 18 내지 21, 23 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트;
    서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머, 서열번호 5의 정방향 프라이머, 서열번호 6의 역방향 프라이머 및 서열번호 15 내지 17 및 40으로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트; 및
    서열번호 11의 정방향 프라이머, 서열번호 12의 역방향 프라이머, 서열번호 13의 정방향 프라이머, 서열번호 14의 역방향 프라이머 및 서열번호 32 내지 35 및 41로 이루어진 군에서 선택된 프로브의 폴리뉴클레오티드 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 세트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 EGFR (epidermal growth factor receptor) 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
    
11. 제10항의 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 RUO (research use only) 키트.
    
12. 제10항의 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 EGFR 유전자 돌연변이 검출용 IVD (investigation use only) 키트.
    
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