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KR101756935B1 - 이중 가교를 갖는 하이드로젤 지지체, 그의 용도 및 이단계 가교를 사용하여 그를 제조하는 하는 방법 - Google Patents

이중 가교를 갖는 하이드로젤 지지체, 그의 용도 및 이단계 가교를 사용하여 그를 제조하는 하는 방법 Download PDF

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KR101756935B1
KR101756935B1 KR1020150188915A KR20150188915A KR101756935B1 KR 101756935 B1 KR101756935 B1 KR 101756935B1 KR 1020150188915 A KR1020150188915 A KR 1020150188915A KR 20150188915 A KR20150188915 A KR 20150188915A KR 101756935 B1 KR101756935 B1 KR 101756935B1
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Abstract

이중 가교를 갖는 하이드로젤 지지체, 그의 용도 및 이단계 가교를 사용하여 그를 제조하는 하는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 지지체는 화학적 가교제를 사용하지 않고 지지체의 물리적 물성을 강화시켜, 지지체가 통상적인 세포 배양 온도에서도 3차원 구조의 형태를 유지함으로써 조직 재생을 위한 지지체, 또는 바이오잉크로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

이중 가교를 갖는 하이드로젤 지지체, 그의 용도 및 이단계 가교를 사용하여 그를 제조하는 하는 방법{Hydrogel scaffold having double crosslinking, uses thereof and method for producing the same using two-step crosslinking}
이중 가교를 갖는 하이드로젤 지지체, 그의 용도 및 이단계 가교를 사용하여 그를 제조하는 하는 방법에 관한 것이다.
하이드로젤은 친수성이 우수하여 물을 쉽게 흡수 할 수 있을 뿐아니라 강도, 모양 등을 쉽게 바꿀 수 있어 조직공학용 지지체 또는 약물전달 등에 사용되고 있다. 하이드로젤은 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 또는 수성환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤하지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는 성질을 가지고 있다. 따라서 구성성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로젤이 만들어질 수 있으며 일반적으로 다량의 수분을 함유하고 있으므로 액체와 고체의 중간성질을 갖는 것이 특징이다.
알지네이트는 조직공학 등에서 상당히 오랜 기간 동안 널리 쓰이고 있는 하이드로젤 생체재료이다. 그러나 알지네이트는 생체적합하기는 하나 RGD 펩타이드 등으로 화학적 수정을 하지 않으면 생물학적으로 불활성(bioinert)하다는 단점이 있다. 따라서, 세포들이 젤 내에서 리모델링이 가능한 생체재료를 이용하여 3D 배양 플랫폼을 만드는 기술 개발이 한창 이루어지고 있는데 가장 대표적으로 쓰이는 물질이 우리 몸을 구성하는 세포외 기질(ECM) 중 하나인 콜라젠이다
젤라틴은 동물의 뼈, 연골, 가죽 등 결합조직의 주요 단백질 성분인 콜라겐의 부분적인 가수분해에 의해 얻어지는 단백질로써 생체 적합성이 높고 무독성의 생분해성 특성을 가지고 있어 음식, 제약, 포토그래픽, 화장품 사업 등에 광범위하게 사용되고고 있다. 젤라틴은 비교적 낮은 온도와 농도에서도 점성을 부여하며, 젤라틴 용액은 냉각될 때 선명하고 탄력성 있는 열가역적 겔을 형성하지만, 수용액에서 쉽게 녹아버리기 때문에 그 안정성을 높여주기 위하여 포름알데히드, 또는 글루타알데히드 글루타알데히드와 같은 화학물질과의 가교 방법이 이용되고 있다. 그러나 이들 가교제 성분이 내부에 미량이라도 잔류할 경우 이로 인해 세포독성을 나타낼 뿐만 아니라 체내 이식 후 이들로 인한 주변 장기에 대해 독성을 나타낼 수 있다. 따라서 가교제의 사용을 최소화하거나 가교제를 사용하지 않고 지지체의 기계적 물성을 증가시키기 위한 연구가 요구되고 있다.
일 양상은 알지네이트 및 젤라틴을 포함하고, 상기 알지네이트 및 젤라틴은 각각 가교된 것인 하이드로젤 지지체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 하이드로젤 지지체를 포함하는 바이오프린팅을 위한 바이오잉크 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 젤라틴 및 알지네이트를 혼합하여 젤라틴-알지네이트 용액을 형성하는 단계; 및 상기 젤라틴-알지네이트 용액에 이단계 가교를 수행하여 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 하이드로젤 지지체를 형성하는 단계로서, 젤라틴을 가교하는 단계 및, 알지네이트를 가교하는 단계를 포함하는 것인 단계를 포함하는 하이드로젤 지지체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 알지네이트 및 젤라틴을 포함하고, 상기 알지네이트 및 젤라틴은 각각 가교된 것인 하이드로젤 지지체를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "하이드로젤(hydrogel)"은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어져 만들어진 3차원 망상구조물을 의미할 수 있다. 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 및 수성환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤하지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는 성질을 가지고 있다. 따라서 구성성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로겔이 만들어질 수 있으며 일반적으로 다량의 수분을 함유하고 있으므로 액체와 고체의 중간성질을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "알지네이트(Alginate)"는 그의 일반적 의미로 사용되고, 알긴(algin), 알긴산의 염, 및 알긴산의 유도체 및 알긴산 자체를 포함한다. 상기 알지네이트는 칼슘, 소듐, 포타슘, 암모늄 또는 마그네슘 알지네이트를 포함할 수 있다. 일부 구체예에 있어서 알지네이트는 알긴산의 칼슘, 마그네슘, 및 나트륨염으로 갈조류의 세포벽으로부터 수득할 수 있다. 알지네이트의 일부 상업적인 종류는 해초류로부터 추출될 수 있다. 소듐 알지네이트는 갈조류로부터 추출된 천연 다가음이온성 공중합체(polyanionic copolymer)이고, 글루론산(guluronic acid) 및 만누론산(mannuronic acid) 구성 요소를 포함할 수 있다. 일부 구체예에 있어서, 칼슘, 소듐, 포타슘, 암모늄 및 마그네슘 알지네이트는 수용성이다. 염화 칼슘은 안정하고 일부 경우에 있어서 칼슘 알지네이트로 명명된 수 중 불용성 물질을 형성하기 위하여 소듐 알지네이트를 가교하는데 사용될 수 있다. 알지네이트는 글루로네이트(guluronate) (G) 및 만누로네이트(mannuronate) (M) 단량체의 공중합체일 수 있다. G 및 M 단위는 일반적으로 GG, MM, 및 MG/GM 블록으로 서로 연결된다. 이들 블록의 비율, 분산, 및 길이는 알지네이트 분자의 화학적 및 물리적 특성을 결정할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "젤라틴(gelatin)"은 동물의 뼈, 연골, 가죽 등 결합조직의 주요 단백질 성분인 콜라겐의 부분적인 가수분해에 의해 얻어지는 단백질을 의미할 수 있다. 상기 젤라틴은, 순수 젤라틴 외에, 젤라틴 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 젤라틴 유도체는 프탈화 젤라틴, 에스터화 젤라틴, 아미드화 젤라틴, 또는 포르밀화 젤라틴 중에서 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 젤라틴과 관련하여, 그의 종류 (원천)은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 포유류, 어류, 예를 들면, 소 뼈, 소 피부, 돼지 뼈, 돼지 피부 등으로부터 유래된 다양한 젤라틴을 사용할 수 있다. 또한, 상기 젤라틴은 분자량이 10,000 내지 30,000인 것일 수 있다.
상기 하이드로젤 지지체는 이중 가교를 갖는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 이중 가교는 상기 알지네이트 및 젤라틴이 각각 가교된 것을 의미할 수 있으며, 이는 알지네이트와 젤라틴 사이의 가교와는 구분된다. 예를 들면, 상기 가교된 젤라틴에 의해 알지네이트가 고정되고, 상기 가교된 알지네이트에 의해 젤라틴이 고정되어 있는 것일 수 있다. 또한, 특정 이론에 제한됨이 없이, 상기 알지네이트 및 젤라틴 각각의 가교인 이중 가교에 의해 세포 배양 또는 세포 분화 온도에서 겔화의 상태를 유지할 수 있다. 통상적인 세포 배양 온도 또는 세포를 다른 세포로 분화시키는 온도인 세포 분화 온도에서 젤라틴은 졸화되어 지지체로부터 빠져나올 수 있다. 따라서, 통상적인 젤라틴은 지지체로서 사용하기 위해 안정성을 높여주기 위한 독성의 화학물질을 사용해야 한다. 그러나, 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체는 이단계 가교에 의한 상기한 이중 가교에 의해 화학적 물질이 없이도 젤라틴이 세포 배양 또는 세포 분화 온도에서 녹아서 지지체로부터 실질적으로 빠져나오지 않을 수 있다. 상기 젤라틴이 지지체로부터 실질적으로 빠져나오지 않는다는 것은 세포의 배양 또는 세포의 분화시에 세포를 3차원적으로 배양할 수 있을 정도로 지지체가 3차 구조의 형태를 가지는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 상기 가교는 화학적 가교제 의한 것이 아닌 물리적 가교인 것일 수 있다. 또한, 일구체예에 따른 하이드로젤 지지체는 화학적 가교제를 사용하지 않고도, 이단계 가교에 의해 물리적 물성이 강화된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 하이드로젤 지지체는 세포, 성장인자, 또는 분화인자가 더 포함되어 있는 것일 수 있다. 상기 세포는 지지체 내에서 배양하고자 하는 세포, 조직, 또는 다른 세포로 분화시키고자 하는 세포, 또는 조직 재생에 사용하고자 하는 세포를 포함할 수 있다. 상기 세포의 예는 줄기세포, 감각세포, 뇌세포, 생식세포, 상피세포, 면역세포, 암세포 또는 그들의 조합일 수 있다. 상기 줄기세포는 분화능을 갖는 세포를 의미할 수 있으며, 상기 분화능을 갖는 세포는 예를 들면, 아세포, 간세포, 섬유아세포, 근육아세포, 성체줄기세포, 중간엽줄기세포, 지방유래 중간엽줄기세포, 골수유래 중간엽줄기세포, 신경유래 중간엽줄기세포, 태반유래 중간엽줄기세포, 또는 제대혈줄기세포 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 상기 성장인자는 세포의 성장과 기능을 조절할 수 있는 물질을 의미할 수 있다. 상기 분화인자는 세포의 조직으로의 분화, 또는 다른 세포로의 분화를 유도하는 물질을 의미할 수 있다. 예를 들면, 상기 성장인자 또는 분화인자는 형질전환성장인자(TGF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF), 인슐린 유사 성장인자 (IGF), 사이토카인, 캐모카인 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 하이드로젤 지지체는 상기 하이드로젤 지지체 전체에 대하여 0.1 내지 20 중량%, 0.5 내지 20 중량%, 0.5 내지 15 중량%, 0.5 내지 10 중량%, 또는 1 내지 10 중량%의 알지네이트, 0.1 내지 20 중량%, 0.5 내지 20 중량%, 0.5 내지 15 중량%, 0.5 내지 10 중량%, 또는 수분을 포함하는 것일 수 있다. 상기 수분은 60 내지 99 중량%의 수분을 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 하이드로젤 지지체는 생체조직 재생을 위한 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 하이드로젤 지지체는 조직 공학용일 수 있다. 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체는 생체 친화성을 가지고, 지지체 내에서 세포의 조직 재생을 유도할 수 있어, 생체조직 재생, 예를 들면 조직 공학에 유용하게 사용될 수 있다.
다른 양상은 알지네이트 및 젤라틴을 포함하고, 상기 알지네이트 및 젤라틴은 각각 가교된 것인 하이드로젤 지지체를 포함하는 바이오프린팅을 위한 바이오잉크 조성물을 제공한다.
상기 하이드로젤 지지체에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 바이오프린팅은 살아있는 세포를 원하는 형상 또는 패턴으로 적층하여 조직이나 장기를 제작하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 바이오잉크는 상기 바이오프린팅에 사용하기 위한 잉크재료를 의미할 수 있다.
일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체는 상기 지지체 내에 세포를 배양 또는 분화시켜 원하는 조직으로 만들 수 있으면서, 원하는 모양으로 프린팅이 가능하고 모양의 유지가 가능하므로, 바이오프린팅을 위한 바이오잉크 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
또 다른 양상은 이단계 가교를 사용하여 하이드로젤 지지체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 젤라틴 및 알지네이트를 혼합하여 젤라틴-알지네이트 용액을 형성하는 단계; 및 상기 젤라틴-알지네이트 용액에 이단계 가교를 수행하여 알지네이트 및 젤라틴을 포함하는 하이드로젤 지지체를 형성하는 단계로서, 젤라틴을 가교하는 단계 및, 알지네이트를 가교하는 단계를 포함하는 것인 단계를 포함할 수 있다.
상기 하이드로젤 지지체에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 방법은 상기 젤라틴-알지네이트 용액에 세포 또는 성장인자를 혼합하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 다음으로, 상기 세포 또는 성장인자가 혼합된 젤라틴-알지네이트 용액에 이단계 가교를 수행할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "이단계 가교(two step crosslinking)"는 용액 중 포함된 두 개 이상의 물질, 예를 들면, 젤라틴 및 알지네이트를 각각 가교하는 것을 의미할 수 있다. 상기와 같이 이단계 가교를 수행함으로써 가교된 젤라틴에 의해 알지네이트가 고정되고, 가교된 알지네이트에 의해 젤라틴이 고정될 수 있다. 상기 가교는 젤라틴을 먼저 가교하고, 알지네이트를 가교하는 단계, 또는 알지네이트를 먼저 가교하고, 젤라틴을 가교하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체는 상기 알지네이트 및 젤라틴 각각의 이단계 가교에 의해 세포 배양 또는 세포 분화 온도에서 겔화의 상태를 유지하는 것일 수 있다.
상기 젤라틴을 가교하는 단계는 화학적 가교제에 의한 것이 아닌 물리적 가교에 의한 것일 수 있다. 예를 들면, 2 내지 10 ℃, 3 내지 8 ℃, 3 내지 5 ℃, 또는 4 ℃의 온도에서 겔화를 수행하는 것일 수 있다. 상기 겔화는 5분 내지 5시간, 10분 내지 3시간, 20분 내지 1시간, 또는 30분 동안 수행될 수 있다.
상기 알지네이트를 가교하는 단계는 이온 가교, 공유 가교, 광 가교, 또는 세포 가교에 의한 것일 수 있다. 알지네이트의 이온 가교에 대해서는 상기한 바와 같으며, 예를 들면, 알긴산 수용액과 2가 양이온, 예를 들면, 염화칼슘 수용액을 혼합하는 것을 포함할 수 있다. 공유 가교, 광 가교, 또는 세포 가교는 통상의 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 방법은 상기 세포가 포함된 하이드로젤 지지체를 배양 배지 중 배양하거나, 또는 분화 유도 배지 중 분화시키는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 배양 또는 분화는 통상의 당업자가 의도하고자 하는 목적에 맞게 적절한 배지, 배양 시간, 또는 온도를 선택함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 골 조직 재생을 위해, 골수 유래 중간엽 줄기세포를 상기 지지체 내에서 골분화용 배지 중 배양함으로써 골 조직 재생을 수행할 수 있다.
일 구체예에 따른 방법은 이단계 가교를 사용함으로써, 화학적 가교제에 의하지 않고도, 물리적 물성이 향상된 하이드로젤 지지체를 제조할 수 있고, 그를 사용하여 다양한 세포의 조직 재생을 수행할 수 있다.
일 양상에 따른 하이드로젤 지지체 및 그를 제조하는 방법에 의하면, 화학적 가교제를 사용하지 않고 지지체의 물리적 물성을 강화시켜, 지지체가 통상적인 세포 배양 온도에서도 3차원 구조의 형태를 유지함으로써 조직 재생을 위한 지지체, 및 바이오잉크로서 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 배양된 근육아세포를 염색한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 배양된 근육아세포를 개수한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 배양된 근육아세포를 관찰한 현미경 사진이다.
도 4는 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 배양된 인간 중간엽줄기세포를 관찰한 현미경 사진이다.
도 5는 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 근육 조직으로 분화시킨 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 인간 중간엽줄기세포를 골조직으로 분화시킨 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 인간 중간엽줄기세포를 골 조직으로 분화시켜 ALP 어세이를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체의 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크로서의 사용을 나타낸 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 . 하이드로젤 지지체의 제조 및 그의 활성 분석
1. 하이드로젤의 제조
하이드로젤을 제조하기 위하여 이단계 가교(two-step crosslinking)를 수행하였다.
구체적으로, 젤라틴(porcine skin type A, Sigma, USA) 3g을 DPBS(Dubecco's Phosphate-Buffered Saline)(웰진, 한국) 100 ml에 넣고 자력가열교반기에서 60 ℃로 유지하면서 완전히 용해시켜 젤라틴 용액을 제조하였다. 이후에, 알지네이트 분말(Sigma, USA) 2g을 상기 제조한 젤라틴 용액에 첨가하여 1시간 동안 자력가열교반기를 사용하여 완전히 용해시켜, 알지네이트-젤라틴 혼합 용액을 제조하였다. 상기 혼합 용액을 0.2 ㎛의 시린지 필터로 여과한 후 배지병(media bottle)에 보관하여 사용하였다. 다음으로는 이단계 가교를 수행하였다. 이단계 가교는 1차적으로 젤라틴을 가교하기 위해 상기 혼합 용액을 4 ℃에서 30분간 겔화시켰고, 2차적으로 알지네이트를 가교하기 위해 300 mM CaCl2 용액과 혼합하여 4 ℃에서 30분간 반응시켰다. 상기한 바와 같이 이단계 가교를 수행함으로써 알지네이트 및 젤라틴 혼합 하이드로젤을 제조하였다.
2. 하이드로젤의 생체친화성 분석
상기 제조한 하이드로젤의 생체 친화성을 근육아세포주 및 인간 중간엽줄기세포를 사용하여 확인하였다.
구체적으로, 4 X 106 cells/ml의 농도의 쥐의 근육아세포주 C2C12 세포(한국세포주은행) 및 37 ℃에서 가온된 상기 하이드로젤 용액 1 ml를 혼합하고, 3D 프린터를 사용하여 제작한 지름 1cm 높이 1mm 크기의 원형틀을 갖는 3차원 세포 배양 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 분주하였다. 이후에, 1차적으로 젤라틴을 가교하기 위해 상기 플레이트 내의 하이드로젤 용액을 4 ℃에서 30분간 겔화시켰다. 다음에 2차적으로 알지네이트를 가교하기 위해 300 mM CaCl2 용액을 각 웰에 첨가하여 30분간 반응시켰다. 이후에, 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 DMEM 배지를 각 웰에 첨가하여 37 ℃에서 배양하였다. 각 배양 시간별(1일, 2일, 3일 및 4일)로 배양된 상기 하이드로젤을 플레이트로부터 제거하여 100 mM 소듐 시트레이트 용액에 넣고 37 ℃에서 20분간 라이시스 시킨 후, 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 분리하였다. 이후에, 상기 분리된 세포를 트리판 블루로 염색하였고, 세포수를 세포계수기를 사용하여 개수하였고, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 또한, 배양 후 72시간 시점 세포가 배양된 하이드로젤 지지체를 광학 현미경(Nicon, Japan)을 사용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
또한, 인간 중간엽줄기세포(Lonza, USA)에 대해서도 상기한 바와 같이 하이드로젤의 생체친화성을 확인하였고, 배양 후 72시간 째에 세포가 배양된 하이드로젤 지지체를 광학 현미경을 사용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 1은 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 배양된 근육아세포를 염색한 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 배양된 근육아세포를 개수한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 배양된 근육아세포를 관찰한 현미경 사진이다.
도 4는 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 배양된 인간 중간엽줄기세포를 관찰한 현미경 사진이다.
도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 제조된 3차원의 하이드로젤 내에서 세포들이 증식하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 상기 하이드로젤 지지체가 생체친화성을 가짐을 알 수 있다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 세포들이 3차원 하이드로젤 내에서 잘 부착되어 있으며, 하이드로젤 내부에서 섬유(fiber)를 형성하여 서로 네트워크를 잘형성하고 있음을 알 수 있다.
상기의 결과로, 젤라틴 및 알지네이트 각각의 가교에 의해 배양시의 온도에서 젤라틴이 용해되어 3차원의 하이드로젤로부터 빠져나오지 않고, 지지체를 잘 형성하여 세포가 잘 배양될 수 있음을 알 수 있다.
3. 하이드로젤 지지체의 조직 재생 지지체로서의 활성 확인
상기 제조된 하이드로젤 지지체를 조직 재생 지지체로서 활용하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
(3.1) 근육 조직 재생
먼저, 4 X 106 cells/ml의 농도의 쥐의 근육아세포주 C2C12 세포(한국세포주은행) 및 37 ℃에서 가온된 상기 하이드로젤 용액 1 ml를 혼합하고, 3D 프린터를 사용하여 제작한 지름 1cm 높이 1mm 크기의 원형틀을 갖는 3차원 세포 배양 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 분주하였다. 이후에, 1차적으로 젤라틴을 가교하기 위해 상기 플레이트 내의 하이드로젤 용액을 4 ℃에서 30분간 겔화시켰다. 다음에 2차적으로 알지네이트를 가교하기 위해 300 mM CaCl2 용액을 각 웰에 첨가하여 30분간 반응시켰다. 이후에, 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 DMEM 배지를 각 웰에 첨가하여 37 ℃에서 3일 동안 배양하였다. 이후에, 근육아세포의 근육세포로의 분화를 유도하기 위해 2% 말 혈청이 첨가된 DMEM 배지로 바꾸어 10일간 배양하였고, 그 결과를 광학 현미경으로 관찰하여 도 5에 나타내었다.
도 5는 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 근육 조직으로 분화시킨 결과를 나타낸 사진이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 근육아세포를 일 구체예에 따른 하이드로젤에서 3차원적으로 배양시킴으로써, 근육 조직의 특성인 미오튜브(myotube)가 형성되었음을 알 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 근육 조직의 재생에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
(3.2)골 조직 재생
먼저, 4 X 106 cells/ml의 농도의 골수 유래의 인간 중간엽줄기세포(hMSCs, Lonza) 및 37 ℃에서 가온된 상기 하이드로젤 용액 1 ml를 혼합하고, 3D 프린터를 사용하여 제작한 지름 1cm 높이 1mm 크기의 원형틀을 갖는 3차원 세포 배양 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 분주하였다. 이후에, 1차적으로 젤라틴을 가교하기 위해 상기 플레이트 내의 하이드로젤 용액을 4 ℃에서 30분간 겔화시켰다. 다음에 2차적으로 알지네이트를 가교하기 위해 300 mM CaCl2 용액을 각 웰에 첨가하여 30분간 반응시켰다. 이후에, DPBS로 3번 세척하고, MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium, Lonza)에서 24시간 동안 배양하였다. 이후에, 골 조직으로의 분화를 유도하기 위해, MSCBGM에 아스코르브산 (Sigma, USA), 덱사메타손 (Sigma, USA), 베타 글리포스페이트 (Sigma, USA)가 첨가된 골분화용 배지로 바꾸어 14일간 배양하였다.
인간 중간엽줄기세포가 골조직으로 분화되면 골 결절(bone nodule)이 형성되고, 골분화 초기에 알칼린 포스파타아제(alkaline phosphatase: ALP)의 활성이 증가하고, 골분화 후기에 칼슘이 다량으로 형성되면서 골조직 형성이 완료되는 것으로 알려져 있다. 이에, 골조직 형성 여부를 확인하기 위해 배양 7일째에 ALP를 염색하기 위한 ALP 염색과 배양 14일째에 알리자린 레드 S(alizarin red S: ARS) 염색을 수행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
추가적으로, 상기 결과를 확인하기 위해 배양 3일째 및 배양 7일째에 ALP 어세이 키트(Sigma, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 ALP 어세이를 수행하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 BM은 Basal medium: 증식용 배지에서 배양한 결과를 나타내고, IM은 induction medium: 골분화유도 배지에서 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 인간 중간엽줄기세포를 골조직으로 분화시킨 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체에서 인간 중간엽줄기세포를 골 조직으로 분화시켜 ALP 어세이를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 분화 초기에 ALP 생성을 나타내는 보라색 염색 부분이 확인되었고, 분화 후기에 적색으로 염색된 칼슘을 확인할 수 있다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기와 동일하게 ALP의 활성이 증가되어 있음을 확인할 수 있다. 상기의 결과로, 하이드로젤 지지체에서 인간 중간엽줄기세포가 골 조직으로 분화되었음을 알 수 있다.
이상의 결과로, 일 구체예에 따른 하이드로젤은 세포의 조직 재생을 위한 바이오 잉크로서 활용가능함을 알 수 있다.
4. 하이드로젤 지지체의 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크로서의 활용 여부
하이드로젤 지지체가 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크로서 활용가능한지 확인하기 위해 손으로 직접 프린팅을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1.에서 제조한 하이드로겔을 주사기 22G 10mL에 넣어주었다. 이후에, 상기 하이드로겔이 들어있는 주사기를 페트리 디시에 일정한 모양을 만들면서 주입하여 보았다. 상기 결과를 사진을 찍어, 도 8에 나타내었다.
도 8은 일 구체예에 따른 하이드로젤 지지체의 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크로서의 사용을 나타낸 사진이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 수동으로 수행하였기 때문에 정교한 모양으로 프린팅이 수행되지는 않았지만, 용이하게 원하는 모양으로 프린팅이 가능하고 모양의 유지가 가능함을 확인할 수 있다. 상기의 결과로, 일 구체예에 따른 하이드로젤은 바이오 프린팅을 위한 바이오 잉크로서 사용가능함을 알 수 있다.

Claims (16)

  1. 하이드로젤 지지체 전체에 대하여 0.5 내지 20 중량%의 알지네이트, 0.5 내지 20 중량%의 젤라틴, 및 60 내지 99 중량%의 수분을 포함하고,
    상기 젤라틴의 가교제를 포함하지 않고,
    상기 알지네이트 및 젤라틴은 각각 가교된 것이며, 및
    상기 가교된 젤라틴에 의해 알지네이트가 고정되고, 상기 가교된 알지네이트에 의해 젤라틴이 고정되어 있는 것인 하이드로젤 지지체.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 알지네이트 및 젤라틴 각각의 가교인 이중 가교에 의해 세포 배양 또는 세포 분화 온도에서 겔화의 상태를 유지하는 것인 하이드로젤 지지체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 가교는 화학적 가교제 의한 것이 아닌 물리적 가교인 것인 하이드로젤 지지체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로젤 지지체에 세포, 성장인자 또는 분화인자가 더 포함되어 있는 것인 하이드로젤 지지체.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 세포는 줄기세포, 감각세포, 뇌세포, 생식세포, 상피세포, 면역세포, 암세포 또는 그의 조합인 것인 하이드로젤 지지체.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 성장인자는 형질전환성장인자(TGF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF), 인슐린 유사 성장인자 (IGF), 사이토카인, 캐모카인 또는 그의 조합인 것인 하이드로젤 지지체.
  8. 삭제
  9. 청구항 1에 있어서, 생체조직 재생을 위한 것인 하이드로젤 지지체.
  10. 청구항 1의 하이드로젤 지지체를 포함하는 바이오프린팅을 위한 바이오잉크 조성물.
  11. 젤라틴 및 알지네이트를 혼합하여 젤라틴-알지네이트 용액을 형성하는 단계; 및
    상기 젤라틴-알지네이트 용액에 이단계 가교를 수행하여 하이드로젤 지지체 전체에 대하여 0.5 내지 20 중량%의 알지네이트, 0.5 내지 20 중량%의 젤라틴, 및 60 내지 99 중량%의 수분을 포함하는 하이드로젤 지지체를 형성하는 단계로서, 상기 젤라틴을 2 내지 10 ℃의 온도에서 겔화하여 젤라틴을 가교하는 단계 및, 알지네이트를 가교하는 단계를 포함하는 것인 단계를 포함하고,
    상기 젤라틴을 가교하는 단계는 젤라틴의 가교제를 첨가하는 단계를 포함하지 않는 것이고, 및
    상기 가교된 젤라틴에 의해 알지네이트가 고정되고, 상기 가교된 알지네이트에 의해 젤라틴이 고정되어 있는 것인 하이드로젤 지지체를 제조하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 젤라틴-알지네이트 용액에 세포 또는 성장인자를 혼합하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  13. 삭제
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 알지네이트를 가교하는 단계는 이온 가교, 공유 가교, 광 가교, 또는 세포 가교에 의한 것인 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 상기 세포가 포함된 하이드로젤 지지체를 배양 배지 중 배양하거나, 또는 분화 유도 배지 중 분화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 상기 알지네이트 및 젤라틴 각각의 이단계 가교에 의해 세포 배양 또는 세포 분화 온도에서 겔화의 상태를 유지하는 것인 방법.
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