KR101704815B1 - Ｉｌ－１７ 매개 염증질환의 치료를 위한 조합 제제 및 이를 이용한 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아데노신 생성 촉진제, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13 등의 Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제, 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 포함하는, IL-17에 의해 매개되는 염증질환의 예방용 또는 치료용 조합 제제에 관한 것이다. 또한 본 발명은 아데노신 생성 촉진제, Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제, 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 병합투여함으로써 IL-17에 의해 발생 또는 악화되는 비호산구성 또는 호중구성 호흡기 염증질환, IL-17에 의한 호중구성 염증을 특징으로 하는 소화기질환, 혈관/대사질환, 피부질환, 골관절질환, 뇌신경질환, 및 IL-17에 의한 호중구성 염증의 합병증으로 생기는 폐암, 위암, 대장암 등을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＩＬ­１７ 매개 염증질환의 치료를 위한 조합 제제 및 이를 이용한 치료 방법 {Combination preparation for treating IL-17 mediated inflammatory diseases and the treatment method using the same}

본 발명은 아데노신 생성 촉진제, Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제, 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 포함하는 IL-17 매개 염증질환의 예방용 또는 치료용 조합 제제 및 이를 이용한 치료방법에 관한 것이다.

IL(Interleukin, 인터루킨)-17은 Th17(T helper type 17) 세포, 감마/델타 T 세포, NK 세포, 대식세포, 또는 호중구 등에서 분비되는 사이토카인으로, 조직에 대식세포, 호중구 침윤을 특징으로 하는 비호산구성 또는 호중구성 염증을 일으키는 중요한 사이토카인이다. IL-17에 의해 매개되는 질환으로 중증천식, 만성폐쇄성폐질환, 폐섬유증 등의 호흡기성 염증질환, 위염, 염증성장염 등의 소화기질환, 류마치스관절염 등의 골관절질환, 동맥경화증 등의 혈관질환, 혈관성치매 등의 뇌신경질환 등이 있다. 또한 최근 IL-17에 의해 매개되는 염증반응에 의하여 점막에 암이 발생함이 보고되었다 [Wu et al. A human colonic commensal promotes colon tumorigenesis via activation of T helper type 17 T cell responses. Nat Med. 5(9):1016-22 (2009)].

아스피린은 COX-1/-2 기전을 억제함으로써 해열 및 진통에 효과적인 약으로 알려져 있고, 아데노신 생성을 증가시켜 염증세포의 유입을 억제하는 것으로 알려져 있다 [Bruce N. Cronstein et al., Salicylates and sulfasalazine, but not glucocorticoids, inhibit leukocyte accumulation by an adenosine-dependent mechanism that is independent of inhibition of prostaglandin synthesis and p105 of NFkB. Proc. Natl. Acad. Sci. 96:6377-6381 (1999)]. 한편, 아데노신은 신약개발 후보물질 중 하나로써, 염증에 관해서는 수용체(A_A1AR, A_A2aAR, A_A2bAR, A_A3AR)의 종류에 따라 상이한 반응을 나타낸다. 아데노신 수용체 A_A1AR 및 A_A2aAR 는 항염증반응에 관여하는 것으로 알려져 있으며, A_A2bAR 는 염증반응을 유도하는 것으로 알려져 있고, A_A3AR 는 염증을 유발하는 보강물질에 따라 염증반응과 항염증반응을 상이하게 유도한다 [Chun-Xiao Sun et al., A protective role for the A1 adenosine receptor in adenosine-dependent pulmonary injury. J. Clin. Invest. 115:35-43 (2005). Ahmed Nadeem et al., Enhanced airway reactivity and inflammation in A2A adenosine receptor-deficient allergic mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 292:1335-1344 (2007). Chun-Xiao Sun et al., Role of A2B adenosine receptor signaling in adenosine-dependent pulmonary inflammation and injury. J. Clin. Invest. 116:2173-2182 (2006). Stefania Gessi et al., The A3 adenosine receptor: An enigmatic player in cell biology, Pharmacology & Therapeutics 117:123-140 (2008)].

알로퓨리놀은 xanthine oxidase 억제제로서 수십년간 통풍 치료제로 사용되고 있다 [Pascual, E. & Sivera, F. Therapeutic advances in gout. Curr. Opin. Rheumatol. 19:122-127 (2007)]. 아스피린 및 아데노신에 의한 항염증 작용은 잘 알려져 있으나 [Gyorgy Hasko et al., Adenosine receptors: therapeutic aspects for inflammatory and immune diseases, Nature Review of Drug Discovery 7:759-770], IL-17에 의해 매개되는 염증질환에 대한 아스피린의 치료효과에 대해서는 잘 알려져 있지 않고, 특히, Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제와의 병합투여, 요산생성 억제 또는 분해 촉진제와의 병합투여 시 치료효과에 대해서는 알려져 있지 않다.

본 발명의 목적은 IL-17에 의해 매개되는 비호산구성 또는 호중구성 염증을 특징으로 하는 호흡기질환 등에 대한 치료제 및 치료 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로, 본 발명은 아데노신 생성 촉진제, Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제, 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 병합투여함으로써 IL-17에 의해 매개되는 호중구성 염증을 특징으로 하는 천식, 만성폐쇄성폐질환, 폐섬유증 등의 호흡기 질환, 위염, 염증성장염 등의 소화기질환, 류마치스관절염, 골다공증 등의 골관절질환, 동맥경화증, 당뇨 등의 혈관/대사질환, 아토피피부염 등의 피부질환, 혈관성치매 등의 뇌신경질환, 및/또는 IL-17에 의해 매개되는 염증으로 발생하는 폐암, 위암, 대장암 등의 예방 및/또는 치료방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 일 측면은 아데노신 생성 촉진제; Th2(T helper type 2) 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제; 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 포함하는, IL-17 매개 염증질환 예방 및/또는 치료용 조합 제제를 제공한다.

상기 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조합 제제는 병용 제제 또는 약학 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조합 제제는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 IL-17 매개 염증질환은 비호산구성 또는 호중구성 염증을 특징으로 하는 비염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 폐섬유증 등의 호흡기질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 IL-17 매개 염증질환은 비호산구성 또는 호중구성 염증을 특징으로 하는 위염, 염증성장염 등의 소화기질환, 류마치스관절염, 골다공증 등의 골관절질환, 동맥경화증, 당뇨병 등의 혈관 또는 대사질환, 아토피피부염 등의 피부질환, 혈관성치매 등의 뇌신경질환 등과 같이 호흡기계 이외의 장기에 발생하는 염증성 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 IL-17 매개 염증질환은 폐암, 위암, 대장암 등의 암을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 측면은, 아데노신 생성 촉진제; Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제; 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 포함하는 조합 제제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 IL-17 매개 염증질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 투여는 동시 투여, 개별 투여 또는 연속 투여하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 아데노신 생성 촉진제, 및 Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제를 동시 투여, 개별 투여 또는 연속 투여할 수 있다. 또한 아데노신 생성 촉진제, 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 동시 투여, 개별 투여, 또는 연속 투여할 수 있다. 이에 더하여, 아데노신 생성 촉진제; Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제; 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 동시 투여, 개별 투여, 또는 연속 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 아데노신 생성 촉진제; Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제; 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 포함하는 조합물의, IL-17 매개 염증질환의 예방 및/또는 치료를 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 아데노신 생성 촉진제; Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제; 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 포함하는 조합물의, IL-17 매개 염증질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 용도를 제공한다.

본 발명의 아데노신 생성 촉진제; Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제; 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 포함하는 조합 제제는 IL-17 매개 호흡기 질환을 효과적으로 치료할 수 있다. 구체적으로, 아스피린과 같은 아데노신 생성 촉진제는 체내에서 아데노신을 증가시키고, 아데노신은 아데노신 수용체를 통해 IL-17에 의한 호흡기 염증을 억제하고, Th2 사이토카인에 의한 호산구성 호흡기 염증을 증가시킨다. 반면, 아스피린과 같은 아데노신 생성 촉진제에 의해 증가된 아데노신은 대사과정을 통해 요산으로 분해되고, 이는 Th2 사이토카인에 의한 염증을 증가시키는데, 이는 요산합성을 억제하는 알로퓨리놀과 같은 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물에 의해 효율적으로 억제된다. 즉, 아데노신 생성 촉진제; Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제; 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 병합 투여한 경우 IL-17 매개 염증질환을 효과적으로 치료할 수 있으며, 상기 IL-17 매개 염증질환은 호흡기질환 이외에 IL-17에 의해 되는 위염, 염증성장염 등의 소화기질환, 류마치스관절염, 골다공증 등의 골관절질환, 동맥경화증, 당뇨병 등의 혈관 또는 대사질환, 아토피피부염 등의 피부질환, 혈관성치매 등의 뇌신경질환, 및 폐암, 위암, 대장암 등을 포함한다.

도 1은 알레르겐과 LPS 이용한 Th17 및 Th1 면역반응에 의한 비호산구성 천식 동물모델에서 마지막 알레르겐 투여 6시간 후인 22일째에 폐조직에서 분리한 염증세포에서 IL-17을 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 알레르겐과 LPS 이용한 Th17 및 Th1 면역반응에 의한 비호산구성 천식 동물모델에서 마지막 알레르겐 투여 6시간 후인 22일째에 기관지폐포세척액에서 IL-17 양 (좌)과 폐조직에서 분리한 T세포를 체외에서 anti-CD3+antiCD28 자극 후 6시간째 IL-17 분비량(우)을 엘리자 방법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 알레르겐과 LPS 이용한 Th17 및 Th1 면역반응에 의한 비호산구성 천식 동물모델에서 마지막 알레르겐 투여 6시간 후인 22일째에 폐조직에서 분리한 염증세포에서 IFN-γ 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 알레르겐과 LPS 이용한 Th17 및 Th1 면역반응에 의한 비호산구성 천식 동물모델에서 마지막 알레르겐 투여 6시간 후인 22일째에 기관지폐포세척액에서 IP-10 양 (좌)과 폐조직에서 분리한 T세포를 체외에서 anti-CD3+antiCD28 자극 후 6시간째 IFN-γ분비량(우)을 엘리자 방법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 알레르겐과 alum을 이용한 Th2 면역반응에 의한 호산구성 천식 동물모델에서 아스피린치료에 의한 염증의 변화를 기관지폐포세척액에서 염증세포 수를 측정한 결과이다.
도 6은 비호산구성 천식 동물모델에서 마지막 알레르겐 투여 2시간 후인 22일째에 비장에서 분리한 염증세포에 체외에서 알레르겐으로 자극하여 분비된 IL-13 양을 측정한 결과이다.
도 7은 비호산구성 천식 동물모델에서 마지막 알레르겐 투여 48시간 후인 24일째에 기관지폐포세척액에서 케모카인 양을 측정한 결과이다.
도 8은 비호산구성 천식 동물모델을 정상 마우스와 IL-13 결핍 마우스에적용하여 마지막 알레르겐 투여 48시간 후인 24일째에 기관지폐포세척액 내 염증세포 수를 측정한 결과이다.
도 9는 비호산구성 천식 동물모델을 정상 마우스와 IL-13 결핍 마우스에적용하여 마지막 알레르겐 투여 48시간 후인 24일째에 기관지폐포세척액 내 케모카인 양을 측정한 결과이다.
도 10은 비호산구성 천식 동물모델을 정상 마우스와 IL-4Ralpha 결핍 마우스에 적용하여 마지막 알레르겐 투여 48시간 후인 24일째에 기관지폐포세척액 내 염증세포 수를 측정한 결과이다.
도 11은 비호산구성 천식 동물모델을 정상 마우스와 STAT6 결핍 마우스에 적용하여 마지막 알레르겐 투여 48시간 후인 24일째에 기관지폐포세척액 내 염증세포 수를 측정한 결과이다.
도 12는 비호산구성 천식 동물모델에서 아스피린 투여 유무에 따라 마지막 알레르겐 투여 6시간 후인 22일째에 폐조직에서 아데노신 양을 측정한 결과이다.
도 13은 비호산구성 천식 동물모델에서 아스피린 투여 유무에 따라 14일째 알레르겐 투여 3, 6, 12 시간에 혈청에서 요산 농도를 측정한 결과이다.
도 14는 비호산구성 천식 동물모델에서 아스피린과 알로퓨리놀 병합 투여의 치료 효과를 마지막 알레르겐 투여 48시간 후인 24일째에 기관지폐포세척액 내 염증세포 수로 평가한 결과이다.
도 15는 비호산구성 천식 동물모델에서 아스피린과 알로퓨리놀 병합 투여의 효과를 마지막 알레르겐 투여 48시간 후인 24일째에 혈청 내 요산의 농도로 평가한 결과이다.
도 16은 블레오마이신(bleo)을 이용한 폐섬유증 동물모델에서 아스피린(ASA)을 2주간 투여한 후, 폐조직에서 IL-17을 분비하는 감마/델타 T 세포 수를 측정한 결과이다.

본 발명은 아데노신 생성 촉진제; Th2 (T helper type 2) 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제; 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 포함하는 IL-17 매개 염증질환 예방용 및/또는 치료용 조합 제제를 제공한다.

본 발명에서 '아데노신 생성 촉진제'는 체내에서 아데노신 생성을 증가시키는 약물을 의미하며, 예를 들어, 이러한 약물로써 당업계에서 공지된 약물을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 아데노신 생성 촉진제로서 아스피린, 그 유도체 또는 염을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 'Th2 사이토카인'은 IL(Interleukin, 인터루킨)-4, IL-5, IL-9, 및 IL-13 등을 포함하는 의미이며, 상기 'Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제'는 상기의 Th2 사이토카인에 의해 매개되는 반응을 억제하는 약물을 포함하며, 예를 들어, 이러한 약물로써 당업계에서 공지된 약물을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, Th2 사이토카인 중에서 IL-13 억제제로 IL-13 생성을 억제하거나, IL-13에 결합 또는 IL-13 수용체에 결합하여 신호전달을 억제하는 재조합 단백질, 단클론 항체, 압타머(aptamer), siRNA, miRNA 등을 사용할 수 있고, IL-13 신호전달 억제제로 IL-13과 IL-13 수용체가 결합한 후 세포내 신호전달을 억제하는 siRNA, miRNA 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 STAT6 (signal transducer and activator of transcription 6)를 통한 신호전달을 억제하는 약물을 사용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 '요산 생성 억제 또는 분해 촉진 약물'은 체내에서 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 작용을 하는 당업계에 공지된 약물을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물로서 알로푸리놀 또는 그 유도체, uricase 또는 그 유도체 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

고대시대부터 통증을 억제할 목적으로 버드나무줄기 성분을 사용하였고, 19세기에 진통효과를 나타내는 성분으로 아스피린의 구조가 밝혀져 합성을 하게 되면서, 아스피린은 현재까지 가장 많이 사용하고 있는 약물 중의 하나이다. 현재 아스피린은 진통, 항염증, 항응고 등의 목적으로 많이 사용하고 있고, 작용기전으로는 아라키돈산의 대사산물이 생성과정에서 COX 효소를 억제하여 효과를 나타낸다고 알려졌다. 그러나, 비염, 천식, 만성폐쇄성폐질환 등의 호흡기질환 환자가 아스피린을 복용하는 경우, 일부의 환자에서 심한 부작용을 나타내지만, 정확한 작용기전에 대해선 논란이 있다.

한편, 호산구의 침윤 여부에 따라 염증을 호산구성 및 비호산구성 (또는 호중구성) 염증으로 나눌 수 있고, 호산구성 염증은 주로 Th2 면역반응에 의해 유도되고, 비호산구성 염증은 Th17 및/또는 Th1 면역반응의 결과로 발생한다.

본 발명자들은 IL-17을 분비하는 Th17 세포 및/또는 감마인터페론 (IFN-γ를 분비하는 Th1 세포 면역반응에 의한 비호산구성 염증이 발생하는 과정에서 아스피린을 투여하였을 때, Th17 면역반응에 의한 염증은 억제되는 반면, Th2 면역반응에 의한 염증은 오히려 악화됨을 밝혀냈다. 호산구 침윤이 증가되어 있는 호흡기질환 환자에서 아스피린에 과민한 경우가 흔히 발생하는 점을 감안하면, Th2 면역반응에 의해 호산구성 염증을 특징으로 하는 환자에 아스피린 투여 시 염증이 오히려 악화될 수 있음을 알 수 있다. 반면, Th17 면역반응에 의한 비호산구성 염증을 갖고 있는 환자에 아스피린을 투여하면, Th17 염증을 억제하는 치료효과를 기대할 수 있지만, Th2 염증이 악화되는 문제를 해결해야 한다.

본 발명자들은 아스피린이 체내에서 아데노신을 증가시키고, 이렇게 증가된 아데노신은 Th17 염증을 효율적으로 억제시킴을 발견하였다. 반면, 아데노신의 대사산물인 요산에 의해 오히려 Th2 염증이 악화되었다.

또한 본 발명자들은 Th2 사이토카인 결핍 마우스에 아스피린을 투여한 경우에 Th2 염증의 악화 없이 Th17 염증이 발생하지 않았고, 정상 마우스에 아스피린과 함께 요산생성을 억제하는 알로퓨리놀을 병합투여한 경우에 Th2 염증의 악화 없이 Th17 염증을 효율적으로 억제됨을 발견하였다. 이는 아데노신 생성 촉진제; Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제; 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 병합 투여한 경우에 Th17 면역반응에 의한 비호산구성 또는 호중구성 염증을 효율적으로 억제할 수 있음을 의미한다.

따라서 아데노신 생성 촉진제; Th2 사이토카인 억제제 또는 이의 신호전달 억제제; 및 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물을 병합투여함으로써 비호산구성 또는 호중구성 호흡기염증을 억제할 수 있고 따라서 이를 특징으로 하는 중증천식과 만성폐쇄성폐질환 등을 효과적으로 치료할 수 있다.

즉, 아스피린과 같은 아데노신 생성 촉진제는 체내에서 아데노신을 증가시키고, 아데노신은 아데노신 수용체를 통해 Th17 면역반응에 의한 호흡기 염증을 억제하고, Th2 면역반응에 의한 호산구성 호흡기 염증을 증가시킨다. 반면, 아스피린과 같은 아데노신 생성 촉진제에 의해 증가된 아데노신은 대사과정을 통해 요산으로 분해되고, 이는 Th2 면역반응에 의한 염증을 증가시키는데, 이는 요산합성을 억제하는 알로퓨리놀과 같은 요산의 생성 억제 또는 분해 촉진 약물에 의해 효율적으로 억제된다.

본 발명에서 'IL-17 매개 염증질환'은 Th17 세포뿐만 아니라 감마/델타 T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 등의 면역 또는 염증세포에서 분비되는 IL-17에 의해 발생 또는 악화되는 호흡기질환; 소화기질환; 피부질환; 혈관 또는 대사질환; 골관절질환; 및 뇌신경질환 등을 포함한다.

구체적으로 상기 호흡기질환은 비염, 비용종, 부비동염, 천식, 기관지염, 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 폐섬유증, 폐암 등을 포함하며, 상기 소화기질환은 구강염, 식도염, 위염, 위궤양, 염증성장염, 과민성장증후군, 담도염, 췌장염, 구강암, 식도암, 위암, 대장암, 담도암, 담낭암, 췌장암 등을 포함한다.

또한 상기 혈관 또는 대사질환은 동맥경화증, 당뇨, 통풍 등을 포함하며, 상기 골관절질환은 류마티스관절염, 골관절염, 골다공증 등을 포함한다. 상기 뇌신경질환은 혈관성치매, 알츠하이머병, 퇴행성뇌질환 등을 포함한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 비호산구성 천식 동물 모델에서 Th1 및 Th17 면역반응의 발생에 대한 아스피린의 치료 효과

감마인터페론(IFN-γ을 분비하는 Th1 세포와 IL-17을 분비하는 Th17 세포에 의한 면역반응의 결과로 발생하는 비호산구성 또는 호중구성 염증이 발생하는 천식모델을 만들기 위하여, 6주령의 마우스에 알레르겐으로 난알부민 (ovalbumin, OVA) 75 ㎍과 면역보강제로서 LPS (lipopolysaccharide) 10 ㎍을 각각 0, 1, 2, 및 7일에 비강으로 투여 (감작, sensitization)한 후, 14, 15, 21 및 22일에 알레르겐 (ovalbumin 50 ㎍) 단독으로 비강으로 투여 (challenge) 하였다. Th1 및 Th17 면역반응에 의한 비호산구성 염증의 발생에 아스피린의 치료효과를 평가하기 위하여 14, 15, 21, 22일째 알레르겐 투여 시 아스피린(ASA) 18 mg/kg을 복강으로 투여하였다.

알레르겐 특이 Th17 면역반응을 평가하기 위하여, 알레르겐 투여 6시간 후에 폐조직에 침윤된 IL-17을 발현하는 T 세포 수를 측정하였다. 폐를 적출하여 collagenase type IV (sigma)를 처리하여 세포를 분리하였다. 면역반응에 의해 폐로 유입된 T 세포의 아형을 결정하기 위하여 세포표면을 형광물질이 부착된 anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 (BD Pharmingen) 항체로 염색한 후, triton으로 세포 표면에 구멍을 내고 anti-IFN-γ, anti-IL-17, anti-IL-10 및 anti-IL-4로 세포내 사이토카인 염색(intracellular cytokine staining)을 시행하였다. 발현 분석은 fluorescence activated cell scanner인 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 사용하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 알레르겐 challenge에 의해 증가된 IL-17을 발현하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 폐조직으로의 침윤이 아스피린 치료에 의하여 유의하게 억제되었다.

도 2는 폐조직 및 기관지폐포세척액에서 IL-17 농도를 엘리자(ELISA) 방법으로 측정한 결과로서, 알레르겐 challenge에 의해 증가된 IL-17 분비가 아스피린 치료에 의하여 유의하게 억제되었다.

도 3은 상기의 방법으로 알레르겐 투여 시 폐조직에서 IFN-γ를 분비하는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 침윤을 나타낸 것으로, 알레르겐 challenge에 의해 유도된 IFN-γ 발현 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 아스피린 치료에 의해 변화되지 않았다.

도 4는 상기의 방법으로 알레르겐 투여 시 폐조직에서 IFN-γ 농도 및 기관지폐포세척액에서 IFN-γ에 의해 유도되는 케모카인인 IP-10(IFN-γ-inducible protein-10)를 측정한 것을 나타낸 것으로, 알레르겐 challenge에 의해 생성된 IFN-γ과 이에 의해 유도되는 케모카인 생성이 아스피린 치료에 의해 변화되지 않았다.

상기 결과는 Th1 및 Th17 면역반응을 특징으로 하는 동물 모델에서 알레르겐 challenge 시 아스피린 치료에 의해, IFN-γ를 분비하는 Th1 세포에 의한 면역반응에는 큰 영향이 없으나, IL-17을 분비하는 Th17 세포에 의한 면역반응은 효율적으로 억제됨을 의미한다.

실시예 2. Th2 면역반응에 의한 호산구성 천식 동물 모델에서 아스피린에 의한 호산구성 염증의 악화

Th2 면역반응에 의한 호산구성 염증이 발생하는 천식모델을 만들기 위하여, 6주령의 마우스에 알레르겐으로 난알부민 (ovalbumin, OVA) 75 ℃㎍과 면역보강제로서 aluminum hydroxide (alum) 2 mg을 각각 0 및 7일에 복강으로 투여 (감작, sensitization)한 후, 14, 15, 21 및 22일에 알레르겐 (ovalbumin 50 ㎍) 단독으로 비강으로 투여 (challenge) 하였다. Th2 면역반응에 의한 호산구성 염증의 발생에 대한 아스피린의 치료효과를 평가하기 위하여 14, 15, 21, 22일째 알레르겐 투여 시 아스피린 18 mg/kg을 복강으로 투여하였다.

기관지폐포세척액(Bronchoalveolar lavage fluid, BAL fluid)내 염증세포 수를 측정하기 위하여, 케타민(Ketamin)과 자일라진(xylazine)을 혼합한 마취액을 마우스 복강에 투여하여 마취한 후, 흉부를 절개하고 기관을 노출시켜 카테터를 기도에 삽입하고 결찰시켰다. 무균성 생리식염수를 1 ml씩 2회 주입하고 기도를 세척하여 기관지폐포세척액을 얻었다. 기관지폐포세척액을 섭씨 4도에서 3000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤, 세포 펠렛 (cell pellet)을 생리식엽수(phosphage-buffered saline, PBS)에 풀어서 세포수를 측정하였다. 광학현미경에서 염증세포의 총 수를 측정한 후, cell pellet을 사이토스핀(cytospin)하여 슬라이드에 도말하고 디프퀵(Diff Quick) 염색을 시행하여 광학현미경 1000배 시야에서 300개 이상의 염증세포를 관찰하여 대식세포, 림프구, 호중구, 호산구로 분류하여 각각의 염증세포 수를 측정하였다.

도 5는 마지막 알레르겐 투여 48시간 후인 24일에 기관지폐포세척액에서 염증세포 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 기관지폐포세척액내의 염증세포 수가 알레르겐과 alum으로 감작시킨 호산구성 천식 모델에서 아스피린 치료에 의해 염증세포의 총 수는 차이가 없었지만, 호산구 수는 증가되었다.

상기 결과는 Th2 면역반응에 의해 유도되는 호산구성 염증이 아스피린 투여에 의해 오히려 악화됨을 의미한다.

실시예 3. 비호산구성 천식 동물 모델에서 아스피린에 의한 Th2 면역반응의 항진

실시예 1의 비호산구성 천식 모델에서 알레르겐 특이 Th2 사이토카인 발현에 아스피린의 영향을 평가하기 위하여, 22일째 아스피린을 투여한 2시간 후, 마우스 비장에서 분리한 염증세포에 체외에서 알레르겐(OVA 100 μg/ml)으로 72시간 동안 자극하여 IL-13의 농도를 엘리자 방법으로 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 비호산구성 천식 모델에서 아스피린으로 치료하지 않은 경우에는 IL-13이 분비되지 않았으나, 아스피린으로 치료한 경우에는 알레르겐에 의해 T 세포에서 IL-13이 분비되었다.

또한, 상기의 비호산구성 천식 모델에서 아스피린 치료 후, 기관지폐포세척액에서 호산구 침윤에 관련된 사이토카인 양을 엘리자 방법으로 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 호산구 침윤과 관련된 eotaxin, monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1)의 농도가 아스피린 치료에 의해 유의하게 증가되었다.

상기 결과는 Th1 및 Th17 면역반응에 의한 비호산구성 천식 모델에서 아스피린에 의해 Th2 면역반응과 이에 따른 호산구성 염증이 오히려 증가됨을 의미한다.

실시예 4. 아스피린을 투여한 비호산구성 천식 동물 모델에서 Th2 사이토카인의 역할

아스피린을 투여한 비호산구성 천식 동물 모델에서 대표적인 Th2 사이토카인인 IL-13의 역할을 평가하기 위하여 상기 실시예 1의 비호산구성 천식 모델을 IL-13 결핍 마우스에 적용하였다.

6주령의 정상 마우스(WT)와 IL-13 결핍 마우스(IL-13KO)에 알레르겐으로 난알부민 (ovalbumin, OVA) 75 ㎍과 면역보강제로서 LPS (lipopolysaccharide) 10 ㎍을 각각 0, 1, 2, 및 7일에 비강으로 투여 (감작, sensitization)한 후, 14, 15, 21 및 22일에 알레르겐 (ovalbumin 50 ㎍) 단독으로 비강으로 투여 (challenge) 하였다. IL-13 결핍 마우스에서 아스피린의 역할을 평가하기 위하여 14, 15, 21, 22일째 알레르겐 투여 시 아스피린 18 mg/kg을 복강으로 투여하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 아스피린을 투여하지 않은 비호산구성 천식 모델에서 염증 정도 (기관지폐포세척액 내 염증세포 수)는 정상 마우스와 IL-13 결핍 마우스에서 차이가 없었으나, 아스피린을 투여한 경우에는 정상 마우스에 비하여 IL-13 결핍 마우스에서 기관지폐포세척액 내 염증세포 수가 유의하게 감소하였다.

도 9는 기관지폐포세척액에서 IL-13에 의해 유도되는 케모카인의 양을 측정한 결과로서, 아스피린을 투여한 비호산구성 천식 동물 모델에서 정상 마우스에서 증가된 eotaxin과 MCP-1 양이 IL-13 결핍 마우스에서는 관찰되지 아니하였다.

상기 결과는 비호산구성 천식 동물 모델에서 아스피린을 투여하는 경우에 염증의 발생에 IL-13이 중요한 매개체임을 의미한다.

실시예 5. 아스피린을 투여한 비호산구성 천식 동물 모델에서 Th2 사이토카인 수용체 및 세포내 신호전달의 역할

아스피린을 투여한 비호산구성 천식 동물 모델에서 IL-13의 신호전달에 관련된 IL-4Ralpha 수용체의 역할을 평가하기 위하여 실시예1의 비호산구성 천식 모델을 IL-4Ralpha 결핍 마우스에 적용하였다.

6주령의 정상 마우스(WT)와 IL-4Ra 결핍 마우스(IL-4Ra^-/-)에 알레르겐으로 난알부민 (ovalbumin, OVA) 75 ㎍과 면역보강제로서 LPS (lipopolysaccharide) 10 ㎍을 각각 0, 1, 2, 및 7일에 비강으로 투여 (감작, sensitization)한 후, 14, 15, 21 및 22일에 알레르겐 (ovalbumin 50 ㎍) 단독으로 비강으로 투여 (challenge) 하였다. IL-4Ra 결핍 마우스에서 아스피린의 역할을 평가하기 위하여 14, 15, 21, 22일째 알레르겐 투여 시 아스피린 18 mg/kg을 복강으로 투여하였다.

도 10 에 나타난 바와 같이, 아스피린을 투여하지 않은 비호산구성 천식 모델에서 기관지폐포세척액 내 염증세포 수는 정상 마우스와 IL-4Ralpha 결핍 마우스에서 차이가 없었으나, 아스피린을 투여한 경우에는 정상 마우스에 비하여 IL-4Ralpha 결핍 마우스에서 기관지폐포세척액 내 염증세포 수가 유의하게 감소하였다.

또한, 아스피린을 투여한 비호산구성 천식 동물 모델에서 IL-13의 세포내 신호전달에 관련된 STAT6 신호전달의 역할을 평가하기 위하여 실시예 1의 비호산구성 천식 모델을 STAT6결핍 마우스에 적용하였다.

6주령의 정상 마우스(WT)와 STAT6 결핍 마우스 (STAT6^-/-)에 알레르겐으로 난알부민 (ovalbumin, OVA) 75 ㎍과 면역보강제로서 LPS (lipopolysaccharide) 10 ㎍을 각각 0, 1, 2, 및 7일에 비강으로 투여 (감작, sensitization)한 후, 14, 15, 21 및 22일에 알레르겐 (ovalbumin 50 ㎍) 단독으로 비강으로 투여 (challenge) 하였다. STAT6 결핍 마우스에서 아스피린의 역할을 평가하기 위하여 14, 15, 21, 22일째 알레르겐 투여 시 아스피린 18 mg/kg을 복강으로 투여하였다.

도 11 에 나타난 바와 같이, 아스피린을 투여하지 않은 비호산구성 천식 모델에서 기관지폐포세척액 내 염증세포 수는 정상 마우스와 STAT6 결핍 마우스에서 차이가 없었으나, 아스피린을 투여한 경우에는 정상 마우스에 비하여 STAT6 결핍 마우스에서 기관지폐포세척액 내 염증세포 수가 유의하게 감소하였다.

상기 결과는 비호산구성 천식 동물 모델에서 아스피린을 투여하는 경우 염증의 발생에 있어서 IL-13의 수용체인 IL-4Ralpha와 세포내 신호전달에 관련된 STAT6 신호전달이 중요함을 의미한다.

실시예 6. 아스피린에 의한 아데노신 및 아데노신 대사산물의 생성

실시예 1의 비호산구성 천식 동물 모델에서 아스피린을 투여한 지 6시간 후에 폐조직에 존재하는 아데노신을 측정하였다. 폐를 적출하여 0.4 N HClO₄ 를 넣고 폐조직을 부순 후, 섭씨 4도에서 12000 rpm으로 2분간 원심분리하였다. 상층액을 얻고, reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) 를 통해 아데노신 양을 측정하였다.

도 12는 실시예1의 비호산구성 천식 동물 모델에서 아스피린 치료 유무에따른 폐조직 내 아데노신 양을 나타낸 것이다.

도 12에 나타난 바와 같이, 비호산구성 천식 동물 모델에서 알레르겐 challenge 후에 폐조직 내 아데노신 양이 증가하였고, 이는 아스피린을 투여하는 경우에 더욱 더 증가하였다.

아데노신 대사 산물로 요산이 형성되는 것이 알려져 있다. 요산 농도를 측정하기 위해 마우스에서 혈청을 분리한 후, 혈청에서 요산이 철분 (iron)과 결합될 때에 파란색을 나타내는 2,4,6-tripyridyl-s-triazine 을 이용하였고, 농도를 정량화 하기 위해서 590nm 의 파장에서의 흡광도를 측정하였다.

도 13은 실시예1의 비호산구성 천식 모델에서 아스피린 투여 유무에 따른혈청 내 요산의 농도를 나타낸 것으로, 알레르겐 challenge 후 혈청 요산의 농도가 증가하지 않았으나, 아스피린을 투여한 경우에는 유의하게 증가하였다.

상기 결과는 비호산구성 천식 동물 모델에서 아스피린에 의해 아데노신 생성이 증가하고, 이와 더불어 아데노신의 대사산물인 요산의 생성도 증가함을 의미한다.

실시예 7. 비호산구성 천식 동물 모델에서 아스피린과 요산생성억제제 조합제제의 치료 효과

최근 체내에서 생성된 요산이 Th2 면역반응을 유도한다고 알려졌다. 본 발명자들은 비호산구성 천식 동물 모델에서 아스피린에 의해 증가된 Th2 면역반응이 아데노신의 대사산물인 요산에 의해 매개됨을 평가하기 위하여, 실시예 1의 비호산구성 천식 동물 모델에서 알레르겐 challenge 시 아스피린(18 mg/kg)과 요산 생성 억제제인 알로퓨리놀 (allopurinol, 1 mg/kg)를 복강으로 병합 투여하였다. 도 14는 22일째 알레르겐 challenge 후 48시간째 기관지폐포세척액 내 염증세포 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 14에서 알 수 있는 바와 같이, 아스피린(ASA) 또는 알로퓨리놀(APL) 단독으로 치료한 경우에는 알레르겐 challenge 후에 유도되는 염증반응에는 차이가 없었으나, 아스피린과 알로퓨리놀을 병합 투여한 경우에는 염증 정도 (기관지폐포세척액 내 염증세포 수)가 유의하게 감소하였고, 특히 호산구 침윤이 유의하게 감소하였다.

도 15는 상기의 질병모델에서 아스피린 또는 알로퓨리놀 치료 후 48시간째 혈청에서 요산 농도를 측정한 결과로서, 아스피린에 의해 증가되는 혈청 요산의 농도는 아스피린과 알로퓨리놀을 병합 투여한 경우에 유의하게 감소하였다.

상기 결과는 상기의 비호산구성 천식 동물 모델에서 아스피린 투여시 Th2 면역반응에 의한 호산구 침윤이 요산에 의해 유도되고, 이는 Th17 세포에서 분비되는 IL-17에 의해 매개되는 비호산구성 염증의 치료에 아스피린과 알로퓨리놀 병합 치료가 매우 효과적임을 의미한다.

실시예 8. 폐섬유증 ( pulmonary fibrosis ) 동물 모델에서 아스피린에 의한 감마/델타 T 세포에서 IL -17 발현의 억제

블레오마이신 (Bleomycin)은 항암제로 개발되었으나 부작용으로 폐섬유화를 유발하는 것으로 알려졌으며, 이를 이용하여 폐섬유증을 연구하는 동물 모델로 확립되었다. 폐섬유증에서 감마/델타(g/d) T 세포가 증가되는 것이 보고되었으며, 이때에 g/d T 세포가 IL-17을 분비하는 것이 알려졌다.

블레오마이신 3mg/kg를 마우스의 기도 (trachea)에 투여하여 폐섬유증을 유발하였고, 이때 아스피린(18 mg/kg)을 매일 복강 투여하였다. 2주 후에 폐조직에서 IL-17을 분비하는 g/d T 세포 수를 측정하였는데, 세포표면에 형광물질이 부착된 anti-d (BD Pharmingen) 항체로 염색한 후, triton으로 세포 표면에 구멍을 내고 anti-IL-17 세포내 사이토카인 염색(intracellular cytokine staining)을 시행하였다. 발현 분석은 fluorescence activated cell scanner인 FACSCalibur (Becton Dickinson)를 사용하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다

도 16에 나타난 바와 같이, 블레오마이신에 의해 폐섬유증이 유발되는 경우 IL-17을 분비하는 세포가 증가되고 아스피린은 이를 효율적으로 감소시켰다. 또한 IL-17을 분비하는 세포를 확인하였을 때, 대부분의 세포가 g/d T 세포임이 밝혀졌다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (53)

1. (a)아데노신 생성 촉진제; 및
   (b)요산 생성 억제제 또는 요산 분해 촉진제를 유효성분으로 포함하는, 천식, 기관지염, 기관지확장증, 또는 세기관지염 예방용 또는 치료용 조합 제제로서,
   상기 아데노신 생성 촉진제는 아스피린(Aspirin)이고, 요산 생성 억제제는 알로퓨리놀(allopurinol)이며, 요산 분해 촉진제는 우리카아제(uricase)인 것을 특징으로 하는, 조합 제제.
   
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21. 제 1항에 있어서,
    상기 조합 제제가 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가적으로 포함하는 조합 제제.
    
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