KR101695165B1 - E-카데린 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주 및 이의 용도 - Google Patents
E-카데린 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 E-cadherin 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 E-cadherin 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주는 조직병리학적 특징이 인체 위암과 유사하고, 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 표현형 및 β-카테닌(β-catenin) 경로가 활성화되어 있고, 면역이 결핍된 마우스에서 높은 전이성 및 면역을 가진 마우스에서의 발암 잠재성으로 생체 내 암 성장을 촉진시키는 것을 확인하였으므로, 항암신약의 활성평가 및 전이 억제제의 발굴에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 E-카데린(E-cadherin) 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인체미만성위암에서 가장 흔히 변이가 관찰되는 유전자인 E-cadherin 및 p53이 결손되어 인체 위암과 매우 유사한 표현형(phenotype)을 보이는 마우스 위암세포주 NCC-S3/NCC-S3M 및 상기 위암세포주를 이용한 면역 치료 및 위암 치료제에 대한 효능 또는 및 독성 평가 방법에 관한 것이다.
항암신약이나 새로운 항암화학요법을 개발하기 위한 전임상 연구의 핵심은 항암활성을 정확하고 신속하게 평가하는 데 있다. 새로운 항암제 및 항암화학요법을 개발하기 위해서는 비용 및 신속성의 면에서 시험관(invitro) 시험계가 생체내(invivo) 실험계에 비해 경제적이고 우수하지만, 시험관 실험계에 있어서 효능평가의 유효성은 상기 실험계가 생체 내 상황을 충분히 대변하여 임상적으로 의미있는 효능이 검증될 수 있는지의 여부에 달려있다. 현재까지 전임상 개발 단계를 거쳐 임상시험에 진입한 항암 후보물질들의 약 90%가 최종개발에 실패하였는데 이는 적절한 실험계의 부재로 인해 임상 효능의 가능성을 지닌 화합물의 발굴에 실패했기 때문이다 (Staquet M.J. et al ., Cancer Treat Rep ., 67:753, 1983; Twentyman P.R., Ann Oncol ., 5:394, 1994: von Hoff D.D., Clin Cancer Res ., 4:1079, 1998).
지금까지 널리 쓰이고 있는 시험관 내 화학감수성 분석방법(invitro chemosensitivity assay)으로는 콜론 형성 분석법(clonogenic assay), 염료 배제 분석법(dye exclusion assay), MTT 분석법[tetrazolium salt 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay] 또는 SRB 분석법(sulforhodamine B assay) 등이 있다. 상기한 방법은 항암신약개발에 있어서 대량검색(high-throughput)이 필요한 1차 스크리닝 계로서는 의미가 있으나, 인체 고형암의 생체 내 조건과는 조건이 매우 달라서 고형암에 대한 반응률을 예측하기에는 무리가 있다. 고형암의 경우, 항암화학요법제에 대한 반응률이 낮은 이유는 고형암 세포의 삼차원적 조직화와 다세포계(multicellular system)에서 기인하는 세포간 및 세포와 세포간질(extracellular matrix, ECM)간의 상호작용 등이 항암약물의 암조직내 침투저하 및 조직 내 농도저하를 가져오는 등의 여러 기전으로 말미암아 약물에 대한 내성을 유발하기 때문으로 알려져 있다 (Wolfgang M.K., Crit Rev Oncol Hematol ., 36:123, 2000: Bernard D. et al ., Crit Rev Oncol Hematol., 36: 193, 2000).
한편, 위암은 전 세계적으로 발생빈도가 높은 암 중 하나로 한국 및 일본 등 아시아에서 발생하는 가장 흔한 암으로서 사망률 1위를 나타내는 암이다 (Parkin et al ., Int . J. Cancer, 80:827, 1999; Neugut et al ., Semin . Oncol ., 23:281, 1996; Parkin, Lancet Oncol ., 2:533, 2001). 또한, 위암의 증상은 전혀 증상이 없는 경우에서부터 격심한 통증에 이르기까지 다양한 양상을 나타내고 있으며, 위암의 증상이 어떤 특성을 갖는 것이 아니라 일반적인 소화기 증상을 보이며, 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 증상이 있다 하더라도 비교적 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람 이를 간과하기 쉬워 위암의 사망률을 높이는 원인이 되기도 한다. 따라서, 실제 위암 환자들 중 원발암(primary culture)의 상태에서 사망하는 것보다 약 90% 정도의 환자가 전이암으로 악화한 후 사망에 이르고 있다.
현재 위암 항암제의 전임상 시험을 위해서는 인간 위암세포주를 면역억제마우스(SCID 또는 누드마우스)에 주입하여 항암신약의 활성을 평가하고 있다. 그러나 상기 면역억제마우스를 이용한 전임상 시험은 면역요법의 효능평가 및 면역 치료에 대한 안전성 평가방법에 부적합하다는 문제점이 있기 때문에 위암의 전이 억제제 개발을 위한 인간 위암과 유사한 위암세포주 모델에 대한 개발이 필요한 실정이다.
하지만, 면역 능력을 가진 마우스에서 동소이식모델(orthotopic allograft models; 질환과 가장 유사한 환경을 만들어 효능 평가의 신뢰도 및 정확도를 향상시키는 방법으로, 위암세포를 위 조직에 이식해 질환 모델을 만들고, 이를 통해 보다 임상과 유사한 동물모델을 개발할 수 있음)은 생리적 미세환경에 대한 이점을 가지고 있지만, 그들은 과학계에서 매우 희귀하고 변함없이 발암 유도 및 유전적으로 잘 정의되지 않는 문제점이 있다 (Shan YS, et al ., Mol Carcinog., 50:739, 2011).
이에 본 발명자들은 인간 위암과 유사한 마우스 유래 위암 세포주를 확립하기 위해 예의노력한 결과, 면역 능력을 가진 마우스에서 수립된 동소이식모델에서 자연적으로 형성된 위선암으로부터 두개의 위암 세포주인 NCC-S3 및 NCC-S3M를 선별하였으며, 상기 위암세포주는 인체미만성위암에서 가장 흔히 변이가 관찰되는 유전자인 E-cadherin 및 p53이 결손되어 인간 위암과 매우 유사한 표현형(phenotype)을 가지는 것을 확인하였으며, 상기 NCC-S3 세포주는 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 표현형 및 β-카테닌(β-catenin) 경로가 활성화 되었으며, 상기 NCC-S3M 세포주는 면역능력을 가진 마우스에서 높은 전이성 및 발암 잠재성으로 생체 내 암 성장을 촉진시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 E-cadherin 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 위암 세포주를 포함하는 약제효능평가 시스템 또는 전이억제 유전자를 발굴하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주 또는 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주를 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 위암 세포주는 E-cadherin 및 p53이 결손되어 있을 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 위암 세포주는 마우스(mouse) 유래일 수 있으며, 특히 Pdx1-cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스에서 자연적으로 형성된 위선암(gastric adenocarcinoma)으로부터 분리하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주는 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주의 이소성 이형이식편(heterotopic allografts)의 폐 전이물로부터 분리하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주는 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 표현형을 가지며, 비멘틴(vimentin)이 과발현되어 있고, Wnt/β-카테닌(β-catenin) 경로가 활성화되어 있을 수 있다.
본 발명의 두번째 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, (a) 상기 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주 및 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 위암세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 위암 세포를 억제하는 정도를 측정하는 단계를 포함하는 위암 치료제 후보물질의 효능평가 방법을 포함한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주 및 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 위암세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 위암 세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법을 포함한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주 및 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 위암세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 위암 세포의 전이를 억제하는 정도를 측정하는 단계를 포함하는 위암 치료제 후보물질의 효능평가 방법을 포함한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주 및 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 위암세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 위암 세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법을 포함한다.
본 발명의 E-cadherin 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주는 조직병리학적 특징이 인체 위암과 유사하고, 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 표현형 및 β-카테닌(β-catenin) 경로가 활성화되어 있고, 면역이 결핍된 마우스에서 높은 전이성 및 면역을 가진 마우스에서의 발암 잠재성으로 생체 내 암 성장을 촉진시키는 것을 확인하였으므로, 항암신약의 활성평가 및 전이 억제제의 발굴에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 Pdx1-Cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스에서 형성된 일차 종양 및 상기 종양조직을 조직학적으로 관찰한 데이터이다. ⅰ: 육안으로 관찰되는 종양조직(Gross findings), ⅱ 및 ⅲ: 종양조직의 현미경 검색(microscopic finding) 사진, ⅳ: 정상조직과 상기 종양조직에서 발현되는 p53 및 E-cadherin의 발현을 면역조직학적으로 관찰한 사진이며, 화살표는 종양 경계를 나타낸다.
도 2는 동소이식모델에서 자연적으로 형성된 위선암으로부터 분리한 위암 세포주인 NCC-S3(A) 및 NCC-S3M(B)의 생체 외에서 세포 형태학(morphology)를 관찰한 사진이다 (x100).
도 3은 NCC-S3 세포주에서 판사이토케라틴(pan-cytokeratin) 및 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)의 발현 정도(A)와 EGFR, p-Erk, p-Akt, Myc 및 cyclin D1의 발현정도(B)를 웨스턴블랏으로 확인한 데이터이다 (NEG: 정상 위 상피 세포, S3: NCC-S3 세포주, ASG: 인간 위암 세포주, NIH-3T3: 마우스 배아 섬유아세포).
도 4는 Pdx1-Cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스 유래 일차 종양(primary tumors)에서의 Myc 단백질을 면역조직화학적 방법으로 관찰한 사진이다 (T : 일차 종양, N : 인접 정상 점막).
도 5는 NCC-S3에서 CD44, CD133, 및 EpCAM에 대한 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 결과를 나타낸 데이터이다.
도 6은 NCC-S3M의 전이력(metastatic potential) 향상에 기여했을 것으로 판단되는 EMT를 확인하기 위해, NCC-S3에 대한 NCC-S3M의 EMT 활성화 전사 인자(Snail 1, Snail 2, Zeb 1, Zeb 2, Twist 1 및 Twist 2) mRNA 발현 정도를 비교한 데이터이다.
도 7은 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 E-cadherin, Smad 3, p53 및 비멘틴(vimentin)의 발현정도를 웨스턴블랏으로 확인한 데이터이다.
도 8은 SCID 마우스에서 NCC-S3 및 NCC-S3M 이소성 이형이식편의 성장 곡선을 나타낸 데이터이다.
도 9는 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 Tcf/Lef1(T-cell factor/lymphoid enhancer factor) 활성을 리포터어세이로 측정한 데이타이다.
도 10은 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 β-카테닌(β-catenin) 발현정도를 웨스턴 블랏으로 확인한 데이터이다.
도 11은 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 Mmp3 및 Mmp14의 mRNA 발현정도를 측정한 데이터이다.
도 12는 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 Wnt5a, Wnt10b 및 Fzd8(frizzled-8)의 mRNA 발현정도를 측정한 데이터이다.
도 2는 동소이식모델에서 자연적으로 형성된 위선암으로부터 분리한 위암 세포주인 NCC-S3(A) 및 NCC-S3M(B)의 생체 외에서 세포 형태학(morphology)를 관찰한 사진이다 (x100).
도 3은 NCC-S3 세포주에서 판사이토케라틴(pan-cytokeratin) 및 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)의 발현 정도(A)와 EGFR, p-Erk, p-Akt, Myc 및 cyclin D1의 발현정도(B)를 웨스턴블랏으로 확인한 데이터이다 (NEG: 정상 위 상피 세포, S3: NCC-S3 세포주, ASG: 인간 위암 세포주, NIH-3T3: 마우스 배아 섬유아세포).
도 4는 Pdx1-Cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스 유래 일차 종양(primary tumors)에서의 Myc 단백질을 면역조직화학적 방법으로 관찰한 사진이다 (T : 일차 종양, N : 인접 정상 점막).
도 5는 NCC-S3에서 CD44, CD133, 및 EpCAM에 대한 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 결과를 나타낸 데이터이다.
도 6은 NCC-S3M의 전이력(metastatic potential) 향상에 기여했을 것으로 판단되는 EMT를 확인하기 위해, NCC-S3에 대한 NCC-S3M의 EMT 활성화 전사 인자(Snail 1, Snail 2, Zeb 1, Zeb 2, Twist 1 및 Twist 2) mRNA 발현 정도를 비교한 데이터이다.
도 7은 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 E-cadherin, Smad 3, p53 및 비멘틴(vimentin)의 발현정도를 웨스턴블랏으로 확인한 데이터이다.
도 8은 SCID 마우스에서 NCC-S3 및 NCC-S3M 이소성 이형이식편의 성장 곡선을 나타낸 데이터이다.
도 9는 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 Tcf/Lef1(T-cell factor/lymphoid enhancer factor) 활성을 리포터어세이로 측정한 데이타이다.
도 10은 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 β-카테닌(β-catenin) 발현정도를 웨스턴 블랏으로 확인한 데이터이다.
도 11은 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 Mmp3 및 Mmp14의 mRNA 발현정도를 측정한 데이터이다.
도 12는 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 Wnt5a, Wnt10b 및 Fzd8(frizzled-8)의 mRNA 발현정도를 측정한 데이터이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 위암의 전이 억제제 개발을 위한 인간 위암과 유사한 위암세포주 모델에 대한 개발이 요구되고 있으며, 면역 능력을 가진 마우스에서의 동소이식모델(orthotopic allograft models)은 생리적 미세환경에 대한 이점이 있지만, 매우 희귀하고, 유전적으로 잘 정의되지 않는 문제점이 있다.
본 발명은 E-cadherin 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 상기 위암세포주인 NCC-S3 및 NCC-S3M은 E-cadherin 및 p53이 결손되어 인간 위암과 매우 유사한 표현형(phenotype)을 가지며, 특히 NCC-S3 세포주는 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 표현형 및 β-카테닌(β-catenin) 경로가 활성화되어 있고, 면역이 결핍된 마우스에서의 높은 전이성 및 면역을 가진 마우스에서의 발암 잠재성으로 생체 내 암 성장을 촉진시키므로, 항암신약의 활성평가 및 전이 억제제의 발굴에 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주 또는 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주를 포함한다.
상기 위암 세포주는 E-cadherin 및 p53이 결손된 것을 특징으로 할 수 있으며, 위암 세포주는 마우스(mouse) 유래인 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, Pdx1-cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스에서 자연적으로 형성된 위선암(gastric adenocarcinoma)으로부터 분리하여 제조된 것 일 수 있다.
본 발명의 일양태에서는, 마우스 유래 위암 세포주를 분리하기 위해 면역 능력을 가진 마우스에서의 동소이식모델(orthotopic allograft models)을 수립하였으며, Pdx1-cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스를 생성하여 자연적으로 형성된 위선암으로부터 위암세포주를 분리하였다.
상기 동물모델은 설치류인 것이 바람직하고, 마우스인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 동물모델은 암이 발생하는 것이 바람직하고, 위장관계열 암이 발생하는 것이 더욱 바람직하나, 위암, 소장암 및 대장암이 발생하는 것이 가장 바람직하다. 또한 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 상기 위암은 인체 미만형 위암과 조직병리학적 특성이 거의 동일한 것이 바람직하고, 인환세포(signet ring cell)을 갖는 저분화 미만형 위암(poorly differentiated diffuse-type adenocarcinoma)인 것이 가장 바람직하다.
도 1은 Pdx1-Cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스에서 형성된 일차 종양 및 상기 종양조직을 조직학적으로 관찰한 데이터로, 상기 종양은 인간미만형위암종과 유사한 것을 확인하였으며, 정상조직과 상기 종양조직에서 발현되는 p53 및 E-cadherin의 발현을 면역조직학적으로 관찰한 결과(도 1 ⅳ), Pdx1-Cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스에서 형성된 일차 종양 조직에서 E-cadherin 및 p53의 단백질 발현이 되지 않는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일양태에서는, Pdx1-Cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스 위선암 조직에서 세포를 분리하여 배양을 수행하였으며, E-cadherin 및 p53이 결손된 위암세포주를 분리하여 NCC-S3으로 명명하였다.
도 2A는 상기에서 분리한 NCC-S3를 세포 배양용기에서 배양하였을 때, 세포 형태학(morphology)를 관찰한 것으로, NCC-S3 세포주는 상피 세포 형상을 보이는 것을 관찰하였다.
본 발명의 또 다른 일양태에서는, 실시예 2에서 분리한 NCC-S3 세포주의 특성을 파악하고, 인간 위암 세포주와 유사성을 보이는지 확인하기 위해 판사이토케라틴(pan-cytokeratin) 및 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)의 발현 정도(도 3A)와 EGFR, p-Erk, p-Akt, Myc 및 cyclin D1의 발현정도(B)를 웨스턴블랏으로 측정하였다. 그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 인간 위암 세포주인 AGS와 본 발명에서 분리한 NCC-S3 세포주는 동일한 특성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
상기 결과는 본 발명에서 분리한 NCC-S3 세포주는 EGFR/MAPK 시그널이 활성화 되어 있으며, Wnt 타겟 분자인 Myc와 Cyclin D1이 과발현된 결과를 바탕으로 Wnt/β-카테닌(β-catenin) 시그널이 활성화되어 있는 것을 유추할 수 있다. 또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 세포가 생성된 일차 종양에서 Myc 과발현이 검출된 것을 확인하였다.
도 5는 NCC-S3에서 CD44, CD133, 및 EpCAM에 대한 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 분석결과를 나타낸 데이터로, NCC-S3 세포는 인간 위암에서 발현되고 있는 CD44, CD133, 및 EpCAM가 과발현 되는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에서 확립한 NCC-S3 세포주는 인간 위암과 매우 유사한 것을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주는 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주의 이소성 이형이식편 (heterotopic allografts)의 폐 전이물로부터 분리하여 제조된 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주는 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 표현형을 가지며, 비멘틴(vimentin)이 과발현되어 있고, Wnt/β-카테닌(β-catenin) 경로가 활성화되어 있을 수 있다.
본 발명의 일양태에서는 상기 NCC-S3 세포주 의외의 전이성 능력이 향상된 세포주를 확립하기 위해, NCC-S3 세포주를 SCID 마우스의 피하 조직에 이식한 다음, 폐조직에서 관찰된 전이소를 절제하여 실시예 2와 동일한 방법으로 NCC-S3M 세포주를 확립하였다.
도 2B는 상기에서 분리한 NCC-S3M를 세포 배양용기에서 배양하였을 때, 세포 형태학(morphology)를 관찰한 것으로, NCC-S3M 세포주는 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 표현형을 가지고 있는 것을 확인하였다.
NCC-S3M의 EMT를 확인하기 위해서 EMT 활성화 전사 인자인 Snail 1, Snail 2, Zeb 1, Zeb 2, Twist 1 및 Twist 2 mRNA 발현 정도를 측정한 다음, NCC-S3M에서 증가된 EMT 활성화 전사 인자의 발현정도를 확인하였다 (NCC-S3M/NCC-S3). 도 6에 나타난 바와 같이, NCC-S3M는 NCC-S3에 비해 Snail 1, Snail 2, Zeb 1, Zeb 2, Twist 1 및 Twist 2 mRNA 발현이 모두 증가하는 것을 확인하였으며, NCC-S3M의 전이력은 NCC-S3에 비해 현저하게 향상된 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 일양태에서는 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 E-cadherin 및 비멘틴(vimentin)의 발현정도를 웨스턴블랏으로 확인하였으며, 그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, NCC-S3 및 NCC-S3M 모두 E-cadherin을 발현하지 않은 것을 관찰하였으며, 비멘틴은 NCC-S3M 세포주에서만 과발현되는 것을 관찰하였다.
상기에서 E-cadherin의 결손은 EMT를 강력하게 유발하는 것으로 알려져 있으며(Park JW, et al., Mol Cancer Res., 2014.), 비멘틴은 섬유아세포, 백혈구세포 등의 간엽계 세포(mesenchymal cell)에 특이적인 중간경 필라멘트 단백질으로, 암 세포의 침윤 기능 항진과 간엽계 표지자로 알려져 있다.
본 발명의 도 8은 SCID 마우스에서 NCC-S3 및 NCC-S3M 이소성 이형이식편의 성장 곡선을 나타낸 데이터로, NCC-S3M 이소성 이형이식편은 SCID 마우스의 NCC-S3 이형이식편보다 더 빨리 성장하였으며, NCC-S3M 이소성 이형이식편은 일차 종양의 부피가 약 2500 mm3에 도달 시 일관되게 폐 전이를 발전시키는 것을 확인하였다 (표 2).
반면, NCC-S3 이형이식편은 10% 만이 전이가 발달되었으며, 이는 NCC-S3 세포에 비하여, NCC-S3M 세포들의 향상된 종양형성능 및 전이능을 가지는 것을 의미한다.
나아가, 본 발명에서 분리한 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 실제로 Wnt/β-카테닌(β-catenin) 시그널이 활성화 되었는지 확인하기 위해, TCF/LEF1, β-카테닌 발현정도, Mmp3 및 Mmp14의 mRNA 발현정도 및 Wnt5a, Wnt10b 및 Fzd8의 mRNA 발현정도를 측정하였다.
도 9는 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 Tcf/Lef1(T-cell factor/lymphoid enhancer factor) 활성을 리포터어세이로, NCC-S3M 세포주에서 TCF/LEF1 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 상기 "TCF/LEF1"은 Wnt/β-catenin 신호전달과정에서 DNA와 결합하는 전사인자로 작용하며, β-catenin이 존재하지 않을 때는 TCF/LEF1은 Groucho, CtBP, HIC-5 같은 co-repressor들과 함께 전사억제인자로 작용하다가 β-catenin이 존재할 때는 전사활성인자로 바뀌어 작용하게 된다.
도 10은 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 β-catenin 발현 여부를 측정한 것으로, 두 개의 위암 세포주 모두 β-catenin이 발현되는 것을 확인하였으며, β-catenin의 타겟 유전자로 알려진 Mmp3 및 Mmp14의 mRNA가 NCC-S3M 세포주에서 과발현 되는 것을 확인하였다 (도 11).
또한, 도 12에 나타난 바와 같이 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 Wnt5a, Wnt10b 및 Fzd8(frizzled-8)의 mRNA 발현정도를 측정한 결과, NCC-S3M 세포주는 NCC-S3 세포주에 비해 Wnt5a, Wnt10b 및 Fzd8(frizzled-8)의 mRNA 발현이 각각 3배, 10.5배 및 5배 증가한 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에서 확립한 NCC-S3M 세포주는 실제로 Wnt/β-catenin 신호전달과정이 활성화 되어 있는 것을 확인하였으며, 상기 전이성 세포주인 NCC-S3M 세포주의 전이성 표현형이 β-카테닌 신호 경로의 활성화를 통해 부분적으로는 EMT에 기인할 수 있다는 것을 제시하고 있다.
본 발명에서는 우리는 인간 위암을 밀접하게 모사하고 있고 면역요법 제제를 시험하는 데 유용한 마우스 유래 위암 세포주인 NCC-S3 및 NCC-S3M를 확립하고, 이들 세포주를 한국세포주은행에 2014년 07월 10일 날짜로 기탁하였다 (NCC-S3 세포주: 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320, NCC-S3M 세포주 : 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321).
따라서, 본 발명의 E-cadherin 및 p53이 결손된 마우스 유래 위암 세포주는 조직병리학적 특징이 인체 위암과 유사하고, 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 표현형 및 β-카테닌(β-catenin) 경로가 활성화되어 있고, 면역이 결핍된 마우스에서 높은 전이성 및 면역을 가진 마우스에서의 발암 잠재성으로 생체 내 암 성장을 촉진시키는 것을 확인하였으므로, 항암신약의 활성평가 및 전이 억제제의 발굴에 활용될 수 있다.
본 발명은, (a) 상기 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주 및 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 위암세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 위암 세포를 억제하는 정도를 측정하는 단계를 포함하는 위암 치료제 후보물질의 효능평가 방법을 포함한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주 및 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 위암세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 위암 세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법을 포함한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주 및 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 위암세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 위암 세포의 전이를 억제하는 정도를 측정하는 단계를 포함하는 위암 치료제 후보물질의 효능평가 방법을 포함한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320의 위암 세포주 및 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 위암세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 위암 세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법을 포함한다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
자연발생 위암 마우스의 제작
1-1 : 자연발생 위암 마우스 제작
본 발명에서는 마우스 유래 위암 세포주를 분리하기 위해 면역 능력을 가진 마우스에서의 동소이식모델(orthotopic allograft models)을 수립하였으며, Pdx1-cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스를 생성하여 자연적으로 형성된 위선암으로부터 위암세포주를 분리하였다.
Pdx1-cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스는 이전에 공지된 방법(Park JW, et al ., Mol Cancer Res ., 2014)을 사용하여 제조하였으며, Pdx1-cre-음성, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스를 사용하여 면역생성능 마우스에서 이형이식편을 생성하였다. 중증 복합형 면역부전증 (SCID) 마우스는 오리엔트바이오 (성남, 한국)에서 구입하여 사용하였으며, 모든 동물 관리 및 수술 절차는 국립암센터의 동물 관리 및 사용위원회와 국립암연구소 (National Cancer Institute)에 의해 승인되었다.
1-2 : 종양에 대한 육안 및 조직병리학적 관찰
실시예 1-1에서 제작한 Pdx1-cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스에서 원발종양의 발생여부를 확인하기 위하여, 부검 후 육안 및 조직병리학적 관찰을 수행하였다.
구체적으로, 하룻밤 동안 금식한 마우스를 이소플루레인(isoflurane)을 이용하여 안락사시키고, 위장관(gastrointestinal tract)을 바로 제거하였다. 위(stomach)는 가위를 이용하여 큰만곡(greater curvature)을 따라 절제되어 여과지에 조각을 펼쳐놓은 다음, 차가운 PBS로 씻어낸 후, 전체적인 관찰을 수행하였다.
그 후, 상기 조직들은 당업계에 널리 알려진 방법으로 조직 샘플을 수득하여 10% 완충포르말린(neutral buffered formalin) 용액에 24시간 고정시킨 다음, 파라핀 왁스로 블럭(embedded)을 제하였다. 상기 파라핀 블록은 5 ㎛ 횡단면(cross section)을 잘라내어 병리조직학적시험을 위한 H & E(Hematoxylin and Eosin)염색을 수행하였다. 상기 H & E 염색은 당업계의 당업자라면 누구나 알 수 있는 보편적인 방법으로 수행되었다.
면역조직화학적(immunohistochemistry)분석은 공지된 방법(Park JW, et al ., Mol Cancer Res ., 2014)으로 수행하였으며, ABC 방법(Vectastain Elite ABC kit and Vectastain M.O.M. kit)을 사용하였다.
간략하게는 상기에서 5 ㎛ 두께로 절편된 조직(slide)을 탈지(dewaxed) 및 재수화(rehydrated) 시킨 다음, 항원복구(antigen retrieval)를 위해 0.01 M 시트레이트 버퍼(citrate buffer; pH 6.0)에서 100℃ 조건으로 20분 동안 가열하였다. 그 다음 슬라이드는 과산화 효소(endogenouse peroxidase) 활성을 차단하기 위해 3% 과산화수소에서 3분 동안 침지시켰으며, 비특이적인 결합을 감소시키기 위해, 키트에 포함된 블로킹 시약(blocking reagents)에서 슬라이드를 반응시킨 다음, 희석된 1차 항체를 처리하여 상온에서 20분 동안 반응시켰다.
상기 1차 항체는 p53(rabbit polyclonal anti p53 antibody (1:100; Santa Cruz, sc-6243) 및 E-cadherin(rabbit polyclonal anti E-cadherin antibody (1:200; Cell Signaling, #3195)에 특이적인 항체를 사용하였다.
그 후, 1차 항체에 특이적인 2차 항체(biotinylated secondary antibody)를 처리하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 다음, ABC 시약(ABC reagent)을 처리하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 발색(colorimetric detection)을 위해 ImmPact DAB 기질(Vector Laboratories, SK-4105)을 처리하였으며, 10초간 Mayer's hematoxylin 시약을 처리하여 대비염색(counterstaine)을 수행하였다.
음성 대조군은 1차 항체의 처리를 생략하고, 희석제로 대체하여 반응을 수행하였으며, 각각의 마커의 양성 염색은 배경에 비해 더 명백하고 깊게 염색되었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 상기 마우스에서 분리한 종양은 인간미만형위암종과 유사한 형태를 가지는 것을 확인하였으며, 정상조직과 상기 종양조직에서 발현되는 p53 및 E-cadherin의 발현을 면역조직학적으로 관찰한 결과(도 1 ⅳ), Pdx1-Cre, Trp53F /F, Cdh1F /F 마우스에서 형성된 일차 종양 조직에서 E-cadherin 및 p53의 단백질 발현이 되지 않는 것을 확인하였다.
마우스 유래 암 조직에서 초대 배양 및
위암세포주
확립
본 발명에서는 위암 세포주 확립을 위해, 실시예 1에서 분리한 종양 조직을 이용하여 초대 배양(primary culture)을 수행하였다.
구체적으로, 실시예 1의 마우스 모델의 위에서 관찰된 위 종양조직을 절제하고, 차가운 PBS로 세척하여, 세척된 종괴를 소량의 RPMI1640 배지가 담긴 세포 배양접시(tissue culture dish)로 옮긴 후, 종괴를 외과용 메스(surgical blade)로 잘게 다져 작은 조각으로 만들고 수차례 파이펫팅(pipetting)을 통해 더 작은 조각으로 만들었다. 상기 잘게 부셔진 종괴를 20% FBS, 100 U/ml 페니실린(penicillin) 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함한 RPMI1640 배지가 담긴 25 cm2 플라스크에 접종(seeding) 하였다. 충분한 정도의 종양세포집단(tumor cell population)의 형성 및 심각한(heavy) 종양세포 성장이 관찰되었을 때, 트립신처리(trypsinization)을 통해 1차 계대를 수행하였다. 1차 계대 이후로는 10% FBS를 포함한 RPMI1640을 이용하여, 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다 (계대 수 11 내지 15).
그 결과, E-cadherin 및 p53이 결손된 위암세포주를 분리하여 NCC-S3으로 명명하였다. 도 2A는 상기에서 분리한 NCC-S3를 세포 배양용기에서 배양하였을 때, 세포 형태학(morphology)를 관찰한 것으로, NCC-S3 세포주는 상피 세포 형상을 보이는 것을 관찰하였다.
NCC
-
S3
세포주 특성 파악
3-1 :
웨스턴블랏을
이용한 특성 파악
본 발명에서는 실시예 2에서 분리한 NCC-S3 세포주의 특성을 파악하고, 인간 위암 세포주와 유사성을 보이는지 확인하기 위해 판사이토케라틴(pan-cytokeratin) 및 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)의 발현 정도(도 3A)와 EGFR, p-Erk, p-Akt, Myc 및 cyclin D1의 발현정도(B)를 웨스턴블랏으로 측정하였다.
먼저, 확립된 위암 세포에서 단백질을 분리하기 위해, 프로테아제 저해제(protease inhibitor; 0.8 M aprotinin, 20 M leupeptin, 10 M pepstatin A, 40 M bestatin, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) 및 포스파타아제 저해제(phosphatase inhibitor; 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium pyrophosphate dehydrate, 1 mM sodium orthovanadate)를 추가한 TPER 시약(Tissue Protein Extraction Reagent; Thermo Fisher Scientific, 미국)을 처리하였다.
마우스 유래 위암 세포주의 핵 단백질 분리는 Qproteome nuclear protein extraction kit (Qiagen, 미국)을 사용하여 매뉴얼에 따라 분리하였으며, 분리된 단백질의 농도는 BCA reagent kit (Thermo Fisher Scientific, 미국)을 사용하여 매뉴얼에 따라 수행하였다.
정량된 단백질은 공지된 방법(Park JW, et al ., Mol Cancer Res ., 2014)을 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴블랏을 수행하였으며, 웨스턴블랏 수행을 위한 1차 항체는 판사이토케라틴(pan-cytokeratin), PCNA, EGFR, p-Erk, p-Akt, Myc 및 cyclin D1에 특이적인 항체를 사용하였으며, 각각의 단백질에 대한 항체는 다음과 같다: mouse monoclonal anti pan-cytokeratin (1:1000; Santa Cruz, sc-8018), mouse monoclonal anti PCNA antibody (1:1000, Santa Cruz, sc-56), rabbit polyclonal anti c-Myc antibody (1:1000; Abcam, ab32072), rabbit polyclonal anti EGFR antibody (1:1000; Santa Cruz, sc-03), rabbit polyclonal anti p-Akt1/2/3 (Thr 308) antibody (1:1000, Santa Cruz, sc-16646-R), rabbit monoclonal anti Cyclin D1 antibody (1:1000, Cell Signaling, #2978S) 및 mouse monoclonal anti GAPDH antibody (1:1000, Santa Cruz, sc-32233).
단백질 레벨은 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출 키트(Thermo Fisher Scientific Inc., 미국)용액을 사용하여 Fuji LAS-3000 시스템 (Fujifilm, 일본)으로 측정한 다음, ImageJ software (http://imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 각 밴드의 밀도를 측정하고 GAPDH와의 노멀라이제이션(normalization)을 수행하였다.
대조군으로 사용한 정상세포(mouse conditionally immortalized stomach epithelial cells; ImSt), 및 인간 위암 세포주인 AGS는 10% FBS(Fetal bovine serum; Gibco, 미국) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-streptomycin; Invitrogen, 미국)이 포함된 RPMI 1640(Royal Park Memorial Institute; Gibco, 미국) 배지를 사용하여 배양하였으며, 마우스 배아 섬유아세포인 NIH-3T3은 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-streptomycin)이 포함된 DMEN(Gibco, 미국) 배지를 사용하여 배양한 다음, 상기와 같은 방법으로 단백질을 추출하여 웨스턴블랏을 수행하였다.
그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 인간 위암 세포주인 AGS와 본 발명에서 분리한 NCC-S3 세포주는 동일한 특성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
상기 결과는 본 발명에서 분리한 NCC-S3 세포주는 EGFR/MAPK 시그널이 활성화 되어 있으며, Wnt 타겟 분자인 Myc와 Cyclin D1이 과발현된 결과를 바탕으로 Wnt/β-카테닌(β-catenin) 시그널이 활성화 되어 있는 것을 유추할 수 있다.
또한, 상기 세포가 생성 되어진 일차 종양 조직에서 Myc 발현정도를 실시예 1-2과 동일한 방법으로 수행한 결과, 일차 종양에서 Myc 과발현이 검출된 것을 확인하였다.
3-2 : 유세포분석기(
Fluorescence
activated
cell
sorter
;
FACS
)를 통한 특성파악
NCC-S3에서 CD44, CD133, 및 EpCAM에 대한 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 분석을 위해서 FACSCalibur(BD Biosciences, 미국)을 사용하였으며 기기에 포함된 메뉴얼에 따라 분석을 수행하였다.
먼저, 실시예 2에서 배양한 NCC-S3 세포주에 트립신(trypsin)을 처리하여 세포 배양용기에 부착된 세포를 분리한 다음, rat anti-mouse CD133 PE (1:300; ebioscience, 12-1331-82), rat anti-mouse Epcam PE (1:200; ebioscience, 12-5791-82), rat anti-mouse CD44 FITC (1:200, ebioscience, 11-0441-82), rat IgG isotype control PE (BD pharminogen, 553930), 및 rat IgG isotype control FITC (ebioscience, 11-4031-81)를 각각 처리하여 세포를 염색하였으며, 염색반응은 4℃에서 30분 동안 어두운 환경(dark room)에서 부드럽게 교반하였다.
염색된 NCC-S3 세포주는 FACS sorting buffer(1 mM EDTA, pH 7.0 25 mM HEPES, 1% FBS 및 Ca2 +, Mg2 + free PBS)로 재현탁한 다음, FACSCalibur를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 NCC-S3 세포는 인간 위암에서 발현되고 있는 CD44, CD133, 및 EpCAM가 과발현되는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에서 확립한 NCC-S3 세포주는 인간 위암과 매우 유사한 것을 확인하였다.
전이성 능력이 향상된 위암 세포주 확립
본 발명에서는 NCC-S3 세포주 의외의 전이성 능력이 향상된 세포주를 확립하기 위해, NCC-S3 세포주를 SCID 마우스의 피하 조직이식 하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 1 x 106 개의 NCC-S3을 면역결핍 마우스의 옆구리에 주사하고 115일 후, 상기 마우스를 부검하였으며, 폐에서 전이소가 관찰되었다. 상기 전이소를 절제하여 실시예 2와 동일한 방법으로 세포주를 확립하였으며, 이를 NCC-S3M으로 명명하였다.
도 2B는 상기에서 분리한 NCC-S3M를 세포 배양용기에서 배양하였을 때, 세포 형태학(morphology)를 관찰한 것으로, NCC-S3M 세포주는 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 표현형을 가지고 있는 것을 확인하였다.
NCC
-
S3M
세포주의 전이성 확인
본 발명에서는 실시예 4에서 새로 수득한 위암 세포주(NCC-S3M)가 모세포(NCC-S3)에 비해EMT의 표현형을 띠고 있는지를 확인하기 위하여, EMT 활성화 전사 인자인 Snail 1, Snail 2, Zeb 1, Zeb 2, Twist 1 및 Twist 2 mRNA 발현 정도를 측정하였다.
먼저, 마우스 유래 위암 세포주에서 총 RNA를 분리하기 위해 AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit (Qiagen, 미국)을 사용하여 매뉴얼에 따라 수행하였으며, 분리된 0.3㎍의 총 RNA는 amfiRivertII Reverse Transcriptase(GenDEPOT, 미국)을 사용하여 키트에 제공된 매뉴얼을 참고로 cDNA를 합성하였다.
PCR 수행은 2× QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) 5 ㎕, 각 프라이머 400 nM 및 cDNA를 1:5로 희석시킨 물 2 ㎕에 총 부피가 10 ㎕가 되도록 물을 추가로 첨가한 다음, Roche LC480 (Roche Diagnostics, 독일)을 이용하여 수행하였다.
PCR에 수행된 각 프라이머는 마크로젠 (www.macrogen.com/kor/) 에 의뢰하여 합성하였으며, 각 프라이머의 서열정보는 하기 표 1과 같다.
| Name | sequence(5' -> 3') | 서열번호 | |
| Snail 1 | Forward | 5'-CACACGCTGCCTTGTGTCT-3' | 서열번호 1 |
| Reverse | 5'-GGTCAGCAAAAGCACGGTT-3' | 서열번호 2 | |
| Snail 2 | Forward | 5'-CCTTGGGGCGTGTAAGTCC-3' | 서열번호 3 |
| Reverse | 5'-TTCTCAGCTTCGATGGCATGG-3' | 서열번호 4 | |
| Zeb 1 | Forward | 5'-TGATGAAAACGGAACACCAGATG-3' | 서열번호 5 |
| Reverse | 5'-GTTGTCCTCGTTCTTCTCATGG-3' | 서열번호 6 | |
| Zeb 2 | Forward | 5'-AGCGACACGGCCATTATTTAC-3' | 서열번호 7 |
| Reverse | 5'-GTTGGGCAAAAGCATCTGGAG-3' | 서열번호 8 | |
| Twist 1 | Forward | 5'-GGACAAGCTGAGCAAGATTCA-3' | 서열번호 9 |
| Reverse | 5'-CGGAGAAGGCGTAGCTGAG-3' | 서열번호 10 | |
| Twist 2 | Forward | 5'-ACGAGCGTCTCAGCTACGCC-3' | 서열번호 11 |
| Reverse | 5'-AGGTGGGTCCTGGCTTGCGG-3' | 서열번호 12 | |
| GAPDH | Forward | 5'-GGTCGGTGTGAACGGATTTG-3' | 서열번호 13 |
| Reverse | 5'-GTGAGTGGAGTCATACTGGAAC-3' | 서열번호 14 | |
실시간 PCR은 하기의 조건으로 수행하였다; 95℃에서 15분 반응시킨 다음, 94℃에서 20초, 57℃에서 20초, 72℃에서 20초를 1 사이클(cycle)로 하여 55 사이클을 반복하였으며, 데이터 분석은 LC480 software(Roche Diagnostics)를 이용하여 수행하였다.
상대적인 mRNA의 발현량은 ΔΔCT 방법을 사용하여 계산하였으며, 각 유전자의 mRNA 레벨은 GAPDH를 이용하여 노멀라이제이션(normalization) 하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, NCC-S3M는 NCC-S3에 비해 Snail 1, Snail 2, Zeb 1, Zeb 2, Twist 1 및 Twist 2 mRNA 발현이 모두 증가하는 것을 확인하였으며, NCC-S3M의 전이력은 NCC-S3에 비해 현저하게 향상된 것을 확인하였다.
NCC
-
S3
및
NCC
-
S3M
세포주의 E-
cadherin
및
p53
발현 확인
본 발명에서는 실제로 E-cadherin 및 p53의 발현이 결손되었는지 확인하기 위해, 실시예 3과 동일한 방법으로 웨스턴블랏을 수행하였으며, 추가로 Smad4 및 비멘틴(vimentin)의 발현량도 측정하였다.
웨스턴블랏을 수행하기 위한 1차 항체는 다음과 같다: rabbit polyclonal anti E-cadherin antibody (1:1000; Cell Signaling, #3195), mouse monoclonal anti smad4 antibody (1:1000; Santa Cruz, sc-7966), rabbit polyclonal anti p53 antibody (1:1000; Santa Cruz, sc-6243), rabbit monoclonal anti vimentin antibody (1:1000; Cell signaling, #5741), mouse monoclonal anti E-catenin antibody (1:1000; BD, 610154),
그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, NCC-S3 및 NCC-S3M 모두 E-cadherin과 p53을 발현하지 않은 것을 관찰하였으며, 비멘틴은 NCC-S3M 세포주에서만 과발현되는 것을 관찰하였다.
NCC
-
S3
및
NCC
-
S3M
세포주의
종양형성
능력 확인
본 발명에서 확립한 두개의 위암 세포주의 종양형성 능력 및 전이능력을 확인하기 위해, 마우스 위암 세포의 이소성 이형이식편을 생성하였다.
먼저, 1×106 개의 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주 각각을 면역력이 결핍된 SCID(severe combined immunodefi-ciency mouse) 마우스 및 동계(syngenic) 유전자성 마우스의 피하 옆구리 조직에 주입하였다. 그 후, 종양 부피가 2,500 ㎣에 달할 때 부검을 실시하였다. 종양 부피(V)는 하기 수학식 1을 사용하여 계산하였다:
[수학식 1]
V = 1/2 x a x b2
상기 식에서 a 및 b는 각각 종양괴의 최장 및 최단 직경이다.
| 이소성 주입 | ||
| NCC-S3 | NCC-S3M | |
| 폐 전이의 빈도 | 1/10 | 9/9 |
| 이소성 주입 | ||
| NCC-S3 | NCC-S3M | |
| 종양 형성 여부 | 3/10 | 9/10 |
도 8에 나타난 바와 같이, NCC-S3M 이소성 이형이식편은 SCID 마우스의 NCC-S3 이형이식편보다 더 빨리 성장하였으며, NCC-S3M 이소성 이형이식편은 일차 종양의 부피가 약 2500 ㎣에 도달 시 일관되게 폐 전이를 발전시키는 것을 확인하였다. 또한 면역을 가진 마우스에서 NCC-S3M이 NCC-S3에 비해서 향상된 종양 형성능을 보였다.
반면, NCC-S3 이형이식편은 10% 만이 전이가 발달되었으며, 이는 NCC-S3 세포에 비하여, NCC-S3M 세포들의 향상된 종양형성능 및 전이능을 가지는 것을 의미한다.
NCC
-
S3
및
NCC
-
S3M
세포주의
Wnt
/β-
카테닌
(β-
catenin
) 시그널 활성 확인
본 발명에서는 분리한 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 실제로 Wnt/β-카테닌(β-catenin) 시그널이 활성화 되었는지 확인하기 위해, TCF/LEF1, β-카테닌 발현정도, Mmp3 및 Mmp14의 mRNA 발현정도 및 Wnt5a, Wnt10b 및 Fzd8의 mRNA 발현정도를 측정하였다.
8-1 :
TCF
/
LEF1
리포터 활성 측정
β-catenin 활성은 TCF/LEF1 리포터 어세이(reporter assay) 방법으로 측정하였으며, TCF/LEF1은 Wnt/β-catenin 신호전달과정에서 DNA와 결합하는 전사인자로 작용하는 것으로 알려져 있다.
β-catenin 활성 측정을 위해서 TCF/LEF 리포터 어세이 키트(CCS-018L, SA Biosciences, 미국)을 사용하였으며, 먼저 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주가 각각 2 x 105 개가 되도록 1㎖ Opti-MEM 배지(Life Technologie, 미국)에 현탁시킨 다음, 12-웰 플레이트(12 well plate)에 접종하였다.
상기 접종된 세포에 Lipofectamine 2000 형질감염 시약(Life Technologies, 미국)를 사용하여 Tcf/Lef 리포터 플라스미드(Tcf/Lef reporter plasmid)를 혼합하여 형질감염시켰다 (transiently transfected). 형질감염 24시간 후, Opti-MEM 배지를 0.5% FBS가 포함된 RPMI 1640으로 교환하였으며, 그 후 48시간 동안 배양하였다.
루시퍼레이즈 어세이(luciferase assays)는 듀얼 루시퍼레이즈 리포터 어세이 시스템(dual luciferase reporter assay system; Promega, 미국)을 사용하여 매뉴얼에 따라 수행하였다. 발광(Light emission)은 Victor 3 1420 루미네센스 마이크로플레이트 리더(Victor 3 1420 luminescence microplate reader; Perkin-Elmer, 미국)을 사용하여 정량화하였으며, 시그널은 내부 레닐라(Renilla) 대조군을 사용하여 형질전환 효율을 노말라이제이션(normalization) 시켰다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, NCC-S3M 세포주에서 TCF/LEF1 활성이 증가하는 것을 확인하였으며, NCC-S3M 세포의 모세포인 NCC-S3 세포주에 비해 활성이 증가한 것을 확인하였다.
8-2 : β-
catenin
단백질 발현량 측정
β-catenin 단백질 발현량은 실시예 3과 동일한 방법으로 웨스턴블랏을 수행하였으며, 웨스턴블랏을 수행하기 위한 1차 항체는 mouse monoclonal anti β-catenin antibody (1:1000; BD, 610154)를 사용하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, NCC-S3M이 NCC-S3 보다 핵 내에서 β-catenin이 더 많이 발현되는 것을 확인하였다.
8-3 :
Mmp3
및
Mmp14
의
mRNA
발현 확인
본 발명에서는 β-catenin의 타겟 유전자로 알려진 Mmp3 및 Mmp14의 mRNA 발현 정도를 실시예 5와 동일한 방법으로 수행하였으며, PCR에 수행된 각 프라이머는 마크로젠 (www.macrogen.com/kor/) 에 의뢰하여 합성하였으며, 각 프라이머의 서열정보는 하기 표 4와 같다.
| Name | sequence(5' -> 3') | 서열번호 | |
| Mmp3 | Forward | 5'-GCAGTTGGAGAACATGGAGAC-3' | 서열번호 15 |
| Reverse | 5'- AATAGGTTGGTACCAGTGACATCC-3' | 서열번호 16 | |
| Mmp14 | Forward | 5'- CTTCAAGGAGCGATGGTTCTG-3' | 서열번호 17 |
| Reverse | 5'- TTGCCATCCTTCCTCTCGTAG-3' | 서열번호 18 | |
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, NCC-S3 세포주에 비해 NCC-S3M 세포주에서 Mmp3 및 Mmp14의 mRNA 발현정도가 각각 10배 및 3배 증가하는 것으로 측정되었으며, 즉, β-catenin의 시그널 활성화에 따라 NCC-S3M 세포주에서 Mmp3 및 Mmp14의 mRNA가 과발현되는 것을 확인하였다.
8-4 :
Wnt
시그널 확인
본 발명에서는 NCC-S3 및 NCC-S3M 세포주에서 Wnt 시그널이 활성화 되었는지 확인하기 위해 Wnt5a , Wnt10b 및 Fzd8(frizzled-8)의 mRNA 발현 정도를 실시예 5와 동일한 방법으로 수행하였으며, PCR에 수행된 각 프라이머는 마크로젠 (www.macrogen.com/kor/) 에 의뢰하여 합성하였으며, 각 프라이머의 서열정보는 하기 표 5와 같다.
| Name | sequence(5' -> 3') | 서열번호 | |
| Wnt5a | Forward | 5'-GCAGGCCGTAGGACAGTATA-3' | 서열번호 19 |
| Reverse | 5'-CCGCGCTATCATACTTCTCC-3' | 서열번호 20 | |
| Wnt10b | Forward | 5'-CTCAAGCGCGGTTTCCGTGA-3' | 서열번호 21 |
| Reverse | 5'-CTAAGCCGGTCTTGCTCACC-3' | 서열번호 22 | |
| Fzd8 | Forward | 5'-ACTCGCAGTACTTCCACCTG-3' | 서열번호 23 |
| Reverse | 5'-GGTTGTCAAGGCTCTGGTTG-3' | 서열번호 24 | |
도 12에 나타난 바와 같이, NCC-S3M 세포주는 NCC-S3 세포주에 비해 Wnt5a, Wnt10b 및 Fzd8(frizzled-8)의 mRNA 발현이 각각 3배, 10.5배 및 5배 증가한 것을 확인하였다.
즉, 본 발명에서 확립한 NCC-S3M 세포주는 실제로 Wnt/β-catenin 신호전달과정이 활성화되어 있는 것을 확인하였으며, 상기 전이성 세포주인 NCC-S3M 세포주의 전이성 표현형이 β-카테닌 신호 경로의 활성화를 통해 부분적으로는 EMT에 기인할 수 있다는 것을 제시하고 있다.
본 발명에서는 우리는 인간 위암을 밀접하게 모사하고 있고 면역요법 제제를 시험하는 데 유용한 마우스 유래 위암 세포주인 NCC-S3 및 NCC-S3M를 확립하고, 이들 세포주를 한국세포주은행에 2014년 07월 10일 날짜로 기탁하였다 (NCC-S3 세포주: 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320, NCC-S3M 세포주 : 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321).
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> NATIONAL CANCER CENTER
<120> Gastric Cancer Cell line Derived Murine Gastric Adenocarcinoma
Lacking p53 and E-Cadherin and Use Thereof
<130> 1041207
<160> 24
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Snail 1 Forward primer
<400> 1
cacacgctgc cttgtgtct 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Snail 1 Reverse primer
<400> 2
ggtcagcaaa agcacggtt 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Snail 2 Forward primer
<400> 3
ccttggggcg tgtaagtcc 19
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Snail 2 Reverse primer
<400> 4
ttctcagctt cgatggcatg g 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zeb 1 Forward primer
<400> 5
tgatgaaaac ggaacaccag atg 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zeb 1 Reverse primer
<400> 6
gttgtcctcg ttcttctcat gg 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zeb 2 Forward primer
<400> 7
agcgacacgg ccattattta c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Zeb 2 Reverse primer
<400> 8
gttgggcaaa agcatctgga g 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twist 1 Forward primer
<400> 9
ggacaagctg agcaagattc a 21
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twist 1 Reverse primer
<400> 10
cggagaaggc gtagctgag 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twist 2 Forward primer
<400> 11
acgagcgtct cagctacgcc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Twist 2 Reverse primer
<400> 12
aggtgggtcc tggcttgcgg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Forward primer
<400> 13
ggtcggtgtg aacggatttg 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH Reverse primer
<400> 14
gtgagtggag tcatactgga ac 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mmp3 Forward primer
<400> 15
gcagttggag aacatggaga c 21
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mmp3 Reverse primer
<400> 16
aataggttgg taccagtgac atcc 24
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mmp14 Forward primer
<400> 17
cttcaaggag cgatggttct g 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mmp14 Reverse primer
<400> 18
ttgccatcct tcctctcgta g 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wnt5a Forward primer
<400> 19
gcaggccgta ggacagtata 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wnt5a Reverse primer
<400> 20
ccgcgctatc atacttctcc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wnt10b Forward primer
<400> 21
ctcaagcgcg gtttccgtga 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wnt10b Reverse primer
<400> 22
ctaagccggt cttgctcacc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fzd8 Forward primer
<400> 23
actcgcagta cttccacctg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fzd8 Reverse primer
<400> 24
ggttgtcaag gctctggttg 20
Claims (11)
- 삭제
- 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주.
- 제2항에 있어서, 상기 위암 세포주는 E-카데린(E-cadherin) 및 p53이 결손되어 있는 것을 특징으로 하는 위암 세포주.
- 제2항에 있어서, 상기 위암 세포주는 마우스(mouse) 유래인 것을 특징으로 하는 위암 세포주.
- 제2항에 있어서, 상기 위암 세포주는 Pdx1-cre, Trp53F/F, Cdh1F/F 마우스에서 자연적으로 형성된 위선암(gastric adenocarcinoma)으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 위암 세포주.
- 제2항에 있어서, 상기 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주는 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00320 위암 세포주의 이소성 이형이식편 (heterotopic allografts)의 폐 전이물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 위암 세포주.
- 제2항에 있어서, 상기 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주는 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 표현형을 가지며,
비멘틴(vimentin)이 과발현되어 있고,
Wnt/β-카테닌(β-catenin) 경로가 활성화되어 있는 것을 특징으로 하는 위암 세포주.
- (a) 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 위암 세포를 억제하는 정도를 측정하는 단계;
를 포함하는 위암 치료제 후보물질의 효능평가 방법.
- (a) 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주에 위암 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 위암 세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계;
를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법.
- (a) 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 위암 세포의 전이를 억제하는 정도를 측정하는 단계;
를 포함하는 위암 치료제 후보물질의 효능평가 방법.
- (a) 한국 세포주 은행 기탁번호 KCLRF-BP-00321의 위암 세포주에 위암의 전이 억제제 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 위암 세포의 면역 치료에 대한 안전성을 측정하는 단계;
를 포함하는 면역 치료에 대한 안전성 평가방법.
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Non-Patent Citations (1)
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| 박사학위논문(2014) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2025150936A1 (ko) * | 2024-01-09 | 2025-07-17 | 국립암센터 | Cldn18.2 타겟 약물의 효능 및 안전성 평가를 위한 cldn18.2 발현 위암 세포주 및 이를 포함하는 동물 모델 |
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