KR101633703B1

KR101633703B1 - necro X-5를 유효성분으로 포함하는 방사선 조사에 의한 세포손상 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101633703B1
Application number: KR1020140193135A
Authority: KR
Inventors: 배상우; 손민식
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2016-06-27
Anticipated expiration: 2034-12-30

Abstract

본 발명은 necro X-5를 유효성분으로 포함하는 방사선 조사에 의한 세포손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 방사선 조사에 의해 발생하는 활성산소 및 염증반응은 정상세포 괴사 등의 부작용 또는 암세포의 방사선 저항성을 증가시킬 수 있어 혈관세포주인 HUVEC 세포에서 방사선 조사 후 발현량이 크게 변화되는 MCP-1의 유전자 또는 그 발현 단백질을 necro X-5의 처리를 통하여 감소시킬 수 있으며, 또한, 이를 통하여 방사선 치료 부작용을 억제하고 방사선 치료 효과를 한층 증진시킬 수 있다.

Description

necro X-5를 유효성분으로 포함하는 방사선 조사에 의한 세포손상 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating of irradiation induced cell damage comprising necro X-5}

본 발명은 necro X-5를 유효성분으로 포함하는 방사선 조사에 의한 세포손상 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

방사선 치료는 수술, 항암제 치료와 함께 3대 암 치료법의 하나로 높은 에너지의 방사선으로 종양 부위를 조사하여 유전자 손상 반응 등을 통한 세포 사멸을 유도하여 치료하는 방식이다. 방사선 치료는 지난 수십 년간 다양한 종류의 암에 필수적인 치료 방법으로 사용되어 왔으나, 암세포의 방사선 저항성 획득, 생체 물질의 이온화에 따른 활성산소 증가와 이에 따른 정상 조직 손상 등의 부작용이 방사선 치료의 문제점으로 대두되어 왔다.

따라서, 이러한 방사선 치료의 효율을 증대시키고 부작용을 저하시키기 위하여 방사선 조사에 의해 발생하는 활성산소, 염증반응 등을 억제하는 연구는 암의 치료와 환자의 회복을 위해 매우 중요한 요소이다. 방사선 치료의 효과를 최대화시켜 다양한 암 질환을 효과적으로 치료하기 위해서 상기 문제점이 해결되어 부작용을 예방하거나 최소화할 수 있는 치료방법의 개발이 요구된다.

necro X-5는 세포 내로 침투할 수 있는 necrosis 저해제로 알려져 있으며, 이 전 연구들을 통해 항산화 작용 효과와 미토콘드리아 내의 칼슘 축적 저해를 통한 세포 및 조직 손상 억제 등이 보고되었으나, 방사선 조사에 따른 활성산소 생성과 염증반응 억제에 관한 보고는 없는 실정이다.

한국공개특허 10-2012-0116520 (2012.10.23 공개)

본 발명의 목적은 necro X-5를 유효성분으로 포함하는 방사선 조사에 의한 세포손상 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, necro X-5를 유효성분으로 포함하여 방사선 치료시 방사선 조사에 따른 정상 세포의 손상을 예방 또는 치료하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 방사선 조사에 의해 발생하는 활성산소 및 염증반응은 정상세포 괴사 등의 부작용 또는 암세포의 방사선 저항성을 증가시킬 수 있어 혈관세포주인 HUVEC 세포에서 방사선 조사 후 발현량이 크게 변화되는 MCP-1의 유전자 또는 그 발현 단백질을 necro X-5의 처리를 통하여 감소시킬 수 있으며, 또한, 이를 통하여 방사선 치료 부작용을 억제하고 방사선 치료 효과를 한층 증진시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예(실시예 2)에 따라 수행한 RT-PCR(1) 및 실시간 PCR(2) 분석 결과에 따른 염증인자의 발현양상의 변화를 나타낸 것이다.
도 2은 본 발명의 일실시예에 따라 혈관세포로부터 분비되는 사이토카인 및 케모카인의 변화를 나타낸 것이다.
도 3는 본 발명의 일실시예에 따라 방사선조사에 의한 혈관세포의 활성산소(Reactive oxygen species)의 발생량을 나타낸 것이다.
도 4는 염증유발 유전자의 전사인자를 세포핵과 세포질의 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 것이다.

본 발명자들은 방사선 피폭 또는 조사시에 발생할 수 있는 부작용을 최소화하기 위한 연구를 하던 중, necro X-5가 사람의 혈관세포에서 방사선 조사에 의한 활성산소 생성 및 염증반응을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 necro X-5를 유효성분으로 포함하는 방사선 조사에 의한 세포손상 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상세하게는, 상기 세포손상은 방사선 치료시 정상 세포의 손상일 수 있으며, 상기 세포 손상은 활성산소를 증가시키고, 염증반응을 증가시킬 수 있다.

상세하게는, 상기 세포는 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "necro X-5"는 하기 화학식 1과 같이, 인돌 구조를 가진 화합물로 멜라토닌과 같은 항산화 활성을 가진 것으로 알려져 있으며 특히 미토콘드리아 ROS (reactive oxygen species)와 RNS (reactive nitrogen species)를 제거하는 작용기전을 가지는 것으로 알려져 있다.

[화학식 1]

본 명세서에서 "혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)"는 주로 혈관운동성 및 투과성, 혈액응고 및 분해, 염증세포나 혈관평활근세포의 이동인 증식을 조절함으로써 혈관의 항상성을 유지시키는 기능을 한다. 혈관내피세포가 손상되면 염증 반응과 함께 섬유화 증식을 초래하여 일련의 동맥경화증을 발생 또는 악화시킨다고 알려져 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제 또는 기능성 식품의 형태로 제공될 수 있다.

즉, 본 발명은 necro X-5을 유효성분으로 함유하는 방사선 조사에 의한 세포손상의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로즈 또는 락토오즈, 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물의 유효성분인 necro X-5의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, necro X-5의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 necro X-5을 유효성분으로 함유하는 방사선 조사에 의한 세포손상의 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제공한다. 이때, 상기 기능성 식품은 건강 기능식품 또는 건강음료의 형태로 제공될 수 있으며, 기능성 음료, 환제, 정제 또는 상기 성분을 건조 분말화하여 충진한 연질 또는 경질 캡슐제의 형태로 이용하는 것이 바람직하다.

상기 기능성 식품은 necro X-5 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 기능성 식품에 함유된 necro X-5의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 기능성 식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포주, necro X-5 처리 및 방사선 조사

사람 혈관세포주인 HUVEC 세포는 EGM2 미디어(CC-3162, Lonza)에서 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 비교군으로 DMSO를 처리하였고, 10 ~ 20μM necro X-5(ALX-430-167-M005, Enzo)를 처리하여 1시간 동안 세포와 반응시켰다. 방사선 조사는 감마선을 조사하였고, 이것은 ¹³⁷Cs γ-선 소스 (Atomic Energy of Canada, Ltd, Canada)를 사용하였다.

< 실시예 2> RT - PCR 및 실시간 PCR 을 통한 유전자 발현양 분석

1. RT - PCR 분석

뽑아놓은 RNA을 정량해서 2㎍의 RNA에 올리고 dT, dNTP를 넣고 65℃에서 5분간 가열하고 얼음에 꽂아 식혔다. 여기에 5X First strand buffer (invitrogen superscript II kit), 0.1M DTT, RNase 억제제를 넣고 42℃에 2분 가열 후, 1㎕의 superscript II를 넣고 42℃에서 1시간 방치한 뒤, 70℃에서 15분을 가열하여 반응을 종료시켜 cDNA를 합성하였다. 이렇게 합성한 cDNA를 가지고 각각의 프라이머에 맞는 어닐링 온도를 잡아 PCR을 수행하였다.

2. 실시간 PCR 분석

cDNA를 qPCR SYBR Green 2X Master Mix Kit (18303, M.biotech)를 이용하여 혼합물을 만든 뒤, CFX96 Touch real time PCR detection system (Biorad)를 이용하여 실시간 정량 역전사중합효소 PCR을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머 시퀀스는 하기 표 1과 같다.

순서	유전자명	실시간 PCR 프라이머 시퀀스
1	GAPDH	Forward: GCCATCAATGACCCCTTCATT (서열번호 1) Reverse: TTGACGGTGCCATGGAATTT (서열번호 2)
2	IL-1α	Forward: GAATGACGCCCTCAATCAAAGT (서열번호 3) Reverse: TCATCTTGGGCAGTCACATACA (서열번호 4)
3	IL-1β	Forward: AAATACCTGTGGCCTTGGGC (서열번호 5) Reverse: TTTGGGATCTACACTCTCCAGCT (서열번호 6)
4	MCP-1	Forward: ACTCTCGCCTCCAGCATGAA (서열번호 7) Reverse: TTGATTGCATCTGGCTGAGC (서열번호 8)
5	COX1	Forward: TGCCCAGCTCCTGGCCCGCCGCTT (서열번호 9) Reverse: GTGCATCAACACAGGCGCCTCTTC (서열번호 10)
6	COX2	Forward: GTTTGCATTCTTTGCCCAGC (서열번호 11) Reverse: CAGGCACCAGACCAAAGACC (서열번호 12)

그 결과, 도 1과 같이 HUVEC 세포에서 방사선에 의해서 IL-1α, IL-1β의 발현이 증가되고 MCP-1의 발현이 급격히 증가되었으며, necro X-5에 의해 MCP-1의 발현을 효과적으로 억제할 수 있음을 RT-PCR로 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 사이토카인 어레이를 통해 세포에서 분비되는 염증인자의 확인

HUVEC 세포를 1×10⁵ 개의 세포수로 60 mm plate에 분주하여 24 시간 배양한 후, 방사선 조사(10Gy)를 실시하여 24시간 배양하였다. HUVEC 세포로부터 분비되는 사이토카인 및 케모카인을 포함하고 있는 미디어를 분리하여 Human cytokine array kit, Panel A(ARY005, R&D systems)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 염증인자의 분비량을 확인 하였다.

그 결과, 도 2와 같이 방사선 조사에 의해 HUVEC 세포에서 RT-PCR 결과와 유사하게 MCP-1의 분비량이 증가되고, necro X-5에 의해 MCP-1의 분비를 억제할 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 4> DHR123 에 의한 활성산소 분석

DHR 123(Dihydrorhodamine 123)은 본래 형광을 띄지 않지만 활성산소에 의해 환원되어 형광을 발색하며, 이를 감지하여 활성산소의 양을 분석하는 실험방법을 사용하였다. HUVEC 세포는 5×10⁴ 개의 세포수로 6 well plate에 분주하여 24 시간 배양하였다. DMSO 또는 10μM necro X-5를 처리하여 1시간 동안 세포와 반응시킨 후 방사선 조사(10Gy)를 실시하여 3시간 동안 배양하였다. 세포를 회수하기 30분 전 1×PBS로 세척하고, 0.75μM DHR123을 반응시켰다. 세포는 차가운 1×PBS로 두 번 수세한 다음 plate에서 긁어내어 세포를 모았다. 모은 세포에 RIPA 완충액 (50 mM Tris-Cl (pH8.0), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 0.1% 데옥시콜레이트, 프로테아제 억제제, 포스파타아제 억제제)로 세포를 용해하여 세포내 성분을 추출하였다. 추출한 세포성분은 형광분석기(PerkinElmer2030 VICTOR×2)를 이용하여 exitation/emission = 485nm/520nm 파장에서 분석하였다. 발생한 활성산소의 양은 브래드포드(Bradford) 방법으로 단백질을 정량하여 세포의 단백질양에 대한 DHR123 형광 발생의 상대적 양으로 정의하였다.

그 결과, 도 3과 같이 necro X-5는 세포의 활성산소를 감소시킬 수 있으며 방사선 조사에 의해 증가된 활성산소도 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 5> necro X-5 처리 후 방사선 조사에 따른 세포핵과 세포질 내의 영향 분석

1. 세포핵과 세포질의 단백질 분리

HUVEC 세포를 각각 5×10⁵ 개의 세포수로 100 mm plate에 분주하여 24 시간 배양하였다. 배양한 세포를 차가운 1×PBS로 두 번 수세한 다음 plate에서 긁어내어 세포를 모았다. 모은 세포에 완충액 A (10 mM HEPES-KOH (pH7.9), 150 mM MgCl, 10mM KCl, 0.5mM DTT, 0.5mM PMSF, 프로테아제 억제제, 포스파타아제 억제제)로 세포막을 용해하여 세포질 단백질 분획을 획득하였다. 세포핵은 Extraction 완축액 (10mM HEPES (pH7.2), 422mM NaCl, 0.1mM EGTA, 0.5mM PMSF, 5.3% Glycerol)에서 초음파로 분쇄하여 세포핵 단백질 분획을 획득하였다.

2. 웨스턴 블롯 분석을 통한 단백질 변화 확인

추출한 세포핵과 세포질의 단백질 분획은 브래드포드(Bradford) 방법으로 정량하여 웨스턴 블롯 분석을 통하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다.

그 결과, 도 4와 같이 방사선 조사에 의해 MCP-1의 발현을 조절하는 전사인자인 NF-κB와 AP-1의 활성형인 p65와 c-jun의 인산화가 세포핵에서 모두 증가함을 확인할 수 있었고, necro X-5의 처리를 통해 세포질에서 IκB 단백질의 안정성에 기여하고, 세포핵에서 NF-κB와 AP-1의 활성을 모두 감소시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. MCP-1은 염증조직에서 분비되어 대식세포, NK 세포, T 세포 등의 면역세포를 염증부위로 유도하는 케모카인으로 광범위한 염증반응을 야기하고 암세포의 전이를 촉진한다는 연구결과가 보고되었으며, 전사인자인 NF-κB와 AP-1에 의해 발현이 조절되는 것으로 알려져 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Composition for preventing or treating of irradiation induced cell damage comprising necro X-5 <130> ADP-2014-0584 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gccatcaatg accccttcat t 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ttgacggtgc catggaattt 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaatgacgcc ctcaatcaaa gt 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcatcttggg cagtcacata ca 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aaatacctgt ggccttgggc 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tttgggatct acactctcca gct 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 actctcgcct ccagcatgaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ttgattgcat ctggctgagc 20 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgcccagctc ctggcccgcc gctt 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gtgcatcaac acaggcgcct cttc 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtttgcattc tttgcccagc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 caggcaccag accaaagacc 20

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 necro X-5를 유효성분으로 포함하는 방사선 조사에 의한 세포손상 예방 또는 치료용 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 세포손상은 방사선 치료시 정상 세포의 손상인 것을 특징으로 하는 방사선 조사에 의한 세포손상 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포 손상은 활성산소를 증가시키고, 염증반응을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방사선 조사에 의한 세포손상 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)인 것을 특징으로 하는 방사선 조사에 의한 세포손상 예방 또는 치료용 조성물.