KR101597812B1

KR101597812B1 - 후성유전학적 변화 및 전사체 통합분석을 통한 후성 유전학적 진단법 개발

Info

Publication number: KR101597812B1
Application number: KR1020150142996A
Authority: KR
Inventors: 안정혁
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2015-10-13
Filing date: 2015-10-13
Publication date: 2016-02-25
Anticipated expiration: 2035-10-13

Abstract

본 발명은 ZFP37 (zinc finger protein 37 homolog) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출함으로써, 난소암 환자의 백금 기반의 항암제 치료 반응성을 예측하기 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.

Description

후성유전학적 변화 및 전사체 통합분석을 통한 후성 유전학적 진단법 개발{Development of epigenetic diagnostic method using integrated epigenetic and transcriptomic analysis}

난소암은 여성암 중 사망률이 가장 높은 난치성 암질환으로, 최근 생활양식이 서구화되고 호르몬 대체요법이 확산되고 노령인구가 증가함에 따라 그 빈도가 꾸준히 증가하고 있다. 난소암의 경우 초기에는 뚜렷한 증상이 나타나지 않으므로 약 70% 이상의 환자가 3기 이상인 진행성 난소암으로 최초 발견되며 약 75% 이상의 환자에서 최초 치료 후 2년 내 재발 및 전이가 일어나는 것으로 보고되어 있다.

난소암은 초기에 발견되는 확률이 환자 전체의 15% 에 불과하며, 환자 전체의 65% 이상이 다른 조직에 전이가 발생된 채로 발견된다. 현재 난소암의 치료는 자궁, 난소, 림프절 등의 전이 병소 및 전이 의심 병소를 절제하는 외과적 수술과 파클리탁셀(paclitaxel) 또는 백금(platinum) 기반의 항암 화학요법을 병행하는 경우가 많다. 그러나, 현재의 치료법으로 80~90%는 초기에 양호한 반응을 보이나 최종적으로 10~15%만이 완전 관해에 이르며, 치료 이후에 재발된 환자는 65~75%가 항암 화학요법에 반응을 보이지 않는 것으로 보고되어 있어, 후속적인 치료가 매우 어렵다. 더욱이, 비슷한 임상적 특징을 가지는 환자들 중에서도 항암 화학요법에 대한 반응이 다양하게 나타나고, 같은 병기의 환자라 할지라도 환자의 생존에 상당한 차이를 보인다.

따라서, 치료에 대한 종양의 반응 여부를 잘 예측하고 특정 치료법에 효과적인 환자군을 선별할 수 있는 바이오마커가 요구되고 있다. 이러한 바이오마커의 개발은 환자의 생존율과 치료 효율을 높이는데 크게 기여 할 것으로 기대된다.

국내특허공개 제2011-0043097호(2011. 4. 27 공개)

이에, 본 발명에서는 항암제에 민감성을 나타내는 세포주와 항암제 내성을 나타내는 세포주로부터 게놈 DNA 와 RNA 를 추출하여, DNA 메틸레이션 마이크로어레이 및 유전자 발현 마이크로어레이 분석을 실시하였으며, 난소암 세포주들에서 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 및 프로모터 CpG의 DNA 메틸화 변화 정도의 유의성을 Pearson correlation 과 Spearman correlation 을 통해 분석하였다. 이들 결과를 통합 분석(integration analysis)하여, 항암제 치료 내성에 관여하는 유전자 중 DNA 메틸화에 의해 발현이 조절되는 유전자를 최종 선별하여, 이와 같이 유전자의 발현에 영향을 준 특정 CpG 부위를 확인하였다. 또한, 해당 유전자의 특정 CpG 위치에서 일어나는 메틸화 정도를 측정함으로써 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 EPS8L3(epidermal growth factor receptor pathway substrate 8-like 3), HSPA2(heat shock 70kDa protein 2), SYNPO(synaptopodin), ZNF93(zinc finger protein 93), ADD2(adducin 2), H1F0(H1 histone family, member 0), LRRC8B(leucine rich repeat containing 8 family, member B), SHC3(Src homology 2 domain containing transforming protein 3) 및 ZFP37(zinc finger protein 37 homolog)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준의 측정하여, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 EPS8L3, HSPA2, SYNPO 및 ZNF93 유전자 프로모터의 특정 CpG부위가 항암제 내성 세포에서 특이적으로 저메틸화되며 이에 의하여 상기 유전자의 발현이 특이적으로 증가한다는 것과, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 유전자 프로모터의 특정 CpG부위가 항암제 내성 세포에서 특이적으로 과메틸화되며 이에 의하여 상기 유전자의 발현이 특이적으로 감소한다는 것을 처음으로 밝혀내었으며, 상기 유전자들의 프로모터의 메틸화 정도를 바이오마커로서 이용하여 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하는 기술을 제공한다.

상기 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 유전자 프로모터의 CpG 는 각각 항암제 내성 세포에서 특이적인 메틸화 변화를 나타내므로, 이들 중 각각을 항암제에 대한 환자 반응성을 예측하기 위한 단독의 바이오마커로 사용하거나, 이들 중 2종 이상을 복합 바이오마커로 사용할 수도 있다.

따라서 하나의 양태로서, 본 발명은 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

일구현예로, 본 발명은 EPS8L3 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 조성물 및 키트는 HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

다른 일구현예로, 본 발명은 HSPA2 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 조성물 및 키트는 EPS8L3, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

다른 일구현예로, 본 발명은 SYNPO 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 조성물 및 키트는 EPS8L3, HSPA2, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

다른 일구현예로, 본 발명은 ZNF93 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 조성물 및 키트는 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

다른 일구현예로, 본 발명은 ADD2 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 조성물 및 키트는 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

다른 일구현예로, 본 발명은 H1F0 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 조성물 및 키트는 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

다른 일구현예로, 본 발명은 LRRC8B 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 조성물 및 키트는 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

다른 일구현예로, 본 발명은 SHC3 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 조성물 및 키트는 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

다른 일구현예로, 본 발명은 ZFP37 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 조성물 및 키트는 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B 및 SHC3로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 유전자는 공지된 유전자 데이터베이스에서 그 서열 정보를 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "메틸화" 또는 "메틸레이션"은 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 말한다. 바람직하게, 본 발명에서 메틸화 여부는 특정 유전자의 프로모터 부위의 특정 CpG 부위의 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부를 의미한다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 반대로, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다.

포유동물 세포의 게놈 DNA 에는 A, C, G 및 T 에 더하여, 사이토신 링의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.

본 발명에서 용어, "메틸화 수준의 측정"은 EPS8L3유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것으로서, 메틸화 특이적인 PCR, 예를 들어 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 또는 정량 PCR 등을 통해 측정할 수 있다. 또는, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱과 같은 자동염기분석 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게, 본 발명에서 EPS8L3 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 1번 염색체의 109763825 내지 109763946 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 CpG 부위의 염기 서열을 서열번호 1로 나타내었다.

더욱 바람직하게, 본 발명에서 EPS8L3 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 1번 염색체의 109763885 번째(서열번호 1의 61 번째) 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.

또한 바람직하게, 본 발명에서 HSPA2 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 14번 염색체의 64540187 내지 64540308 번째 염기, 64540272 내지 64540393 번째 염기, 64540659 내지 64540780 번째 염기, 64539999 내지 64540120 번째 염기, 64540165 내지 64540286 번째 염기, 64540549 내지 64540670 번째 염기, 64540318 내지 64540439 번째 염기, 64542323 내지 64542444 번째 염기, 64540734 내지 64540855 번째 염기, 64540045 내지 64540166 번째 염기, 64542487 내지 64542608 번째 염기, 또는 64542929 내지 64543050 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 CpG 부위의 염기 서열을 각각 서열번호 2 내지 서열번호 13으로 나타내었다.

더욱 바람직하게, 본 발명에서 HSPA2 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 14번 염색체의 64540247 번째(서열번호 2의 61 번째), 64540332 번째(서열번호 3의 61 번째) 또는 64540719 번째(서열번호 4의 61 번째), 64540059 번째(서열번호 5의 61 번째), 64540225 번째(서열번호 6의 61 번째), 64540609 번째(서열번호 7의 61 번째), 64540378 번째(서열번호 8의 61 번째), 64542383 번째(서열번호 9의 61 번째), 64540794 번째(서열번호 10의 61 번째), 64540105 번째(서열번호 11의 61 번째), 64542547 번째(서열번호 12의 61 번째) 또는 64542989 번째(서열번호 13의 61 번째)에 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.

또한 바람직하게, 본 발명에서 SYNPO 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 5번 염색체의 150639874 내지 150639995 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 CpG 부위의 염기 서열을 서열번호 14로 나타내었다.

더욱 바람직하게, 본 발명에서 SYNPO 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 5번 염색체의 150639934 번째(서열번호 14의 61 번째) 에 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.

또한 바람직하게, 본 발명에서 ZNF93 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 19번 염색체의 19900852 내지 19900973 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 CpG 부위의 염기 서열을 서열번호 15로 나타내었다.

더욱 바람직하게, 본 발명에서 ZNF93 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 19번 염색체의 19900912 번째(서열번호 15의 61 번째) 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.

또한 바람직하게, 본 발명에서 ADD2 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 2번 염색체의 70768415 내지 70768536 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 CpG 부위의 염기 서열을 서열번호 16으로 나타내었다.

더욱 바람직하게, 본 발명에서 ADD2 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 2번 염색체의 70768475 번째(서열번호 16의 61 번째)에 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.

또한 바람직하게, 본 발명에서 H1F0 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 22번 염색체의 37805527 내지 37805648 번째 염기, 37805781 내지 37805902 번째 염기, 37805623 내지 37805744 번째 염기, 37804154 내지 37804275 번째 염기, 37805429 내지 37805550 번째 염기, 37805070 내지 37805191번째 염기, 37806592 내지 37806713 번째 염기 또는 37805075 내지 37805196 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 CpG 부위의 염기 서열을 각각 서열번호 17 내지 서열번호 24 로 나타내었다.

더욱 바람직하게, 본 발명에서 H1F0 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 22번 염색체의 37805587 번째(서열번호 17의 61 번째), 37805841 번째(서열번호 18의 61 번째), 37805683 번째(서열번호 19의 61 번째), 37804214 번째(서열번호 20의 61 번째), 37805489 번째(서열번호 21의 61 번째), 37805130 번째(서열번호 22의 61 번째), 37806652 번째(서열번호 23의 61 번째) 또는 37805135 번째(서열번호 24의 61 번째)에 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.

또한 바람직하게, 본 발명에서 LRRC8B 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 1번 염색체의 89524306 내지 89524427 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는 상기 CpG 부위의 염기 서열을 서열번호 25으로 나타내었다.

더욱 바람직하게, 본 발명에서 LRRC8B 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 1번 염색체의 89524366 번째(서열번호 25의 61 번째) 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.

또한 바람직하게, 본 발명에서 SHC3 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 9번 염색체의 89178746 내지 89178867 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 CpG 부위의 염기 서열을 서열번호 26으로 나타내었다.

더욱 바람직하게, 본 발명에서 SHC3 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 9번 염색체의 89178806 번째(서열번호 26의 61 번째) 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.

또한 바람직하게, 본 발명에서 ZFP37 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 9번 염색체의 113056818 내지 113056939 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 CpG 부위의 염기 서열을 서열번호 27로 나타내었다.

더욱 바람직하게, 본 발명에서 ZFP37 유전자의 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 9번 염색체의 113056878 번째(서열번호 27의 61 번째) 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서는 상기 인간 게놈 염색체 부위의 염기서열은 최신 버전인 The December 2013 Human reference sequence(GRCh38)에 따라 표현하였지만, 상기 인간 게놈 염색체 부위의 구체적 서열은 게놈 서열 연구 결과가 업데이트됨에 따라서 그 표현이 다소 변경될 수 있으며, 이러한 변경에 따라 본 발명의 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 상이해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 The December 2013 Human reference sequence(GRCh38)에 따라 표현된 인간 게놈 염색체 부위는 본 발명의 출원일 이후 인간 표준 염기서열(human reference sequence)이 업데이트되어 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 지금과 다르게 변경된다고 하여도, 본 발명의 범위가 상기 변경된 인간 게놈 염색체 부위에 미치게 됨은 자명하다고 할 것이다. 이러한 변경 내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 용이하게 알 수 있는 사항이다.

본 발명에서는 11종의 난소암 세포주에 대하여 시스플라틴 항암제에 대한 내성 정도를 조사하여 항암제 민감성 세포주와 항암제 내성 세포주로 분류하였고, 이들 세포주로부터 게놈 DNA 와 RNA 를 추출하여, Illumina Human Methylation 450 Bead Chip을 이용한 DNA 메틸레이션 마이크로어레이 및 Affymetrix Human Gene 1.0 ST를 이용한 유전자 발현 마이크로어레이 분석을 실시하였으며, 난소암 세포주들에서 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 및 프로모터 CpG의 DNA 메틸화 변화 정도의 유의성을 Pearson correlation 과 Spearman correlation 을 통해 분석하였다. 이들 결과를 통합 분석(integration analysis)하여, 항암제 치료 내성에 관여하는 유전자 중 DNA 메틸화에 의해 발현이 조절되는 유전자 9종(EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37)을 최종 선별하였다. 또한, 이와 같이 유전자의 발현에 영향을 준 특정 CpG 부위를 확인하였으며, 해당 유전자의 특정 CpG 위치에서 일어나는 메틸화 정도를 측정함으로써 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측할 수 있다는 것을 확인하였다.

따라서, EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및/또는 ZFP37 의 특정 CpG 위치에서 일어나는 DNA 메틸레이션의 저메틸화 또는 과메틸화는 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측할 수 있는 바이오마커로 활용될 수 있다.

본 발명에서, 환자는 난소암이 발병한 환자를 의미한다. 이들 난소암 환자로부터 획득한 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨 등으로부터 유전자 시료를 얻는데, 그 유전자 시료는 DNA, mRNA, 또는 mRNA로부터 합성되는 cDNA를 포함한다.

본 발명에서 용어, "항암제에 대한 반응성 예측"이란 환자가 항암제 치료에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응할지 여부를 예측하는 것, 또는 항암제 내성의 여부 또는 내성의 위험성을 예측하는 것을 의미한다. 본 발명의 예측 방법은 난소암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 항암제는 백금 기반의 항암제, 일예로 시스플라틴일 수 있다.

일반적으로 난소암의 경우에는 항암 화학요법으로 치료를 시행하고 있고, 특히 시스플라틴 등의 백금 기반의 항암제 병합요법을 가장 많이 사용하고 있지만, 비슷한 임상적 특징 또는 비슷한 병기를 가지는 환자들 중에서도 항암 화학요법에 대한 반응이 다양하고 생존에 상당한 차이를 보인다. 본 발명의 상기 방법을 이용하면 항암 화학요법에 대한 반응성을 쉽게 예측할 수 있으며, 이에 따른 생존 예후를 판단할 수 있어, 항암 화학요법에 적절한 환자군을 선별하여 치료 효율을 높일 수 있다. 또한, 이로써 난소암 발병 후의 생존율을 높일 수 있다.

또한, 항암제 내성 암 세포의 비정상적인 메틸레이션의 변화는 조직, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 생물학적 시료에서 얻은 게놈 DNA의 메틸레이션 변화와 상당한 유사성을 보이므로, 본 발명의 마커를 이용할 경우 환자의 항암제에 대한 반응성 예측에 대하여, 혈액이나 체액 등을 통한 손쉬운 진단이 가능하다는 장점이 있다.

본 발명에서, CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및/또는 ZFP37 유전자 프로모터의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.

상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 CpG 부위의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다(WO01/26536; US2003/0148326A1).

또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당업계에 잘 알려져 있다.

환자의 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및/또는 ZFP37 유전자 프로모터의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 대표적인 방법으로, 환자의 생물학적 시료에서 게놈 DNA를 수득하고, 수득한 DNA에 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소를 처리한 후, 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고 그 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 것을 통해 측정할 수 있다.

따라서, 본 발명의 제제는 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및/또는 ZFP37 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 절편을 말한다.

본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다.

상기 조성물 및 키트에는 상기 제제 이외에도, 중합효소 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준의 측정하여, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화를 검출하는 방법에 관한 것이다.

일예로, 본 발명은 난소암 환자의 시료로부터 EPS8L3 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 상기 대조구 시료는 항암제 민감성 대조구 시료일 수 있다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 방법은 추가적으로, 환자의 시료로부터 HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 대조구 시료는 항암제 민감성 대조구 시료일 수 있다.

다른 일예로, 본 발명은 난소암 환자의 시료로부터 HSPA2 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 상기 대조구 시료는 항암제 민감성 대조구 시료일 수 있다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 방법은 추가적으로, 환자의 EPS8L3, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 일예로, 본 발명은 난소암 환자의 시료로부터 SYNPO 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 방법은 추가적으로, 환자의 시료로부터 EPS8L3, HSPA2, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 일예로, 본 발명은 난소암 환자의 시료로부터 ZNF93 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 방법은 추가적으로, 환자의 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 일예로, 본 발명은 난소암 환자의 시료로부터 ADD2 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 방법은 추가적으로, 환자의 시료로부터 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 일예로, 본 발명은 난소암 환자의 시료로부터 H1F0 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 방법은 추가적으로, 환자의 시료로부터 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 일예로, 본 발명은 난소암 환자의 시료로부터 LRRC8B 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 방법은 추가적으로, 환자의 시료로부터 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, SHC3 및 ZFP37 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 일예로, 본 발명은 난소암 환자의 시료로부터 SHC3 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 방법은 추가적으로, 환자의 시료로부터 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B 및 ZFP37 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

다른 일예로, 본 발명은 난소암 환자의 시료로부터 ZFP37 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소암 환자의 항암제에 대한 반응성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

이 경우, 보다 바람직하게, 상기 방법은 추가적으로, 환자의 시료로부터 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B 및 SHC3 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 항암제 민감성 대조구 시료의 해당 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "환자의 시료"란 항암제 내성에 의해 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및/또는 ZFP37 유전자의 메틸화 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

먼저, 환자로부터 게놈 DNA를 수득하여 메틸화 수준을 측정하기 위하여, 게놈 DNA의 수득은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는, 보다 상세하게는, (a) 수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 (b) 상기 처리된 DNA를 해당 유전자의 특정 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 (a) 단계에서 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트일 수 있으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 특정 CpG 부위의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

또한, 상기 (a) 단계에서 메틸화 민감성 제한효소는 상기에서 설명한 바와 같이, 특정 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있으며, 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 (b) 단계에서 증폭은 통상적인 PCR 방법에 의해 수행될 수 있다. 이때 사용되는 프라이머는 상기에서 설명한 바와 같이, 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.

상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는, (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물의 존부는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기영동을 수행하여 원하는 위치의 밴드의 검출 여부에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들면, 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시키는 화합물을 사용한 경우 상기 (a) 단계에서 사용한 두 종류의 프라이머쌍, 즉 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 의해 각각 증폭된 PCR 결과물의 존부에 따라 메틸화 정도를 판단할 수 있다. 바람직하게, 샘플 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리하고, 해당 유전자 프로모터의 CpG 부위를 PCR로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 분석하는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 메틸화 여부를 판단할 수 있다.

또한, 제한효소를 이용한 경우에도 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 CpG 부위가 메틸화된 것으로 판단하고, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 CpG 부위가 비메틸화 한 것으로 판단하는 것에 따라 그 메틸화 여부를 판단할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다. 상기에서 mock DNA란 시료에서 분리되고 아무런 처리를 하지 않은 상태의 시료 DNA를 의미한다.

이와 같은 방법에 따라, 환자 시료 내 EPS8L3, HSPA2, SYNPO 및 ZNF93 유전자 프로모터의 특정 CpG 부위가 저메틸화 상태로 측정되거나, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 유전자 프로모터의 특정 CpG 부위가 과메틸화 상태로 측정되는 경우, 해당 환자가 항암제에 대하여 반응성을 나타낼 것으로 예측할 수 있는 것이다.

따라서, 상기 본 발명에 따를 경우, EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및/또는 ZFP37 유전자 프로모터의 CpG의 메틸화 여부를 효과적으로 확인하여 난소암 환자의 항암제 반응성을 용이하게 예측할 수 있다.

본 발명에 따라, 환자의 생물학적 시료에서 채취한 게놈 DNA의 특정 유전자 프로모터 부위의 메틸화 정도를 PCR 기법을 기초로 한 MSP(methylation-specific PCR) 등의 방법으로 측정함으로써 수 시간 내에 난소암 환자의 항암제 반응성을 예측 할 수 있으므로, 정확도가 높고 편리한 진단 키트를 개발할 수 있다.

도 1은 난소암 환자의 항암제 치료 반응성 마커를 선정한 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 난소암 세포주 11종 (OVCAR-3, TOV-21G, TOV-112D, CaOV-3, ES-2, OV-90, PA-1, MDAH 2774, A2780, A2780cp, SK-OV-3)을 시스플라틴 항암제에 반응하는 IC₅₀에 따라 차례대로 나열하여 항암제에 민감한 군(Sensitive)과 내성을 갖고 있는 군(Resistant), 그리고 민감성 세포주군과 내성 세포주군 사이에 중간내성 정도를 갖는 세포주군(Intermediate)으로 분류한 결과를 나타낸다.
도 3은 난소암 세포주에 5-aza-2'-deoxycytidin 을 처리한 후 EPS8L3 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 난소암 세포주에 5-aza-2'-deoxycytidin 을 처리한 후 HSPA2 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 난소암 세포주에 5-aza-2'-deoxycytidin 을 처리한 후 SYNPO 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 난소암 세포주에 5-aza-2'-deoxycytidin 을 처리한 후 ZNF93 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 난소암 세포주에 5-aza-2'-deoxycytidin 을 처리한 후 ADD2 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 난소암 세포주에 5-aza-2'-deoxycytidin 을 처리한 후 H1F0 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 난소암 세포주에 5-aza-2'-deoxycytidin 을 처리한 후 LRRC8B 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 난소암 세포주에 5-aza-2'-deoxycytidin 을 처리한 후 SHC3 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 난소암 세포주에 5-aza-2'-deoxycytidin 을 처리한 후 ZFP37 유전자의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포주 배양

항암제 시스플라틴의 내성 정도를 알아보기 위하여 아래 11종의 난소암 세포주를 사용하였다(표 1). 실험에 사용한 11종의 난소암 세포주는 American type culture collection (ATCC)에서 구입하였고, SK-OV-3와 ES-2 세포주는 McCoy's 5a, PA-1 세포주는 MEM alpha, Caov-3 세포주는 DMEM, TOV-21G, TOV-112D 및 OV-90 세포주는 MCDB 105와 medium 199 (1:1 mix), OVCAR-3, MDAH2774, A2780 및 A2780cis 세포주는 RPMI1640에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 100 U/mL 페니실린(penicillin) 및 100μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)을 추가하여 배양하였다. A2780cis 세포주의 경우, 시스플라틴 내성을 유지하기 위해 배양 배지에 1μM 시스플라틴을 첨가하여 배양하였다.

세포주	세포주 유래/관련질환	형태학	배지	배지입수처
SKOV-3	인간/선암/전이상태에서 유래	epithelial	McCoy's 5a+10%FBS+1%P/S	(REF)16600-082(Gibco)
ES-2	인간/암종	fibroblast	McCoy's 5a+10%FBS+1%P/S	(REF)16600-082(Gibco)
PA-1	인간/기형암종	epithelial	MEM alpha+10%FBS+1%P/S	41061-029(Gibco)
Caov-3	인간/선암	epithelial	DMEM(1.5g/L sodium bicarbonate)+10%FBS+1%P/S	LM001-51(welgene)
TOV-21G	인간/선암	epithelial	MCDB 105(1.5g/L sodium bicarbonate)&Medium 199(2.2g/L sodium bicarbonate) 1:1 mix	11150-059(Gibco, Medium199)
TOV-112D	인간/선암	epithelial	MCDB 105(1.5g/L sodium bicarbonate)&Medium 199(2.2g/L sodium bicarbonate) 1:1 mix	11150-059(Gibco, Medium199)
OV-90	인간/복수	epithelial	MCDB 105(1.5g/L sodium bicarbonate)&Medium 199(2.2g/L sodium bicarbonate) 1:1 mix	11150-059(Gibco, Medium199)
OVCAR-3	인간/선암	epithelial	RPMI 1640(25mM HEPES)+10%FBS+1%P/S	LM011-03(welgene)
MDAH 2774	인간/선암	mucinous	RPMI 1640(25mM HEPES)+10%FBS+1%P/S	LM011-03(welgene)
A2780 (parent)	인간/암종	epithelial	RPMI 1640(25mM HEPES)+10%FBS+1%P/S	LM011-03(welgene)
A2780cis	인간/암종	epithelial	RPMI 1640(25mM HEPES)+10%FBS+1%P/S	LM011-03(welgene)

실시예 2. 시스플라틴 항암제 내성 측정

항암제 내성은 tetrazolium salt (3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)방법으로 측정하였다. 96-well plate에 2×10⁵/㎖ 세포의 밀도로 100 ㎕씩 분주하여 37℃, 95% 0₂/5% CO₂배양조에서 16~18시간 동안 안정화시켰다. 시스플라틴을 농도별(0~100μM)로 48시간 처리한 후 2.5 mg/ml MTT 용액을 20 ㎕/well씩 첨가하여 2시간 더 반응시켰다. Dimethyl sulfoxide (DMSO) 100 ㎕/well을 넣고 1시간 뒤 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. MTT assay로 측정한 세포의 시스플라틴에 대한 항암제 내성은 측정한 흡광도 값을 각각의 암세포들의 대조군에 대한 백분율로 표시하였고, 세포생존도가 50%로 감소하는 농도를 IC₅₀ (50% inhibitory concentration)으로 표시하였다. 11종의 세포주를 시스플라틴 항암제에 반응하는 IC₅₀에 따라 차례대로 나열하여 항암제에 민감한 군(Sensitive)과 내성을 갖고 있는 군(Resistant), 그리고 민감성 세포주군과 내성 세포주군 사이에 중간내성 정도를 갖는 세포주군(Intermediate)으로 나누었다.

실시예 3. Total RNA와 genomic DNA 추출

각 세포주에서 각각 RNeasy mini kit (Qiagen)와 QIAmp mini kit (Qiagen)을 이용하여 total RNA와 genomic DNA를 추출하였다. 추출방법은 제조사의 매뉴얼을 따라 실시하였다. 추출된 total RNA와 genomic DNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량하였으며, RNA와 DNA 상태는 1% agarose gel에서 전기영동하여 degradation 여부를 확인하였다.

실시예 4. 바이설파이트 ( Bisulfite ) 처리

Genomic DNA에 바이설파이트(Bisulfite)를 처리하면 DNA 염기서열 중 5'-CpG-3' 부위의 사이토신이 메틸화된 경우에는 그대로 유지되지만, 비메틸화된 경우에는 우라실로 바뀌어서 메틸화 정도를 측정할 수 있다. 따라서, 메틸화된 시토신과 비메틸화된 시토신을 구별하기 위하여 genomic DNA 를 바이설파이트로 처리하였다. 우선, 2 μg의 genomic DNA를 EpiTech Bisulfite kit (Qiagen)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 처리하였고, 이렇게 만들어진 바이설파이트 처리된 DNA를 20 μL의 H₂O로 녹여서 사용 시까지 -20℃에서 보관하였다. 바이설파이트 처리된 DNA를 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)로 증폭하였다.

실시예 5. 정량적 실시간 ( Quantitative real - time ) PCR ( qRT - PCR )

cDNA합성을 위해 Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen)을 사용하였다. 1 μg의 total RNA 와 50 ng oligo dT를 70 ℃에서 10분간 denature한 후 여기에 5X RT buffer 4 μl, 0.1 mM DTT 2 μl, 2.5 mM dNTP mixture 4 μl, Superscript II reverse transcriptase 200 units, RNase inhibitor 10 units 포함한 반응액에 혼합한 20 μl반응액을 25 ℃ 에서 10분, 42 ℃에서 50분, 95 ℃에서 5분동안 반응하여 cDNA를 합성한 후 이것을 1:4로 희석하고 이 중 2μl를 취하여 qRT-PCR의 주형으로 사용하였다. qRT-PCR은 cDNA 2μl, SYBR Premix EX Taq (Takara Bio) 10μl, Rox reference dye (50X Takara Bio) 0.4μl, 각 유전자의 primer 200 nM를 포함한 20μl 반응액을 ABI 7500fast sequence detection system (Applied Biosystems)을 이용하여 95 ℃에서 30초 반응한 후, 40 cycles (95 ℃ 에서 3초, 60 ℃ 에서30초) 반복하여 증폭하였다. PCR product의 specificity는 95 ℃에서 15초, 60 ℃에서 1분, 95 ℃에서 15초 동안 반응하여 확인하였다. GAPDH 발현을 internal control로 사용하였으며, EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 유전자의 발현은 GAPDH 발현 수준으로 ΔΔCT 방법으로 보정되었다. 사용된 oligonucleotide primer sequence는 다음과 같다(표 2).

프라이머	서열	서열번호
human EPS8L3 (forward)	5'- TCTTACCGCCTAGACAGCATC -3'	28
Human EPS8L3 (reverse)	5'- GGCTGGTCTTCAGTCGCTC -3'	29
human HSPA2 (forward)	5'- GGTCCCGGCCTATTTCAACG -3'	30
Human HSPA2 (reverse)	5'- GGACACGTCGAAAGTGCCA -3'	31
human SYNPO (forward)	5'- ATGGAGGGGTACTCAGAGGAG -3'	32
human SYNPO (reverse)	5'- CTCTCGGTTTTGGGACAGGTG -3'	33
human ZNF93 (forward)	5'- GCCAAAACATGCCCTAGTGT --3'	34
human ZNF93 (reverse)	5'- TCCACCTTTAGCTGGCTTGT -3'	35
human ADD2 (forward)	5'- CCATGATGACGCCTATCAATGA -3'	36
human ADD2 (reverse)	5'- GTCCAGGAGTCGGTAGACAC -3'	37
human H1F0 (forward)	5'- ACTCGCAGATCAAGTTGTCCA -3'	38
human H1F0 (reverse)	5'- GGTTCGTCGCTCTTGGCTA -3'	39
human LRRC8B (forward)	5'- TTTATGCTCAACGGTCTTCCAG -3'	40
human LRRC8B (reverse)	5'- GGTCTACGACCAGAGATGAATGG -3'	41
human SHC3 (forward)	5'- AACCTCCAGTTTGCGGGAATG -3'	42
human SHC3 (reverse)	5'- GTGGTGATTCGCTATGATCTGTT -3'	43
human ZFP37 (forward)	5'- GGCGTCCAGATTCTGACAAAG -3'	44
human ZFP37 (reverse)	5'- GCTCGGACACAGCCATCTC -3'	45
human GAPDH (forward)	5'-AATCCCATCACCATCTTCCA-3'	46
human GAPDH (reverse)	5'-TGGACTCCACGACGTACTCA-3'	47

실시예 6. 5- aza -2'- deoxycytidine (5- aza - dC ) 처리

각 난소암 세포주에 메틸화 억제제인 5-aza-2'-deoxycytidine (Sigma-Aldrich)를 10μM 농도로 3일간 처리한 후 EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 유전자 발현의 변화를 qRT-PCR 을 이용하여 측정하였다.

실시예 7. 항암제 민감성 난소암 세포주 및 항암제 내성 난소암 세포주에서 유전자 발현 변화 분석

11종의 난소암 세포주에서 RNA를 추출하여 Affymetrix Human Gene 1.0 ST 을이용하여 mRNA 마이크로어레이를 수행하였다. Scanning 후 얻어진 각 유전자의 발현량 (expression value)을 배경보정 (background correction), RMA 표준화 (RMA normalization) (Biostatistics. 2003 Apr;4(2):249-64. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data), 및 log2 변환 (log2 transformation)을 거쳐 최종적으로 통계분석에 사용하였다. 시스플라틴 민감성 세포군과 내성 세포군에서의 유전자 발현 정도를 비교하여, 시스플라틴 내성과 연관되어 유의하게 발현이 변화하는 유전자를 찾기 위하여 아래와 같은 3가지 분석을 수행하였고 각각의 분석결과에서 유의하게 나타난 유전자를, 두 군에서 차별적으로 발현되는 유전자 (Differentially expressed genes, DEGs)로 선정하였다:

a. 11종의 난소암 세포주를 시스플라틴 민감성군과 내성군으로 분류하여 두 군간의 발현 변화를 분석하여 민감성 세포주에 대하여 내성 세포주에서 발현 변화가 1.5배 이상 유의하게 변화하고(p <0.05) 최고 발현 정도가 7 이상(maximum log2 expression≥7), 및 11종 세포주 내에서 발현 정도의 변화가 1 이상(Δlog2 expression in 11 cell lines≥1.0) 되는 유전자를 찾았다.

b. 11종의 난소암 세포주의 IC₅₀ 값과 각 유전자 발현의 Pearson correlation coefficient가 유의하고(p <0.05), 최고 발현 정도가 7 이상, 및 11종 세포주 내에서 발현 정도의 변화가 1 이상 되는 유전자를 찾았다.

c. 11종의 난소암 세포주의 IC₅₀ 값과 각 유전자 발현의 Spearman correlation coefficient가 유의하고(p <0.05), 최고 발현 정도가 7 이상, 및 11종 세포주 내에서 발현 정도의 변화가 1 이상 되는 유전자를 찾았다.

실시예 8. 항암제 민감성 난소암 세포주 및 항암제 내성 난소암 세포주에서 DNA methylation 변화 분석

11종의 난소암 세포주에서 DNA를 추출한 후 바이설파이트 전환(Bisulfite conversion)을 수행하여 비메틸화된 사이토신을 우라실로 바꾼 후, Human methylation 450 bead chip (illumina)을 사용하여 약 485,000 개의 CpG 부위에 대하여 메틸화 정도를 측정하였다. DNA 메틸레이션 정도는 0~1 값을 갖는 β 값으로 표시되며 β값 0은 해당 CpG 부위가 완전히 비메틸화 된 것을 의미하며, 1은 완전히 메틸화된 것을 의미한다. 시스플라틴 민감성 세포군과 내성 세포군에서의 메틸화 정도를 비교하여, 시스플라틴 내성과 연관되어 유의하게 메틸화 정도가 다른 CpG 부위를 찾기 위하여 아래와 같은 3가지 분석을 수행하였고 각각의 분석결과에서 유의하게 나타난 CpG 부위를 찾았고, 이를 두 군에서 차별적으로 메틸레이션되어 있는 유전자 (Differentially methylated genes, DMGs)로 선정하였다:

a. 11종의 난소암 세포주를 시스플라틴 민감성군과 내성군으로 분류하여 두 군간의 DNA 메틸레이션 변화를 분석하여 민감성 세포주에 대하여 내성 세포주에서 β value의 변화가 0.25 이상 유의하게 변화한 CpG 부위를 찾았다 (β≥0.25 & p <0.05)

b. 11종의 난소암 세포주의 IC₅₀ 값과 각 CpG 부위의 β value의 Pearson correlation coefficient가 유의한 CpG 부위를 찾았다 (p <0.05)

c. 11종의 난소암 세포주의 IC₅₀ 값과 각 CpG 부위의 β value의 Spearman correlation coefficient가 유의한 CpG 부위를 찾았다 (p <0.05)

실시예 9. 항암제 민감성 난소암 세포주 및 항암제 내성 난소암 세포주에서 DNA methylation 변화와 유전자 발현의 통합분석

항암제 치료 내성에 관여하는 유전자 중 메틸레이션에 의해 발현이 조절되는 유전자를 규명하기 위해, DNA 메틸레이션 분석 자료와 유전자 발현 분석자료를 통합 분석 (integration analysis)하여, 각각의 DNA 메틸레이션 분석 자료와 유전자 발현 분석자료에서 사용한 3가지 분석방법 중 2개 이상의 분석 결과에서 유의하게 DNA 저메틸화 및 이에 따른 발현 증가(hypomethylation-up_regulation), DNA 과메틸화 및 이에 따른 발현 감소(hypermethylation-down_regulation)의 관계를 보이는 유전자를 최종 선별하였다 (도 1).

실험결과

1. 항암제 민감성 난소암 세포주 및 항암제 내성 난소암 세포주의 분류

난소암 세포주 11종 (OVCAR-3, TOV-21G, TOV-112D, CaOV-3, ES-2, OV-90, PA-1, MDAH 2774, A2780, A2780cp, SK-OV-3)을 시스플라틴 항암제에 반응하는 IC₅₀에 따라 차례대로 나열하여 항암제에 민감한 군(Sensitive)과 내성을 갖고 있는 군(Resistant), 그리고 민감성 세포주군과 내성 세포주군 사이에 중간내성 정도를 갖는 세포주군(Intermediate)으로 나누었으며, 그 결과는 도 2와 같다.

2. 프로모터 CpG 메틸레이션 변화를 이용한 항암제 치료반응 예측 마커의 선정

항암제 민감성 난소암 세포주 및 항암제 내성 난소암 세포주에서 유전자 발현변화 분석 결과를 표 3에 나타내었다. EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93 유전자의 경우 시스플라틴 민감성 난소암 세포주군에 비하여 내성 세포주군에서 유전자 발현이 증가되어 있었고, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3, ZFP37 유전자의 경우 내성 세포주군에서 유전자 발현이 감소되어 있었다. 또한, 11종의 난소암 세포주에서 시스플라틴 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 정도의 유의성을 살펴본 결과, EPS8L3, SYNPO, SHC3 유전자는 Spearman correlation에서 유의성을 보였고 ZNF93, LRRC8B 유전자는 Pearson correlation 에서 유의성을 보였으며 HSPA2, ADD2, H1F0, ZFP37 유전자는 Pearson correlation과 Spearman correlation 모두에서 유의성을 보였다.

gene symbol	Resistant vs Sensitive		Pearson Correlation		Spearman correlation		Average expression ¹⁾	Range of expression ²⁾
gene symbol	log2 Fold change	p value	Pearson rho	p value	Spearman rho	p value	Average expression ¹⁾	Range of expression ²⁾
EPS8L3	1.16	0.041	0.48	0.134	0.67	0.028	7.87	2.63
HSPA2	2.56	0.039	0.63	0.037	0.65	0.037	8.62	5.03
SYNPO	0.75	0.036	0.59	0.056	0.63	0.044	8.35	1.80
ZNF93	1.25	0.047	0.61	0.046	0.59	0.061	6.66	3.19
ADD2	-1.90	0.028	-0.72	0.012	-0.76	0.009	8.17	4.09
H1F0	-2.54	0.000	-0.85	0.001	-0.79	0.006	11.43	3.43
LRRC8B	-1.43	0.018	-0.62	0.043	-0.46	0.154	8.80	2.85
SHC3	-1.11	0.057	-0.57	0.067	-0.67	0.028	7.81	2.35
ZFP37	-1.68	0.007	-0.60	0.049	-0.62	0.048	7.41	3.29

1) 최고 발현 정도(maximum log2 expression)와 관련됨

2) 11종의 세포주 내에서 발현 정도의 변화(Δlog2 expression in 11 cell lines)와 관련됨

또한, 항암제 민감성 난소암 세포주 및 항암제 내성 난소암 세포주에서 DNA methylation 변화 분석 결과를 표 4에 나타내었다. EPS8L3, HSPA2, SYNPO 및 ZNF93 유전자의 경우 항암제 내성 난소암 세포주에서 프로모터 CpG 부위의 DNA 메틸레이션이 감소하였으며, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37 유전자의 경우 항암제 내성 난소암 세포주에서 프로모터 CpG 부위의 DNA 메틸레이션이 증가하였다. 또한, 11종의 난소암 세포주에서 시스플라틴 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 프로모터 CpG 메틸레이션의 변화 정도의 유의성을 살펴본 결과, EPS8L3, SYNPO, ZNF93, ADD2, LRRC8B 및 SHC3 유전자는 Pearson correlation과 Spearman correlation 모두에서 유의성을 보였고, ZFP37 유전자는 Spearman correlation 에서 유의성을 보이며, HSPA2와 H1F0 유전자는 Pearson correlation 혹은 Spearman correlation 에서 유의성을 보였다.

gene symbol	Methylation Chip ID	Resistant vs Sensitive		Pearson Correlation		Spearman correlation		Range of methyalton ¹⁾
gene symbol	Methylation Chip ID	difference in β value	p value	Pearson rho	p value	Spearman rho	p value	Range of methyalton ¹⁾
EPS8L3	cg00515905	-0.54	0.000	-0.62	0.048	-0.71	0.014	0.82
HSPA2	cg00880494	-0.50	0.070	-0.63	0.044	-0.60	0.049	0.80
	cg01141043	-0.51	0.053	-0.64	0.040	-0.63	0.036	0.81
	cg01786715	-0.53	0.036	-0.68	0.025	-0.68	0.021	0.82
	cg08161617	-0.59	0.042	-0.47	0.146	-0.66	0.028	0.87
	cg08317373	-0.52	0.046	-0.40	0.225	-0.64	0.033	0.77
	cg14057961	-0.52	0.038	-0.49	0.129	-0.66	0.028	0.75
	cg14060296	-0.61	0.068	-0.64	0.040	-0.61	0.045	0.96
	cg15802091	-0.51	0.000	-0.48	0.137	-0.67	0.025	0.72
	cg16319578	-0.29	0.060	-0.75	0.012	-0.66	0.028	0.61
	cg22947154	-0.52	0.059	-0.73	0.015	-0.63	0.037	0.85
	cg24642523	-0.40	0.000	-0.44	0.183	-0.64	0.034	0.57
	cg25581090	-0.27	0.000	-0.56	0.076	-0.72	0.012	0.42
SYNPO	cg13590277	-0.30	0.009	-0.85	0.002	-0.79	0.004	0.60
ZNF93	cg05661139	-0.64	0.022	-0.66	0.031	-0.69	0.019	0.87
ADD2	cg22370480	0.29	0.036	0.74	0.013	0.65	0.032	0.59
H1F0	cg01443426	0.73	0.000	0.83	0.003	0.83	0.002	0.83
	cg01883777	0.78	0.002	0.71	0.019	0.75	0.007	0.89
	cg07141002	0.74	0.011	0.66	0.044	0.69	0.029	0.86
	cg10999992	0.39	0.030	0.79	0.006	0.74	0.010	0.81
	cg14910534	0.36	0.001	0.74	0.013	0.82	0.002	0.47
	cg24292323	0.37	0.001	0.46	0.154	0.61	0.048	0.55
	cg25043629	0.34	0.001	0.66	0.031	0.76	0.006	0.44
	cg27424226	0.34	0.009	0.65	0.037	0.56	0.075	0.62
LRRC8B	cg08128789	0.29	0.035	0.76	0.009	0.69	0.018	0.52
SHC3	cg26493353	0.35	0.039	0.66	0.031	0.67	0.023	0.76
ZFP37	cg14633455	0.36	0.009	0.39	0.237	0.61	0.046	0.55

1) 11종의 세포주의 최대 β value에서 최소 β value를 뺀 값을 의미함

표 5는 항암제 민감성 난소암 세포주 및 항암제 내성 난소암 세포주에서 유의적인 DNA 메틸레이션 발현 변화를 나타낸 CpG 부위의 위치를 나타낸 것이다. 염색체 위치는 The December 2013 Human reference sequence (GRCh38)에 따라 표시한 것이다.

유전자	서열	염색체 위치
EPS8L3	GGTGCCAGTGAAGGCCGGGTGCCTGGTCCCCCCAGGAGGCTGGTCTTGGAGCAGGTGGTC[CG]GTGCTGGTGGTGGAAGGACAGCAGCTTCTCTGCTAGTGGCCACAGGCAGAGCCTGCCTTT (서열번호 1)	ch1: 109763825- 109763946
HSPA2	TTATTTCTTCGGTGCAACCAACTCAGAATGAATTCCTCCGCCCCTGCGTGCTCAGTGAGT[CG]GCACCCTAGCAGTGAACTGCATTTAAAACCTCAGGAATTGAGCGAACTCTCCCAGTGGCT (서열번호 2)	ch14 : 64540187- 64540308
	TAAAACCTCAGGAATTGAGCGAACTCTCCCAGTGGCTCTCCTCACCGGGATCCCCTTCCA[CG]CCTCCTCCCCGTGCCGCGCCTCAGTCCGCACTGCTCATTGGCCGCGTGCCCTGCCAATCC (서열번호 3)	ch14 : 64540272- 64540393
	TGTGAGGGCGGTCCCGGGAGCGGATTGGGTCTGGGAGTTCCCAGAGGCGGCTATAAGAAC[CG]GGAACTGGGCGCGGGGAGCTGAGTTGCTGGTAGTGCCCGTGGTGCTTGGTTCGAGGTGGC (서열번호 4)	ch14 : 64540659- 64540780
	GAGCGCTCACAACCACTGAGACGCAGTGAAGCACCCACCATAAAATCCCAGGAGGCCGAC[CG]CCGGTTCAGACTTTTTCTTTTCTTTAATCCCCGTCCAAGGGATCCGCCCTCACCCCCCAC (서열번호 5)	ch14 : 64539999- 64540120
	GGGAAAACAAGCTGCTCGAGCTTTATTTCTTCGGTGCAACCAACTCAGAATGAATTCCTC[CG]CCCCTGCGTGCTCAGTGAGTCGGCACCCTAGCAGTGAACTGCATTTAAAACCTCAGGAAT (서열번호 6)	ch14 : 64540165- 64540286
	TCTGTCTCCTGGCGGGGGCCGGAGTCCCGCCCCTCGTCCAACTTGAAATCTGTTGGGTCA[CG]GGCCAGTCACTCCGACCTAGGCAAGCCTGTGGTGGAGCTGGAAGAGTTTGTGAGGGCGGT (서열번호 7)	ch14 : 64540549- 64540670
	GGGATCCCCTTCCACGCCTCCTCCCCGTGCCGCGCCTCAGTCCGCACTGCTCATTGGCCG[CG]TGCCCTGCCAATCCGATGCACGTCGGCTAGGGCAAAGACCGCGAAAAAGCGCGTACACCT (서열번호 8)	ch14 : 64540318- 64540439
	ACCGCCGCCGACAAGAGCACCGGTAAGGAAAACAAAATCACCATCACCAATGACAAAGGT[CG]TCTGAGCAAGGACGACATTGACCGGATGGTGCAGGAGGCGGAGCGGTACAAATCGGAAGA (서열번호 9)	ch14 : 64542323- 64542444
	GGGAGCTGAGTTGCTGGTAGTGCCCGTGGTGCTTGGTTCGAGGTGGCCGTTAGTTGACTC[CG]CGGAGTTCATCTCCCTGGTTTTCCCGTCCTAACGTCGCTCGCCTTTCAGTCAGGATGTCT (서열번호 10)	ch14 : 64540734- 64540855
	CCCAGGAGGCCGACCGCCGGTTCAGACTTTTTCTTTTCTTTAATCCCCGTCCAAGGGATC[CG]CCCTCACCCCCCACCCCAGCCACCCCAATTCCCTATTCCCTCCCCTTGGACGGCGCCGGG (서열번호 11)	ch14 : 64540045- 64540166
	GTCCTATACCTACAACATCAAGCAGACGGTGGAAGACGAGAAACTGAGGGGCAAGATTAG[CG]AGCAGGACAAAAACAAGATCCTCGACAAGTGTCAGGAGGTGATCAACTGGCTCGACCGAA (서열번호 12)	ch14 : 64542487- 64542608
	AAAAGTTCCAAAGTTTGTTTTTTAAAAACATTATTCGAGGTTTCTCTTTAATGCATTTTG[CG]TGTTTGCTGACTTGAGCATTTTTGATTAGTTCGTGCATGGAGATTTGTTTGAGATGAGAA (서열번호 13)	ch14 : 64542929- 64543050
SYNPO	AATAGGGCCCAGACCCTCATTGCTACAAAGCAAAACACTGGGAGGGGGCAGCATGGCCCA[CG]TGACTGGCCCTGCACTGGGCATTAGGCCAACCTGGGCTTGAATTTCAGCTCTTCCTCTGG (서열번호 14)	Ch5 : 150639874- 150639995
ZNF93	TAAGAATTATCCAATCAGGGACGCTGGGCTGGAAACGTCCAATCAGGCAAGCAGCCGGAC[CG]AACAGGGCGGCTTCTGGTTTGGCGGGTCCTTTGTCTCTCGGTGCAGCCGGAGCTCCAGGT (서열번호 15)	Ch19 : 19900852- 19900973
ADD2	CAGACCCCCCTAGCCAGGCTTCCAGCCCCCTTCCACCCCCGCCCCGCACCACTCACTACC[CG]GGATGGCCAGAGCTAAGCAGGGGAGTCTGTTACTAGGGAGAAAATCTGAAACAGAGCTCC (서열번호 16)	Ch2 : 70768415- 70768536
H1F0	CGGACCAGACAGGCCACCATGACCGAGAATTCCACGTCCGCCCCTGCGGCCAAGCCCAAG[CG]GGCCAAGGCCTCCAAGAAGTCCACAGACCACCCCAAGTATTCAGACATGATCGTGGCTGC (서열번호 17)	Ch22 : 37805527- 37805648
	TGTCCTCAAGCAGACCAAAGGGGTGGGGGCCTCGGGGTCCTTCCGGCTAGCCAAGAGCGA[CG]AACCCAAGAAGTCAGTGGCCTTCAAGAAGACCAAGAAGGAAATCAAGAAGGTAGCCACGC (서열번호 18)	Ch22 : 37805781- 37805902
	AAGTATTCAGACATGATCGTGGCTGCCATCCAGGCCGAGAAGAACCGCGCTGGCTCCTCG[CG]CCAGTCCATTCAGAAGTATATCAAGAGCCACTACAAGGTGGGTGAGAACGCTGACTCGCA (서열번호 19)	Ch22 : 37805623- 37805744
	GCGCCCCGCTTTCCCAAGTCCCCAAAGCACTCAGGGCCTCTCCTCATTACAGGGGCCCCC[CG]GACCGTCCCTGGTTAGAGCTTCTGGGGCAGCTTCTCCATTGTGGACCGCCCTCCCCCGCC (서열번호 20)	Ch22 : 37804154- 37804275
	AGACTGGCCCGGTAGTCAGGGGCTCAGGAGCAGATCCCGAGGCAGGCTTTGCTCAGCCTC[CG]ACGAGGGCTGGCCCTTTGGAAGGCGCCTTCAACAGCCGGACCAGACAGGCCACCATGACC (서열번호 21)	Ch22 : 37805429- 37805550
	AGGCCCGGGCCGGGGGGAAAGGTCGGATTTGCTCGGCGGAAGAAACACAGATGGCGGCGG[CG]CAGCGCCATTCCGGGCCGGGAGCAGGCAGCCAGCAGCCCTGTCCTCACCGCGGTCCGCCC (서열번호 22)	Ch22 : 37805070- 37805191
	GGAGAGAGGTGGTAGGGAGCAGCCAGCCGGCAAAGGAAGGAGGGGGAAAAAAACCGCCAC[CG]GGCTGACTTCCACCTCCCAGTGGTGAGCAGTGGGGGCCCAAACCCAGTTTCCTTCTCATT (서열번호 23)	Ch22 : 37806592- 37806713
	CGGGCCGGGGGGAAAGGTCGGATTTGCTCGGCGGAAGAAACACAGATGGCGGCGGCGCAG[CG]CCATTCCGGGCCGGGAGCAGGCAGCCAGCAGCCCTGTCCTCACCGCGGTCCGCCCGCCGC (서열번호 24)	Ch22 : 37805075- 37805196
LRRC8B	CGTTATATAAATGCCAAGTTACTCAGGGACGCACACGTGAGAAGGCTGGGGCCCGACACA[CG]CGGTGTAGTGCCGAAGTCACCGGTGTGGCGCGCCTGGGGGACACGCCGAAGCCCATTTCC (서열번호 25)	Ch1 : 89524306- 89524427
SHC3	GGGGCTGCTCACAGCAAAAGCATGACTCACTCTGAGAGGAGACCCTTCTCAACAAAGGCT[CG]GTGAGCACTGCAAATCACTTCCTGTAGCAGAAGAAAAAAAAGGAAAAAAAGAAGAAAAAA (서열번호 26)	Ch9 : 89178746- 89178867
ZFP37	ACAATTAGATCGGGAGGTGGAAGCTGGCGAGGGCGTTACTTGCAGGATGCAGGAGTGATG[CG]ATCAGAGCCAGCCGGAACCGAGTTCCGTTACGCACTACAGGACTGACCTGGGCCTGACAA (서열번호 27)	Ch9 : 113056818- 113056939

항암제 민감성 난소암 세포주 및 항암제 내성 난소암 세포주에서 DNA methylation 변화와 유전자 발현의 통합분석 결과, 유의하게 DNA 저메틸화 및 이에 따른 발현증가(hypomethylation-up_regulation), DNA 과메틸화 및 이에 따른 발현감소(hypermethylation-down_regulation)의 관계를 보이는 유전자 9종(EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37)을 항암제 치료 반응 예측 마커로 최종 선정하였다.

EPS8L3는 항암제 민감성 세포주군에 대하여 내성 세포주군에서 유전자 발현이 2.2 배 증가함과 동시에 프로모터 CpG 부위에서 저메틸화 되어 있었으며, 11종의 난소암 세포주에서 시스플라틴 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 및 프로모터 CpG의 DNA 메틸화 변화 정도가 Spearman correlation에서 유의성을 보였으므로, EPS8L3 유전자의 프로모터 CpG 부위에서 일어나는 DNA 메틸레이션의 변화를 항암제 치료반응 예측 마커로 선정하였다.

HSPA2는 항암제 민감성 세포주군에 대하여 내성 세포주군에서 유전자 발현이 5.9 배 증가함과 동시에 프로모터 CpG 부위에서 저메틸화 되어 있었으며, 11종의 난소암 세포주에서 시스플라틴 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 및 프로모터 CpG의 DNA 메틸화 변화 정도가 Pearson correlation 혹은 Spearman correlation에서 유의성을 보였으므로, HSPA2 유전자의 프로모터 CpG 부위에서 일어나는 DNA 메틸레이션의 변화를 항암제 치료반응 예측 마커로 선정하였다.

SYNPO는 항암제 민감성 세포주군에 대하여 내성 세포주군에서 유전자 발현이 1.7배 증가함과 동시에 프로모터 CpG 부위에서 저메틸화 되어 있었으며, 11종의 난소암 세포주에서 시스플라틴 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 및 프로모터 CpG의 DNA 메틸화 변화 정도가 Spearman correlation에서 유의성을 보였으므로, SYNPO 유전자의 프로모터 CpG 부위에서 일어나는 DNA 메틸레이션의 변화를 항암제 치료반응 예측 마커로 선정하였다.

ZNF93는 항암제 민감성 세포주군에 대하여 내성 세포주군에서 유전자 발현이 2.4배 증가함과 동시에 프로모터 CpG 부위에서 저메틸화 되어 있었으며, 11종의 난소암 세포주에서 시스플라틴 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 및 프로모터 CpG의 DNA 메틸화 변화 정도가 Pearson correlation 에서 유의성을 보였으므로, ZNF93 유전자의 프로모터 CpG 부위에서 일어나는 DNA 메틸레이션의 변화를 항암제 치료반응 예측 마커로 선정하였다.

ADD2는 항암제 민감성 세포주군에 대하여 내성 세포주군에서 유전자 발현이 3.7 배 감소함과 동시에 프로모터 CpG 부위에서 고메틸화 되어 있었으며, 11종의 난소암 세포주에서 시스플라틴 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 및 프로모터 CpG의 DNA 메틸화 변화 정도가 Pearson correlation과 Spearman correlation에서 유의성을 보였으므로, ADD2 유전자의 프로모터 CpG 부위에서 일어나는 DNA 메틸레이션의 변화를 항암제 치료반응 예측 마커로 선정하였다.

H1F0는 항암제 민감성 세포주군에 대하여 내성 세포주군에서 유전자 발현이 5.8 배 감소함과 동시에 프로모터 CpG 부위에서 고메틸화 되어 있었으며, 11종의 난소암 세포주에서 시스플라틴 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 및 프로모터 CpG의 DNA 메틸화 변화 정도가 Pearson correlation 혹은 Spearman correlation에서 유의성을 보였으므로, H1F0 유전자의 프로모터 CpG 부위에서 일어나는 DNA 메틸레이션의 변화를 항암제 치료반응 예측 마커로 선정하였다.

LRRC8B는 항암제 민감성 세포주군에 대하여 내성 세포주군에서 유전자 발현이 2.7배 감소함과 동시에 프로모터 CpG 부위에서 고메틸화 되어 있었으며, 11종의 난소암 세포주에서 시스플라틴 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 및 프로모터 CpG의 DNA 메틸화 변화 정도가 Pearson correlation 에서 유의성을 보였으므로, LRRC8B유전자의 프로모터 CpG 부위에서 일어나는 DNA 메틸레이션의 변화를 항암제 치료반응 예측 마커로 선정하였다.

SHC3는 항암제 민감성 세포주군에 대하여 내성 세포주군에서 유전자 발현이 2.2배 감소함과 동시에 프로모터 CpG 부위에서 고메틸화 되어 있었으며, 11종의 난소암 세포주에서 시스플라틴 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 및 프로모터 CpG의 DNA 메틸화 변화 정도가 Spearman correlation에서 유의성을 보였으므로, SHC3 유전자의 프로모터 CpG 부위에서 일어나는 DNA 메틸레이션의 변화를 항암제 치료반응 예측 마커로 선정하였다.

ZFP37는 항암제 민감성 세포주군에 대하여 내성 세포주군에서 유전자 발현이 3.2배 감소함과 동시에 프로모터 CpG 부위에서 고메틸화 되어 있었으며, 11종의 난소암 세포주에서 시스플라틴 항암제에 대한 IC₅₀ 값과 유전자 발현 및 프로모터 CpG의 DNA 메틸화 변화 정도가 Spearman correlation에서 유의성을 보였으므로, ZFP37 유전자의 프로모터 CpG 부위에서 일어나는 DNA 메틸레이션의 변화를 항암제 치료반응 예측 마커로 선정하였다.

3. 난소암 세포주에서 유전자의 프로모터 CpG 메틸레이션의 변화에 의한 유전자 발현의 조절 확인

각 난소암 세포주에 탈 DNA메틸레이션 제제인 5-aza-2'-deoxycytidin을 3일간 처리한 후, 선정된 유전자 9종(EPS8L3, HSPA2, SYNPO, ZNF93, ADD2, H1F0, LRRC8B, SHC3 및 ZFP37) 의 유전자 발현의 변화를 조사한 결과, 이들 유전자 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 위 유전자들의 발현이 DNA methylation에 의해 조절되는 것을 의미한다(도 3 내지 도 11).

이러한 실험 결과들은, 항암제 내성 난소암 세포주에서 유의적인 발현 변화를 나타내는 9종의 유전자가 각 유전자의 프로모터 부위의 특정 CpG 부위의 저메틸화 또는 과메틸화에 의해서 조절되며, 이를 항암제 치료 반응을 예측하기 위한 마커로 사용할 수 있음을 의미한다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Development of epigenetic diagnostic method using integrated epigenetic and transcriptomic analysis <130> DPP20154336KR <160> 47 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 122 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> promoter <222> (1)..(122) <223> ch1: 109763825- 109763946 <400> 1 ggtgccagtg aaggccgggt gcctggtccc cccaggaggc tggtcttgga gcaggtggtc 60 cggtgctggt ggtggaagga cagcagcttc tctgctagtg gccacaggca gagcctgcct 120 tt 122 <210> 2 <211> 122 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> promoter <222> (1)..(122) <223> ch14 : 64540187- 64540308 <400> 2 ttatttcttc ggtgcaacca actcagaatg aattcctccg cccctgcgtg ctcagtgagt 60 cggcacccta gcagtgaact gcatttaaaa cctcaggaat tgagcgaact ctcccagtgg 120 ct 122 <210> 3 <211> 122 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> promoter <222> (1)..(122) <223> ch14 : 64540272- 64540393 <400> 3 taaaacctca ggaattgagc gaactctccc agtggctctc ctcaccggga tccccttcca 60 cgcctcctcc ccgtgccgcg cctcagtccg cactgctcat 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Artificial Sequence <220> <223> Human HSPA2 (reverse) <400> 31 ggacacgtcg aaagtgcca 19 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human SYNPO (forward) <400> 32 atggaggggt actcagagga g 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human SYNPO (reverse) <400> 33 ctctcggttt tgggacaggt g 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human ZNF93 (forward) <400> 34 gccaaaacat gccctagtgt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human ZNF93 (reverse) <400> 35 tccaccttta gctggcttgt 20 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human ADD2 (forward) <400> 36 ccatgatgac gcctatcaat ga 22 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human ADD2 (reverse) <400> 37 gtccaggagt cggtagacac 20 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human H1F0 (forward) <400> 38 actcgcagat caagttgtcc a 21 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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human GAPDH (reverse) <400> 47 tggactccac gacgtactca 20

Claims

ZFP37 (zinc finger protein 37 homolog) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소암 환자의 백금 기반의 항암제에 대한 반응성 예측용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는,
비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소;
상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머; 및
비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI 또는 NotI인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 프로모터의 CpG 부위는 서열번호 27 (9번 염색체의 113056818 내지 113056939 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 난소암 환자의 백금 기반의 항암제에 대한 반응성 예측용 키트.
난소암 환자의 백금 기반의 항암제에 대한 반응성 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 ZFP37 (zinc finger protein 37 homolog) 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 유전자 프로모터의 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출하는 방법은,
(a) 수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
(b) 상기 처리된 DNA를 상기 유전자 프로모터의 CpG 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 유전자 프로모터의 CpG 부위는 서열번호 27 (9번 염색체의 113056818 내지 113056939 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 방법.
제7항에 있어서, 상기 메틸화 수준을 검출하는 방법은 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.