KR101581036B1 - 급성 및 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 급성 및 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하는 방법 - Google Patents

Abstract

고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 고양이과 개체의 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하는 방법을 제공한다.

Description

급성 및 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 급성 및 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하는 방법{Composition and kit for diagnosing acute and chronic Toxoplasma gondii infection and method for diagnosing acute and chronic Toxoplasma gondii infection}

본 발명은 고양이과 개체의 급성 및 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 고양이과 개체의 급성 및 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다.

톡소포자충증 (Toxoplasmosis)은 톡소플라즈마 콘디의 감염에 의해 일어난다. 톡소플라즈마 콘디 (Toxoplasma gondii)는 종숙주인 고양이 또는 고양이과의 야생동물이 서식하는 곳이면 어디나 발견되며, 사람과 애완동물 및 가축을 포함한 거의 모든 포유류와 조류 및 기타 동물들이 중간숙주 역할을 하기 때문에 감염되어 있을 수 있다. 종숙주인 고양이가 감염될 경우 1~2주간 난포낭(oocyst)이 분변을 통해 배출될 수 있어서 고양이 분변을 취급하는 사람이나 오염된 환경에 처한 사람들이 감염될 수 있다.

고양이는 톡소포자충증에 감염되는 경우, 망막염과 뇌염, 심근염, 림프염, 및 복막염 등 여러 가지 질병을 갖는다. 임신 중에 처음 감염된 고양이는 유산하며, 대부분의 고양이는 상기 질병에 걸리지 않지만, 추후 혈청검사를 통해 톡사포자충에 감염되었다는 것을 알게 되며, 전체 고양이의 30-50% 정도가 상기 혈청검사를 통해 양성을 보인다. 이미 감염이 되어 양성을 보인 고양이는 나중에 다시 감염되어도 이미 면역이 생겨서 증상이 나타나지 않으며, 혹시 임신 중이라도 태아에게는 영향이 없으며, 물론 사람에게도 감염시키는 일이 없다

톡소플라즈마증에 감염된 모친으로부터 태반을 경유하며 태아가 감염되기도 한다. 태아는 사산하던지 유산하게 되기도 하지만, 출산하게 되면 망맥락막염, 뇌내석회화, 정신운동장애아 등의 후유증을 남기게 된다. 고양이의 분변 중에 알(Oocyst)을 위에서 말한 경로로 섭취하게 되어서 감염되는 것을 후천감염이라고 하는데 성인보다는 소아가 발병되기 쉬우며, 급성에서 만성으로 될 때, 원충의 증식으로 전신의 림프절염 등이 생기기도 한다.

톡소플라즈마 콘디 알이 동물의 먹이를 통해 동물의 몸에 들어가면 근육 등에 낭포(Oocyst)의 형태로 남아있게 되는데 즉, 고양이를 포함한 육식동물이 쥐나 새, 돼지와 같은 동물을 잡아먹으면 톡소플라즈마 콘디의 낭포가 몸안에 들어가게 된다. 고양이를 포함한 고양이과 동물은 다른 동물과 달리 배설물에 톡소플라즈마 콘디의 알을 배설하게 된다. 배설된 알은 자연 상태에서는 1년까지도 감염력이 있는데 고양이의 배설물로 오염된 곡식, 야채 등을 소, 돼지, 쥐, 양 등이 먹으면 그 동물들도 감염되게 된다. 톡소플라즈마 콘디의 알에 오염된 고기나 채소를 잘 익히지 않거나 오염된 채소를 잘 씻지 않고 먹거나 때로는 고양이과 동물의 배설물에 의해 오염된 물을 마시고 감염되는 경우도 있고 또, 톡소플라즈마 콘디의 알에 오염된 고양이의 분변을 맨손으로 만진 임산부나 그 외의 사람에게 전염될 수 있다. 톡소포자충증은 고양이를 통하여 옮는 것으로 알려져 있지만, 실제로 고양이 배설물을 통하여 옮은 경우보다는 날고기나 덜 익힌 고기, 또는 고양이의 배설물에 오염된 야채나 과일을 통하여 옮는 경우가 훨씬 많다.

따라서, 톡소플라즈마 콘디 감염의 진단이 요구되고 있다.

일 양상은 고양이과 개체의 급성 및 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 고양이과 개체의 급성 및 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

다른 양상은 고양이과 개체의 급성 및 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 톡소플라즈마 콘디(Toxoplasma gondii)의 GRA6 단백질 및 GRA1과 ROP2의 융합 단백질을 포함하는, 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 고양이과 개체가 급성 톡소플라즈마 콘디 감염인지, 만성 톡소플라즈마 콘디 감염인지, 또는 급성 및/만성 톡소플라즈마 콘디 감염인지를 진단하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 급성, 만성, 및 그의 조합인 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 톡소플라스마증(toxoplasmosis) 급성, 만성, 및 그의 조합 여부를 진단하기 위한 것일 수 있다. 상기 톡소플라스마증은 고양이 톡소플라스마증(feline toxoplasmosis)일 수 있다.

GRA6 단백질은 T. gondii dense granule 6 단백질일 수 있다. 상기 GRA6 단백질은 또한 P32로 지칭될 수 있다. 상기 GRA6 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 GRA6 단백질은 급성 톡소플라즈마 콘디 감염을 갖는 개체 중에서 GRA6 단백질에 대한 항체가 특이적으로 존재하므로, 톡소플라즈마 콘디 감염 개체 중의 GRA6 단백질에 대한 항체를 검출하여 톡소플라즈마 콘디 감염이 급성인지를 확인하는데 사용될 수 있다.

상기 GRA1와 ROP2의 융합 단백질은 GRA1 단백질 또는 그의 면역원성 단편과 ROP2 단백질 또는 그의 면역원성 단편이 융합된 단백질일 수 있다. GRA1 항원은 T. gondii dense granule 1 단백질일 수 있다. 상기 GRA1 단백질은 또한 P24로 지칭될 수 있다. ROP2 단백질은 T. gondii Rhoptry protein 2일 수 있다. 상기 ROP2 항원은 또한 P54로 지칭될 수 있다. 상기 GRA1과 ROP2의 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 GRA1과 ROP2의 융합 단백질은 만성 톡소플라스마증을 갖는 개체 중에 GRA1 및/또는 ROP2이 선택적으로 존재하므로, 톡소플라즈마 콘디 감염 개체 중의 GRA1 및/또는 ROP2 단백질에 대한 항체를 검출하여 톡소플라즈마 콘디 감염이 만성인지를 확인하는데 사용될 수 있다.

상기 GRA1와 ROP2의 융합 단백질은 GRA1 단백질, 및 ROP2 단백질을 포함할 수 있다. 상기 GRA1와 ROP2의 융합 단백질은 GRA1 단백질 및 ROP2 단백질이 링커에 의하여 연결된 것일 수 있다. ROP2 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. GRA1 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 링커는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 용어 "면원원성 단편"은 GRA1와 ROP2 단백질의 각 단편이 개체, 예를 들면, 고양이에 도입되는 경우, 항체 생성을 유도하는 것일 수 있다. 상기 융합은 ROP2 또는 그의 면역원성 단편의 C-말단이 GRA1 단백질 또는 그의 면역원성 단편의 N-말단에 결합하는 것, 또는 GRA1 또는 그의 면역원성 단편의 C-말단이 ROP2 단백질 또는 그의 면역원성 단편의 N-말단에 결합하는 것일 수 있다. ROP2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. GRA1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 링커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 항원은 단독 또는 다른 물질과 접합된 것일 수 있다. 상기 다른 물질은 검출가능한 신호를 발생하거나 발생시킬 수 있는 것일 수 있다. 상기 다른 물질은, 예를 들면, 형광물질과 같은 발색 물질 또는 효소와 같은 단백질일 수 있다.

상기 조성물은 고양이과 (Felidae) 개체의 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 것일 수 있다. 상기 고양이과 개체는 고양이속 (Felis)일 수 있다. 상기 고양이속은 고양이 (Felis catus), 야생고양이 (Felis silvestris), 사막고양이 (Felis bieti), 정글살쾡이 (Felis chaus), 모래고양이 (Felis margarita), 또는 검은발상쾡이 (Felis nigripes)일 수 있다.

상기 조성물은 상기 단백질을 액체 중에서 포함하는 액체 조성물일 수 있다. 상기 액체는 상기 단백질을 용해시킬 수 있고 유지시킬 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 물, 또는 PBS와 같은 버퍼 용액일 수 있다. 상기 조성물은 상기 단백질을 안정하게 유지하는 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 톡소플라즈마 콘디(Toxoplasma gondii)의 GRA6 단백질 및 GRA1과 ROP2의 융합 단백질을 포함하는, 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 키트를 제공한다.

톡소플라즈마 콘디(Toxoplasma gondii)의 GRA6 단백질 및 GRA1과 ROP2의 융합 단백질에 관하여는 상술한 바와 같다. 또한 고양이과 개체에 관하여 상술한 바와 같다.

상기 키트는 항체에 결합하는 protein A와 골드의 접합체 또는 제2 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 표지되거나 표지되지 않은 protein A와 골드의 접합체, 항-토끼 항체, 또는 항-마우스 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 ELISA 또는 면역형광 분석과 같은 항체를 이용한 분석 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다.

상기 키트는 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염 진단에 사용하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 시약은 버퍼, 지시약, 또는 그 조합을 포함할 수 있다.

상기 키트는 분석물을 포함하는 액체 시료가 적용되는 부위인 검체 패드,

상기 검체 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고, 골드 입자의 접합체가 이동가능하게 지지되어 있는 저장 패드로서, 상기 골드 입자의 접합체는 Protein A와 골드 입자의 접합체이고,

상기 저장 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고 모세관 이동에 의하여 상기 액체 시료가 이동하는 크로마토그래피 막(membrane) 물질로서, 상기 저장 패드의 하류에 톡소플라즈마 콘디(Toxoplasma gondii)의 GRA6 단백질 및 GRA1과 ROP2의 융합 단백질이 비확산적으로 고정화되어 있는 검출 영역을 포함하는 크로마토그래피 막 물질;

상기 크로마토그래피 막 물질과 유체 소통가능하게 연결되어 있는 흡습 패드 및

상기 검체 패드, 저장 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드를 지지하는 고체 지지체를 포함하는, 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 분석 장치일 수 있다.

상기 분석 장치는 항원 또는 항체와 같은 면역화학 성분의 고상 담체로서 다공성 물질을 이용하는 면역분석 키트에 관한 것이다. 본 발명에서 사용되는 검체패드, 저장 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드는 분석될 액체 시료를 수용하고 포함하기 충분한 다공성 (porosity)과 부피를 가진 물질이며, 예를 들면 마이크로다공성 막 물질일 수 있다. 상기 마이크로다공성 막 물질의 예에는 나일론, 셀룰로즈 물질, 폴리술폰, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리에스테르 및 유리 섬유가 포함된다. 상기 마이크로다공성 막 물질의 바람직한 예는, 니트로셀룰로스 막이다. 상기 분석 장치는 스트립의 형태를 가질 수 있다.

본 발명에 있어서, "유체 소통가능하게 연결되어 있는 (in flow communication with)"이라는 표현은 하나의 위치 (예, 검체패드)에 액체 시료가 적용되었을 경우 모세관 이동에 의하여 다른 위치 (예, 저장 패드)로 이용가능하게 연결되어 있는 것을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 "이동가능하게 지지되어 있는 (movably supported)"이라는 표현은 액체 시료의 모세관 이동과 함께 골드 입자의 접합체가 이동가능하게 저장 패드에 고정화되어 있는 것을 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서 "비확산적으로 고정화되어 있는 (nondiffusively immobilized)"이라는 표현은 톡소플라즈마 콘디(Toxoplasma gondii)의 GRA6 단백질 및 GRA1과 ROP2의 융합 단백질이 상기 검출 영역 내에 상기 액체 시료의 모세관 이동에 의하여 함께 확산되지 않도록 고정화되어 있는 것을 의미한다. 항원과 같은 단백질을 비확산적으로 고정화하는 방법은 상기 크로마토그래피 막 물질과 상기 항원와 같은 단백질을 크로마토그래피 막 물질의 상기 검출 영역에 비확산적으로 고정화할 수 있는 것이면 임의의 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 공유결합법이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 검출 영역은 임의의 모양, 예를 들면 사각형 및 원형의 형태를 취할 수 있으며 그 면적은 상기 크로마토그래피 막 물질의 면적보다는 작다.

본 발명의 키트에 사용되는 Protein A와 골드 접합체는 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 골드 콜로이드 용액을 만들고, 상기 용액 중의 골드를 Pretein A와 결합시킴으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 고양이과 개체로부터 유래된 시료를 톡소플라즈마 콘디(Toxoplasma gondii)의 GRA6 단백질 및 GRA1과 ROP2의 융합 단백질과 접촉시키는 단계; 및 상기 GRA6 단백질과 고양이과 개체 중 항체의 제1 복합체의 존재, 및 상기 GRA1과 ROP2의 융합 단백질과 고양이과 개체 중 항체의 제2 복합체의 존재를 검출하는 단계;를 포함하는 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하는 방법을 제공한다.

상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질을 나타낸다. 상기 생물학적 물질은 신선한 또는 보존된 기관 또는 조직 시료 또는 생검 (biopsy)와 같은 고체 조직 (solid tissue); 혈액 또는 혈액 구성성분; 양수 (amniotic fluid), 복수 (peritoneal fluid), 또는 세포간질액 (interstitial fluid)와 같은 체액 (bodily fluid); 세포 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정제 (fixatives), 영양성분 (nutrients), 항생제 등과 같은 생물학적 물질과 자연적으로 혼합되어 있지 않은 화합물을 포함할 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들면 분변, 타액, 혈액, 뇨, 세포 또는 조직일 수 있다.

상기 방법은 고양이과 개체로부터 유래된 시료를 톡소플라즈마 콘디(Toxoplasma gondii)의 GRA6 단백질 및 GRA1과 ROP2의 융합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 접촉은 고양이과 개체로부터 유래된 시료를 상기 GRA6 단백질과 상기 GRA1과 ROP2의 융합 단백질과 별도로 접촉시키는 것일 수 있다. 즉, 상기 시료는 상기 GRA6 단백질과 접촉되며, 이와 별개로 또한 상기 시료는 상기 GRA1과 ROP2의 융합 단백질과 접촉되는 것일 수 있다. 상기 접촉은 액체 매질 중에서 정적 또는 동적으로 이루어질 수 있다.

상기 방법은 상기 GRA6 단백질과 고양이과 개체 중 항체의 제1 복합체의 존재, 및 상기 GRA1과 ROP2의 융합 단백질과 고양이과 개체 중 항체의 제2 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 복합체의 검출은 당업계에 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 GRA6 단백질과 GRA1과 ROP2의 융합 단백질에 부착된 검출가능한 표지는 서로 상이할 수 있다. 상이한 검출가능한 표지가 부착된 항원을 사용하고, 상기 제1 복합체 및 제2 복합체로부터의 상기 상이한 검출가능한 표지로부터 나오는 신호를 측정함으로써 제1 복합체, 제2 복합체, 또는 제1 복합체 및 제2 복합체를 각각 구별하여 검출할 수 있다.

또한, 상기 GRA6 단백질과 GRA1과 ROP2의 융합 단백질에 부착된 검출가능한 표지가 동일한 경우에는, 고양이과 개체로부터 유래된 시료를 상기 GRA6 단백질과 상기 GRA1과 ROP2의 융합 단백질과 별도로 접촉시켜 제1 복합체와 제2 복합체를 구별하여 검출할 수 있다.

또한, 상기 방법은 제1 복합체가 검출된 경우, 상기 개체는 급성 톡소플라즈마 콘디 감염인 것으로 결정하는 단계; 및 제2 복합체가 검출된 경우, 상기 개체는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염인 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 조성물에 의하면, 고양이과 개체의 톡소플라즈마 콘디 감염이 급성, 만성, 또는 급성 및 만성인지 여부를 효과적으로 진단할 수 있다.

본 발명의 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 키트에 의하면, 고양이과 개체의 톡소플라즈마 콘디 감염이 급성, 만성, 또는 급성 및 만성인지 여부를 효과적으로 진단할 수 있다.

본 발명의 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하는 방법에 의하면, 고양이과 개체의 톡소플라즈마 콘디 감염이 급성, 만성, 또는 급성 및 만성인지 여부를 효과적으로 진단할 수 있다.

도 1a은 증폭된 GRA6TC1 DNA에 대한 전기영동 결과를 나타낸다.
도 1b는 증폭된 ROP2TC2 + GRA1TC2 DNA에 대한 전기영동 결과를 나타낸다.
도 2a은 GRA6TC1 융합 단백질을 발현하는 세포에 대한 SDS-PAGE과 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 2b는 ROP2TC2+GRA1TC2 융합 단백질을 발현하는 세포에 대한 SDS-PAGE과 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재조합 단백질의 제조

톡소플라즈마 콘디 (Toxoplasma gondii) GRA6 TC1 항원과 GRA1과 ROP2TC2의 융합 단백질을 사용하였다. 제조 과정은 다음과 같이 수행하였다.

(1) 주형 DNA 추출

ATCC 균주 은행에서 톡소플라즈마 콘디 (ATCC®50174D)를 입수하여 톡소플라즈마 콘디 DNA를 분리하였다.

(2) PCR 및 발현벡터 제조

GRAG6 TC1 및 ROP2RC2+GRAG1TC2 유전자를 코딩하는 유전자는 추출된 톡소플라즈마 콘디 DNA를 주형으로 하여 Polymerase Chain Reaction (PCR)을 수행하여 획득하였다. PCR을 수행하기 위해 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 유전자은행 (Accession No. JN649063 & Z36906& HM067753)에서 정보를 얻어 작성하였다(표 1).

프라이머 세트 1	서열번호
GRA6 TC1 F	11
GRA6 TC1 R	12
프라이머 세트 2
ROP2 TC2 F	13
ROP2 TC2 R	14
GRA1 TC2 F	15
GRA1 TC2 R	16
프라이머 세트 3
ROP2 TC2+GRA1 TC2 F	17
ROP2 TC2+GRA1 TC2 R	18

GRA6 TC1, 및 ROP2 TC2+GRA1 TC2 유전자의 증폭을 위한 열순환 (thermocycle) (Mycycler: BioRad 사)은 (94℃, 5분)x1 순환, (94℃, 1분, 45℃, 1분, 72℃, 1분)x28 순환, (94℃, 1분, 60℃, 1분, 72℃, 10분)x1 순환, 4℃, 16시간으로 사용하였다. PCR 반응이 완전히 끝난 후, 1.5%의 아가로즈 겔을 만들어 PCR 산물 1 ㎕를 전기 영동하여 항원의 크기를 확인하고 Gene clean Kit (MP biochemical, #1101-400, France)를 사용하여 각각 증폭된 GRA6TC1, ROP2TC2, 및 GRA1TC2 PCR 산물을 추출하였다. 추출 후 상기 ROP2TC2 및 GRA1TC2 PCR 산물은 합성 PCR을 하여 서로 연결하여 ROP2TC2 + GRA1TC2 PCR하였고, 상기 Gene clean kit을 사용하여 ROP2TC2 + GRA1TC2 PCR 산물을 수득하였다. 도 1a은 증폭된 GRA6TC1 DNA에 대한 전기영동 결과를 나타낸다. 도 1b는 증폭된 ROP2TC2 + GRA1TC2 DNA에 대한 전기영동 결과를 나타낸다.

DNA의 확인은 작업의 효율과 정확성을 기하기 위하여 전문업체 (Jenotech, Korea)에 DNA 서열분석을 의뢰하였고, 추출한 DNA가 각각 GRA6TC1 및 ROP2TC2 + GRA1TC2 유전자임을 확인하였다 (각각 서열번호 2 및 4 참조).

각각 GRA6TC1 및 ROP2TC2+GRA1TC2 재조합 DNA 클로닝을 위하여, GRA6TC1 PCR 산물은 BamHI (NEB R0136S, USA) 및 SalI(NEB, #R0138S, USA) 제한 효소로 절단하고, ROP2TC2+GRA1TC2 PCR 산물은 BglII(NEB, #R0144S, USA), SalI(NEB, #R0138S, USA) 제한 효소로 절단하였다. 또한 대장균 발현 벡터인 pGEX-4T 벡터(GE healthcare 사)를 프라이머의 링커 부위인 BamHI (NEB, #R0136S, USA), SalI (NEB, #R0138S, USA)으로 절단하고, 각각 절단된 GRA6TC1 유전자 및 ROP2TC2+GRA1TC2 유전자와 아가로즈 겔에 전기영동하여 Gene Clean Kit (MP biochemical, #1101-400, France)를 이용해 추출하였다.

T4 DNA 리가제 (Roche, 10481220001, Germany)를 이용해 증폭해서 추출한 GRA6TC1 삽입체와 ROP2TC2+GRA1TC2 삽입체와 pGEX-4T 벡터를 16℃ 밤샘 라이게이션시키고 컴페턴트 세포 (Top10F')에 형질전환 시켰다. 형질전환은 열충격 (heat-shock) 법을 이용하였으며, -70℃에 보관된 컴페턴트 세포를 꺼내 얼음 위에서 해동시킨 후 라이게이션 혼합물 5 ㎕를 넣고 약 3초간 조심스럽게 혼합한 후 얼음에서 30분간 정치시켰다. 반응물이 혼합된 컴페턴트 세포의 튜브를 42℃의 항온 수조에 60초간 정치시킨 후 열 충격을 주고 즉시 얼음에 넣어 주었다. LB 액체 배지를 1 ml 넣어주어 37℃, 1시간 인큐베이션시킨 후 선발마커로 항생제 암피실린이 포함된 LB 아가 플레이트에 100 ㎕의 균액을 도말하고 밤샘, 37℃ 조건으로 배양하였다.

LB 아가 플레이트에 자란 콜로니를 액체 LB 배지(+암피실린)에 접종하여 세포가 자랐을 때 Wizard Plus SV Minipreps Kit (Promega, #A1460, USA)를 이용해서 DNA를 추출하고, 추출한 재조합 DNA가 각각 pGEX-4T GRA6TC1 및 pGEX-4T ROP2TC2+GRA1TC2가 맞는지 확인하기 위하여 전문업체(Jenotech, Korea)에 DNA sequencing을 의뢰하였고, 추출한 DNA가 각각 pGEX-4T GRA6TC1 및 pGEX-4T ROP2TC2+GRA1TC2 유전자임을 확인하였다.

(3) SDS - PAGE 및 웨스턴 블롯

대장균 발현용 균주인 BL21에 상기에서 추출한 pGEX-4T GRA6TC1 및 pGEX-4T ROP2TC2+GRA1TC2 재조합 DNA를 각각 1~2 ㎕ 첨가한 후 42℃의 항온수조에 60초간 정치시킨 후 열충격을 주고 즉시 얼음에 넣어 주었다. LB 액체 배지를 1 ml 넣어주어 37℃, 1시간 인큐베이션을 시킨 후 선별 마커로 항생제 암피실린이 포함된 LB 아가 플레이트에 100 ul의 균액을 도말하고 밤샘, 37℃ 조건으로 배양 후 콜로니가 형성되었다.

GRA6TC1 단백질, 및 ROP2TC2와 GRA1TC2의 융합 단백질을 발현하는 대장균 균주를 삼각 플라스크에 넣어 18시간 이상 진탕 배양하였다. 배양된 균주를 발효기에 배양 배지 총 부피의 약 1~2% 접종하여 37℃에서 약 2시간 배양하고 균주가 증식하여 600 nm에서 흡광도 값이 약 0.5~0.6 내외가 될 때까지 배양하였다. 균주가 흡광도 0.5~0.6 내외로 증식하였을 경우 IPTG를 2.5 mM 되도록 첨가하여 추가로 약 3 시간을 배양한 후 배양된 균주액을 회수하여 원심분리방법으로 균체를 회수하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯을 수행하여 발현된 융합 단백질 (GRA6TC1 단백질: 35 kDa, ROP2TC2와 GRA1TC2의 융합 단백질: 75 kDa)을 확인하였다. 도 2a는 GRA6TC1 융합 단백질을 발현하는 세포에 대한 SDS-PAGE과 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 도 2b는 ROP2TC2+GRA1TC2 융합 단백질을 발현하는 세포에 대한 SDS-PAGE과 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.

(4) 융합 단백질의 정제

GRA6TC1 단백질, 및 ROP2TC2와 GRA1TC2의 융합 단백질을 발현하는 대장균 균주를 배양하여 회수하기 위해 4,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리 (HANIL, UNION 32R)하여 상층액은 버린 후 펠렛(pellet) 양의 5배 부피인 파쇄 용액에 용해시켰다. 용해한 대장균 세포는 얼음 속에서 10분 정치 후 초음파처리 하였다(vibra cell, sonics) (5초 파쇄, 5초 정지; 총 10분). 파쇄된 융합 단백질은 12,000 rpm으로, 4℃에서 10분 동안 원심분리(VS24SMTi: vision science)하여 상층액을 회수하였다. 융합 단백질이 함유된 상층액은 0.45 ㎛ 필터(Sartorius stedim, Ministart)로 여과시킨 후, 융합 단백질이 함유된 상층액을 평형액과 1:1 비율로 섞은 후 Glutathione-resin column에 전량 로딩하여 융합 단백질을 모두 컬럼에 로딩한 후 O.D₂₈₀=0.05이하가 될 때까지 평형액으로 세척한 후, 용출액으로 GRA6TC1 단백질, 및 ROP2TC2와 GRA1TC2의 융합 단백질을 회수하였다.

실시예 2: 키트 제작

GRA6TC1 단백질, 및 ROP2TC2와 GRA1TC2의 융합 단백질을 별도의 스트립에 포함한 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염 진단용 키트를 제조하였다. 하기에서 GRA6TC1 단백질을 포함하는 스트립(이하 '급성 스트립')을 제작하고, ROP2TC2와 GRA1TC2의 융합 단백질을 포함하는 스트립(이하 '만성 스트립')을 제작하였다. 제작된 각각의 급성 및 만성 스트립을 최종 디바이스의 하판에 넣고 상판을 덮어 키트를 제조하였다.

2.1 GRA6TC1 단백질을 포함한 스트립 제작

실시예 1에서 따라 준비되고 정제된 GRA6TC1 단백질을 멤브레인의 검사선 위치에 2.0 mg/ml 농도로 분주하여 코팅하였다. 또한, 골드 패드에 Protein A-금 접합체를 접합하였다. 상기 Protein A-금 접합체는 Protein A(Pierce사, US, Cat.#21184)에 금 콜로이드(gold colloid)와 결합하여 제조하였다. 그 후, 흡습 패드 및 검체 패드를 반응 용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 제조하였다. 상기에서 제조된 멤브레인, 패드들을 오른쪽부터 검체 패드, 골드 패드, 멤브레인, 마지막으로 흡습 패드를 각각 중첩되게 결합하고 4.45 mm/스트립 크기로 절단하였다.

2.2 ROP2TC2 와 GRA1TC2 의 융합 단백질을 포함한 스트립 제작

실시예 1에서 따라 준비되고 정제된 ROP2TC2와 GRA1TC2의 융합 단백질을 멤브레인의 검사선 위치에 2.0 mg/ml 농도로 분주하여 코팅하였다. 또한, 골드 패드에 Protein A-금 접합체를 접합하였다. 상기 Protein A-금 접합체는 Protein A(Pierce사, US, Cat.#21184)에 금 콜로이드(gold colloid)와 결합하여 제조하였다. 그 후, 흡습 패드 및 검체 패드를 반응 용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 제조하였다. 상기에서 제조된 멤브레인, 패드들을 오른쪽부터 검체 패드, 골드 패드, 멤브레인, 마지막으로 흡습 패드를 각각 중첩되게 결합하고 4.45 mm/스트립 크기로 절단하였다.

실시예 3: 양성 검체와 음성 검체에 대한 본 발명의 키트를 적용한 시험

본 발명자는 보유 중인 무작위 검체 86개(출처: 모란시장 길고양이)를 미국 Cornell 대학교의 수의대학에 병성 감정하여 톡소플라스마 항체 테스트를 진행하였다. 표 2는 코넬대학교 수의대학에서 86개의 무작위 검체에 대한 톡소플라스마 항체 ELISAS 결과를 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 10개의 검체는 양성 검체로 확인되었으며, 76개의 검체는 음성 검체로 확인되었다. 또한 본 발명자는 코넬대학교 수의대학에서 음성으로 확인된 76개의 무작위 검체를 음성으로 기준하여 사용하였다. 상기 코넬대 결과를 임상평가에 대한 자료로 사용하였다.

ID	코넬대학교 결과 k-ELISA	ID	코넬대학교 결과 k-ELISA	ID	코넬대학교 결과 k-ELISA
1	양성, 1:54	43	음성	74	음성
2	음성	44	음성	75	음성
3	음성	46	음성	76	음성
7	음성	48	음성	77	양성, 1:407
8	음성	49	음성	78	양성, 1:48
10	음성	50	음성	79	양성, 1:178
12	양성, 1:59	51	음성	80	음성
14	음성	52	음성	81	음성
16	음성	53	음성	82	음성
17	음성	54	음성	83	음성
18	음성	55	음성	84	음성
19	음성	56	음성	85	음성
20	양성, 1:64	57	음성	86	음성
22	음성	58	음성	87	음성
23	음성	59	음성	88	음성
24	음성	60	음성	89	음성
25	음성	61	양성, 1:139	90	음성
26	음성	62	양성, 1:242	91	음성
27	음성	63	음성	92	음성
28	양성, 1:114	64	음성	93	음성
30	음성	65	음성	94	음성
31	음성	66	음성	95	음성
34	음성	67	음성	98	음성
35	음성	68	음성	97	음성
36	음성	69	음성	98	음성
37	음성	70	음성	99	음성
39	음성	71	음성	100	음성
40	양성, 1:93	72	음성	101	음성
42	음성	73	음성

또한, 코넬대 결과에서 양성으로 확인된 개체인 경우 급성인지 혹은 만성인지에 대한 정확한 정보가 부족하기 때문에, 본 발명자는 급성감염 개체를 제조하기 위해 톡소플라즈마 콘디 RH 균주를 쥐의 복강에서 인 비보 배양하고 그 균체를 구입한 모란시장 길고양이에게 인공 감염 시켜 급성감염에 대한 검체를 확보하였다.

본 발명의 키트를 사용하여 양성 검체와 음성 검체에 대한 반응성 여부를 확인하였다.

표 3은 양성 검체에 대하여 본 발명의 일 구체예인 키트를 사용하여 나타낸 결과를 나타낸 표이다. 또한 대조군으로 아산사 키트를 사용하여 나타낸 결과를 함께 표시하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 10개의 양성 검체에 대하여, 본 발명의 키트 중 만성 스트립에서 모두 양성이 나타났고, 급성 스트립에서도 간헐적인 동시 양성이 확인되었다. 또한, 76개의 음성 검체의 경우, 1개 검체를 제외하고 75개의 검체가 음성으로 나타났다.

ID	코넬대학교 결과 k- ELISA	본 발명의 급성 스트립	본 발명의 만성 스트립	아산사 키트
1	1:54	+	++	+
12	1:59	음성	+	음성
20	1:64	음성	++	+
28	1:114	음성	+++	+
40	1:93	음성	++	+
61	1:139	+	++	++
62	1:242	++	++	+
77	1:407	음성	+++	++
78	1:48	++	++	음성
79	1:178	음성	++	++

* +: weak positive, ++: medium positive, +++: strong positive

표 4는 본 발명의 키트를 이용한 진단에 대한 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 나타내는 표이다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 민감도는 100%로 나타났으며, 특이도는 98.6%로 나타났다.

본 발명의 키트	코넬대학 양성 확인	코넬대학 음성 확인	계
급성 스트립: 양성 만성 스트립: 양성	4	0	4
급성 스트립: 양성 만성 스트립: 음성	0	1	1
급성 스트립: 음성 만성 스트립: 양성	6	0	6
급성 스트립: 음성 만성 스트립: 음성	0	75	75
계	10	75	86
민감도 = 10/10 x 100% = 100%			100%
특이도 = 75/76 x 100% = 98.6%			98.6%

또한, 모란시장에서 입수된 무작위 검체의 경우에는 감염시기에 대한 정보가 불충분하기 때문에 본사는 확실한 급성감염 검체를 제조하기 위해 상기 기재된 대로 총 6개의 급성 검체를 제조하였다. 표 5는 6개의 급성 검체에 대한 본 발명의 키트를 적용한 결과를 나타낸 표이다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 모든 검체에 대하여 본 발명의 키트 중 급성 스트립에서 모두 양성의 결과가 나타났다. 또한, 본 발명의 키트 중 급성 스트립에서 양성으로 나타난 검체 중, 본 발명의 키트 중 만성 스트립에서도 양성으로 검출된 검체는 88, 90, 및 91 번의 검체, 즉, 3개의 검체에서 나타났다.

ID	본 발명의 키트 중 급성 스트립	본 발명의 키트 중 만성 스트립	아산사 키트
87	+	음성	음성
88	+	++	+
89	++	음성	음성
90	+++	++	+
91	++	++	+
92	++	음성	음성

* +: weak positive, ++: medium positive, +++: strong positive

<110> Bionote, Inc. <120> Composition and kit for diagnosing acute and chronic Toxoplasma gondii infection and method for diagnosing acute and chronic Toxoplasma gondii infection <130> PN105293 <160> 18 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Toxoplasma Gondii <400> 1 Val Ala Val Ala Ala Asp Ser Gly Gly Val Lys Gln Thr Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Gly Ser Ser Gly Gly Gln Gln Glu Ala Val Gly Thr Thr Glu Asp 20 25 30 Tyr Val Asn Ser Ser Ala Met Gly Gly Gly Gln Gly Asp Ser Leu Ala 35 40 45 Glu Asp Asp Thr Thr Ser Glu Ala Ala Glu Gly Asp Val Asp Pro Phe 50 55 60 Pro Val Leu Ala Asn Glu Gly Lys Ser Glu Ala Arg Gly Pro Ser Leu 65 70 75 80 Glu Glu Arg Ile Glu Glu Gln Gly Thr Arg Arg Arg Tyr Ser Ser Val 85 90 95 Gln Glu Pro Gln Ala Lys Val Pro Ser Lys Arg Thr Gln Lys Arg 100 105 110 <210> 2 <211> 336 <212> DNA <213> Toxoplasma Gondii <400> 2 gtcgctgtcg cagcagacag cggtggtgtt aagcagaccc cttcggaaac cggttcgagc 60 ggtggacagc aagaagcagt ggggaccact gaagactatg tcaactcttc ggcgatgggc 120 ggtggccaag gcgactcgtt agctgaagat gatacaacct ccgaagcggc ggagggcgac 180 gttgaccctt ttcccgtgct ggcgaatgag gggaagtcgg aggcgcgtgg cccgtcgctc 240 gaggaaagaa tcgaagaaca gggcacaaga cgacgttact cctctgttca agaaccacaa 300 gcgaaggtgc ctagcaaacg aacacagaaa cgctaa 336 <210> 3 <211> 443 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400> 3 Met Pro Pro Asp Glu Phe Pro Glu Asp Val Asp Thr Asn Pro Met Tyr 1 5 10 15 Phe Arg Gly Thr Asp Pro Gly Asp Val Val Ile Glu Glu Leu Phe Asn 20 25 30 Arg Ile Pro Glu Thr Ser Val Trp Asn Glu Asn Glu Arg Val Leu Ser 35 40 45 Asn Ala Asn His Leu Val Ser Thr Ala Leu Trp Arg Asn Glu Gln Ser 50 55 60 Phe Arg Val Gly Ser Glu Leu Gly Glu Arg Pro Arg Thr Leu Val Arg 65 70 75 80 Gly Pro Val Leu Arg Asp Asp Gly Ser Tyr Ile Cys Leu Glu Ala Thr 85 90 95 Asp Gln Glu Thr Gly Glu Pro Leu Glu Val His Val Pro Tyr Phe Thr 100 105 110 Glu Arg Pro Pro Ser Asn Ala Ile Lys Gln Leu Ser Glu Gln Val Leu 115 120 125 Arg Leu Arg Leu Leu Arg Gly Ile Lys Asn Gln Arg Gln Ala Lys Ala 130 135 140 Tyr Leu Arg Phe Ile Phe Pro Ile Asp Leu Val Lys Asp Pro Lys Lys 145 150 155 160 Arg Lys Met Ile Arg Val Arg Leu Asp Glu Arg Asp Met Trp Val Leu 165 170 175 Ser Arg Phe Ser Leu Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Asn Leu His Ile Leu 180 185 190 Gly Asp Val Leu Leu Ser His Ser Ser Thr His Lys Ser Leu Val His 195 200 205 His Ala Arg Leu Gln Leu Thr Leu Gln Leu Ile Arg Leu Ala Ala Ser 210 215 220 Leu Gln His Tyr Gly Leu Val His Ala Asp Phe Gln Val Arg Asn Ile 225 230 235 240 Leu Leu Asp Gln Arg Gly Gly Val Phe Leu Thr Gly Phe Glu His Leu 245 250 255 Val Arg Asp Gly Ala Ser Ala Val Ser Pro Ile Gly Arg Gly Ser Gly 260 265 270 Gly Gly Ser Tyr Ala Ala Glu Gly Gly Asp Asn Gln Ser Ser Ala Val 275 280 285 Ser Asp Arg Ala Ser Leu Leu Gly Leu Leu Ser Gly Gly Thr Gly Gln 290 295 300 Gly Leu Gly Ile Gly Glu Ser Val Glu Leu Glu Met Met Gly Asn Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Glu Arg Pro Thr Gly Asn Pro Asp Leu Leu Lys Ile Ala 325 330 335 Ile Lys Thr Ser Asp Gly Ser Tyr Ser Glu Val Gly Asn Val Asn Met 340 345 350 Glu Glu Val Ile Asp Thr Met Lys Ser Met Gln Arg Asp Glu Glu Ile 355 360 365 Phe Phe Arg Ala Leu Asn Lys Gly Glu Thr Val Glu Glu Ala Ile Glu 370 375 380 Asp Val Ala Gln Ala Glu Gly Leu Asn Ser Glu Gln Thr Leu Gln Leu 385 390 395 400 Glu Asp Ala Val Ser Ala Val Ala Ser Val Val Gln Asp Glu Met Asn 405 410 415 Val Ile Asp Asp Val Gln Gln Leu Glu Lys Asp Lys Gln Gln Leu Lys 420 425 430 Asp Asp Ile Gly Phe Leu Thr Gly Glu Arg Glu 435 440 <210> 4 <211> 1332 <212> DNA <213> Toxoplasma gondii <400> 4 atgcctcccg acgagtttcc ggaggatgtt gacacgaacc ctatgtattt ccgcggtacg 60 gatcctggag acgtcgtcat tgaggagctg ttcaatcgta taccggaaac aagcgtatgg 120 aatgagaacg aacgcgtcct gtcgaatgcc aaccatctag tgtccacagc attgtggcgt 180 aatgagcaga gcttccgcgt ggggtcggag ctgggcgagc ggccaaggac gctagtcaga 240 ggcccagtgc tccgcgacga cggctcgtat atctgtctcg aggcgaccga ccaggagaca 300 ggagaaccac ttgaggtgca cgttccatat ttcacggaac ggccgccttc caacgcgatc 360 aagcagttga gcgagcaggt gctgcgccta cgcttgctac gaggcatcaa aaaccagagg 420 caagccaagg cgtatctcag atttatattc cccatcgatt tggtgaagga cccaaagaaa 480 aggaagatga tccgggttcg cttagatgag agggatatgt gggtcttgag cagattctct 540 ctgtatcccc gaatacagag taaccttcat attcttggag acgtcctact gagtcattcc 600 tcaacacaca agtccctcgt gcaccacgct cggttgcagc tcacgcttca gctcataagg 660 ttggccgcga gtctccagca ctatggcctt gtgcatgccg attttcaagt caggaatatc 720 ctgttagacc agcgtggtgg cgtgtttttg accggctttg aacatctggt gcgagacggc 780 gccagtgcgg tgtcgcccat cggtcgagga tctggagggg gttcctacgc tgccgaaggc 840 ggcgacaacc agtcgagcgc cgtctcagat cgggcgtctc tccttggttt gctgagtgga 900 gggacagggc agggattagg aatcggagaa tctgtagagc tggagatgat ggggaacacg 960 tatcgtgtgg agagacccac aggcaacccg gacttgctca agatcgccat taaaacttca 1020 gatggatcgt acagcgaagt cggcaatgtt aacatggagg aggtgattga tactatgaaa 1080 agcatgcaga gggacgagga gattttcttt cgtgcgttga acaaaggcga aacagtagag 1140 gaagcgatcg aagacgtggc tcaagcagaa gggcttaatt cggagcaaac cctgcaactg 1200 gaagatgcag tgagcgcggt ggcgtctgtt gttcaagacg agatgaacgt gatcgacgat 1260 gtgcagcagc ttgaaaagga caaacaacag cttaaggatg acatagggtt cttaacagga 1320 gagagagagt aa 1332 <210> 5 <211> 270 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400> 5 Met Pro Pro Asp Glu Phe Pro Glu Asp Val Asp Thr Asn Pro Met Tyr 1 5 10 15 Phe Arg Gly Thr Asp Pro Gly Asp Val Val Ile Glu Glu Leu Phe Asn 20 25 30 Arg Ile Pro Glu Thr Ser Val Trp Asn Glu Asn Glu Arg Val Leu Ser 35 40 45 Asn Ala Asn His Leu Val Ser Thr Ala Leu Trp Arg Asn Glu Gln Ser 50 55 60 Phe Arg Val Gly Ser Glu Leu Gly Glu Arg Pro Arg Thr Leu Val Arg 65 70 75 80 Gly Pro Val Leu Arg Asp Asp Gly Ser Tyr Ile Cys Leu Glu Ala Thr 85 90 95 Asp Gln Glu Thr Gly Glu Pro Leu Glu Val His Val Pro Tyr Phe Thr 100 105 110 Glu Arg Pro Pro Ser Asn Ala Ile Lys Gln Leu Ser Glu Gln Val Leu 115 120 125 Arg Leu Arg Leu Leu Arg Gly Ile Lys Asn Gln Arg Gln Ala Lys Ala 130 135 140 Tyr Leu Arg Phe Ile Phe Pro Ile Asp Leu Val Lys Asp Pro Lys Lys 145 150 155 160 Arg Lys Met Ile Arg Val Arg Leu Asp Glu Arg Asp Met Trp Val Leu 165 170 175 Ser Arg Phe Ser Leu Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Asn Leu His Ile Leu 180 185 190 Gly Asp Val Leu Leu Ser His Ser Ser Thr His Lys Ser Leu Val His 195 200 205 His Ala Arg Leu Gln Leu Thr Leu Gln Leu Ile Arg Leu Ala Ala Ser 210 215 220 Leu Gln His Tyr Gly Leu Val His Ala Asp Phe Gln Val Arg Asn Ile 225 230 235 240 Leu Leu Asp Gln Arg Gly Gly Val Phe Leu Thr Gly Phe Glu His Leu 245 250 255 Val Arg Asp Gly Ala Ser Ala Val Ser Pro Ile Gly Arg Gly 260 265 270 <210> 6 <211> 168 <212> PRT <213> Toxoplasma gondii <400> 6 Tyr Ala Ala Glu Gly Gly Asp Asn Gln Ser Ser Ala Val Ser Asp Arg 1 5 10 15 Ala Ser Leu Leu Gly Leu Leu Ser Gly Gly Thr Gly Gln Gly Leu Gly 20 25 30 Ile Gly Glu Ser Val Glu Leu Glu Met Met Gly Asn Thr Tyr Arg Val 35 40 45 Glu Arg Pro Thr Gly Asn Pro Asp Leu Leu Lys Ile Ala Ile Lys Thr 50 55 60 Ser Asp Gly Ser Tyr Ser Glu Val Gly Asn Val Asn Met Glu Glu Val 65 70 75 80 Ile Asp Thr Met Lys Ser Met Gln Arg Asp Glu Glu Ile Phe Phe Arg 85 90 95 Ala Leu Asn Lys Gly Glu Thr Val Glu Glu Ala Ile Glu Asp Val Ala 100 105 110 Gln Ala Glu Gly Leu Asn Ser Glu Gln Thr Leu Gln Leu Glu Asp Ala 115 120 125 Val Ser Ala Val Ala Ser Val Val Gln Asp Glu Met Asn Val Ile Asp 130 135 140 Asp Val Gln Gln Leu Glu Lys Asp Lys Gln Gln Leu Lys Asp Asp Ile 145 150 155 160 Gly Phe Leu Thr Gly Glu Arg Glu 165 <210> 7 <211> 810 <212> DNA <213> Toxoplasma gondii <400> 7 atgcctcccg acgagtttcc ggaggatgtt gacacgaacc ctatgtattt ccgcggtacg 60 gatcctggag acgtcgtcat tgaggagctg ttcaatcgta taccggaaac aagcgtatgg 120 aatgagaacg aacgcgtcct gtcgaatgcc aaccatctag tgtccacagc attgtggcgt 180 aatgagcaga gcttccgcgt ggggtcggag ctgggcgagc ggccaaggac gctagtcaga 240 ggcccagtgc tccgcgacga cggctcgtat atctgtctcg aggcgaccga ccaggagaca 300 ggagaaccac ttgaggtgca cgttccatat ttcacggaac ggccgccttc caacgcgatc 360 aagcagttga gcgagcaggt gctgcgccta cgcttgctac gaggcatcaa aaaccagagg 420 caagccaagg cgtatctcag atttatattc cccatcgatt tggtgaagga cccaaagaaa 480 aggaagatga tccgggttcg cttagatgag agggatatgt gggtcttgag cagattctct 540 ctgtatcccc gaatacagag taaccttcat attcttggag acgtcctact gagtcattcc 600 tcaacacaca agtccctcgt gcaccacgct cggttgcagc tcacgcttca gctcataagg 660 ttggccgcga gtctccagca ctatggcctt gtgcatgccg attttcaagt caggaatatc 720 ctgttagacc agcgtggtgg cgtgtttttg accggctttg aacatctggt gcgagacggc 780 gccagtgcgg tgtcgcccat cggtcgagga 810 <210> 8 <211> 504 <212> DNA <213> Toxoplasma gondii <400> 8 tacgctgccg aaggcggcga caaccagtcg agcgccgtct cagatcgggc gtctctcctt 60 ggtttgctga gtggagggac agggcaggga ttaggaatcg gagaatctgt agagctggag 120 atgatgggga acacgtatcg tgtggagaga cccacaggca acccggactt gctcaagatc 180 gccattaaaa cttcagatgg atcgtacagc gaagtcggca atgttaacat ggaggaggtg 240 attgatacta tgaaaagcat gcagagggac gaggagattt tctttcgtgc gttgaacaaa 300 ggcgaaacag tagaggaagc gatcgaagac gtggctcaag cagaagggct taattcggag 360 caaaccctgc aactggaaga tgcagtgagc gcggtggcgt ctgttgttca agacgagatg 420 aacgtgatcg acgatgtgca gcagcttgaa aaggacaaac aacagcttaa ggatgacata 480 gggttcttaa caggagagag agag 504 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 9 Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 10 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 10 tctggagggg gttc 14 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA6 TC1 Forward primer <400> 11 ggatccgtcg ctgtcgcagc agac 24 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA6 TC1 Reverse primer <400> 12 gtcgacttag cgtttctgtg ttcgttt 27 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROP2 TC2 Forward primer <400> 13 agatctatgc ctcccgacga gttt 24 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROP2 TC2 Reverse primer <400> 14 ggaaccccct ccagatcctc gaccgatggg cga 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA1 TC2 Forward primer <400> 15 tctggagggg gttcctacgc tgccgaaggc ggc 33 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRA1 TC2 Reverse primer <400> 16 gtcgacttac tctctctctc ctgttaa 27 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROP2 TC2+GRA1 TC2 Forward primer <400> 17 agatctatgc ctcccgacga gttt 24 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ROP2 TC2+GRA1 TC2 Reverse primer <400> 18 gtcgacttac tctctctctc ctgttaa 27

Claims (8)

1. 톡소플라즈마 콘디(Toxoplasma gondii)의 GRA6 단백질 및 GRA1 및 ROP2의 융합 단백질을 포함하고, 상기 GRA1와 ROP2의 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는, 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 톡소플라즈마 콘디의 GRA6 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 GRA1와 ROP2의 융합 단백질은 서열번호 6의 아미노산 서열과 서열번호 5의 아미노산 서열이 융합된 것인 조성물.
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서, 상기 톡소플라즈마 콘디의 GRA6 단백질은 급성 톡소플라즈마 콘디 감염을 갖는 개체 중의 항체와 결합하고, 상기 GRA1과 ROP2의 융합 단백질은 만성 톡소플라스마증을 갖는 개체 중의 항체와 결합하는 것인 조성물.
5. 톡소플라즈마 콘디(Toxoplasma gondii)의 GRA6 단백질 및 GRA1과 ROP2의 융합 단백질을 포함하고, 상기 GRA1와 ROP2의 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는, 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하기 위한 키트.
6. 고양이과 개체로부터 유래된 시료를 톡소플라즈마 콘디(Toxoplasma gondii)의 GRA6 단백질 및 GRA1과 ROP2의 융합 단백질과 접촉시키는 단계; 및
   상기 GRA6 단백질과 고양이과 개체 중 항체의 제1 복합체의 존재, 및 상기 GRA1과 ROP2의 융합 단백질과 고양이과 개체 중 항체의 제2 복합체의 존재를 검출하는 단계;를 포함하고, 상기 GRA1와 ROP2의 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 고양이과 개체의 급성 및/또는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염을 진단하는 방법.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 접촉은 고양이과 개체로부터 유래된 시료를 상기 GRA6 단백질과의 접촉과 상기 GRA1과 ROP2의 융합 단백질과의 접촉을 별도로 수행시키는 것인 방법.
8. 청구항 6에 있어서,
   제1 복합체가 검출된 경우, 상기 개체는 급성 톡소플라즈마 콘디 감염인 것으로 결정하는 단계; 및
   제2 복합체가 검출된 경우, 상기 개체는 만성 톡소플라즈마 콘디 감염인 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.

Images