KR101571136B1 - 형광 이미지의 획득과 광 자극이 가능한 광 파이버 시스템 - Google Patents

Abstract

광 자극에 의해 세포막전위의 변화를 유도하는 광반응성 채널이 세포막에 발현된 세포의 위치를 확인하여 광 자극할 수 있는 광 파이버 시스템이 제공된다. 상기 광반응성 채널에는 빛을 조사하면 형광을 일으키는 제1형광성 지시자가 표지되고, 상기 광 자극 시스템은, 복수의 광 파이버로 이루어진 광 파이버 다발을 포함하는 프로브 및 상기 복수의 광 파이버 중 원하는 광 파이버에 선택적으로 빛을 입사시킬 수 있는 프로젝션 장치를 포함하고, 상기 제1형광성 지시자에서 형광이 일어나도록 하는 제1관찰 광을 상기 광 파이버 다발로 입사시켜 광반응성 채널의 형광 이미지를 획득하고, 상기 프로젝션 장치를 통해 형광을 일으킨 위치에 대응하는 광 파이버에 상기 광반응성 채널을 활성화시킬 수 있는 자극 광을 입사시켜 상기 광반응성 채널을 광 자극한다.

Description

형광 이미지의 획득과 광 자극이 가능한 광 파이버 시스템{fiber-optic systems for fluorescence imaging and light stimulation}

본 발명은 광 파이버 다발을 이용해 신경 세포에 광 자극을 가하는 광 파이버 시스템에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 광 자극에 감응하도록 처리된 신경 세포에서 광 자극 부위를 확인하여 선택적으로 광 자극을 수행할 수 있는 광 파이버 시스템에 관한 것이다.

신경 질환이 증가함에 따라 신경 질환을 치료하고 재활하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

저하된 신경 기능을 복원하기 위한 기술로 신경에 전기 자극을 가하는 DBS (Deep brain stimulation), FES (Functional electrical stimulation) 기술들이 치료에 이용되고 있다.

그러나 이러한 전기자극에 의한 복원 기술은 전극 기판을 삽입하여 이루어지므로, 인위적인 전기 자극에 의해 신경 세포가 손상되거나, 전극 기판의 생체 부적합성으로 인해 생체 내 염증 반응을 일으키는 등의 2차 손상을 초래하게 된다.

또한, 전해질로 이루어진 생체의 특성상 전기 자극을 원하는 부위에만 자극을 주기가 어려우며 원하지 않은 반응을 초래할 수 있다.

따라서, 유전자 기법을 이용해 신경 세포를 광 자극하여 활성화시킬 수 있는 광 유전학 기법이 개발되고 있다.

유전자 기법의 대표적인 예로서, 녹조류 등에서 유래된 채널로돕신-2(Channelrhodopsin-2, ChR2) 및 할로로돕신(Halorhodopsin, NpHR)의 채널 단백질로부터 얻어진 광 반응성 광 유전자를 세포의 세포막에 주입하여, 채널로돕신-2 및 할로로돕신과 실질적으로 동일한 작용의 광 반응성 채널 단백질("광반응성 채널")이 세포막에 발현되도록 하는 방법이 있다.

광반응성 채널은 광 자극에 반응하여 작동하여 해당 세포를 활성화시킨다.

도 1은 채널로돕신-2의 작동을 개념적으로 도시한 것이다.

채널로돕신-2(ACCESSION ABZ90903, VERSION ABZ90903.1 GI: 167650748)은 녹조류(Chlamydomonas reinhardtii)에서 볼 수 있는 양이온(Na⁺, K⁺, Ca^{2 +}) 채널의 막단백질로서, 푸른빛의 광자극(470 nm)에 의해서 활성화된다. 구체적으로, 푸른빛이 채널로돕신-2 이온 채널에 감지되면 세포내 활성화가 되면서 이온 채널이 열리고 Na⁺, Ca²⁺가 세포안으로 들어와 세포막을 탈분극화(Depolarization)시켜, 신경세포의 활동전위를 증가시킨다.

도 2는 할로로돕신의 작동을 개념적으로 도시한 것이다.

상기 할로로돕신(ACCESSION AAA72222, VERSION AAA72222.1 GI:150235)은 나트로노모나스 파라오니스(Natronomonas pharaonis)에서 추출된 염소이온 (Cl^-) 펌프 막단백질로, 노란빛(593nm)에서 활성화된다. 구체적으로, 노란빛이 조사되면 할로로돕신이 반응하여 염소이온(Cl^-)을 세포안으로 들어오는 염소이온 수송체를 작동시키고, 이는 세포 내부의 과분극화(Hyperpolarization)를 유발하여 신경세포의 활동전위를 억제시킨다.

채널로돕신-2와 할로로돕신로부터 얻어진 광 반응성 유전자는 원하는 신경 세포의 세포막에 선택적으로 주입될 수 있으며, 다양한 주입 방법이 공지되어 있다.

광유전자 중 채널로돕신-2의 유전정보를 가지는 광유전자에 의해 발현된 광 반응성 채널은 광 자극이 가해지면 신경 세포의 활동전위를 증가시키고, 할로로돕신의 유전정보를 가지는 광 유전자에 의해 발현된 광 반응성 채널은 광 자극이 가해지면 신경세포의 활동전위를 억제하도록 세포특이적으로 발현된다.

상기 광유전자를 생체의 신경 세포에 주입함으로써 여러 가지 신경 세포를 선택적, 독립적으로 발현시킬 수 있다. 또한 높은 광감응도를 가지므로, 저광도의 빛을 사용할 수 있다는 장점이 있다.

채널로돕신-2 및 할로로돕신의 유전자를 각각 프로모터 및 바이러스 벡터와 함께 적용 대상의 세포 조직에 초자체내주사(intravitreous injection)할 수 있다. 주사된 바이러스가 신경 세포를 감염시켜 단백질을 발현시켜, 상기 광유전자인 채널로돕신-2 및 할로로돕신을 합성하게 되고, 각각 신경 세포의 세포막에 발현된다.

이러한 광반응성 채널을 광 자극하기 위해 체내에 삽입이 용이하고 광을 전달할 수 있는 광 파이버가 이용될 수 있다.

하지만, 종래 기술에 따르면 단일의 파이버를 이용해 광 자극을 수행하므로, 자극 범위에 한계가 있고, 자극 부위를 확인하여 선택적으로 자극할 수 없는 한계가 있다.

미국 특허공개 US2011/0125078호

본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 형광 이미징을 통해 광반응성 채널이 발현된 세포의 위치를 파악하고 선택적으로 해당 세포를 광 자극하여 활성화시킬 수 있는 광 파이버 시스템을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따르면, 광 자극에 의해 세포막전위의 변화를 유도하는 광반응성 채널이 세포막에 발현된 세포의 위치를 확인하여 광 자극할 수 있는 광 파이버 시스템이 제공된다. 상기 광반응성 채널에는 빛을 조사하면 형광을 일으키는 제1형광성 지시자가 표지되고, 상기 광 자극 시스템은, 복수의 광 파이버로 이루어진 광 파이버 다발을 포함하는 프로브 및 상기 복수의 광 파이버 중 원하는 광 파이버에 선택적으로 빛을 입사시킬 수 있는 프로젝션 장치를 포함하고, 상기 제1형광성 지시자에서 형광이 일어나도록 하는 제1관찰 광을 상기 광 파이버 다발로 입사시켜 광반응성 채널의 형광 이미지를 획득하고, 상기 프로젝션 장치를 통해 형광을 일으킨 위치에 대응하는 광 파이버에 상기 광반응성 채널을 활성화시킬 수 있는 자극 광을 입사시켜 상기 광반응성 채널을 광 자극한다.

일 실시예에 따르면, 복수의 세포로 이루어진 세포군에 복수의 광반응성 채널이 발현되고, 상기 프로젝션 장치는 복수의 광반응성 채널에 순차적으로 또는 동시에 상기 자극 광이 조사되도록 상기 자극 광을 패턴화하여 상기 광 파이버 다발에 입사시킨다.

일 실시예에 따르면, 상기 복수의 광반응성 채널에 표지되는 제1형광성 지시자는, 녹색형광단백질, 황색형광단백질 또는 적색형광단백질 중 적어도 하나 이상이다.

일 실시예에 따르면, 상기 프로젝션 장치는, 선택적으로 빛을 반사 또는 통과시킬 수 있는 복수의 픽셀을 포함하고, 상기 광 파이버 다발의 각각의 광 파이버는 적어도 하나의 픽셀에 매칭되고, 상기 픽셀로부터 반사되는 자극 광이 해당 픽셀과 매칭된 광 파이버로 입사된다.

일 실시예에 따르면, 하나의 광 파이버가 하나의 픽셀에 매칭된다.

일 실시예에 따르면, 상기 광 파이버 다발에 포함된 복수의 광 파이버는 그 직경이 수 마이크로 미터이다.

일 실시예에 따르면, 상기 세포군에는 상기 세포의 활성화에 관계된 전달 물질 또는 이온(이하 "세포 물질"이라고 함)에 결합되며, 빛을 조사하면 형광을 일으키는 제2형광성 지시자가 삽입되고, 상기 제2형광성 지시자에서 형광이 일어나도록 하는 제2관찰 광을 상기 광 파이버 다발로 입사시켜 상기 세포군에서 발생한 세포 물질의 형광 이미지를 획득하고, 획득된 상기 세포 물질의 형광 이미지를 통해 세포의 활성화 여부를 확인할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 자극 광과 상기 제2관찰 광은 상기 광 파이버 다발을 통해 상기 세포군 내로 동시에 조사된다.

일 실시예에 따르면, 상기 제1관찰 광과 상기 제2관찰 광은 파장대가 겹치지 않는 빛이고, 하나의 관찰 광 광원이 상기 제1관찰 광과 상기 제2관찰 광을 포함하는 광대역 파장을 가지는 광대역 관찰 광을 생성하고, 상기 자극 광과 상기 광대역 관찰 광은 상기 광 파이버 다발을 통해 상기 세포군 내로 동시에 조사된다.

일 실시예에 따르면, 상기 관찰 광 광원으로부터 조사되는 상기 광대역 관찰 광으로부터 상기 제1관찰 광 또는 상기 제2관찰 광을 선택적으로 필터링하는 관찰 광 필터 장치를 포함한다.

일 실시예에 따르면, 상기 세포는 신경 세포이고, 상기 세포 물질은 칼슘 이온이며, 상기 제2형광성 지시자는 상기 칼슘 이온에 결합하는 칼슘 지시자이다.

일 실시예에 따르면, 상기 광 파이버 다발의 후단부로부터 출력되는, 상기 광반응성 채널의 형광 이미지와 상기 세포 물질의 형광 이미지를 수집하는 카메라 장치를 포함한다.

일 실시예에 따르면, 상기 광반응성 채널의 형광 이미지와 상기 세포 물질의 형광 이미지를 선택적으로 필터링하여 상기 카메라 장치로 전달하는 형광 이미지 필터 장치를 포함한다.

일 실시예에 따르면, 상기 프로브는 전단으로 갈수록 뾰족해지는 니들 형태를 가지고, 유연하게 구부러질 수 있는 몸체를 포함한다.

도 1은 채널로돕신-2의 작동을 개념적으로 도시한 것이다.
도 2는 할로로돕신의 작동을 개념적으로 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 광반응성 채널이 세포막에 발현된 신경 세포의 일부를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 광 파이버 시스템의 개념도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 광 파이버 시스템의 프로브의 전단부를 확대도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 광 파이버 시스템에서 제1의 광 경로를 표시한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 광 파이버 시스템에서 제3의 광 경로를 표시한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 광 파이버 시스템에서 제2의 광 경로를 표시한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 광 파이버 시스템의 제2의 광 경로를 도시한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로젝션 장치의 구성을 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 광 파이버 시스템에서 자극 광을 타겟에 전달하는 형태를 도시한 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조하여 설명한다. 본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 하나의 실시예로서 설명되는 것이며, 이것에 의해 본 발명의 기술적 사상과 그 핵심 구성 및 작용은 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 광유전자 기법을 통해 광유전자를 기능이 저하 또는 손상된 신경 세포에 삽입하여 광반응성 채널을 해당 신경 세포의 세포막에 발현시키고, 형광 이미징을 통해 상기 광반응성 채널이 발현된 신경 세포의 정확한 위치를 확인하여 선택적으로 광자극할 수 있다.

이를 위해 먼저 피험체(S)에서 광 자극의 대상이 되는 신경 세포에 광유전자를 삽입하여 광반응성 채널(100)을 발현시킨다.

도 3은 광반응성 채널(100)이 세포막(M)에 발현된 신경 세포의 일부를 도시한 것이다.

본 실시예에 따른 광반응성 채널(100)은 채널로돕신-2로서, 녹조류(Chlamydomonas reinhardtii)에서 추출된 광 유전자에 의해 발현된 양이온(Na⁺, K⁺, Ca^{2 +}) 채널의 막단백질이다. 푸른빛의 광자극(470 nm)에 의해서 활성화된다. 구체적으로, 푸른빛이 채널로돕신-2 이온 채널에 감지되면 세포내 활성화가 되면서 이온 채널이 열리고 Na⁺, Ca^{2 +}가 세포 안으로 들어와 세포막을 탈분극화(Depolarization)시켜, 신경 세포의 활동전위를 증가시킨다.

광반응성 채널(100)의 위치 확인을 위한 형광 이미지 획득을 위해 광반응성 채널(100)에는 빛을 조사하면 형광을 일으키는 제1형광성 지시자(101)가 표지되어 있다.

본 실시예에 따르면, 제1형광성 지시자(101)는, 녹색형광단백질(Green Fluorescent Protein; GFP), 황색형광단백질(Yellow Fluorescent Protein; YFP) 또는 적색형광단백질(Red Fluorescent Protein; RFP)일 수 있다.

"형광"은 원하는 파장대의 빛을 주면 에너지 흡수가 일어나고 이 에너지가 방출될 때 빛이 나는 현상을 말한다.

GFP는 녹색광을 조사하는 경우 녹색 형광을 발생시키고, YFP는 황색광을 조사하는 경우 황색 형광을 발생시키며, RFP는 적색광을 조사하는 경우 적색 형광을 발생시키는 단백질이다.

후술하는 바와 같이, 본 실시예에 따르면 복수의 광파이버 다발을 이용해 비교적 넓은 범위에 놓여 있는 복수의 신경 세포를 관찰 및 광 자극할 수 있다. 또한, 복수의 신경 세포에는 복수의 광반응성 채널(100)이 발현될 수 있다.

이때, 복수의 광반응성 채널(100) 모두에 반드시 하나의 종류의 형광성 지시자가 표지될 필요는 없으며, 복수 종류의 형광성 지시자가 필요에 따라 표지되어도 좋다.

신경 세포 단위로 광반응성 채널에 표지되는 제1형광성 지시자의 종류를 달리하는 경우, 신경 세포의 특성에 따라 분류된 형광 이미지를 획득할 수 있다.

다만, 후술하는 세포의 활성화에 관계된 전달 물질 또는 이온에 결합되어 해당 물질을 표지하기 위한 제2형광성 지시자와는 그 방출하는 형광의 파장대가 서로 겹치지지 않도록 제1형광성 지시자(101)를 선택하는 것이 바람직하다.

신경 세포는 나트륨과 칼슘 이온 등에 의해 세포막의 탈분극이 이루어져 활동 전위가 발생한다. 신경 세포가 활성화되면 시냅스를 통해 신경 전달 물질이 배출된다.

본 명세서에서는, 세포의 활성화에 관계된 전달 물질 또는 이온을 "세포 물질"이라고 정의한다.

본 실시예에 따르면 세포 물질 중 신경 세포 활동의 지표가 될 수 있는 물질을 선택하여 해당 물질의 상태를 관찰함으로써, 신경 세포의 활성화 여부를 판단한다.

상술한 바와 같이, 청색광이 채널로돕신-2 이온 채널에 감지되면 세포내 활성화가 되면서 광반응성 채널이 열리고 Na⁺, Ca^{2 +}가 세포안으로 들어와 세포막을 탈분극화(Depolarization)시켜, 신경세포의 활동전위를 증가시킨다.

본 실시예에서는 신경 세포의 활성화에 따른 세포 내 칼슘 유입으로 야기되는 칼슘 농도 변화를 측정하여 신경 세포의 활동을 확인 및 평가한다.

도 3에 도시된 바와 같이, 광 자극에 의한 신경 세포의 활동 여부를 관찰하기 위해 칼슘 이온(103)에 결합될 수 있고, 빛을 조사하면 형광을 일으키는 제2형광성 지시자(104)가 광 자극을 위한 신경 세포 부근에 뿌려진다.

칼슘 이온(103)에 결합 가능한 제2형광성 지시자(104)로는 녹색광을 조사하면 녹색 파장대의 형광을 일으키는 Fluo-3, Fluo-4, Calcium Green-1 등과, 적색광을 조사하면 적색 파장대의 형광을 일으키는 Calcium Crimson 등의 공지의 칼슘 지시자들이 이용될 수 있다.

본 실시예에 따르면 제1형광성 지시자(101)와 제2형광성 지시자(102)가 방출하는 형광 이미지를 구분하기 위하여, 제1형광성 지시자(101)로 RFP를 표지하고 제2형광성 지시자(102)로는 Fluo-3, Fluo-4 및 Calcium Green-1 중 하나를 선택하여 표지한다.

도 3을 참조하여, 본 실시예에 따른 광 파이버 시스템을 이용한 형광 이미지 획득과 광 자극의 원리를 설명한다.

먼저, 제1형광성 지시자(101)에서 형광을 일으키도록 하는 적색 파장대를 가지는 적색의 제1관찰 광(201)을 신경 세포가 위치한 부위에 조사한다.

제1관찰 광(201)에 의해 제1형광성 지시자(101)는 적색 파장대의 형광을 방출한다. 방출되는 적색의 형광 이미지를 통해서 제1형광성 지시자(101)가 표지된 광반응성 채널(100)의 위치를 알 수 있게 된다.

탐지된 광반응성 채널(100)의 위치에 광반응성 채널(100)을 광 자극하기 위한 청색광(약 470nm 대역)의 자극 광(300)을 조사한다. 자극 광(300)은 광반응성 채널(100)의 활동을 유발하는 파장대와 세기를 가진다.

자극 광(300)의 자극에 의해 광반응성 채널(100)은 세포막 전위를 일으켜 세포 내로 칼슘 이온(103)을 유입시켜 해당 신경 세포를 활성화시킨다.

이때, 제2형광성 지시자(104)가 형광을 일으키도록 하는 녹색 파장대를 가지는 제2관찰 광(202)을 신경 세포가 위치한 부위에 조사하면, 제2형광성 지시자(104)는 녹색 파장대의 형광을 방출한다. 방출되는 녹색의 형광 이미지를 통해 제2형광성 지시자(104)가 표지된 칼슘 이온(103)의 농도 변화를 알 수 있다.

더 구체적으로, 칼슘 이온(103)의 농도 변화는 하기 [수학식 1]과 같이 관찰되는 형광 이미지에서 녹색 광의 밝기 차이에 의해 계산될 수 있다.

[수학식 1]

여기서, F는 광 자극을 주었을 때 형광의 밝기이고, F_rest는 광 자극을 주지 않았을 때 형광의 밝기를 나타낸다.

이러한 밝기 차이 측정 공식에 따라 신경 세포의 내부로 유입되는 칼슘의 농도 변화를 계산할 수 있다.

이하, 도면을 참조하여 위와 같은 형광 이미지 획득과 광 자극을 수행할 수 있는 광 파이버 시스템(1)에 대해 설명한다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 광 파이버 시스템(1)의 개념도이다.

도 4에 도시된 바와 같이, 광 파이버 시스템(1)은 피험체(S)의 생체 내에 삽입될 수 있는 프로브(10)를 포함한다.

본 실시예에 따르면, 프로브(10)의 전단에 위치한 광 파이버 다발(12)의 전단부는 피험체(S)의 뇌에 삽입되어 뇌 신경 세포에 광 자극을 가한다.

본 명세서에서는, 복수의 세포로 이루어진 집합체를 "세포군"으로 정의한다.

프로브(10)가 삽입되는 뇌 신경 세포의 세포군은 복수의 뇌 신경 세포가 신경 체인을 형성하고 있다.

뇌 신경 세포의 세포군 중 적어도 일부에는 상술한 바와 같이, 광반응성 채널(100)과, 형광성 지시자(101, 104)가 삽입되어 있다.

본 실시예에 따르면 피험체(S)로서 생쥐가 이용되었지만, 이에 한정되지 않으며 광 파이버 시스템(1)은 인간과 같은 몸집이 큰 생물체에 적용 가능하다.

프로브(10)의 후단부에는 세 갈래의 광 경로가 형성된다.

제1의 광 경로는, 형광 지시자를 통한 형광 이미지 획득을 위한 관찰 광(201, 202)을 조사하기 위한 관찰 광 광원(40)으로부터 프로브(10)로 이어지는 경로이다.

제2의 광 경로는 광반응성 채널(100)을 활성화시킬 수 있는 자극 광(300)을 조사하는 자극 광 광원(30)으로부터 프로브(10)로 이어지는 경로이다.

제3의 광 경로는 프로프(10)의 후단을 통해 출력되는 형광 이미지를 수집하여 시각화할 수 있는 카메라 장치(50)로 이어지는 경로이다.

도 5는 본 실시예에 따른 프로브(10)의 전단부를 확대도시한 것이다.

도 5에 도시된 바와 같이, 본 실시예에 따른 프로브(10)는 원통형의 몸체(11)와, 상기 몸체(11) 안에 복수의 광 파이버(13)로 이루어진 광 파이버 다발(12)을 포함한다.

광 파이버 다발(12)은 수만 가닥의 광 파이버(13)를 포함할 수 있고, 각각의 광 파이버(13)의 직경은 수 마이크로미터로 하나의 신경 세포에 비해 크기가 작다.

자세히 도시하지는 않았지만, 프로브(10)의 몸체(11)는 후단으로 갈수록 직경이 커진다. 즉, 프로브(10)는 전단으로 갈수록 뾰족해지는 니들(needle) 형태를 가진다. 따라서, 피실험체(S)의 내부로 손상을 최소화할 수 있다.

또한, 프로브(10)의 몸체(11)는 유연하게 구부러질 수 있는 재질로 이루어져, 내시경 장비 등으로 적절히 이용될 수 있다.

광 파이버 다발(12)의 후단부에는 대물렌즈(57)가 결합되어 있으며, 상기 제1 내지 제3의 광 경로를 대물렌즈(57)를 통해 광 파이버 다발(12)의 후단부와 정렬되어 있다.

광 파이버(13)는 내부를 통과하는 빛에 전반사를 일으켜, 일단으로 입사된 빛이 실질적으로 그대로 타단으로 출력되는 성질을 가진다.

또한, 복수의 광 파이버(13)로 다발로 형성하고 전단을 물체에 접촉시키면, (해당 물체가 발광하는 경우) 후단을 통해 해당 물체에서 발광하는 빛이 출력되고, 출력되는 빛을 카메라 장치로 수집하여 물체의 표면의 이미지를 획득할 수 있는 성질을 가진다.

본 실시예에 따르면, 광 파이버 다발(12)의 위와 같은 성질을 이용해 형광 이미지를 획득한다.

먼저 도 6을 참조하여 제1의 광 경로를 통해 광반응성 채널(100)의 형광 이미지를 얻기 위한 관찰 광을 조사하는 과정을 설명한다.

관찰 광 광원(40)은 광대역의 파장대를 가지는 빛을 조사한다. 관찰 광 광원(40)이 조사하는 빛은 광반응성 채널(100)을 광 자극하기에는 충분치 않은 세기를 가진다. 일 예에 따르면 관찰 광 광원(40)은 머큐리 램프(mercury lamp)에 의해 형성된다.

관찰 광 광원(40)으로부터 출력되는 빛은 관찰 광 필터 장치(42)를 통해 필터링된다. 다시 도 4를 참조하면, 관찰 광 필터 장치(42)는 특정 색의 빛을 통과시킬 수 있는 복수의 필터(43)를 포함한다.

본 실시예에 따르면, 먼저 제1형광 지시자(101)의 형광에 의한 광반응성 채널(100)의 형광 이미지를 획득하기 위하여, 관찰 광 필터장치(42)는 적색광만을 통과시키도록 조정되어 제1관찰 광(201)을 형성한다.

제1관찰 광(201)은 렌즈(42, 44, 56)에 의해 집광 또는 분광되었다가 광 경로 신호기(56)를 거쳐 대물 렌즈(57)로 입사된다.

대물 렌즈(57)는, 대물 렌즈(57)로 입사되는 빛이 광 파이퍼 다발(12)에 포함된 모든 광 파이버(13)로 동시에 입사되도록 배율이 정해진다.

광 파이버 다발(12)로 입사된 제1관찰 광(201)은 광 파이버 다발(12)의 전단을 통해 광 파이버 다발이 커버하는 면적의 세포군에 조사된다.

광 파이버 다발(12)의 전단부에 GRIN 렌즈 등을 부착하면 전단을 세포군에 에 접촉시키지 않고도 형광 이미지 획득이 가능하며, 광 파이버 다발(12)의 단면적보다 넓은 면적의 세포군에 대한 광 자극과 이미지 획득도 가능하다.

세포군 내에 포함된 복수의 광반응성 채널(100)에 표지된 제1형광성 지시자(101)는 제1관찰 광(201)에 반응하여 형광을 일으킨다.

제1형광성 지시자(101)가 일으키는 형광은 광 파이버 다발(12)을 통해 카메라 장치(50)로 수집된다.

도 7은 제3의 광 경로를 통해 광반응성 채널(100)의 형광 이미지를 획득하는 과정을 도시한 것이다.

도 7에 도시된 바와 같이, 제1형광성 지시자(101)가 일으키는 형광은 대물렌즈(57)를 거쳐 광 경로 신호기(56)를 통과해 렌즈(54)를 통해 배율이 조절된 뒤 카메라 장치(50)로 수집된다.

카메라 장치(50)는 제1형광성 지시자(101)가 일으키는 형광 이미지를 컴퓨터 장치(51)로 전송하고, 컴퓨터 장치(51)는 해당 형광 이미지로부터 적색광 이미지를 검출하여, 광반응성 채널(100)의 위치를 식별해 낼 수 있다.

또한, 컴퓨터 장치(51)는 모니터를 통해 형광 이미지를 영상으로 출력하여 사용자가 육안으로 형광 이미지를 확인할 수 있도록 할 수도 있다.

본 실시예에 따르면, 광반응성 채널(100)의 위치가 확인되면 해당 위치에 자극 광(300)을 조사하여 광반응성 채널(100)을 광 자극한다.

도 8은 광반응성 채널(100)을 광 자극하기 위한 제2의 광 경로를 설명하기 위한 것이다.

도 8에 도시된 바와 같이, 자극 광 광원(30)은 광반응성 채널(100)을 자극할 수 있기에 충분한 강도의 청색의 자극 광(300)을 생성하여 조사한다. 본 실시예에 따른 자극 광 광원(30)으로는 고출력을 가지는 레이저, LD, LED 등이 이용될 수 있다.

본 실시예에 따르면, 자극 광 광원(30)으로부터 조사된 자극 광(300)은 프로젝션 장치(21)를 통해 처리되어 광 파이버 다발(12)의 복수의 광 파이버(13) 중 원하는 광 파이버에 선택적으로 자극 광(300)을 입사시킬 수 있다.

도 9는 제2의 광 경로만을 나타낸 도면이다.

도 9에 도시된 바와 같이, 자극 광 광원(30)으로부터 생성된 자극 광(300)은 디퓨저(23)을 거쳐 일정하게 퍼져 프로젝션 장치(21)에 도달한다. 이때, 디퓨저(23)의 전후에는 자극 광(300)의 초점 및 배율 등을 조절하는 렌즈(24, 28)가 구비될 수 있다.

본 실시예에 따른 프로젝션 장치(21)는 크리스탈의 배열 위치에 따라 빛을 선택적으로 반사 또는 투과시켜 홀로그램 형태의 패턴 이미지 전송이 가능한 공간 광 변조 장치(Spatial light modulator; SLM)일 수 있다. 다만, 이에 한정되지는 않으며, DMD(Digital micromirror device)와 같이 패턴화된 광을 형성할 수 있는 영상장치라면 본 실시예에 따른 프로젝션 장치(21)에 이용될 수 있다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로젝션 장치(21)의 구성을 설명하기 위한 도면이다.

도 10(a)에 도시된 바와 같이, 프로젝션 장치(21)는 선택적으로 빛을 반사 또는 통과시킬 수 있는 복수의 픽셀(210)을 포함한다.

프로젝션 장치(21)에는 디퓨저(23)을 통해 퍼진 자극 광(300)이 도달하고(도 10(a)의 원형 부분), 자극 광(300)은 광 경로 신호기(25, 55)를 통해 대물렌즈(57)로 입사되어 광 파이버 다발(12)로 입사된다(도 8 및 도 9 참조).

대물 렌즈(57)는, 대물 렌즈(57)로 입사되는 빛이 광 파이퍼 다발(12)에 포함된 모든 광 파이버(13)로 동시에 입사되도록 배율이 정해져 있으므로, 프로젝션 장치(21)의 모든 픽셀(210)이 자극 광(300)을 반사시키도록 설정된 경우, 프로젝션 장치(21)로부터 반사된 자극 광(300)은 광 파이버 다발(12)의 모든 광 파이버(13)로 입사된다.

이와 같은 관계에 의하면, 광 파이버 다발(12)의 모든 광 파이버(13)를 프로젝션 장치(21)의 적어도 하나의 픽셀(210)에 매칭시킬 수 있다.

예를 들어, 도 10의 경우, 광 파이버(F₁, F₂, F₃)는 픽셀(P₁)에 매칭되는 광 파이버이다.

픽셀(P₁)만이 빛을 반사시키도록 설정되면, 광 파이버(F₁, F₂, F₃)를 포함한 픽셀(P₁)에 대응되는 광 파이버를 통해서만 자극 광(300)이 조사된다.

따라서, 광 파이버(F₁, F₂, F₃)에 면하는 광반응성 채널(100)만을 선택적으로 광 자극할 수 있다.

본 실시예에서는 광 파이버와 픽셀이 일 대 다의 관계로 매칭되는 것으로 설명하였지만, 프로젝션 장치(21)의 해상도를 조절하여 하나의 광 파이버와 픽셀이 일 대 일로 매칭되도록 할 수 있다는 점이 이해될 것이다.

이와 같은 구성에 따르면, 프로젝션 장치(21)의 복수의 픽셀을 선택적으로 온-오프(온은 빛을 반사시키는 경우이고 오프는 빛을 통과시키는 경우임)시킴으로써, 자극 광(300)을 소정 형태로 패턴화하여 광 파이버 다발(12)에 입사시킬 수 있다. 따라서, 위치가 확인된 광유전자(100)만을 타겟으로 하여 선택적으로 수행할 수 있게 된다.

이와 같은 픽셀의 선택은 컴퓨터에 의해 자동으로 이루어질 수도 있고, 모니터(22)에 출력된 픽셀을 사용자가 직접 온-오프하도록 할 수도 있다.

도 11은 프로젝션 장치(21)를 이용해 자극 광(300)을 타겟에 전달하는 모습을 도시한 것이다.

도 11의 (a)는 프로젝션 장치(21)의 모든 픽셀이 자극 광(300)을 반사하는 경우를 도시한다. 세포군 내의 넓은 범위를 동시에 광 자극할 수 있다.

도 11의 (b) 및 (d)는 프로젝션 장치(21)의 픽셀을 선택하여 패턴화된 자극 광(300)을 조사하는 모습을 도시한 것이다.

도 11의 (b)와 (d)와 같이 패턴화된 자극 광(300)을 동시에 조사할 수도 있지만, 도 11의 (c)와 같이 자극 광(300)을 신경 세포를 따라 순차적으로 조사하여 광 자극 스캔을 수행할 수도 있다.

다시 도 6 및 도 7을 참조하여, 칼슘 이온의 형광 이미지를 획득하는 과정을 설명한다.

도 6에 도시된 바와 같이, 관찰 광 광원(40)은 광대역의 파장대를 가지는 빛을 조사한다. 관찰 광 광원(40)이 조사하는 빛은 광반응성 채널(100)을 광 자극하기에는 충분치 않은 세기를 가진다.

제2형광 지시자(104)의 형광에 의한 칼슘 이온의 형광 이미지를 획득하기 위하여, 본 실시예에 따르면 관찰 광 필터장치(42)는 녹색광 만을 통과시키도록 조정되어 제2관찰 광(202)을 형성한다.

제2관찰 광(202)은 렌즈(42, 44, 56)에 의해 집광 또는 분광되었다가 광 경로 신호기(56)를 거쳐 대물 렌즈(57)로 입사된다.

광 파이버 다발(12)로 입사된 제2관찰 광(202)은 광 파이버 다발(12)의 전단을 통해 광 파이버 다발이 커버하는 면적의 세포군에 조사된다.

세포군 내에 포함된 칼슘 이온(103)에 표지된 제2형광성 지시자(104)는 제2관찰 광(202)에 반응하여 형광을 일으킨다.

제2형광성 지시자(104)가 일으키는 형광은 도 7의 제3의 광 경로를 통해 광 파이버 다발(12)을 통해 카메라 장치(50)로 수집된다.

상기에서는 자극 광(300)과 제2관찰 광(202)의 조사 과정이 분리되어 설명되어 있지만, 자극 광 광원과 관찰 광 광원으로 통해 자극 광(300)과 제2관찰 광(202)을 동시에 광 파이버 다발(12)로 조사하도록 할 수 있다. 이에 따르면, 광 자극에 따른 신경 세포의 반응을 실시간으로 확인할 수 있다.

또한, 상기에서는 광유전자의 형광 이미지를 얻는 과정과 칼슘 이온과 같은 세포 물질의 형광 이미지를 얻는 과정을 설명하고, 관찰 광 필터장치(44)를 통해 관찰 광을 제1관찰 광(201)과 제2관찰 광(202)으로 분리했지만 이에 한정되지는 않는다.

관찰 광 필터장치(42)를 이용하지 않고, 파장대가 겹치지 않는 빛인 제1관찰 광(201)과 제2관찰 광(202)를 포함하는 광대역 관찰 광을 하나의 관찰 광 광원(40)을 통해 생성해 광 파이버 다발(12)로 그대로 입사시켜 세포군 내로 동시에 조사할 수 있다. 이 경우 카메라 장치(50)에는 광반응성 채널의 형광 이미지와 세포 물질의 형광 이미지가 동시에 획득된다.

본 실시예에 따르면, 두 개의 형광 이미지는 적색과 녹색으로 구분되므로, 두 형광 이미지를 동시에 획득하더라도 구분이 가능하다.

또한, 복수의 필터(53)를 구비하는 형광 이미지 필터 장치(52)를 카메라 장치(50)의 앞쪽에 설치하여 두고, 형광 이미지 필터 장치(52)를 통해 광반응성 채널의 형광 이미지와 세포 물질의 형광 이미지를 선택적으로 필터링할 수도 있다.

즉, 자극 광(300) 및 관찰 광(201, 202)은 광 파이버 다발(12)로 동시에 조사하여 다형광 이미지를 획득할 수 있으며, 이와 같은 다형광 이미지를 통해 자극 대상의 확인, 광 자극의 수행 및 반응성의 관찰을 동시에 실시간으로 수행할 수 있게 된다.

본 실시예에 따른 광 파이버 시스템(1)에 따르면, 형광 이미지를 통해 광반응성 채널(100)이 발현된 신경 세포의 위치를 정확히 확인할 수 있고, 원하는 위치의 신경 세포를 선택적으로 광 자극할 수 있다.

또한, 세포 물질의 형광 이미지를 실시간으로 획득할 수 있어, 광 자극과 신경 세포의 활동의 연계성을 규명하는 데이터를 제공할 수 있으며, 나아가 피실험체의 행동 실험을 함께 수행하는 경우 특정 행동 양식과 신경 세포의 활동 간의 연관성을 분석할 수 있는 뇌 신경 맵(map)과 같은 축적된 데이터를 제공할 수 있게 된다.

Claims (14)

1. 광 자극에 의해 세포막전위의 변화를 유도하는 광반응성 채널이 세포막에 발현된 세포의 위치를 확인하여 광 자극할 수 있는 광 파이버 시스템으로서,
   상기 광반응성 채널에는 빛을 조사하면 형광을 일으키는 제1형광성 지시자가 표지되고,
   상기 광 자극 시스템은,
   복수의 광 파이버로 이루어진 광 파이버 다발을 포함하는 프로브 및
   상기 복수의 광 파이버 중 원하는 광 파이버에 선택적으로 빛을 입사시킬 수 있는 프로젝션 장치를 포함하고,
   상기 제1형광성 지시자에서 형광이 일어나도록 하는 제1관찰 광을 상기 광 파이버 다발로 입사시켜 광반응성 채널의 형광 이미지를 획득하고,
   상기 프로젝션 장치를 통해 형광을 일으킨 위치에 대응하는 광 파이버에 상기 광반응성 채널을 활성화시킬 수 있는 자극 광을 입사시켜 상기 광반응성 채널을 광 자극하고,
   세포의 활성화에 관계된 전달 물질 또는 이온(이하 "세포 물질"이라고 함)에 결합되며 빛을 조사하면 형광을 일으키는 제2형광성 지시자가 광 자극을 위한 세포 부근에 뿌려져 상기 세포 물질과 결합되도록 하고,
   상기 세포 물질과 결합된 상기 제2형광성 지시자에서 형광이 일어나도록 하는 제2관찰 광을 상기 광 파이버 다발로 입사시켜 상기 세포 물질의 형광 이미지를 획득하고,
   획득된 상기 세포 물질의 형광 이미지를 통해 세포의 활성화 여부를 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
2. 제1항에 있어서,
   복수의 세포가 세포군을 형성하고,
   상기 세포군에는 복수의 광반응성 채널이 발현되고,
   상기 프로젝션 장치는 복수의 광반응성 채널에 순차적으로 또는 동시에 상기 자극 광이 조사되도록 상기 자극 광을 패턴화하여 상기 광 파이버 다발에 입사시키는 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
3. 제2항에 있어서,
   상기 복수의 광반응성 채널에 표지되는 제1형광성 지시자는,
   녹색형광단백질, 황색형광단백질 또는 적색형광단백질 중 적어도 하나 이상인 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
4. 제2항에 있어서,
   상기 프로젝션 장치는,
   선택적으로 빛을 반사 또는 통과시킬 수 있는 복수의 픽셀을 포함하고,
   상기 광 파이버 다발의 각각의 광 파이버는 적어도 하나의 픽셀에 매칭되고,
   상기 픽셀로부터 반사되는 자극 광이 해당 픽셀과 매칭된 광 파이버로 입사되는 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
5. 제4항에 있어서,
   하나의 광 파이버가 하나의 픽셀에 매칭되는 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
6. 제1항에 있어서,
   상기 광 파이버 다발에 포함된 복수의 광 파이버는 그 직경이 수 마이크로 미터인 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
7. 삭제
8. 제1항에 있어서,
   상기 자극 광과 상기 제2관찰 광은 상기 광 파이버 다발을 통해 동시에 조사되는 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
9. 제1항에 있어서,
   상기 제1관찰 광과 상기 제2관찰 광은 파장대가 겹치지 않는 빛이고,
   하나의 관찰 광 광원이 상기 제1관찰 광과 상기 제2관찰 광을 포함하는 광대역 파장을 가지는 광대역 관찰 광을 생성하고,
   상기 자극 광과 상기 광대역 관찰 광은 상기 광 파이버 다발을 통해 동시에 조사되는 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
10. 제9항에 있어서,
    상기 관찰 광 광원으로부터 조사되는 상기 광대역 관찰 광으로부터 상기 제1관찰 광 또는 상기 제2관찰 광을 선택적으로 필터링하는 관찰 광 필터 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
11. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 신경 세포이고,
    상기 세포 물질은 칼슘 이온이며,
    상기 제2형광성 지시자는 상기 칼슘 이온에 결합하는 칼슘 지시자인 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
12. 제1항에 있어서,
    상기 광 파이버 다발의 후단부로부터 출력되는, 상기 광반응성 채널의 형광 이미지와 상기 세포 물질의 형광 이미지를 수집하는 카메라 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
13. 제12항에 있어서,
    상기 광반응성 채널의 형광 이미지와 상기 세포 물질의 형광 이미지를 선택적으로 필터링하여 상기 카메라 장치로 전달하는 형광 이미지 필터 장치를 포함하는 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.
14. 제1항에 있어서,
    상기 프로브는,
    전단으로 갈수록 뾰족해지는 니들 형태를 가지고,
    유연하게 구부러질 수 있는 몸체를 포함하는 것을 특징으로 하는 광 파이버 시스템.

Images