KR101533600B1

KR101533600B1 - 항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항비만 조성물

Info

Publication number: KR101533600B1
Application number: KR1020130070742A
Authority: KR
Inventors: 윤은영; 황재삼; 구태원; 김미애; 최영철; 정미연
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-06-20
Filing date: 2013-06-20
Publication date: 2015-07-10
Anticipated expiration: 2033-06-20
Also published as: KR20140147948A

Abstract

본 발명은 항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항비만 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출액의 제조방법은 (a) 동결건조된 장수풍뎅이 유충를 분쇄시키는 단계; (b) 분쇄된 장수풍뎅이 유충와 용매를 혼합하여 장수풍뎅이 유충 혼합액을 제조하는 단계; (c) 초음파 분쇄기로 상기 장수풍뎅이 유충 혼합액을 미세화시키는 단계; 및 (d) 미세화된 장수풍뎅이 유충 혼합액을 원심분리 시킨 후, 상층액을 회수하고 여과시키는 단계를 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 따른 장수풍뎅이 유충 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물은 부작용이 없고, 안전성이 우수할 뿐만 아니라 항비만 효능을 가짐으로써 비만 및 비만과 연관된 질병의 예방 및 치료제로서 사용이 가능하다.

Description

항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항비만 조성물{Manufacturing Method for Allomyrina dichotoma extract having anti-Obesity effect and Anti-Obesity Composition Containing the same}

본 발명은 항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항비만 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 통상적으로 간질환에 효과가 있다고 알려진 장수풍뎅이 유충을 유효성분으로 항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 항비만 조성물에 관한 것이다.

현대사회에서 가장 중요한 건강문제로 알려진 비만은 식습관의 서구화, 유전적 영향, 약물과 스트레스에 인한 내분비적 요인, 개인의 정신적, 육체적인 환경적 요인 등의 변화로 인하여 체내의 항상성의 불균형으로 인해 일어난다고 알려져 있다.

비만은 자체로도 건강을 위협하지만 가장 큰 문제는 비만에 수반되는 동맥경화나 심장질환, 호흡장애, 암과 같은 치명적인 합병증을 유발할 수 있기 때문에 비만에 대한 관리와 치료는 현대인에 있어서 매우 중요하다.

2007년 국민영양건강조사에 의하면, 19세 이상 비만 유병율은 31.7%로 1998년 26%에 비해 지난 10년간 5.7%나 증가 하였다. 이는 미국의 34.3% 비하면 낮은 수준이지만, 같은 아시아권인 일본의 24%에 크게 웃도는 수준이다.

이와 같이 증가하는 비만에 대한 예방 및 치료법은 식습관 개선과 주기적인 운동이 요구되고 있지만 현대인의 특성상 비만억제를 위한 주요 노력은 비만치료제 약물과 건강보조 식품에 주로 초점이 맞춰져 있다.

현재 우리나라에서 주로 사용되고 있는 비만 치료제로서는 식욕억제제의 일종인 sibutramine과 phentermine과 지방흡수 억제제인 orlistat이 있다 (Rolls B.J et al., Obes . Res. 6: 1-11, 1988; Hansen D.L. et al , Am . J. Clin . Nutr . 68: 1180-1186, 1998). 이들 약물은 비록 안정성이 FDA에 의해 승인 받고 사용되고 있지만, 혈압을 높이고 심장 박동을 빠르게 하거나 고혈압 및 심장질환계 질환을 가지고 있는 환자들은 복용을 주의해야 하는 등 부작용을 가지고 있다.

따라서 최근 비만의 예방과 치료를 위해서는 부작용이 없거나 적은 식품이나 천연물에서 치료제를 찾는 연구가 많이 진행되고 있다.

지방조직이 우리 몸에서 하는 기능은 주 에너지원인 지방을 합성하고 저장하며, 이를 분해하여 각종 장기에 영양분을 공급하고 다양한 내분비 호르몬과 사이토카인을 분비하여 체내 에너지를 조절하는 항상성을 유지하는 일을 수행한다. 따라서 지방세포를 조절하는 것은 비만에 대해 연구하고 이해하며 치료하는데 매우 중요한 근간이 되는 연구라 할 수 있다.

천연물을 이용한 항비만에 관한 연구는 주로 녹차, 율피, 알쏭이모자반 등 식물에 대한 특허와 논문이 주를 이루고 있다.

관련 선행기술로는 한국공개특허 10-2003-0001659(흰점박이 꽃무지 추출물 및 이의 용도)와 한국공개특허 10-2012-0069041(발효 우렁쉥이 껍질을 유효성분으로 함유하는 항비만용 조성물)에 관한 것이 공개되어 있다.

이와같이 최근 신약 개발과 관련하여 천연자원의 기능에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 지구상에 다수 종을 차지하고 있는 곤충에 대한 연구가 활성화되고 있다. 예로부터 곤충은 한약재로 자주 이용되어 왔으며 주로 굼벵이, 누에, 매미허물, 동충하초, 지네 등 약 30 여종이 유용한 곤충자원으로 이용되고 있다.

그 중, 장수풍뎅이(학명: Allomyrina dichotoma)는 딱정벌레목(Coleoptera), 장수풍뎅이과(Family Dynastidae)에 속하는 곤충으로 장수풍뎅이의 애벌레인 굼벵이가 간 질환에 효과가 있다는 민간요법이 알려지면서 이를 건강보조용 약재로 이용하는 경향이 증가 되고 있다.

또한 장수풍뎅이에서 분리한 단백질이 세균에 대해 강한 활성 억제를 보이며, 장수풍뎅이에서 추출한 렉틴은 강력한 항암능력을 보여 항암효과를 기대할 수 있다고 보고되었다. 또한 사염화탄소로 간독성을 유발한 쥐에 대해 간 보호 효과를 확인한 논문이 보고되었다.

그러나 장수풍뎅이나 그 유충이 민간요법에서 널리 이용되는데 비해 이의 생리기능성에 대한 연구 자료는 매우 미흡한 실정이다. 현재 장수풍뎅이 유충을 이용한 비만 예방 및 치료에 이용한 연구는 보고되지 않았다.

본 발명의 목적은 항비만 효과를 가지는 장수풍뎅이 유충 추출물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 비만 예방 및 치료능이 우수한 천연물 유래 항비만 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물은 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)유충 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다.

또한, 본 발명의 비만예방 및 개선용 식품 조성물은 장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)유충 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다.

상기 추출물은 추출 용매로 70% 에탄올 수용액(V/V)을 사용하는 것이 특징이다.

본 발명의 항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출액의 제조방법은 (a) 동결건조된 장수풍뎅이 유충을 분쇄시키는 단계; (b) 분쇄된 장수풍뎅이 유충과 용매를 혼합하여 장수풍뎅이 유충 혼합액을 제조하는 단계; (c) 초음파 분쇄기로 상기 장수풍뎅이 유충 혼합액을 미세화시키는 단계; 및 (d) 미세화된 장수풍뎅이 유충 혼합액을 원심분리 시킨 후, 상층액을 회수하고 여과시키는 단계를 포함하는 것이 특징이다.

상기 장수풍뎅이 유충 혼합액은 상기 용매 10ml당 상기 분쇄된 장수풍뎅이 유충 0.5∼1g을 혼합시키는 것이 특징이다.

상기 용매로 70% 에탄올 수용액(V/V)을 사용하는 것이 특징이다

상기 장수풍뎅이 유충 혼합액을 미세화시키는 단계는 초음파 분쇄기를 장수풍뎅이 유충 혼합액에 200~250 jule의 세기로 5~20초간, 1~3회 작동시키는 것이 특징이다.

본 발명은 상기와 같이 제조된 장수풍뎅이 유충 추출액을 유효성분으로 포함하는, 항비만 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 장수풍뎅이 유충 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물은 부작용이 없고, 안전성이 우수할 뿐만 아니라 항비만 효능을 가짐으로써 비만 및 비만과 연관된 질병의 예방 및 치료제로서 사용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 장수풍뎅이 유충 추출물의 3T3-L1 세포에 대한 독성 평가를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 장수풍뎅이 유충 추출물의 3T3-L1의 지방 세포의 분화에 대한 억제능을 아이소프로판올(Isopropanol)로 Oil red O를 용출시켜 지방축적정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 장수풍뎅이 유충 추출물을 3T3-L1 세포에 처리하고, Oil-red O 염색 후 관찰한 광학 현미경 사진이다.
Non : 비분화세포(undifferentiated cells)
DM : 분화세포(differentiated media cells)
ADLe : 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 장수풍뎅이 유충 추출물
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 장수풍뎅이 유충 추출물을 처리한 3T3-L1 세포의 분화과정에서 생성된 중성지방(triglyceride) 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 장수풍뎅이 유충 추출물을 3T3-L1 세포에 처리하여, 지방분화에 관련하는 유전자(PPARγ와 C/EBP)의 발현량을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 통상적으로 간질환에 효과가 있다고 알려진 장수풍뎅이 유충이 항비만 효과를 가진다는 것을 확인하고자 한다.

설명하면, 장수풍뎅이의 애벌레인 굼벵이가 간 질환에 효과가 있다는 민간요법이 알려지면서 이를 건강보조용 약재로 이용하는 경향이 증가 되고 있다. 또한 장수풍뎅이에서 분리한 단백질이 세균에 대해 강한 활성 억제를 보이며, 장수풍뎅이에서 추출한 렉틴은 강력한 항암능력을 보여 항암효과를 기대할 수 있다고 보고되었다. 또한 사염화탄소로 간독성을 유발한 쥐에 대해 간 보호 효과를 확인한 논문이 보고되었다. 그러나 장수풍뎅이나 그 유충이 민간요법에서 널리 이용되는데 비해 이의 생리기능성에 대한 연구 자료는 매우 미흡한 실정이며, 특히 현재 장수풍뎅이 유충을 이용한 항비만에 관한 보고는 전무한 실정이다.

이에 본 발명의 발명자는 상기와 같은 장수풍뎅이 유충인 천연물질을 유효성분으로 하는 것으로 부작용의 문제가 발생되지 아니하여 비만을 치료 하고 또는 예방하기 위하여도 널리 사용할 수 있을 것으로 판단하였다.

다시말해, 서구화된 식습관과 도시화된 생활패턴에서 오는 운동부족 등으로 우리나라에서도 비만과 당뇨병 등 각종 대사성 질환들이 크게 확산되고 있다. 비만에 따른 각종 대사성 질환의 발생은 지방세포의 양적, 수적인 과도한 증가에 따라 수반되는 지방 조직의 기능 이상에서 비롯된다. 지방조직은 우리 몸의 주 에너지원인지방을 합성하고 저장하며, 이를 분해하여 필요에 따라 다른 기관에 에너지를 공급하고, 다양한 호르몬과 사이토카인 등을 분비하는 내분비기관으로서의 역할을 담당하여 체내의 에너지 항상성을 조절하는 중추적인 역할을 수행한다. 이로써 지방세포의 조절에 대한 연구가 필요하며 지방세포의 증식과 지방세포에서 분비되는 물질들에 대한 이해로 비만 치료제개발을 하려는 노력이 이루어지고 있다.

이에 본 발명의 발명자들은 미개척분야인 곤충 소재를 이용한 항비만 소재연구를 수행하였으며, 장수풍뎅이 유충 추출물을 이용한 비만치료제 개발을 위한 선행 연구로써 3T3-L1 지방전구세포에 장수풍뎅이 유충 에탄올 추출물을 처리한 후 세포독성 및 지방세포 분화 정도를 측정하고 지방세포 분화에 관련하는 유전자 발현 양상을 확인함으로써, 장수풍뎅이 유충 추출물의 항비만 효능을 확인 할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 동결건조된 장수풍뎅이 유충을 분쇄시키는 단계; (b) 분쇄된 장수풍뎅이 유충과 용매를 혼합하여 장수풍뎅이 유충 혼합액을 제조하는 단계; (c) 초음파 분쇄기로 상기 장수풍뎅이 유충 혼합액을 미세화시키는 단계; 및 (d) 미세화된 장수풍뎅이 유충 혼합액을 원심분리 시킨 후, 상층액을 회수하고 여과시키는 단계를 포함하여 항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출물의 제조방법을 제공하게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 용매는 세포독성이 없고, 장수풍뎅이 유충을 용해시킬 수 있는 것이라면 특별한 제한 없이 이용할 수 있으며, 바람직하게는 70% 에탄올을 사용하는 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 분쇄된 장수풍뎅이 유충과 용매를 혼합하여 장수풍뎅이 유충 혼합액을 제조시, 용매와 분쇄된 장수풍뎅이 유충의 혼합비율은 특별히 제한되지 않으나, 용매 10ml당 분쇄된 장수풍뎅이 유충 0.5~1g을 혼합시키는 것이 바람직하다. 상기 범위를 벗어날 경우, 번거로운 농축이나 희석 과정을 거쳐 적정 농도로 조절하는 추가 과정을 수행해야하는 문제점이 있을 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 장수풍뎅이 유충 혼합액을 미세화시키는 단계는 장수풍뎅이 유충 혼합액으로부터 항비만 효과를 가지는 유효성분을 추출하기 위한 단계로써, 통상적으로 알려진 초음파 분쇄기를 이용하여 특별한 제한 없이 미세화 시킬 수 있으나, 초음파 분쇄기를 장수풍뎅이 유충 혼합액에 200~300jule의 세기로 5~20초간, 1~3회 작동시키는 것이 바람직하다.

상기 초음파 분쇄기의 작동 시간 및 횟수가 상기 범위를 벗어날 경우, 목적하는 유효성분의 추출이 이루어지지 않거나, 유효성분이 파괴되거나 변성되는 문제가 발생될 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 장수풍뎅이 유충 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물에 관한 것이다

상기 장수풍뎅이 유충 추출물은 필요에 따라 추가적으로 농축 또는 희석될 수 있다.

상기 항비만 조성물은 세포독성 및 지방세포 분화 및 지방세포 분화 관련 전사인자의 발현 억제 효과를 가질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항비만 조성물은 비만예방 및 개선용 식품 조성물로 사용된다.

상기 식품이란 건강보조식품, 건강 기능식품, 기능성 식품 등이나 이에 제한되는 것은 아니며, 천연식품, 가공식품, 일반적인 식자재 등에 본 발명의 조성물을 첨가한 것도 포함된다.

본 발명의 장수풍뎅이 유충 추출물을 포함하는 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 건강기능식품을 식품 또는 음료의 제조시에 원료에 대하여 0.01 내지 70.0%, 바람직하게는 0.01 내지 30.0%의 양으로 첨가될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 10.0%의 양으로 첨가될 수 있다. 식품 조성물의 상기 가수분해물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 장수풍뎅이 유충 추출물을 포함하는 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

상기 장수풍뎅이 유충 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 항비만 조성물은 또한 비만예방 및 치료용 약학 조성물로 사용된다.

본 발명의 장수풍뎅이 유충 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 지방세포 분화 및 지방생성 억제 효과가 있다. 또한 본 발명의 장수풍뎅이 유충 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 고지혈증, 지방간, 내장비만, 복부비만 등 부분적 비만 및 총체적 비만(즉, 일반적인 비만)을 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명의 장수풍뎅이 유충 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 바람직한 약제학적 제제는 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제가 있으며 이들 약제학적 제제는 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명의 장수풍뎅이 유충 추출물을 포함하는 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있지만 일반적으로는 성인 1kg 당 0.1 mg 내지 10 g, 바람직하게는 10 mg 내지 1 g의 용량으로 투여될 수 있다. 또, 단위 제형당 상기 약학적 조성물의 1일 용량 또는 이의 1/2, 1/3 또는 1/4의 용량이 함유되도록 하며, 하루 1 내지 6 회 투여될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 장수풍뎅이 유충 추출물 제조

장수풍뎅이는 국내산 가나안 농원(경상남도 거제)으로부터 분양 받아서 이를 이용하여 제조하였다.

분말을 만드는 조건은 상기 장수풍뎅이 3령 유충을 고온고압멸균기로 멸균한 다음, 여기에 액체질소를 부은 후 급속 동결하여 영하 70℃의 초저온 냉동고에 24시간 동안 동결시킨 후 동결 건조기를 이용하여 건조시켜 수분을 제거하였다.

수분을 제거한 장수풍뎅이 유충을 믹서로 분쇄하여 분말을 얻은 후 70% 에탄올 10ml에 분말 0.5g 을 넣은 후 초음파 분쇄기로 230 jule의 세기로 10초 동안 2번 나눠서 분쇄하였다. 분쇄된 분말을 4500 rpm에서 10분 동안 원심분리시킨 후 상층액을 얻어 본 발명의 장수풍뎅이 유충 추출액을 제조하였다.

< 실험예 1> 장수풍뎅이 유충 추출물의 세포독성 측정

1) 실험방법

3T3-L1 지방전구세포(한국세포주은행)를 이용하여 장수풍뎅이 유충 추출물의 세포독성을 MTS 법에 의해 측정하였다.

1×10⁶ cells/well로 분주된 지방전구세포에 장수풍뎅이 유충 추출물을 농도별(100, 500, 1000, 3000, 5000 ㎍/ml)로 처리하여 72시간 동안 배양한 후, MTS assay를 수행하였다.

MTS reagent (3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)를 최종 0.5 mg/ml농도로 처리하여 37℃에서 4시간 추가 배양한 후 생성된 formazan의 양을 microplate reader (Beckman, USA)를 이용하여 515 nm에서 측정하였다. Cell viability는 대조군의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.

2) 실험결과

도 1에 나타나 있듯이 장수풍뎅이 유충 추출물을 지방전구세포 내 100, 500, 1000, 3000, 5000 ㎍/ml의 농도로 72시간 처리한 세포 생존률 확인 결과 다소 생존률이 증가하였으므로 세포독성이 없음을 확인하였다.

< 실험예 2> 장수풍뎅이 유충 추출물의 지방세포 분화능 확인

1) 실험방법

지방전구세포가 지방세포로 분화되는 과정 중 장수풍뎅이 유충 추출물 첨가에 따른 지방 축적률 변화를 8일간 관찰하였다.

이때 3T3-L1 지방전구세포를 지방세포로 분화시키기 위해 지방전구세포를 24-well plate에 5×10⁴ cells/well의 농도로 분주하고 well에 가득 찰 때 까지 배양한 후 4일 경과 시 분화유도 물질인 insulin 5 ㎍/ml, 1 uM dexamethasone 및 0.5 mM isobutylmethylxanthine과 10% FBS가 함유된 DMEM배지로 배지를 교환하면서, 장수풍뎅이 유충 추출물을 농도별(100, 1000, 2000 ㎍/ml)로 첨가하였다.

이후에는 2일에 한번 씩 장수풍뎅이 유충 추출물을 포함한 insulin 5 ㎍/ml과 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 2회 교환한 후 세포의 분화능에 관한 실험을 수행하였다.

세포의 분화능에 관한 실험은 Oil red O staining 후 현미경 관찰을 수행하였는데 이에 대한 방법은 분화가 완료된 세포를 PBS 세척 후 10% formalin으로 고정시킨 지방세포를 Oil red O로 염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.

또한 염색한 세포는 isopropyl alcohol로 용해하여 microplate reader(Beckman, USA)로 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 지방함량은 시료를 처리하지 않은 대조군의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.

2) 실험결과

도 2에 나타나 있듯이, 3T3-L1 지방전구세포를 성숙된 지방세포로 분화를 유도하고 이 때 생성된 지방 확인을 위해 Oil-Red O 염색을 수행한 결과, 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로 분화 유도 시 장수풍뎅이 유충 추출물을 처리하여 지방생성정도 확인을 통해 장수풍뎅이 유충 추출물이 지방세포로의 분화에 영향을 미치는지 관찰하였다. 대조로는 항비만 효과가 알려져 있는 마테 추출물을 사용하였으며, 마테는 100 ㎍/ml의 농도에서 약 14%의 지방생성 억제를 나타내었다.

또한, Isopropanol로 oil red o를 용출시켜 지방축적정도를 확인한 결과, 장수풍뎅이 유충 추출물은 100 ㎍/ml의 농도에서 약 19.5% 정도의 지방축적 감소율을 나타내었다. 또한 2000 ㎍/ml의 고농도에서는 장수풍뎅이 유충 추출물이 39.1% 정도의 지방 감소율을 나타내어 지방세포로의 분화억제를 확인할 수 있었다.

또한, 도 3에 나타나 있듯이, 세포내 지방 축적을 현미경으로 관찰한 결과에서도 장수풍뎅이 유충 추출물 처리군에서 지방축적량이 감소한 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 3> 장수풍뎅이 유충 추출물의 중성지방 함량측정

1) 실험방법

지방전구세포가 지방세포로 분화되는 과정 중 장수풍뎅이 유충 추출물 첨가에 따른 중성지방(TG; Triglyceride) 함량 변화를 8일간의 분화 과정 후 관찰하였다.

3T3-L1 지방전구세포를 분화유도하면서 장수풍뎅이 유충 추출물을 100 ㎍/ml, 1000 ㎍/ml, 2000 ㎍/ml의 농도로 처리하여 조사하였다.

중성지방의 측정은 TG quantification kit (Biobision, USA)를 사용하여 중성지방 함량을 595 nm의 흡광도에서 측정하였다.

2) 실험결과

도 4에 나타나있듯이, 지방전구세포가 지방세포로 분화유도 시 장수풍뎅이 유충 추출물을 처리하고 분화 8일째 세포내 축적된 중성지방의 양을 측정한 결과 2000 ㎍/ml의 농도에서 약 12.88%의 중성지방 감소를 확인할 수 있었다.

이와 같은 결과로 장수풍뎅이 유충 추출물 처리 후 성숙한 지방세포에서 중성지방양이 감소하는 것은 장수풍뎅이 유충 추출물이 지방세포 분화억제 효능이 있음을 예측할 수 있었다.

< 실험예 4> 장수풍뎅이 유충 추출물의 지방세포 분화 관련 전사인자 및 유전자 발현 억제효과 확인

1) 실험방법

장수풍뎅이 유충의 지방세포로의 분화 억제 효능을 분석하기 위해, 지방세포 분화 관련 전사인자의 발현에 관여하는 유전자에 대한 발현양상을 실시간(Real-time) PCR을 통해 전사체 수준에서 조사하였다. 지방전구세포에 분화 유도 인자와 장수풍뎅이 유충 추출물을 처리하여 분화를 유도한 실험군, 분화인자만 처리한 양성대조군, 분화를 유도하지 않은 지방전구세포를 음성대조군으로 이용하였다. 분화 유도 후 8일째 되는 날 세포의 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 트리졸 시약(Trizol reagent)을 처리한 후 회수한 세포에 클로로포름(chloroform)을 넣은 다음, 12,000 g에서 15분 동안 원심분리하여 회수한 상층액에 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 RNA를 분리하고, 2 ㎍/ml로 농도로 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 이용해 Power SYBR Green Mixture와 프라이머(primer)를 혼합한 후, 실시간 PCR 기기(AB, UK)를 통해 지방세포 분화 관련 전사인자인 PPAR-γ와 C/EBPα유전자의 전사체 발현 양상을 조사하였다. 이때, 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.

프라이머 이름		프라이머 염기서열
PPAR-r	Peroxisome proliferator-activated receptor-γ	포워드 : GCCATTGAGTGCCGAGTCT
		리버스 : TTGTGAGACATCCCCACAGC
C/EBP α	CCAAT/enhancer-binding proteins a	포워드 : AGACATCAGCGCCTACATCG
		리버스 : CACCGACTTCTTGGCTTTGC
GAPDH	Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase	포워드 : CTACCCCCAATGTGTCCGTC
		리버스 : TGAAGTCGCAGGAGACAACC

2) 실험결과

도 5에 나타나 있듯이, 지방전구세포가 지방세포로 분화유도 시 장수풍뎅이 유충 추출물을 처리 후 분화 8일째 지방세포 분화에 관여하는 전사인자인 PPAR-γ와 C/EBPα의 발현 정도를 실시간(real-time) PCR을 통해 확인해 본 결과 분화과정에 관여하는 전사인자인 PPAR-r와 C/EBPa의 발현량이 분화유도제만 처리한 대조군에 비해 현저히 감소함을 확인하였으며, 이러한 결과로 장수풍뎅이 유충 추출물이 지방세포 분화를 억제함을 확인할 수 있었다.

이와 같이 지방전구세포는 적절한 환경이 되면 분화되어 세포내 지방을 축적하는데 이 때 adipocyte의 크기와 수의 증가가 비만의 정도를 결정짓는 요인 중 하나로 인식되고 있다. 따라서 지방전구세포의 분화를 억제하는 물질은 비만을 예방하는데 효과적이라고 알려져 있다. 따라서 본 발명에서도 장수풍뎅이 유충 추출물의 지방세포 분화 억제능을 확인하기 위해 지방전구세포 상태인 3T3-L1 세포를 지방세포로 분화시키는 과정 중 장수풍뎅이 유충 추출물을 100 ㎍/ml, 1000 ㎍/ml, 2000 ㎍/ml의 농도로 처리한 후, Oil-red O staining을 통하여 지방축적을 비교해 본 결과 지방세포에서 시료를 처리하지 않은 대조군에서는 지방세포에 지방구의 선명한 붉은색 염색을 통해 세포의 분화가 정상적으로 일어나 충분한 지방이 축적됨을 확인할 수 있었고, 시료를 처리한 실험군의 경우 농도 의존적으로 지방축적이 낮아지는 것을 육안으로 확인할 수 있었다.

또한 Oil-red O staining에 의해 지방염색 후 isopropanol로 용해하고 흡광도에 의해 지방축적 정도의 확인 결과, 100 ㎍/ml에서 약 19.5%, 1000 ㎍/ml에서 26.6%, 그리고 2000 ㎍/ml의 농도에서 약 39.1%로 농도 의존적으로 지방 축적이 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한 이 때의 지방세포의 중성지방 축적율을 측정한 결과 2000 ㎍/ml의 농도에서 약 12.88%의 중성지방 감소율을 확인할 수 있었으며, 지방분화에 관련하는 유전자 발현량을 실시간 (real-time) PCR로 확인한 결과 지방분화에 관련하는 유전자인 PPAR-γ와 C/EBPα의 전사체 발현량이 현저히 감소함을 확인할 수 있었으므로 이상의 결과를 통해서 장수풍뎅이 유충은 지방세포 분화 관련 유전자 발현을 억제시킴으로써 지방세포로의 분화를 억제하고 성숙한 지방세포에서 생성되는 지방과 중성지방의 함량을 감소시킴을 확인할 수 있었다.

비만은 에너지의 과도한 저장을 막기 위한 에너지 흡수의 최소화 및 지방세포 축적 감소를 줄이는 방안을 찾는 것이 핵심이며 이에 본 발명은 장수풍뎅이 유충 추출물의 체지방 감소 효능 확인을 통해 지방세포 분화 억제 효능을 확인한 것으로 항비만용 약재로의 가능성을 나타낸 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)유충 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는,
비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 추출물은 추출 용매로 70% 에탄올 수용액(V/V)을 사용하는 것을 특징으로 하는,
비만 예방 및 치료용 약학적 조성물.
장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)유충 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는,
비만예방 및 개선용 식품 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 추출물은 추출 용매로 70% 에탄올 수용액(V/V)을 사용하는 것을 특징으로 하는,
비만예방 및 개선용 식품 조성물.
(a) 동결건조된 장수풍뎅이 유충을 분쇄시키는 단계;
(b) 분쇄된 장수풍뎅이 유충과 용매를 혼합하여 장수풍뎅이 유충 혼합액을 제조하는 단계;
(c) 초음파 분쇄기로 상기 장수풍뎅이 유충 혼합액을 미세화시키는 단계; 및
(d) 미세화된 장수풍뎅이 유충 혼합액을 원심분리 시킨 후, 상층액을 회수하고 여과시키는 단계를 포함하는,
항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출액의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 장수풍뎅이 유충 혼합액은 상기 용매 10ml당 상기 분쇄된 장수풍뎅이 유충 0.5∼1g을 혼합시키는 것을 특징으로 하는,
항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출액의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 용매는 70% 에탄올 수용액(V/V)을 사용하는 것을 특징으로 하는,
항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출액의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 장수풍뎅이 유충 혼합액을 미세화시키는 단계는 초음파 분쇄기를 장수풍뎅이 유충 혼합액에 200~250 jule의 세기로 5~20초간, 1~3회 작동시키는 것을 특징으로 하는,
항비만효과를 갖는 장수풍뎅이 유충 추출액의 제조방법.
제5항 내지 제8항중 어느 한 항의 방법으로 제조된 장수풍뎅이 유충 추출액을 유효성분으로 포함하는, 항비만 조성물.
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