KR101524079B1

KR101524079B1 - Method for inducing differentiation of adult cells into insulin producing cells using exosome

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Publication number: KR101524079B1
Application number: KR1020140172153A
Authority: KR
Inventors: 최은영; 박경수; 이학모; 오주은; 고용송
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 서울대학교병원; 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2014-12-03
Publication date: 2015-06-04
Anticipated expiration: 2034-12-03

Abstract

본 발명은 엑소솜(exosome)을 포함하는 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물, 상기 배지 조성물을 이용한 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도 방법 및 및 상기 방법에 의해 제조된 인슐린 생산세포를 포함하는 당뇨병 치료용 세포 치료제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 베타세포 유래의 엑소솜은 그 기원과 무관하게 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있다. 이와 같이, 엑소솜을 이용하여 인슐린 생산세포로의 분화를 유도할 경우, 유전자 조작을 배제하기 때문에 안전하며, 기전이 명확하지 않은 고가의 화합물 또는 성장인자를 필요로 하지 않아 비용이 저렴하고, 단기간 내에 이루어질 수 있어 생체 외 조작 시에 문제되는 세포의 오염, 변성 등을 최소화할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 베타세포 유래 엑소솜을 감작된 성체 유래 세포는 분화가 완성되지 않은 세포로서 혈관을 통한 전신적인 이식을 통해 생체에 이식된 후 증식이 가능하여 적은 세포 양으로도 당뇨병 치료가 가능하다. The present invention relates to a composition for inducing differentiation from an adult-derived cell containing an exosome to an insulin-producing cell, a method for inducing differentiation from an adult-derived cell to an insulin-producing cell using the above-mentioned culture medium composition, And a cell therapy agent for treating diabetes comprising insulin-producing cells. The exosome derived from the beta cells according to the present invention can induce the differentiation from the adult-derived cells to the insulin-producing cells effectively regardless of the origins thereof. As described above, induction of differentiation into insulin producing cells using exosomes is safe because of elimination of genetic manipulation, cost is low because expensive compounds or growth factors that are unclear in the mechanism are not needed, So that it is possible to minimize contamination and degeneration of cells which are problematic in in vitro manipulation. In addition, adult cells that have been sensitized with beta cell-derived exosomes are cells in which the differentiation has not been completed, and they can be transplanted into a living body through systemic transplantation through blood vessels, and thus it is possible to treat diabetes even with a small amount of cells.

Description

[0001] The present invention relates to a method for inducing differentiation from adult cells into insulin-producing cells using exosomes,

본 발명은 엑소솜(exosome)을 포함하는 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물, 상기 배지 조성물을 이용한 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도 방법 및 및 상기 방법에 의해 제조된 인슐린 생산세포를 포함하는 당뇨병 치료용 세포 치료제에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for inducing differentiation from an adult-derived cell containing an exosome to an insulin-producing cell, a method for inducing differentiation from an adult-derived cell to an insulin-producing cell using the above-mentioned culture medium composition, And a cell therapy agent for treating diabetes comprising insulin-producing cells.

당뇨병은 만성적인 고혈당을 가장 중요한 특징으로 하는 질환으로 장기화되면 미세혈관 손상에 기인한 창상치유 지연, 신경질환, 신부전증, 심장질환 망막질환 등의 합병증을 유발하여 사회적 경제적 부담을 가중시키는 질환이다. 현재까지 당뇨병을 완치시킬 수 있는 치료법은 없으며 당뇨환자에서 부족한 인슐린을 반복적으로 투여하는 인슐린 강화요법이 오랜 기간 임상에서 활용되어 왔지만 하루에도 수 차례 반복해서 투여해야 하는 불편함이 존재하며, 그럼에도 불구하고 당뇨 합병증을 막을 수 없는 것이 현실이다.Diabetes mellitus is a disease characterized by chronic hyperglycemia as the most important feature. It prolongs wound healing caused by microvascular damage, neurological disease, kidney failure, cardiac disease, retinal disease and so on, which increases social and economic burden. There is no cure to cure diabetes until now, and insulin-enriched therapy which repeated insulin insufficiently in diabetic patients has been used in clinical practice for a long time, but it is inconvenient to be repeated several times a day, It is a reality that diabetes complication can not be prevented.

당뇨병은 원인에 따라 크게 두 가지 형태(제1형, 제2형)로 구분된다. 제1형 당뇨병의 경우 자신의 면역세포가 인슐린 생산세포를 파괴하여 발생하는 당뇨병으로 인슐린 생산세포가 부족하여 혈당을 조절하지 못하기 때문에 발생한다. 제2형 당뇨병의 경우 다양한 원인에 의하여 신체 내 장기/조직/세포 등이 인슐린에 대한 저항성을 가지게 되는 것에 기인하는 것으로, 고혈당에 기인한 인슐린 생산세포의 기능저하 및 소실로 혈당의 조절이 원활하지 않게 되며 결과적으로 고혈당을 보이는 당뇨병 증상과 함께 그에 따른 합병증이 유발된다.Diabetes mellitus is divided into two major types (type 1 and type 2) depending on the cause. In the case of type 1 diabetes, it occurs because the immune cells destroy insulin-producing cells and diabetes mellitus can not regulate blood glucose due to lack of insulin-producing cells. The type 2 diabetes is caused by the fact that the organs / tissues / cells in the body have resistance to various insulin due to various causes. The insulin-producing cells due to hyperglycemia are inferior in function and disappearance, Resulting in diabetes mellitus with hyperglycemia and subsequent complications.

현재 당뇨병의 치료수단으로 동종 혹은 이종 유래의 췌도 세포 이식을 이용한 연구가 진행되고 있으나 췌도 이식을 받은 환자의 경우 평생 동안 면역조절제를 복용해야 하는 불편함이 있으며, 그 성공률이 1년 이내 62.5%에 불과하고 시간이 경과함에 따라 더욱 감소할 뿐만 아니라 췌도 이식이 요구되는 환자 수에 비하여 공여자의 수가 턱없이 부족한 상황이다.Currently, studies on islet or xenogeneic pancreatic islet transplantation have been conducted as a means of treating diabetes. However, in patients receiving islet transplantation, it is inconvenient to take immunosuppressive drugs for a lifetime, and the success rate is 62.5% And the number of donors is insufficient compared with the number of patients requiring islet transplantation.

이와 같이 췌도 공여자의 부족에 대한 대안으로 생체 외에서 배아줄기세포, 역분화 줄기세포 등 다양한 세포를 이용하여 인슐린을 생산하는 세포로 분화시킨 후 이를 이식함으로써 당뇨병을 치료하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 그러나 인슐린 생산 세포로의 분화기전이 여전히 모호하고, 분화된 세포의 경우 증식이 일어나지 않는 현상을 고려할 때 당뇨병 치료에 필요한 양의 세포를 얻기 위해서는 천문학적 비용이 소요될 것으로 예상되며, 효율이 매우 낮고 안전성에 대한 우려로 인하여 임상적용이 불가능한 상황이다 (Zhang D et al. 2009; Thatava T et al. 2011).As an alternative to the insufficiency of an islet donor, studies have been actively carried out to differentiate insulin-producing cells using various cells such as embryonic stem cells and degenerated stem cells in vitro, and then transplanting them to treat diabetes . However, considering the fact that the mechanism of differentiation into insulin-producing cells is still vague and that the differentiated cells do not proliferate, astronomical costs are expected to be required to obtain the cells necessary for the treatment of diabetes, (Zhang D et al. 2009; Thatava T et al. 2011).

한편, 세포치료제의 안전성에 대한 우려를 불식시킬 수 있는 수단으로 성체줄기세포가 제시되고 있다. 특히 골수세포는 골수천자 방법 이외에도 G-CSF, AMD3100 등의 골수세포 동원인자를 투여하여 혈중으로 유리시킨 뒤 말초혈액으로부터 용이하게 획득할 수 있을 뿐만 아니라 (Yeoh JS et al. 2007), 다양한 손상조직의 재생에 기여할 수 있다는 연구결과들이 발표되고 있어 (Badiavas EV et al. 2003, Stilley C et al. 2004, Blocklet D et al. 2006, Uccelli A et al. 2008, Secco M et al. 2008), 이를 이용한 세포 치료제에 대한 연구가 활발히 진해되고 있다. On the other hand, adult stem cells have been suggested as a means to alleviate concerns about the safety of cell therapy drugs. In addition to bone marrow aspiration, bone marrow cells can be easily obtained from the peripheral blood by freeing the bone marrow cell mobilization factors such as G-CSF and AMD3100 (Yeoh JS et al. 2007) (2008), Secco M et al., 2008), and it has been reported that the researchers can contribute to the regeneration of the restorations (Badiavas EV et al. 2003, Stilley C et al 2004, Blocklet D et al 2006, Uccellia et al 2008) Studies on the cell therapy agent that has been used have been intensively studied.

이에 본 발명자들은 새로운 당뇨병 치료용 세포치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 베타세포 유래의 엑소솜을 이용하여 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있으며, 상기 인슐린 생산세포가 생체 내에서 우수한 혈당 조절 효과를 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Therefore, the present inventors have made efforts to develop a new cell therapy agent for treating diabetes. As a result, they have been able to effectively induce the differentiation of adult-derived cells into insulin-producing cells using exosome derived from beta cells, And thus the present invention has been completed.

본 발명의 목적은 엑소솜을 포함하는 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a composition for inducing differentiation from an adult-derived cell containing an exosome to an insulin-producing cell.

본 발명의 다른 목적은 엑소솜을 포함하는 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 배지 조성물 및 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a medium composition and a kit for inducing differentiation of adult cells containing exosomes into insulin-producing cells.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 배지 조성물을 이용한 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도 방법을 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a method for inducing differentiation of an adult-derived cell into an insulin-producing cell using the above-mentioned culture medium composition.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 인슐린 생산세포, 이를 포함하는 당뇨병 치료용 세포 치료제 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide an insulin-producing cell produced by the above method, a cell therapy agent for treating diabetes comprising the same, and a method for producing the same.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 엑소솜을 포함하는 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다. In order to accomplish the above object, the present invention provides a composition for inducing differentiation from an adult-derived cell containing an exosome to an insulin-producing cell.

또한, 본 발명은 엑소솜을 포함하는 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 포함하는 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 키트를 제공한다. The present invention also provides a medium composition for inducing differentiation from an adult-derived cell containing an exosome to an insulin-producing cell, and a kit for inducing differentiation from an adult-derived cell into an insulin-producing cell comprising the above-mentioned medium composition.

또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에서 성체 유래 세포를 배양하는 단계;를 포함하는, 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도 방법을 제공한다. Also, the present invention provides a method for inducing differentiation from an adult-derived cell to an insulin-producing cell, comprising culturing an adult-derived cell in the above-mentioned culture medium composition.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 인슐린 생산세포, 이를 포함하는 당뇨병 치료용 세포 치료제, 및 이의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides insulin-producing cells produced by the above method, a cell therapy agent for treating diabetes comprising the same, and a method for producing the same.

본 발명에 따른 베타세포 유래의 엑소솜은 그 기원과 무관하게 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있다. 이와 같이, 엑소솜을 이용하여 인슐린 생산세포로의 분화를 유도할 경우, 유전자 조작을 배제하기 때문에 안전하며, 기전이 명확하지 않은 고가의 화합물 또는 성장인자를 필요로 하지 않아 비용이 저렴하고, 단기간 내에 이루어질 수 있어 생체 외 조작 시에 문제되는 세포의 오염, 변성 등을 최소화할 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 베타세포 유래 엑소솜을 감작된 성체 유래 세포는 분화가 완성되지 않은 세포로서 혈관을 통한 전신적인 이식을 통해 생체에 이식된 후 증식이 가능하여 적은 세포 양으로도 당뇨병 치료가 가능하다. The exosome derived from the beta cells according to the present invention can induce the differentiation from the adult-derived cells to the insulin-producing cells effectively regardless of the origins thereof. As described above, induction of differentiation into insulin producing cells using exosomes is safe because of elimination of genetic manipulation, cost is low because expensive compounds or growth factors that are unclear in the mechanism are not needed, So that it is possible to minimize contamination and degeneration of cells which are problematic in in vitro manipulation. In addition, adult cells that have been sensitized with beta cell-derived exosomes are cells in which the differentiation has not been completed, and they can be transplanted into a living body through systemic transplantation through blood vessels, and thus it is possible to treat diabetes even with a small amount of cells.

도 1은 MIP-TG 마우스의 골수세포를 이식 받은 C57BL/6 마우스에서 분리한 췌장 조직의 면역형광염색 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 동종(MIN-6) 또는 이종(INS-1) 베타세포 배양상층액으로 분화 유도된 골수세포의 면역형광염색 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 동종(MIN-6) 또는 이종(INS-1) 베타세포 배양상층액으로 분화 유도된 골수세포에서 인슐린 생산세포 특이적인 mRNA의 발현을 q-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 이종 췌도 배양상층액으로 분화 유도된 골수세포의 면역형광염색 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 이종 췌도 배양상층액 없이 동일 조건에서 분화 유도된 골수세포의 면역형광염색 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 이종 베타세포 배양상층액으로 분화 유도된 말초혈액에서 인슐린 생산세포 특이적인 mRNA 및 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 이종 베타세포 배양상층액으로 분화 유도된 피부 섬유아세포에서 인슐린 생산세포 특이적인 mRNA 및 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 이종 베타세포 유래 엑소솜으로 분화 유도된 골수세포의 면역형광염색 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 이종 베타세포 유래 엑소솜 없이 동일 조건에서 분화 유도된 골수세포의 면역형광염색 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 당뇨 마우스에 베타세포 배양상층액으로 감작된 골수세포를 이식 한 후, 공복혈당을 모니터링한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 당뇨 마우스에 베타세포 배양상층액으로 감작된 골수세포를 이식한 후, 췌장 조직을 분리하고 면역형광염색을 수행한 결과를 나타낸 도이다.FIG. 1 shows immunofluorescence staining results of pancreatic tissues isolated from C57BL / 6 mice transplanted with bone marrow cells of MIP-TG mice.
FIG. 2 is a graph showing the results of immunofluorescence staining of bone marrow cells induced to differentiate into a homogenous (MIN-6) or heterologous (INS-1) beta cell culture supernatant.
FIG. 3 shows the results of q-PCR analysis of insulin-producing cell-specific mRNA expression in bone marrow cells induced to differentiate into MIN-6 or INS-1 beta cell culture supernatants.
FIG. 4 is a graph showing the results of immunofluorescence staining of bone marrow cells differentiated into different islet cultures. FIG.
FIG. 5 is a graph showing the results of immunofluorescence staining of bone marrow cells induced to differentiate under the same conditions without differentiation supernatant of different islets.
FIG. 6 is a graph showing the results of confirming the expression of mRNA and protein specific for insulin-producing cells in peripheral blood differentiated into heterologous beta cell culture supernatant.
FIG. 7 is a graph showing the expression of insulin-producing cell-specific mRNA and protein in dermal fibroblasts induced to differentiate into differentiated beta cell culture supernatants.
8 is a diagram showing the result of immunofluorescence staining of bone marrow cells induced to differentiate into exocytes derived from heterologous beta cells.
FIG. 9 is a graph showing the results of immunofluorescence staining of bone marrow cells induced to differentiate under the same conditions without xenograft-derived exosomes.
10 is a graph showing the results of monitoring fasting blood glucose after transplantation of bone marrow cells sensitized with a beta cell culture supernatant to diabetic mice.
FIG. 11 is a graph showing the results of transplanting bone marrow cells sensitized with a beta cell culture supernatant into diabetic mice, isolating pancreatic tissue, and performing immunofluorescence staining.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 엑소솜을 포함하는 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for inducing differentiation from an adult-derived cell containing an exosome to an insulin-producing cell.

본 발명에서 "엑소솜(exosome)"은 바람직하게는 베타세포 유래이고, "베타세포 유래 엑소솜"은 베타세포의 세포막 성분으로 이루어진 지질 이중막에 의해 내부와 외부가 구분되며 세포의 세포막 지질과 세포막 단백질에 둘러싸인 세포질 조성물을 가지고 있으나 핵을 갖지 않는 것을 특징으로 하며 원래 베타세포보다 크기가 작은 것을 의미하는 용어이나 이에 한정되는 것은 아니다.In the present invention, the "exosome" is preferably derived from a beta cell, and the "exosome derived from a beta cell" is divided into a lipid bilayer composed of a cell membrane component of a beta cell, It is characterized by having a cytoplasmic composition surrounded by a cell membrane protein but not having a nucleus, and the term is meant to be smaller than the original beta cell, but is not limited thereto.

상기 베타세포는 동종 또는 이종 유래일 수 있으며, 포유동물 유래인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. The beta cells may be homologous or heterologous, and are preferably mammalian, but are not limited thereto.

본 발명의 베타세포 유래 엑소솜은 순수하게 분리된 엑소솜 이외에 베타세포 배양상층액, 췌도 배양상층액 등에 포함되어 있는 엑소솜을 포함한다. The beta-cell-derived exosomes of the present invention include exosomes contained in the beta cell culture supernatant, the islet culture supernatant, etc. in addition to the exosomes separated in pure.

본 발명에서 "성체 유래 세포"는 포유동물 유래의 모든 세포를 포함하는 것이며, 골수세포, 말초혈액으로 동원된(mobilized) 골수세포, 섬유아세포, 성체줄기세포, 또는 제대혈 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The term "adult-derived cell" in the present invention includes all cells derived from a mammal, and includes, but is not limited to, bone marrow cells, bone marrow cells mobilized with peripheral blood, fibroblasts, adult stem cells, It is not.

상기 골수세포는 골수천자를 통해 획득한 골수세포, 혈중으로 유리된 골수세포 등을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.The bone marrow cells include, but are not limited to, bone marrow cells obtained through bone marrow aspiration, blood marrow cells liberated as blood, and the like.

상기 성체줄기세포는 골수, 제대혈, 혈액, 피부, 지방 또는 태반으로부터 유래된 것을 포함하며, 바람직하게는 골수 또는 제대혈로부터 유래될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The adult stem cells include those derived from bone marrow, umbilical cord blood, blood, skin, fat, or placenta, and may be derived from bone marrow or umbilical cord blood, but are not limited thereto.

상기 엑소솜은 10 ng/ml 내지 1000 μg/ml, 바람직하게는 10 ng/ml 내지 100 μg/ml의 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.The exosome is preferably contained at a concentration of 10 ng / ml to 1000 μg / ml, preferably 10 ng / ml to 100 μg / ml, but is not limited thereto.

본 발명에 따른 베타세포 유래의 엑소솜은 그 기원과 무관하게 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있다. 이와 같이, 엑소솜을 이용하여 인슐린 생산세포로의 분화를 유도할 경우, 유전자 조작을 배제하기 때문에 안전하며, 기전이 명확하지 않은 고가의 화합물 또는 성장인자를 필요로 하지 않아 비용이 저렴하고, 단기간 내에 이루어질 수 있어 생체 외 조작 시에 문제되는 세포의 오염, 변성 등을 최소화할 수 있는 장점을 가지고 있다.
The exosome derived from the beta cells according to the present invention can induce the differentiation from the adult-derived cells to the insulin-producing cells effectively regardless of the origins thereof. As described above, induction of differentiation into insulin producing cells using exosomes is safe because of elimination of genetic manipulation, cost is low because expensive compounds or growth factors that are unclear in the mechanism are not needed, So that it is possible to minimize contamination and degeneration of cells which are problematic in in vitro manipulation.

또한, 본 발명은 엑소솜을 포함하는 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.The present invention also provides a medium composition for inducing differentiation of adult cells containing exosomes into insulin-producing cells.

또한, 본 발명은 상기 배지 조성물을 포함하는, 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화 유도용 키트를 제공한다. In addition, the present invention provides a kit for inducing differentiation from an adult-derived cell to an insulin-producing cell, comprising the above-mentioned culture medium composition.

본 발명에서 "배지(culture media)"는 생체 외에서 인슐린 생산세포로의 분화 유도 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.The term "culture medium" in the present invention means a medium which enables the induction and survival of differentiation into insulin producing cells in vitro, and includes all conventional culture media used in the art suitable for cell culture . Depending on the type of cells, medium and culture conditions can be selected. The medium used for the culture is preferably a cell culture minimum medium (CCMM), which generally contains a carbon source, a nitrogen source and a trace element component. For example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, αMEM Glasgow's Minimal Essential Medium, and Iscove's Modified Dulbecco's Medium. The medium may include antibiotics such as penicillin, streptomycin, gentamicin and the like.

상기 배지에는 엑소솜 외에 기존에 알려진 하나 이상의 인슐린 생산세포로의 분화 유도 물질이 더 포함될 수 있다.
In addition to the exosome, the medium may further contain at least one substance inducing differentiation into one or more insulin-producing cells known in the art.

상기 배양은 부유 배양, 부착 배양 등을 포함하며, 배양 방식에 한정되지 않는다. Such culture includes suspension culture, adhesion culture and the like, and is not limited to the culture system.

본 발명의 일 실시예에서는 1 내지 5일간 부유배양한 후, 1 내지 20일 동안 부착배양하여 성체 유래 세포로부터 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하였다.
In one embodiment of the present invention, suspension culture for 1 to 5 days followed by adhesion culture for 1 to 20 days induces differentiation from adult cells into insulin producing cells.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 인슐린 생산세포를 포함하는 당뇨병 치료용 세포 치료제를 제공한다. In addition, the present invention provides a cell therapy agent for treating diabetes comprising insulin-producing cells produced by the above method.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 인슐린 생산세포를 제조하는 단계;를 포함하는, 당뇨병 치료용 세포 치료제의 제조방법을 제공한다. The present invention also provides a method for producing a cell therapy agent for treating diabetes, comprising the step of producing an insulin producing cell by the above method.

상기 당뇨병은 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병을 포함한다. The diabetes includes type 1 diabetes or type 2 diabetes.

본 발명에서 "세포치료제"는 동물로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. The term "cell therapeutic agent" in the present invention is a pharmaceutical (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention of cells and tissues prepared by isolation, cultivation and specific works from animals, Refers to a drug used for therapeutic, diagnostic and prophylactic purposes through a series of actions, such as living, homologous, or xenogeneic cells that multiply, select, or otherwise alter the biological characteristics of a cell.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다."Administration" in the present invention means providing the subject invention with a composition of the invention in any suitable manner.

본 발명의 세포치료제의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 예를 들어, 엑소솜을 포함하는 배지 조성물에서 3일 이상 감작된 성체 유래 세포를 1×10⁶ ~10¹⁰/kg의 용량으로 혈관을 통해 이식할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
The preferred dosage of the cell therapy agent of the present invention varies depending on the condition and the weight of the individual, the degree of disease, the type of drug, the administration route and the period of time, but can be appropriately selected by those skilled in the art. The administration may be carried out once a day or divided into several doses, and the dosage is not limited in any way to the scope of the present invention. For example, adult-derived cells sensitized for 3 days or more in a medium composition containing exosome can be transplanted through a blood vessel at a dose of 1 × 10 ⁶ to 10 ¹⁰ / kg, but are not limited thereto.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. It should be noted, however, that the following examples are provided to further illustrate the present invention and are not intended to limit the scope of the present invention.

실시예 1. 성체 유래 세포의 인슐린 생산세포로의 분화 가능성 확인Example 1. Confirmation of the possibility of differentiation of adult-derived cells into insulin-producing cells

성체 유래 세포의 인슐린 생산세포로의 분화 가능성을 확인하고, 특히 성체 유래 세포에 의하여 췌도 내 베타세포가 재생될 수 있는지를 확인하기 위해, 인슐린 프로모터의 조절 하에 GFP (green fluorescent protein)를 발현하는 형질전환 마우스(Jackson Laboratory #0129463, 이하 MIP-TG 마우스라 칭함)의 골수세포가 이식된 C57BL/6J 키메라 마우스를 이용하였다. 상기 키메라 마우스는 1,000 cGy의 방사선 조사를 받아 골수가 파괴된 C57BL/6 마우스의 미정맥을 통해, MIP-TG 마우스의 대퇴골과 경골로부터 분리된 골수세포를 이식하여 제조하였으며, 이식 후 4주간 안정화시킨 후 실험에 사용하였다. 키메라 마우스의 베타세포 손상을 유도하기 위해 복강 내로 150 mg/kg의 STZ (streptozotocin, Sigma)를 투여하였으며, STZ 투여 3일 후에 혈당을 측정하여 300 mg/dl 이상의 혈당을 보이는 개체를 당뇨가 유발된 마우스로 분류하였다. 고혈당에 의한 추가적인 베타세포의 손상을 예방함과 동시에 인슐린 생산세포의 재생을 촉진하기 위해, 이후 초기 2주 동안 서방형 인슐린 제제인 린빗 (LinShin Inc)을 피하에 이식하여 혈당을 조절하였으며, STZ 투여 48일 후에 췌장 조직을 분리하여 GFP를 발현하는 세포의 출현 여부를 면역형광염색법을 통하여 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.In order to confirm the possibility of differentiation of adult-derived cells into insulin-producing cells and, in particular, to check whether beta cells in the islets can be regenerated by adult-derived cells, a gene expressing GFP (green fluorescent protein) under the control of an insulin promoter C57BL / 6J chimeric mice transplanted with transformed mice (Jackson Laboratory # 0129463, hereinafter referred to as MIP-TG mouse) bone marrow cells were used. The chimeric mice were prepared by transplanting bone marrow cells isolated from the femur and tibia of a MIP-TG mouse through a vein of a C57BL / 6 mouse in which bone marrow was destroyed by irradiation with 1,000 cGy. After 4 weeks of transplantation, Were used. STZ (streptozotocin, Sigma) was administered intraperitoneally to induce beta cell damage in chimeric mice. After 3 days of STZ administration, blood glucose levels were measured and blood glucose levels above 300 mg / Mice. To prevent further beta cell damage due to hyperglycemia and promote the regeneration of insulin-producing cells, blood glucose was regulated by subcutaneously transplanting the sustained-release insulin preparation LinShin Inc. for the first 2 weeks, and STZ administration After 48 days, pancreatic tissue was isolated and the presence of GFP expressing cells was confirmed by immunofluorescence staining. The results are shown in Fig.

도 1에 나타낸 바와 같이, STZ를 투여 받지 않은 정상 키메라 마우스의 췌장 조직에서는 GFP를 발현하는 세포를 관찰할 수 없었으나[도1 상단], STZ 투여를 통해 베타세포를 손상시킨 키메라 마우스의 췌장 조직에서는 인슐린을 생산하는 세포의 50% 이상에서 GFP가 발현됨을 확인하였다[도1 하단]. As shown in FIG. 1, GFP-expressing cells were not observed in pancreatic tissues of normal chimeric mice not receiving STZ (FIG. 1, upper part), but pancreatic tissues of chimeric mice Showed that GFP was expressed in more than 50% of the cells that produced insulin (Fig. 1 bottom).

상기 결과를 통하여, 기존에 존재하던 베타세포 외에 성체 유래의 다른 세포, 특히 골수세포가 인슐린 생산세포로 분화됨을 확인하였으며, 췌도 내 베타세포의 손상에 따라 골수세포가 동원(mobilization)되고 이는 손상된 췌도에 생착(engraftment)하며, 상기 생착된 골수세포가 손상된 베타세포 유래 유효인자의 영향으로 인슐린 생산세포로 분화되는 것으로 판단하였다.
In addition to the existing beta cells, other adult cells, especially bone marrow cells, were differentiated into insulin-producing cells, and bone marrow cells were mobilized according to the damage of beta cells in the pancreatic islets, And it was judged that the engrafted bone marrow cells were differentiated into insulin producing cells by the effect of the damaged beta cell-derived effective factors.

실시예 2. 베타세포 배양 상층액을 이용한 골수 세포의 인슐린 생산세포로의 분화 확인Example 2 Identification of Bone Marrow Cells into Insulin-Producing Cells Using a Beta Cell Culture Supernatant

상기 실시예 1의 결과를 통하여 확인한 바와 같이, 손상된 베타세포 유래 유효인자가 골수세포를 인슐린 생산세포로 분화시키는 역할을 하는 지를 검증하기 위하여, 마우스(동종) 또는 랫트(이종)로부터 분리 및 배양하여 확립된 베타세포 배양상층액을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. As confirmed from the results of Example 1, in order to examine whether the damaged beta cell-derived effective factor plays a role in differentiating bone marrow cells into insulin-producing cells, they were isolated and cultured from mice (same species) or rats The following experiment was conducted using the established beta cell culture supernatant.

먼저, 베타세포로는 MIN-6 세포와 INS-1 세포를 각각 동종 및 이종 베타세포주로 이용하였다. 유효인자로 예상하고 있는 엑소솜을 포함하고 있는 베타세포 배양상층액을 확보하기 위하여, 100 mm 세포배양 접시에 1.5×10⁷개의 베타세포를 심은 후, 세포배양용 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양시켜 안정화 시키고, PBS로 2회 세척하였다. 이 후, 1% 우혈청 (FBS), 5.5 mM 글루코스 및 1% 항생제가 포함된 DMEM 배지 10 ml을 첨가한 후, 3일간 추가 배양하였다. 배지를 회수하고, 400 ×g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액을 0.45 ㎛ 실린지 필터에 통과시켜 최종적으로 베타세포 배양상층액을 수득하였으며, 실험 전까지 -80℃에서 동결보관하였다. First, MIN-6 cells and INS-1 cells were used as homologous and heterologous beta cell lines, respectively, as beta cells. In order to obtain a beta cell culture supernatant containing exosome expected as an effective factor, 1.5 x 10 < ⁷ > cells of Beta cells were planted in a 100 mm cell culture dish and then stabilized by incubation in a cell culture incubator overnight , And washed twice with PBS. Thereafter, 10 ml of DMEM medium containing 1% fetal bovine serum (FBS), 5.5 mM glucose and 1% antibiotic was added and further cultured for 3 days. The medium was recovered, centrifuged at 400 xg for 5 minutes, and the supernatant was separated. The separated supernatant was passed through a 0.45 μm syringe filter to finally obtain a beta cell culture supernatant, which was stored frozen at -80 ° C. until the experiment.

한편, MIP-TG 마우스(8~12 주령)의 대퇴골과 경골을 분리하고 PBS로 flushing하여 골수세포를 확보한 뒤, 용혈용액(BD Pharmingen)을 이용하여 적혈구를 제거하고 이를 다시 PBS로 세정하여 최종적으로 골수세포를 수득하였다.Meanwhile, the femur and tibia of the MIP-TG mouse (8 to 12 weeks old) were separated, and the bone marrow cells were obtained by flushing with PBS. The red blood cells were then removed using a hemolytic solution (BD Pharmingen) To obtain bone marrow cells.

베타세포 배양 상층액을 이용한 골수세포의 인슐린 생산세포로의 분화 여부를 확인하기 위하여, 상기 과정을 통해 준비된 MIP-TG 마우스 유래의 골수세포(3×10⁶ cells/ml)를 0, 5 또는 20%의 베타세포 배양상층액 및 20% FBS를 함유하는 기본배지에 부유하여 부유배양접시(부착이 저해된 6 well petri-dish)에 3 ml씩 담고 부유배양용 인큐베이터에서 3일간 60 rpm의 속도로 감작배양 하였다. 이후 세포를 회수한 후, PBS로 2회 세정하고 10% FBS를 함유하는 기본배지 3 ml로 재부유시켰으며, 이를 부착배양접시(세포배양용 6 well plate)에서 3~9일 동안 추가배양하였다. 배양이 끝난 후, 형광현미경을 이용하여 GFP를 발현하는 세포의 출현여부를 확인하였으며, 인슐린 생산세포 특이적인 mRNA (Pre-proinsulin, Insulin-2, PDX-1, MafA)의 발현을 정량 PCR (q-PCR)을 통해 확인하였다(정상 골수세포 대비 mRNA 발현량의 증가를 배율(fold)로 표시함). 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. In order to confirm the differentiation of bone marrow cells into insulin-producing cells using the beta cell culture supernatant, bone marrow cells (3 x 10 ⁶ cells / ml) prepared from the MIP-TG mouse prepared above were dissolved in 0, 5 or 20 3% in a floating culture dish (6-well petri-dish with adherence inhibited) and incubated in a floating culture incubator for 3 days at a rate of 60 rpm Sensitization culture. The cells were then harvested, washed twice with PBS, resuspended in 3 ml of basal medium containing 10% FBS, and further cultured for 3 to 9 days in an attachment culture dish (6 well plate for cell culture) . After incubation, the presence of GFP-expressing cells was confirmed by fluorescence microscopy. The expression of insulin-producing cell-specific mRNAs (Pre-proinsulin, Insulin-2, PDX-1 and MafA) -PCR) (increase in mRNA expression relative to normal bone marrow cells is expressed as fold). The results are shown in Fig. 2 and Fig.

도 2에 나타낸 바와 같이, 베타세포 배양상층액이 없는 상태에서 감작배양된 골수세포에서는 GFP 발현을 확인할 수 없었으나, 동종 또는 이종 베타세포 배양상층액이 첨가된 분화배지를 이용하여 3일간 감작배양 후 9일간 부착배양된 골수세포에서는 GFP의 발현이 강하게 확인되었다. As shown in FIG. 2, GFP expression could not be confirmed in the bone marrow cells sensitized and cultured in the absence of the beta cell culture supernatant. However, in the case of using the differentiation medium supplemented with the same or different beta cell culture supernatant, The expression of GFP was strongly observed in the bone marrow cells cultured for 9 days.

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 동종 또는 이종 베타세포 배양상층액이 첨가된 분화배지를 이용하여 3일간 감작배양 후 9일간 부착배양된 골수세포에서 인슐린 생산세포 특이적인 mRNA의 발현이 현저하게 증가되었음을 확인하였다. Further, as shown in Fig. 3, the expression of insulin-producing cell-specific mRNA was remarkably increased in the bone marrow cells cultured for 9 days after 3 days of sensitization with the differentiation medium supplemented with the same or different beta cell culture supernatant Respectively.

상기 결과를 통하여, 손상된 베타세포 배양 상층액에 골수세포를 인슐린 생산세포로 분화시키는 유효인자가 존재하며, 엑소솜이 유래한 종(species)과는 무관하게 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
From the above results, it was confirmed that there exists an effective factor that differentiates bone marrow cells into insulin producing cells in the injured beta cell culture supernatant, and has activity regardless of exosome-derived species.

실시예 3. 이종 췌도 배양 상층액을 이용한 골수 세포의 인슐린 생산세포로의 분화 확인Example 3 Differentiation of Bone Marrow Cells into Insulin-Producing Cells Using Different Islet Culture Supernatants

상기 실시예 2에서 확인한, 베타세포 배양 상층액에 의한 골수세포의 인슐린 생산세포로의 분화 유도 활성이 종양화된 베타세포 배양 상층액만의 특징인지를 확인하기 위하여, 신선하게 분리한 췌도 배양 상층액을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. In order to confirm that the activity of inducing differentiation of bone marrow cells into insulin-producing cells by the beta cell culture supernatant, which was confirmed in Example 2, was only characteristic of the tumor cellized beta cell culture supernatant, freshly isolated islet cultured upper layer The following experiment was carried out using the solution.

먼저, 신선한 췌도는 250~300 g의 SD 랫트(Sprague Dawley rat)로부터 기존에 보고된 방법(Lee et al. Islets. 2013)에 준하여 분리하였으며, 분리된 췌도를 5.5 mM 글루코스, 1% 항생제 및 1% FBS가 포함된 DMEM 배지에 400 IEQ/ml로 부유하여 부유배양용 6 웰 플레이트에 3 ml씩 분주한 후, 부유배양용 인큐베이터에서 60 rpm으로 흔들면서 72시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 회수한 뒤, 400 ×g에서 5분간 원심분리하여 부유물을 가라앉히고 다시 상층액만을 회수하였으며, 분리된 상층액을 0.45 ㎛ 실린지 필터에 통과시켜 이종 췌도 배양 상층액을 수득하고, 실험 전까지 -80℃에서 동결보관 하였다. First, the fresh islets were separated from SD rats (Sprague Dawley rats) of 250 to 300 g according to the previously reported method (Lee et al. Islets. 2013), and isolated islets were suspended in 5.5 mM glucose, 1% The cells were suspended in DMEM medium containing 400 ng / ml of FBS and suspended at 400 IEQ / ml. The cells were dispensed in a 6-well plate for floating culture in an amount of 3 ml each, and incubated for 72 hours with shaking at 60 rpm in a floating culture incubator. The culture supernatant was recovered, centrifuged at 400 xg for 5 minutes to allow the supernatant to settle, and the separated supernatant was passed through a 0.45 mu m syringe filter to obtain a heterogeneous islet culture supernatant, And stored at -80 ° C until the experiment.

췌도 배양 상층액을 이용한 골수세포의 인슐린 생산세포로의 분화 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2에 준하여 실험을 수행하였다. 보다 구체적으로, MIP-TG 마우스 유래의 골수세포(3×10⁶ cells/ml)를 20%의 이종 췌도 배양 상층액 및 20% FBS를 함유하는 기본배지에 부유하여 부유배양접시(부착이 저해된 6 well petri-dish)에 3 ml씩 담고 부유배양용 인큐베이터에서 3일간 60 rpm의 속도로 감작배양 하였다. 이후 세포를 회수한 후, PBS로 2회 세정하고 10% FBS를 함유하는 기본배지 3 ml로 재부유시켰으며, 이를 부착배양접시(세포배양용 6 well plate)에서 3~9일 동안 추가배양하였다. 배양이 끝난 후, 형광현미경을 이용하여 GFP를 발현하는 세포의 출현여부를 확인하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. Experiments were carried out in accordance with Example 2 to confirm whether the bone marrow cells were differentiated into insulin-producing cells using an islet culture supernatant. More specifically, bone marrow cells (3 x 10 ⁶ cells / ml) derived from MIP-TG mice were suspended in a basal medium containing 20% heterogeneous islet cultured supernatant and 20% FBS to prepare suspension culture plates 6 well petri-dish) and incubated for 3 days at 60 rpm in a floating culture incubator. The cells were then harvested, washed twice with PBS, resuspended in 3 ml of basal medium containing 10% FBS, and further cultured for 3 to 9 days in an attachment culture dish (6 well plate for cell culture) . After the incubation, fluorescence microscopy was used to confirm the appearance of GFP-expressing cells. The results are shown in Fig. 4 and Fig.

도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 이종 췌도 배양 상층액이 첨가된 분화배지를 이용하여 3일간 감작배양 후 9일간 부착배양된 골수세포에서 GFP의 발현이 확인되었으나, 이종 췌도 배양 상층액 없이 감작배양된 골수세포에서는 어느 시기에도 GFP 발현 세포를 확인할 수 없었다. As shown in FIG. 4 and FIG. 5, GFP expression was observed in bone marrow cells adherent for 9 days after 3 days of sensitization using differentiation medium supplemented with differentiation supernatant of cultured pancreatic islets. However, GFP-expressing cells could not be identified at any time in cultured bone marrow cells.

상기 결과를 통하여, 베타세포 배양 상층액에 존재하는 유효 인자가 유래한 종과 관계없이 골수세포를 인슐린 생산세포로 분화시키는 활성을 가지고 있음을 다시 한번 확인하였다.
From the above results, it was once again confirmed that the active agent present in the beta cell culture supernatant has an activity of differentiating bone marrow cells into insulin-producing cells irrespective of the species from which the effective factors are derived.

실시예 4. 이종 베타세포 배양 상층액을 이용한 성체 유래 세포의 인슐린 생산세포로의 분화 확인Example 4. Confirmation of differentiation of adult-derived cells into insulin-producing cells using a heterogeneous beta cell culture supernatant

베타세포 배양 상층액이 골수세포 이외의 다른 성체 유래 세포를 인슐린 생산세포로 분화시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. In order to confirm whether the beta cell culture supernatant can differentiate the adult-derived cells other than bone marrow cells into insulin-producing cells, the following experiment was conducted.

베타세포 배양 상층액으로는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 준비한 이종 유래의 INS-1 세포 배양상층액을 이용하였으며, 성체 유래 세포로는 C57BL/6J 마우스의 말초혈액과 피부 섬유아세포(skin fibroblast)를 이용하였다. 보다 구체적으로, 말초혈액은 정상 C57BL/6 마우스에 250 μg/kg의 G-CSF를 1일 1회씩, 총 4일간 피하주사하고, 마지막 G-CSF 주사 6시간 후에 복대정맥을 통하여 말초혈액을 확보한 뒤 적혈구 제거과정을 거쳐 준비하였다. 피부 섬유아세포는 C57BL/6J 마우스의 등쪽 털을 제거한 뒤 biopsy punch를 이용하여 지름 5 mm의 피부 절편을 확보하고, 이를 25 mM 글루코스, 1% 항생제 및 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 2주간 배양한 뒤, 피부 절편 밖으로 자라나오는 세포를 회수하여 준비하였다.As a supernatant for beta cell culture, a heterogeneous INS-1 cell culture supernatant prepared in the same manner as in Example 2 was used. As adult cells, peripheral blood of C57BL / 6J mouse and skin fibroblast Respectively. More specifically, the peripheral blood was subcutaneously injected into normal C57BL / 6 mice at a dose of 250 μg / kg of G-CSF once a day for a total of 4 days, and peripheral blood was collected through the abdominal vein 6 hours after the last G-CSF injection Followed by red blood cell removal. The dermal fibroblast cells were cultured in DMEM medium containing 25 mM glucose, 1% antibiotic, and 10% FBS for 2 weeks. After that, the cells growing out of the slice of the skin were recovered and prepared.

상기 과정을 통하여 준비된 말초혈액을 이종 베타세포 배양 상층액 10%및 20% FBS를 함유하는 기본배지에 부유하여 3일간 감작배양하였으며, 피부 섬유아세포(2×10⁵ cells)는 이종 베타세포 배양상층액 10% 및 20% FBS를 함유하는 기본배지에 부유하여 3일간 감작배양하였다. 이후 말초혈액 및 피부 섬유아세포를 회수한 후, PBS로 2회 세정하고 5.5 mM 글루코스, 1% 항생제 및 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 첨가하여 9일간 추가배양하였다(분화유도 12일). 배양이 끝난 후, 세포를 수거하여 인슐린 생산세포의 특징적인 mRNA(Pre-proinsulin, Insulin-2, PDX-1, MafA) 및 단백질(Insulin, c-peptide, PDX-1)의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다. The prepared peripheral blood was suspended in a basic medium containing 10% and 20% FBS as a heterogeneous beta cell culture supernatant and sensitized for 3 days. The skin fibroblasts (2 x 10 ⁵ cells) 10% and 20% FBS, and cultured for 3 days. After the peripheral blood and skin fibroblasts were collected, the cells were washed twice with PBS, and DMEM medium containing 5.5 mM glucose, 1% antibiotic, and 10% FBS was added and further cultured for 9 days (induction of differentiation). After incubation, the cells were harvested and the expression of characteristic mRNAs of insulin-producing cells (Pre-proinsulin, Insulin-2, PDX-1, MafA) and protein (Insulin, c-peptide, PDX-1) was confirmed. The results are shown in Fig. 6 and Fig.

도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 이종 베타세포 배양 상층액이 첨가된 분화배지를 이용하여 배양된 말초혈액 및 피부 섬유아세포에서 모두 인슐린 생산세포 특이적인 mRNA 및 단백질의 발현을 확인하였다. As shown in FIGS. 6 and 7, the expression of insulin-producing cell-specific mRNA and protein was confirmed in the peripheral blood and the dermal fibroblast cultured using the differentiation medium supplemented with the heterogeneous beta cell culture supernatant.

상기 결과를 통하여, 베타세포 배양 상층액에 존재하는 유효 인자가 골수세포 이외의 성체 유래 세포를 인슐린 생산세포로 분화시키는 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
From the above results, it was confirmed that the effective factors existing in the beta cell culture supernatant have activity to differentiate adult cells other than bone marrow cells into insulin-producing cells.

실시예 5. 이종 베타세포 유래 엑소솜을 이용한 성체 유래 세포의 인슐린 생산세포로의 분화 확인Example 5 Identification of Adult-derived Cells into Insulin-Producing Cells Using Exogenous Beta-Cell-Derived Exosomes

상기 실시예를 통해 확인한, 성체 유래 세포의 인슐린 생산세포로의 분화가 엑소솜 이외에 베타세포 배양상층액에 존재할 수 있는 다른 가용성 인자(soluble factor)에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 순수한 엑소솜만을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. To confirm whether the differentiation of adult cells into insulin-producing cells was due to other soluble factors which may be present in the beta cell culture supernatant in addition to exosomes, only pure exosomes And the following experiment was carried out.

먼저, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 준비한 이종 유래의 INS-1 세포 배양 상층액을 기존에 공지된 방법(Haggani AS et al. 2013)에 준하여 100,000 ×g에서 2시간 동안 초원심분리(ultracentrifugation)하고, 생성된 펠렛 (pellet)을 PBS로 재부유한 후 100,000 ×g에서 1시간 동안 추가 원심분리하는 과정을 통해, 순수한 엑소솜을 수득하였다. First, the heterogeneous INS-1 cell culture supernatant prepared in the same manner as in Example 2 was subjected to ultracentrifugation at 100,000 x g for 2 hours in accordance with a known method (Haggani AS et al. 2013) The resulting pellet was resuspended in PBS and further centrifuged at 100,000 x g for 1 hour to obtain pure exosomes.

상기 과정을 통해 수득한 엑소솜 5 μg/ml을 이용하여, 상기 실시예 2와 동일한 감작 배양 방법으로 골수세포의 인슐린 생산세포로의 분화를 유도하였으며, 형광현미경을 이용하여 GFP를 발현하는 세포의 출현여부를 확인하였다. 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다. Using 5 μg / ml of exosome obtained from the above procedure, differentiation of bone marrow cells into insulin-producing cells was induced by the same sensitization culture method as in Example 2, and the cells expressing GFP . The results are shown in Fig. 8 and Fig.

도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 이종 베타세포 유래 엑소솜이 첨가된 분화배지를 이용하여 3일간 감작배양 후 9일간 부착배양된 골수세포에서 GFP의 발현이 확인되었으며, 이종 베타세포 유래 엑소솜 없이 감작배양된 골수세포에서는 어느 시기에도 GFP 발현 세포를 확인할 수 없었다. As shown in FIG. 8 and FIG. 9, GFP expression was confirmed in bone marrow cells adherent for 9 days after 3 days of sensitization using differentiation medium supplemented with exocytosis derived from heterologous beta cells. GFP-expressing cells could not be identified at any time in sensitized bone marrow cells.

상기 결과를 통하여, 성체유래 세포를 인슐린 생산세포로 분화시키는 베타세포 배양 상층액의 유효 인자가 엑소솜임을 확인였다.
Based on the above results, it was confirmed that the effective factor of the beta cell culture supernatant that differentiates adult cells into insulin producing cells is exosome.

실시예 6. 베타세포 배양상층액을 이용하여 분화된 성체 유래 세포의 생체 내 기능 평가Example 6. In vivo function evaluation of differentiated adult cells using beta cell culture supernatant

베타세포 배양상층액을 이용하여 분화된 성체 유래 세포가 당뇨가 유발된마우스에서 헐당을 조절할 수 있는지를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. In order to confirm whether adult cells differentiated using the beta cell culture supernatant can control the glycosylation in diabetic mice, the following experiment was conducted.

먼저, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 준비한 이종 유래의 INS-1 세포 배양 상층액을 이용하여, MIP-TG 마우스 유래의 골수세포를 3일간 감작시켰다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 베타세포를 손상시켜 혈당이 상승된 C57BL/6J 마우스의 미정맥을 통하여, 상기 베타세포 배양 상층액으로 감작된 골수세포(1×10⁶ cells)를 0.1 ml PBS에 부유하여 이식하였다. 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 린빗을 이용하여 세포 이식 후 2주 동안 혈당을 조절하였으며, 이식 14일 후 린빗을 제거하였다. 대조군은 베타세포 배양 상층액이 없는 상태에서 동일한 방법으로 감작된 골수세포를 이식하였다. 실험 기간 동안 혈당을 모니터링 하였으며, 췌장을 분리하여 면역형광염색을 수행하였다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다. First, bone marrow cells derived from MIP-TG mouse were sensitized for 3 days using a differentiated INS-1 cell culture supernatant prepared in the same manner as in Example 2 above. In the same manner as in Example 1, beta cells were injured and bone marrow cells (1 x 10 ⁶ cells) sensitized with the beta cell culture supernatant were subcutaneously injected into 0.1 ml of PBS through a vein of C57BL / Floating and transplanted. In the same manner as in Example 1, blood glucose was regulated for 2 weeks after the transplantation using a Linbit, and the Linbit was removed after 14 days of transplantation. In the control group, the sensitized bone marrow cells were transplanted in the same manner without the beta cell culture supernatant. Blood glucose was monitored during the experiment and immunofluorescent staining was performed by isolating the pancreas. The results are shown in Fig. 10 and Fig.

도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 릿빗을 제거한 뒤 공복 혈당의 증가가 관찰되었으나, 베타세포 배양 상층액으로 감작된 골수세포를 이식 받은 실험군에서는 린빗을 제거한 이후에도 30일 이상 정상 수준의 혈당을 유지함을 확인하였다. As shown in FIG. 10, in the control group, an increase in fasting blood glucose was observed after removing the rituximab. However, in the experimental group in which bone marrow cells sensitized with the beta cell culture supernatant were transplanted, Respectively.

또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 베타세포 배양 상층액으로 감작된 골수세포를 이식 받은 실험군의 췌도 내에 50% 이상의 인슐린 생산세포가 GFP를 발현하고 있으며, PDX-1과 GFP를 동시에 발현하는 세포가 존재함을 확인하였다. As shown in Fig. 11, more than 50% of the insulin-producing cells express GFP in the pancreatic islets of bone marrow cells sensitized with the beta cell culture supernatant, and cells expressing both PDX-1 and GFP simultaneously Respectively.

상기 결과를 통하여, 베타세포 배양 상층액으로 3일간 감작된 세포는 혈관을 통해 이식된 이후 췌도에 생착될 뿐만 아니라, 생착 이후 증식능력을 가지며 혈당 조절능을 가지고 있어, 베타세포 파괴 및 손상에 의한 인슐린 의존성 당뇨병의 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
From the above results, it can be seen that the cells sensitized for 3 days with the beta cell culture supernatant are not only transplanted into the pancreatic islets after transplantation through the blood vessels, but also have proliferative ability and glucose control ability after engraftment, And can be used for the treatment of insulin-dependent diabetes mellitus.

Claims

A composition for inducing differentiation from an adult-derived cell comprising an exosome derived from a beta cell into an insulin-producing cell.

delete

The composition of claim 1, wherein the beta cells are homologous or heterologous.

The composition according to claim 1, wherein the adult-derived cells are at least one selected from the group consisting of bone marrow cells, bone marrow cells mobilized with peripheral blood, fibroblasts, adult stem cells, and umbilical cord blood.

5. The composition according to claim 4, wherein the adult stem cells are mesenchymal stem cells derived from at least one selected from the group consisting of bone marrow, umbilical cord blood, blood, skin, fat and placenta.

2. The composition of claim 1, wherein the exosome is present at a concentration from 10 ng / ml to 100 μg / ml.

A medium composition for inducing differentiation from an adult-derived cell comprising an exosome derived from a beta cell into an insulin-producing cell.

A kit for inducing differentiation from an adult-derived cell to an insulin-producing cell, comprising the culture medium composition of claim 7.

A method for inducing differentiation from an adult-derived cell to an insulin-producing cell, comprising culturing adult-derived cells in the medium composition of claim 7.

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