KR101510995B1

KR101510995B1 - 마이크로ｒｎａ－３１ 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물

Info

Publication number: KR101510995B1
Application number: KR20140079068A
Authority: KR
Inventors: 민경훈; 민혜영; 임경택; 송지호
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2013-06-26
Filing date: 2014-06-26
Publication date: 2015-04-10
Anticipated expiration: 2034-06-26
Also published as: KR20150003098A

Abstract

본 발명은 신규 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 이의 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 마이크로RNA-31 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것으로, 상기 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 이의 염은 마이크로RNA-31 발현을 조절하여 마이크로RNA-31 관련 암질환 특히, 폐암, 식도 편평세포암, 결장암 또는 난소암과 같은 암질환 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

마이크로ＲＮＡ－３１ 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물{Pharmaceutical composition for treating or preventing microRNA-31 related diseases}

본 발명은 신규 이속사졸릴페닐설폰아마이드(isoxazolylphenylsulfonamide) 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 마이크로RNA-31(miRNA-31) 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물에 관한 것이다.

마이크로RNA(miRNA)는 18 내지 25 뉴클레오타이드 길이를 갖는 작은 비코딩 RNA로서, 타겟 mRNA의 전사후 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. miRNA는 세포 발생, 증식, 생존 및 죽음과 같은 수많은 세포 과정에 관여한다. 또한, 다양한 유형의 암질환에서 miRNA의 하향 조절된 발현이 관찰된다. 예를 들어, miR-155, miR-21 및 miR-17-92 클러스터는 폐암, 유방암, 위암, 대장암 및 임파선암을 포함한 다양한 암에서 자주 상향 조절되며, 한편 miR-15a-miR-16-1 및 miR-29b-1-miR-29a 클러스터의 손상은 백혈병과 다른 암에서 관찰된다. 일반적으로 과발현된 miRNA는 종양 억제 유전자를 하향 조절하여 발암성 miRNA로서 기능을 수행하는 반면, miRNA의 하향 조절은 종양 억제 miRNA 타겟 발암유전자로서 기능을 수행한다.

그리고, miRNA-31은 폐암, 식도 편평상피암, 유방암과 같은 암세포에서 과발현되는 발암성 miRNA이며(J Clin Invest . 120: 1298, 2010; Clin Sci ( Lond ). 121: 437, 2011; Oncogenesis 2: 1, 2013), 또한 결장암 성장 관련 RAS 신호계의 활성화제로서 기능을 수행한다(J. Biol . Chem . 288: 9508, 2013).

국제공개특허 제2010-119698호에서는 마이크로RNA 억제제를 이용한 두경부종양 치료제를 개시하고 있다.

한편, 다양한 암질환에 관련되는 miRNA-31의 조절을 통해 이러한 암질환들을 치료할 수 있기 때문에 miRNA-31 특이적 조절제를 개발할 필요가 있다.

본 발명의 목적은 miRNA-31 조절을 통해 다양한 암질환을 치료할 수 있는 신규 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 이를 유효성분으로 함유하는 miRNA-31 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물 및 화학식 4의 화합물로 이루어진 군에서 선택된 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 마이크로RNA-31 조절제일 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물 및 화학식 4의 화합물로 이루어진 군에서 선택된 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 마이크로RNA-31 관련 질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 마이크로RNA-31 관련 질환은 암질환일 수 있으며, 폐암, 식도 편평세포암, 결장암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택된 암질환일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 암질환 의심 환자로부터 얻은 혈액 시료에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 상기 후보 화합물이 처리된 혈액 시료 중 분비형 알칼라인 포스파타제(secreted alkaline phosphatas; SEAP) 활성을 분석하는 단계를 포함하는 마이크로RNA-31 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 마이크로RNA-31 발현을 조절하여 마이크로RNA-31 관련 암질환 특히, 폐암, 식도 편평세포암, 결장암 또는 난소암과 같은 암질환 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 miRNA-31 조절제를 스크리닝 하는 반응계를 도시한 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 중 화합물 1, 2 그리고 화합물 6의 처리에 의한 mi-RNA 발현 변화를 나타낸 것이고,
도 5는 본 발명에 따른 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 중 화합물 7을 처리하였을 때 miRNA-31의 발현량을 나타낸 것이다.

본 발명에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에 언급된 문헌들은 모두 본 발명을 설명하기 위한 문헌으로 본 명세서에 포함된다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물 및 화학식 4의 화합물로 이루어진 군에서 선택된 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

본 발명에 따른 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체는 다음과 같은 반응식을 통해 제조할 수 있다.

1. 벤젠설포닐 클로라이드와 테트라부틸암모늄 황산수소염을 이용한 설폰 아마이드 유도체 합성.

하기 반응식 1과 같이 벤젠설포닐 클로라이드와 아민을 벤젠에 용해시킨 용액에 테트라부틸암모늄 황산수소염과 NaOH 수용액을 첨가하였고, TLC를 통해 더 이상 출발물질이 관찰되지 않을 때까지 대기 중에서 격렬하게 교반한 후, 상기 반응혼합물을 EtOAc 및 물로 희석시킨 후, 얻어진 유기층을 세정하고, 건조하며, 진공 하에서 농축하며, 잔류물을 실리카겔 상에서 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 정제하여 원하는 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체를 합성할 수 있다:

[반응식 1]

2. ( E )-4-(4- 메톡시페닐 )-3- 메틸부트 -3-엔-2-온을 이용한 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 합성

2-1) ( E )-4-(4- 메톡시페닐 )-3- 메틸부트 -3-엔-2-온 합성

하기 반응식 2-1과 같이 p-아니스알데하이드와 2-부타논의 혼합물에 HCl용액을 적가하여 교반한 후 이를 NaOH로 중화시키고 수층을 디에틸에테르로 추출하였다. 추출물을 브라인으로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조한 후 감압 농축하고 칼럼크로마토그래피로 정제하여 (E)-4-(4-메톡시페닐)-3-메틸부트-3-엔-2-온을 합성할 수 있다:

[반응식 2-1]

2-2) (3 E )-4-(4- 메톡시페닐 )-3- 메틸부트 -3-엔-2-온 옥심 합성

하이드록시아민 하이드로클로라이드의 메탄올 용액에 무수 아세트산 나트륨을 넣은 혼합물을 교반하며 상기 반응식 2-1을 통해 얻은 (E)-4-(4-메톡시페닐)-3-메틸-부트-3-엔-2-온의 메탄올 용액을 적가한 후 반응시켰다. 혼합물에 물을 넣고 여과한 후 잔류물을 물로 세척하고 수분을 감압 건조 시켜 하기 반응식 2-2와 같이 (3E)-4-(4-메톡시페닐)-3-메틸부트-3-엔-2-온 옥심을 얻을 수 있다:

[반응식 2-2]

2-3) 5-(4- 메톡시페닐 )-3,4- 디메틸이속사졸 합성

하기 반응식 2-3과 같이, 상기 반응식 2-2를 통해 얻은 3E)-4-(4-메톡시페닐)-3-메틸부트-3-엔-2-온 옥심의 클로로포름 용액에 이산화망간을 넣고 환류 반응시켰다. TLC로 반응의 종결을 확인하고 클로로포름으로 희석하여 여과한 후 여액을 감압 농축하였다. 그 후 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 5-(4-메톡시페닐)-3,4-디메틸이속사졸을 합성할 수 있다:

[반응식 2-3]

2-4) 5-(3,4- 디메틸이속사졸 -5-일)-2- 메톡시벤젠 -1- 설포닐 클로라이드 합성

하기 반응식 2-4와 같이, 상기 반응식 2-3을 통해 얻은 5-(4-메톡시페닐)-3,4-디메틸이속사졸에 염화설폰산을 첨가하여 교반한 후 EtOAc로 희석하고 물과 브라인으로 세척하였다. 세척물을 무수 MgSO₄로 건조한 후 여과하여 여액을 감압 농축해 원하는 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체를 합성할 수 있다:

[반응식 2-4]

3. 5-(4- 메톡시페닐 ) 이속사졸을 이용한 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 합성

3-1) 5-(4- 메톡시페닐 ) 이속사졸 합성

하기 반응식 3-1과 같이, 테트라하이드로푸란에 수소화나트륨과 포름산 에틸을 넣은 현탁액에 4-메톡시 아세토페논을 0℃에서 천천히 적가한 후 상온에서 교반하였다. 이 후 물로 반응을 종결하고 수층을 에틸 아세테이트로 세척하였다. 세척한 수층에 하이드록시 아민 하이드로클로라이드를 추가하여 상온에서 교반하였고 2N HCl로 산성화하고 다이클로로메탄으로 추출하여 브라인으로 세척하였다. 세척물을 무수 MgSO₄로 건조하고 여액을 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 5-(4-메톡시페닐)이속사졸을 합성할 수 있다:

[반응식 3-1]

3-2) 5-(3- 클로로설포닐 -4- 메톡시페닐 ) 이속사졸 합성

하기 반응식 3-2와 같이, 상기 반응식 3-1을 통해 얻은 5-(4-메톡시페닐)이속사졸에 염화설폰산을 첨가하여 60℃에서 교반한 후 잔사를 에틸 아세테이트로 희석하고 물과 브라인으로 세척하였다. 세척물을 무수 MgSO₄로 건조하고 여액을 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 원하는 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체를 얻을 수 있다:

[반응식 3-2]

본 발명에 따른 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체는 공지의 방법에 의해 상응하는 염으로 제조할 수 있다. 이러한 염은 독성이 없는 수용성의 것이 바람직하다. 바람직한 염으로는 칼륨, 나트륨 등 등과 같은 알칼리 금속의 염; 칼슘, 마그네슘 등과 같은 알칼리토류 금속의 염; 그리고 테트라메틸 암모늄, 트리에틸아민, 메틸아민, 디메틸아민, 시클로펜틸아민, 벤질아민, 페네틸아민, 피페리딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리스(히드록시메틸)아민, 라이신, 아르기닌, N-메틸-D-글루카민 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 아민의 염을 들 수 있다.

본 발명에 사용되는 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체는 공지의 방법에 의해 상응하는 산 부가염으로 제조할 수 있다. 이러한 산 부가염은 독성이 없는 수용성인 것이 바람직하다. 바람직한 산 부가염으로는 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 황산염, 인산염 및 질산염과 같은 무기산염, 또는 아세트산염, 젖산염, 주석산염, 옥살산염, 푸마르산염, 말레인산염, 구연산염, 벤조산염, 메탄술폰산염, 에탄술폰산염, 벤젠술폰산염, 톨루엔술폰산염, 이세티온산염, 글루쿠론산염 및 글루콘산염과 같은 유기산염을 들 수 있다.

본 발명의 사용되는 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 공지의 방법에 의해 수화물로 제조할 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 처리에 의해 SEAP 활성이 유의성 있게 증가하며, 도 4와 도 5에 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 처리에 의해 miRNA 중에서도 특이적으로 miRNA-31의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 마이크로RNA-31 관련 질환은 암질환이며, 특히 상기 암질환은 폐암, 식도 편평세포암, 결장암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 "치료"는 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.

상기 약학조성물은 약학적으로 유효한 양의 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 자가 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 의미한다.

본 발명에 따른 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그 염은 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.01 내지 30.0 중량부로 포함될 수 있다. 상기 함량이 0.01 중량부 미만일 경우에는 대식세포 탐식억제 효과가 미미하며, 30.0 중량부를 초과할 경우에는 사용량에 따른 효과의 개선이 미미한 문제가 야기될 수 있다.

본 발명에 따른 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약학조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있으며, 제형은 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제, 또는 액제 등의 형태일 수 있으며 특정 제형에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학조성물은 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 경구, 경피, 피하, 정맥, 근육, 직장, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있고, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그 염은 50% 치사량(LC₅₀)이 2 g/kg 이상으로 안전성이 확보된 안전한 화합물이다.

본 발명에 따르면, 도 1과 같이 SEAP 리포터 구조체는 SEAP 유전자의 다운스트림에서 miRNA-31 상보적 서열을 포함하며, 성숙한 miRNA-31의 존재는 SEAP 발현 감소를 야기하는 반면, 저분자 화합물에 의한 miRNA-31의 억제는 SEAP 활성을 증가시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 암질환 의심 환자로부터 얻은 혈액 시료에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 상기 후보 화합물이 처리된 혈액 시료 중 분비형 알칼라인 포스파타제(secreted alkaline phosphatas; SEAP) 활성을 분석하는 단계를 포함하는 마이크로RNA-31 조절제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 마이크로RNA-31 조절제 스크리닝 방법에 있어서, 후보 화합물 처리에 의해 SEAP 활성이 증가하면 후보 화합물이 miRNA-31 억제 활성이 있는 것으로 평가할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 합성

< 실시예 1-1> 벤젠설포닐 클로라이드와 테트라부틸암모늄 황산수소염을 이용한 설폰 아마이드 유도체 합성.

하기 반응식 1과 같이 벤젠설포닐 클로라이드(20 mg, 0.07 mmol)과 각각의 아민(인돌, 3-메틸-1H-인돌, 2-메틸-1H-인돌, 3,4-디하이드로이소퀴놀린, 0.084 mmol, 1.2 equiv)을 벤젠(1 mL)에 용해시킨 용액에 테트라부틸암모늄 황산수소염(2.4 mg, 0.007 mmol)과 50% NaOH 수용액(1 mL)을 첨가하였고, TLC(EtOAc : n-hexane = 1 : 4)를 통해 더 이상 출발물질이 관찰되지 않을 때까지 대기 중에서 격렬하게 교반하였다. 상기 반응혼합물을 EtOAc 및 물로 희석시킨 후, 얻어진 유기층을 물과 염수로 세정하고, MgSO₄로 건조하며, 진공 하에서 농축하였다. 잔류물을 실리카겔 상에서 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/n-헥산/CH₂Cl₂=1:10:0.5) 정제하여 원하는 화합물을 합성하였다.

[반응식 1]

¹H NMR 및 ¹³C NMR 분석은 JEOL JNM-LA 300(300MHz), JEOL JNM-GCX(400MHz) 또는 BRUKER AMX-500(500MHz) 분석기를 사용하였다. 질량 분석 및 HRMS는 VG Trio-2 GC-MS와 JEOL JMS-AX로 각각 수행하였다.

1. 5-(3-( 인돌인 -1- 일설포닐 )-4- 메틸페닐 )-3,4- 디메틸이속사졸 [5-(3-( Indolin -1- ylsulfonyl )-4-methylphenyl)-3,4-dimethylisoxazole] (화합물 1)

¹H-NMR (500 MHz, CD₂Cl₂) δ 8.13(d,1H,J = 1.7 Hz), 7.79 (dd, 1H, J = 1.8, 8.0 Hz), 7.44 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.38 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.19-7.18 (m, 1H), 7.13 (t, 1H, J = 7.8 Hz), 6.99 (t, 1H, J = 7.5 Hz), 4.04 (t, 2H, J = 8.5 Hz), 3.07 (t, 2H, J = 8.5 Hz), 2.64 (s, 3H), 2.24 (s, 3H), 2.00 (s, 3H);

¹³C-NMR (CDCl₃,75MHz) δ 162.2, 161.2, 142.2, 139.1, 138.2, 133.6, 131.0, 130.4, 127.8, 126.9, 126.4, 125.3, 123.6, 114.4, 110.0, 49.9, 27.9, 20.7, 10.2, 7.9;

LRMS (FAB) m/z 369 (M+H⁺);

HRMS (FAB) calcd for C₂₀H₂₁N₂O₃S (M+H⁺): 369.1267; found 369.1263.

2. 3,4-디메틸-5-(4- 메틸 -3-((3- 메틸 -1 H -인돌-1-일) 설포닐 ) 페닐 ) 이속사졸 [3,4- Dimethyl -5-(4- methyl -3-((3- methyl -1 H - indol -1- yl ) sulfonyl ) phen

yl ) isoxazole ] (화합물 2)

¹H-NMR (400 MHz, CD₂Cl₂) δ 7.78-7.73 (m,3H), 7.55-7.53 (m,1H), 7.39-7.37 (m,2H), 7.28-7.23 (m,2H), 2.62 (s,3H), 2.28 (s,3H), 2.20 (s,3H), 1.86 (s,3H);

¹³C-NMR (CDCl₃,75MHz) δ 161.8, 161.1, 138.6, 138.6, 135.3, 133.6, 131.3, 131.0, 127.1, 125.5, 124.8, 123.6, 123.2, 119.6, 117.6, 113.4, 110.1, 20.4, 10.2, 9.7, 7.7;

LRMS (FAB) m/z 381 (M+H⁺);

HRMS (FAB) calcd for C₂₁H₂₁N₂O₃S (M+H⁺): 381.1267; found 381.1270.

3. 5-(3-((1 H -인돌-1-일) 설포닐 )-4- 메틸페닐 )-3,4-디메틸이속사졸[5-(3-((1 H - Indol -1-yl)sulfonyl)-4-methylphenyl)-3,4-dimethylisoxazole] (화합물 3)

¹H-NMR (400 MHz, CD₂Cl₂) δ 7.87 (d, 1H, J = 1.3 Hz), 7.78-7.74 (m, 2H), 7.65 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 7.61-7.59 (m, 1H), 7.37, (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.27-7.21 (m, 2H), 6.74 (d, 1H, J = 3.6 Hz), 2.60 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 1.92 (s, 3H);

¹³C-NMR (CDCl₃, 75MHz) δ 161.8, 161.2, 138.6, 138.3, 134.8, 133.7, 131.2, 130.4, 127.2, 126.9, 125.8, 124.7, 123.5, 121.6, 113.2, 110.2, 108.1, 20.2, 10.1, 7.7;

LRMS (FAB) m/z 367 (M+H⁺);

HRMS (FAB) calcd for C₂₀H₁₉N₂O₃S (M+H⁺): 367.1111; found 367.1114.

4. 3,4-디메틸-5-(4- 메틸 -3-((2- 메틸 -1 H -인돌-1-일) 설포닐 ) 페닐 ) 이속사졸 [3,4- Dimethyl -5-(4-methyl-3-((2-methyl-1 H -indol-1-yl)sulfonyl)phenyl)isoxazole] (화합물 4)

¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8.05-8.03 (m, 1H), 7.80 (dd, 1H, J = 1.6, 7.9 Hz), 7.56-7.54 (m, 1H), 7.52-7.50 (m, 1H), 7.41 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.35 (d, 1H, J = 1.4 Hz), 7.33-7.27 (m, 2H), 2.57 (s, 3H), 2.49 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 1.73 (s, 3H);

¹³C-NMR (CDCl₃, 75MHz) δ 161.6, 161.2, 139.4, 138.6, 135.8, 133.8, 132.9, 131.1, 127.3, 127.0, 125.4, 124.4, 124.2, 118.3, 114.6, 112.8, 110.3, 20.1, 12.4, 10.1, 7.5.

5. 5-(3-((3,4- 디하이드로퀴놀린 -1(2 H )-일) 설포닐 )-4- 메틸페닐 )-3,4- 디메틸이속사졸 [5-(3-((3,4- Dihydroquinolin -1(2 H )- yl ) sulfonyl )-4- methylphenyl )-3,4

- dimethylisoxazole ] (화합물 5)

¹H-NMR (500 MHz, CD₂Cl₂) δ 8.14 (d, 1H, J = 1.7 Hz), 7.79 (dd, 1H, J = 1.8, 8.0 Hz), 7.44-7.42 (m, 2H), 7.12-7.04 (m, 3H), 3.82-3.80 (m, 2H), 2.8 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 2.45 (s, 3H), 2.25 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.84-1.76 (m, 2H);

¹³C-NMR (CDCl₃, 75MHz) δ 162.3, 161.2, 139.7, 138.7, 137.1, 133.6, 130.3, 130.1, 129.3, 127.2, 127.0, 126.4, 124.9, 124.1, 110.1, 46.3, 26.6, 22.2, 20.5, 10.2, 8.0;

LRMS (FAB) m/z 383 (M+H⁺);

HRMS (FAB) calcd for C₂₁H₂₃N₂O₃S (M+H⁺): 383.1424; found 383.1425.

< 실시예 1-2> ( E )-4-(4- 메톡시페닐 )-3- 메틸 - 3뷰텐 -2-온을 이용한 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 합성

1)( E )-4-(4- 메톡시페닐 )-3- 메틸부트 -3-엔-2-온 합성

하기 반응식 2-1과 같이 p-아니스알데하이드(1217 μL, 10.0 mmol)와 2-부타논(996 μL, 10.0 mmol) 의 혼합물에 1,4-다이옥신(10mL)에 4.0 M HCl을 용해시킨 용액을 적가하여 12시간 교반한 후 차가운 2N-NaOH로 중화시킨 후 수층을 디에틸에테르(50mL)로 3번 추출하였다. 추출물을 브라인으로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조한 후 감압 농축하고 칼럼크로마토그래피(EtOAc:Hexane=1:15 → 1:12)로 정제하여 해당 화합물 (1341.7mg, 7.05mmol)을 얻었다.

[반응식 2-1]

¹H NMR, (300MHz, CDCl₃): δ 7.48 (s, 1H), 7.42 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.95 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H),2.45 (s, 3H),2.07 (s, 3H).

2)(3 E )-4-(4- 메톡시페닐 )-3- 메틸부트 -3-엔-2-온 옥심 합성

하이드록시아민 하이드로클로라이드(350.7mg, 5.05mmol)의 메탄올(3mL)용액에 무수 아세트산나트륨(414mg, 5.05mmol)을 넣은 혼합물을 30분간 교반하며 상기 반응식 2-1을 통해 얻은 (E)-4-(4-메톡시페닐)-3-메틸부트-3-엔-2-온(800mg, 4.2mmol)의 메탄올(2mL)용액을 적가한 후 60℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 혼합물에 물(20mL)을 넣고 여과한 후 잔류물을 물로 세척하고 수분을 감압 건조 시켜 하기 반응식 2-2의 화합물을 얻었다.

[반응식 2-2]

¹H NMR, (300MHz, CDCl₃): δ8.93 (s, 1H), 7.27 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.91 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.87 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.17 (s, 3H), 2.08 (s, 3H).

3)5-(4- 메톡시페닐 )-3,4- 디메틸이속사졸 합성

하기 반응식 2-3과 같이, 상기 반응식 2-2를 통해 얻은 3E)-4-(4-메톡시페닐)-3-메틸부트-3-엔-2-온 옥심(500mg, 2.44mmol)의 클로로포름(50mL) 용액에 이산화망간(423.6mg, 4.87mmol)을 넣고 3시간 동안 환류 반응시켰다. TLC로 반응의 종결을 확인하고 클로로포름으로 희석하여 여과한 후 여액을 감압 농축하였다. 그 후 칼럼 크로마토그래피(CAN : CHCl₃ = 1:40)로 정제하여 원하는 화합물((320 mg, 1.583 mmol)을 얻었다.

[반응식 2-3]

¹H NMR, (300MHz, CD₂Cl₂): δ 7.64 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 2.24 (s, 3H),2.13 (s, 3H).

4)5-(3,4- 디메틸이속사졸 -5-일)-2- 메톡시벤젠 -1- 설포닐 클로라이드 합성

하기 반응식 2-4와 같이, 상기 반응식 2-3을 통해 얻은 5-(4-메톡시페닐)-3,4-디메틸이속사졸에 염화설폰산을 첨가하여 교반한 후 EtOAc로 희석하고 물과 브라인으로 세척하였다. 세척물을 무수 MgSO₄로 건조한 후 여과하여 여액을 감압 농축해 원하는 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체를 합성할 수 있다.

[반응식 2-4]

5)5-(3-(3,4- 디하이드로이소퀴놀린 -2(1 H )- 일설포닐 )-4- 메톡시페닐 )-3,4- 디메틸이속사졸 (화합물 6)

하기 반응식 2-5와 같이, 상기 반응식 2-4를 통해 얻은 5-(3,4-디메틸이속사졸-5-일)-2-메톡시벤젠-1-설포닐 클로라이드(30mg, 0.1mmol)을 벤젠 1.5에 넣고 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린(14.0㎕, 0.12mmol)을 넣은 뒤 포타슘 카보네이트(15mg, 0.1mmol)와 50% NaOH in water(v/v)1.5 mL을 추가하여 상온에서 5시간 교반하였다. 잔사를 EtOAc로 희석하고 물과 브라인으로 세척하였다. 세척물을 무수 MgSO₄로 건조한 후 감압 농축하고 칼럼크로마토그래피(EtOAc:Hex:MC=1:3:0.5)로 정제하여 원하는 화합물 (20mg, 50%)을 얻었다(화합물 6).

[반응식 2-5]

¹H NMR, (600MHz, CDCl₃): δ8.32 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.87 (dd, J = 8.7 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.13-7.18 (m, 2H), 7.06-7.08 (m, 2H), 7.02 (d, J= 8.7 Hz, 1H), 4.58 (s, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.64 (t, 5.9 Hz, 2H), 2.76 (t, 5.9 Hz, 2H), 2.29 (s, 3H), 2.18 (s, 3H) ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃): δ162.47, 161.16, 157.23, 133.52, 132.61, 132.59, 129.74, 128.95, 127.98, 126.57, 126.34, 126.06, 121.42, 112.52, 109.24, 55.93, 47.14, 43.31, 28.57, 10.24, 8.15.

< 실시예 1-3> 5-(4- 메톡시페닐 ) 이속사졸을 이용한 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 합성

1) 5-(4- 메톡시페닐 ) 이속사졸 합성

하기 반응식 3-1과 같이 테트라하이드로푸란(5 mL)에 각각의 수소화나트륨(200mg, 5.0mmol)과 포름산 에틸(804.4㎕, 10.0mmol)을 넣은 현탁액에 4-메톡시 아세토페논(347.7㎕, 2.5mmol)을 0℃에서 천천히 적가한 후 상온에서 3시간 교반하였다. 이 후 물로 반응을 종결하고 수층을 에틸 아세테이트(EtOAc)로 세척하였다.

세척한 수층에 하이드록시 아민 하이드로클로라이드(173.7 mg, 2.5mmol)를 추가하여 상온에서 24시간 교반하였고 2N HCl로 산성화하고 다이클로로메탄으로 추출하여 브라인(brine)으로 세척하였다. 세척물을 무수 MgSO₄로 건조하고 여액을 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:5)로 정제하여 원하는 화합물(286.8mg, 65%)을 합성하였다.

[반응식 3-1]

¹H NMR, (300MHz, CDCl₃): δ 8.25 (d, J =1.9 Hz, 1H), 7.74 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.98 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.40 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H)

2) 5-(3- 클로로설포닐 -4- 메톡시페닐 ) 이속사졸 합성

하기 반응식 3-2와 같이, 상기 반응식 3-1을 통해 얻은 5-(4-메톡시페닐)이속사졸(257.3mg, 1.47mmol)에 염화설폰산(chlorosulfonic acid, 503㎕,7.34mmol)을 첨가하여 60℃에서 1시간 20분 교반한 후 잔사를 에틸 아세테이트(EtOAc)로 희석하고 물과 브라인으로 세척하였다. 세척물을 무수 MgSO₄로 건조하고 여액을 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex=1:2)로 정제하여 원하는 화합물(213mg,53%)을 얻었다.

[반응식 3-2]

¹H NMR, (300MHz, CDCl₃): δ8.34 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 8.32 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 8.14 (dd, J = 8.8 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.25 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.55 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 4.14 (s, 3H)

3)5-(3-(3,4,-디하이드로이소퀴놀린-2(1H)-일설포닐)-4-메톡시페닐)이속사졸 [5-(3-(3,4,-dihydroisoquinolin-2(1 H )-ylsulfonyl)-4-methoxyphenyl)isoxazole] (화합물 7)

하기 반응식 4와 같이, 상기 반응식 2-2를 통해 얻은 5-(3-클로로설포닐-4-메톡시페닐)이속사졸(30mg, 0.11mmol)을 벤젠 1.5ml에 넣고 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린(16.4㎕, 0.14mmol)을 넣은 뒤 포타슘 카보네이트(15mg, 0.10mmol)와 50% NaOH in water(v/v)1.5mL을 추가하여 상온에서 5시간 교반하였다. 잔사를 EtOAc로 희석하여 물과 브라인으로 세척한 후 무수 MgSO₄로 건조하였다. 건조한 여액을 감압 농축하고 칼럼 크로마토그래피(EtOAc:Hex:MC=1:2:0.5)로 정제하여 원하는 화합물(27mg, 66%)을 얻었다(화합물 7).

[반응식 4]

¹H NMR, (600MHz, CDCl₃):δ8.37 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.30 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.97 (dd, J = 8.6 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.14-7.18 (m, 2H), 7.08-7.06 (m, 2H), 7.02 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.52 (d, 1.9 Hz, 1H), 4.58 (s, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.65 (t, 5.9 Hz, 2H), 2.76 (t, 5.9 Hz, 2H);

¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃): δ 167.64, 157.92, 150.97, 133.48, 132.55, 131.66, 129.39, 128.97, 128.38, 126.61, 126.37, 126.04, 120.09, 112.60, 98.58, 56.00, 47.12, 43.31, 28.55

< 실험예 1> 마이크 RNA -31 억제 활성 검토

1. 세포배양

HEK-293T 세포와 A549 세포를 10% FCS, 100 mg/ml 스트렙토마이신 및 100 U/ml 페니실린을 보강한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 또는 RPMI1640 배지에서 5% CO₂ 분위기 하 37℃에서 각각 배양하였다.

2. SEAP 반응계 구축 및 약물 스크리닝

HEK-293T 세포는 PEI(poly ethylene immine; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 hsa-miR-31 발현 벡터와 miR-31 타겟 서열을 함유한 SEAP 리포터 구조체로 함께 형질감염 시켰다. 상기 형질감염 후 24 시간에 형질감염된 세포를 수집하고, 96웰-플레이트 상에 2 x 10⁴cells/well의 농도로 분주하였다. 4-5 시간 후, 실시예 1에 따른 화합물들을 최종 농도 5 μM이 되도록 세포에 첨가하고, 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포 상등액에 SEAP 기질(p-nitrophenylphosphate; Sigma-Aldrich) 용액을 첨가한 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 화합물 1, 화합물 2 및 화합물 6의 처리에 의해 유의성있게 miR-31의 발현이 억제되었으며, 특히 유사한 화합물인 화합물 3 내지 화합물 5의 처리에 비해 탁월하게 우수한 miR-31의 발현 억제 활성을 나타내었다.

3. 실시간 RT - PCR 분석

6웰-플레이트 상에 A549 세포를 3 x 10⁵cells/well의 농도로 분주하고, 5 μM의 화합물을 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 세포를 수집하고 1 mL의 TRI 시약(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)에서 재현탁시켜 총 RNA를 분리하였다. miScript 역전사 키트(QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 이용하여 총 RNA 1 ㎍을 cDNA로 전사시켰다. 이렇게 합성된 cDNA 0.5 ㎕를 각각 20 μl PCR 반응계에 사용하였고, 2x miScript SYBR Green PCR Kit (QIAGEN)를 사용하였다. 이때 다음과 같은 열사이클링 조건 하에서 증폭시켰다. 즉, iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 95℃에서 15분, 그후 94℃에서 15초, 55℃에서 30초 및 70℃에서 30초의 40주기로 증폭시켰다. 유전자 발현은 RNU6B 발현으로 노말화 하였고, miR-16, miR-21, miR-31 및 miR-155 검출용 miRNA 특이적 프라이머는 QIAGEN (miScript primer assay)로부터 구매하였다.

그 결과, 도 4와 같이 화합물 1, 화합물 2 및 화합물 6의 처리에 의해 다른 miRNA종에 비해 특이적으로 miR-31의 발현이 억제되므로, 이들 화합물들은 특이적으로 miR-31의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다.

또한 도 5와 같이 화합물 7의 처리를 하였을 시 56%의 miR-31 발현량을 보이므로, 화합물 7이 특이적으로 miR-31의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다.

< 실험예 2> 독성 실험

웅성 Balb/c 마우스에 화합물 1을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 각각 현탁하여 0.5g/kg, 1g/kg 및 2g/kg의 용량으로 1회 단회 경구투여하고 7일간 마우스의 생존율 및 체중을 조사하였다.

이러한 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과, 본 발명의 화합물 1은 마우스에서 2g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며, 따라서, 경구 투여 중간치사량(LD50)은 2g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명에 따른 화합물 1을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 산제의 제조

화합물 1 5 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

화합물 1 5 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 3> 캅셀제의 제조

화합물 1 5 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 4> 주사제의 제조

화합물 1 2 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 혼합한 후 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물 및 화학식 4의 화합물로 이루어진 군에서 선택된 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]
청구항 1에 있어서, 상기 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 마이크로RNA-31 조절제인 것을 특징으로 하는 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 화학식 3의 화합물 및 화학식 4의 화합물로 이루어진 군에서 선택된 이속사졸릴페닐설폰아마이드 유도체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]
삭제
청구항 3에 있어서, 상기 암질환은 폐암, 식도 편평세포암, 결장암 및 난소암으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물.
암질환 의심 환자로부터 얻은 혈액 시료에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 상기 후보 화합물이 처리된 혈액 시료 중 분비형 알칼라인 포스파타제(secreted alkaline phosphatas; SEAP) 활성을 분석하는 단계를 포함하는 마이크로RNA-31 조절제 스크리닝 방법.