KR101499299B1 - Ｓｈａｎｋ2 유전자가 결실된 자폐증 모델 형질전환마우스 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Shank2 유전자가 결실되고 NMDA 수용체의 기능이 저하된 것을 특징으로 하는 자폐증 모델 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 Shank2 유전자의 결실로 인하여 자폐증의 임상적 특징을 나타내는 형질전환마우스를 획득할 수 있고, 자폐증 치료제 후보물질을 선별하는 데 사용할 수 있어 유용하다.

Description

ＳＨＡＮＫ2 유전자가 결실된 자폐증 모델 형질전환마우스 및 그 용도{Autism model mouse by Shank2 gene deletion and the use thereof}

본 발명은 Shank2 유전자가 결실되고 NMDA 수용체의 기능이 저하된 것을 특징으로 하는 자폐증 모델 형질전환체에 관한 것이다.

자폐증(Autism, Autism Spectrum Disorder)은 사회적 상호작용과 언어 및 의사소통의 장애를 나타내고 기분과 정서의 불안정성을 나타내며 많은 경우 인지 발달의 저하를 수반하는 발달장애이다. 자폐증은 한 종류의 발달 장애를 지칭하는 용어가 아니라 넓은 범주에서 여러가지 특징적인 증상들을 공유하는 질환을 넓은 의미에서 지칭하는 용어이기 때문에 전반적 발달 장애라고도 한다. 최근들어 자폐증이 나라별 유병률이 증가하는 추세에 있고 이로 인한 사회, 경제적 비용의 증가와 환자 가족들의 삶의 질 저하라는 측면에서 원인 규명 및 치료제 개발에 대한 연구의 필요성이 더욱 커지고 있다. 자폐증의 원인에 대하여 여러 가지 위험 인자들이 연구되어 왔고 대표적으로 유전적 소양, 바이러스 감염, 신진대사의 이상, 양육 방식 등을 포함한 기타 환경적 요인들이 위험 요소 및 원인으로 알려져 왔으나 여태까지 발병 원인에 대한 구체적인 증거는 부족한 실정이다.

최근들어, 자폐증의 유전적 요인에 대한 동물실험 모델에서의 연구가 활발히 진행되고 있고 자폐증 환자들을 대상으로 한 유전자 연구를 통해 자폐증과 밀접하게 관련되어 있을 것으로 여겨지는 여러 유전자들이 밝혀지고 있다. 자폐증의 경우 다른 정신질환들에 비해서 상대적으로 높은 유전율을 보여주고 있기 때문에 자폐증의 유전적 요인에 대한 이러한 연구들은 자폐증의 생물학적 요인들에 대한 이해를 넓히고 보다 효과적인 치료제 개발을 위하여 중요하다. Shank2 단백질은 흥분성 신경 시냅스에 풍부하게 존재하는 scaffolding 단백질이며, 신경세포 수상돌기에서 다른 여러 단백질들과 상호작용하면서 시냅스의 신호전달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 자폐증 환자에게서 Shank2 유전자의 변이가 발견된다는 보고들이 발표되면서 Shank2 유전자가 자폐증과 관련되어 있을 가능성이 크게 대두되었다.

이에 본 발명자들은 자폐증의 발병 원인을 명백히 밝혀내고자 예의 노력한 결과, Shank2 유전자를 결실시킨 형질전환마우스에서 자폐증의 임상적 특징이 나타남을 확인하였다.

본 발명의 목적은 Shank2 유전자가 결실되고 NMDA 수용체의 기능이 저하된 것을 특징으로 하는 자폐증 모델 형질전환마우스를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Shank2 유전자가 결실되고 NMDA 수용체의 기능이 저하된 것을 특징으로 하는 자폐증 모델 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 다른 구체예에서, (a) Shank2 유전자가 결실된 자폐증 유발용 형질전환벡터를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환벡터를 마우스의 수정란에 도입하여 NMDA 수용체의 기능이 저하된 마우스를 생산하는 단계를 포함하는 자폐증 모델 형질전환체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 구체예에서, (a) 상기 자폐증 모델 형질전환체에 피검 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계; (b) 상기 피검 화합물 또는 조성물이 처리된 형질전환체(실험군)와 피검 화합물 또는 조성물을 미처리한 형질전환체(대조군)로부터 각각 자폐증 증상을 측정하는 단계; 및 (c) 대조군에 비하여 실험군에서 자폐증 증상이 감소된 피검화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 자폐증 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, Shank2 유전자의 엑손 6 및 7 영역이 결실된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환체는 마우스인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 형질전환체는 자폐증의 임상적 특징인 사회성 결핍 행동, 의사소통 장애 행동, 반복행동 및 과잉행동으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 증상을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피검화합물 또는 조성물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 구체예에서, NMDA 수용체에 대한 아고니스트를 포함하는 자폐증 치료용 약학조성물 및 대사성 글루타메이트 수용체 5(mGluR5)에 대한 양성 알로스테릭 조절자를 포함하는 자폐증 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 NMDA 수용체에 대한 아고니스트는 D-알라닌, D-세린, D-사이클로세린, 메만틴, 케타민, 아미노아다만탄, 네라멕산, 리만타딘 및 아만타딘으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 대사성 글루타메이트 수용체 5(mGluR5)에 대한 양성 알로스테릭 조절자는 CDPPB인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용된 D-사이클로세린 이외에도 다른 NMDAR 아고니스트 역시 자폐증 치료 효과를 나타낼 수 있다. 예를 들어, NMDAR 글리신 위치 partial 아고니스트인 GLYX-13은 자폐증에 대한 치료 효과를 나타내고(Moskal et al. Neurosci Biobehav Rev 35, 1982-8 (2011)), D-cycloserine는 자폐증 치료제 임상 3 단계 중에 있다(Spooren et al. Trends in Pharmacological Sciences 33, 669-84 (2012)).

본 발명에서는 mGluR5에 대한 양성 알로스테릭 조절자로 CDPPB를 사용하여 그 효과를 확인하였으나, 이에 한정되지 않고 DFB, CPPHA, ADX47273, MPPA, VU0092273, VU0360172 등을 포함할 수 있다(Cleva and Olive, Molecules 16, 2097-106 (2011)).

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중), 0.01-80 mg/kg(체중), 0.1-60 mg/kg(체중)일 수 있다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명에 따르면 Shank2 유전자의 결실로 인하여 자폐증의 임상적 특징을 나타내는 형질전환마우스를 획득할 수 있고, 자폐증 치료제 후보물질을 선별하는 데 사용할 수 있어 유용하다.

도 1은 Shank2 ^-/- 마우스의 자폐증과 유사한 손상된 사회적 상호작용, 사회적 소통 및 반복 점핑 행동을 나타내는 것을 확인한 것이다.
도 2는 Shank2 ^-/- 마우스에서 손상된 NMDAR-의존적 시냅스 가소성을 나타낸 것이다.
도 3은 D-사이클로세린이 Shank2 ^-/- 마우스에서 NMDAR의 기능을 회복시키고 사회적 상호작용을 향상시키는 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 CDPPB가 Shank2 ^-/- 마우스에서 NMDAR의 기능을 회복시키고 사회적 상호작용을 향상시키는 결과를 나타낸 것이다.

Shank2 ^-/- 마우스의 생산

표적 벡터는 Shank2 유전자의 ~3.1 kb 단편을 양성 선별마커(MC1 프로모터 및 네오마이신 내성유전자)로 대체하도록 설계되었다. 또한, 음성 선별마커(티미딘인산화효소 유전자 유래의 HSV-1 프로모터)가 비상동 재조합에 대한 선별을 위해 구조체에 첨부되었다. Shank2 (엑손 번호는 Shank2b [NM_001113373]의 cDNA 서열에 의해 지정되었음)의 PDZ 도메인에 상응하는 엑손 6 및 엑손 7을 제거하기 위하여, 5'- 및 3'- 플랭킹(flanking) DNA 서열이 올리고뉴클레오티드 프라이머 두 쌍을 이용한 PCR에 의해 129/SvJ 마우스 유전자의 게놈 DNA로부터 분리되었다. Shank2 엑손 6의 5' 영역에서 유래한 7.3 kb NotI - SalI 단편은 표적 벡터의 레프트 암(left arm)으로 사용되었다: 정방향 프라이머( NotI ) 5'-AAG GAA AAA AGC GGC CGC ACC CAG GAA CTG GGA ACC AGT AAC TGC TGA GAT CCT AGA GGC CAG TGG ATG GCC ATG TGT G-3' ; 역방향 프라이머 ( SalI ) 5'-TTC CGC GGC CGC TAT GGC CGA CGT CGA CAT TTC AGT CCT ACC AGA GCC AAG GAG GGC AGC GGC TCC CT-3' Shank2 엑손 7의 3' 영역에서 유래한 2.7 kb XhoI - NheI 단편은 표적 벡터의 라이트 암(right arm)으로 사용되었다: 정방향 프라이머( XhoI ) 5'-CCG CTC GAG AAA GCA GGA TAA TGT TGG TCA TTT GAG GAG TCT TCT TGT GTG CAA GTG TTG GTG TCT GTG AAC GTC ACC TGC GGG TTG TAT GTT GGT GCC AGT GAG GAA-3' 역방향 프라이머( NheI ) 5'-CTA GCT AGC CCT AAG CGA TTT AGT CTA ACA GCC ATG GAC AAA GCC TTT ACT ATA TAG TGT AAG CAT GGA GTG CTG CTC TCA AGT CTC AA-3'. 5'-롱 암(long arm) 및 3'-숏 암(short arm) 단편은 pOsdupdel 플라스미드에 서브클로닝되었다. 표적 벡터는 NotI으로 선형화(linearize)하고 129/SvJ 쥐 J1 배아줄기세포에 전기천공법(electroporation)을 시켰다. G418 및 간시클로비르(gancyclovir)에 저항성인 클론을 선택하고, 상동 재조합을 서던 블로팅으로 확인하였다. Shank2 유전자는 선별된 210개 클론 가운데 6개에서 변형되었다.

표적 돌연변이를 함유하는 세 개의 클론들이 C57BL/6N 배반포로 주입되고, 그 후 가임신상태의 위탁모에게로 이동되었다. 그 결과 얻은 수컷 키메릭 마우스는 이형 접합적 Shank2(Shank2 ^+/-)마우스를 얻기 위하여 C57BL/6N 암컷 마우스로 교배시켰다. 돌연변이 대립유전자의 생식계열 전달은 아구티 털 색깔을 가진 F1 자손의 꼬리 DNA에 대한 서던 블로팅에 의해 증명되었다. 이형접합적 마우스 간의 교배는 동형접합적 Shank2 유전자 결실된 마우스(Shank2 ^-/-)를 생산하도록 수행되었다. 마우스에서 Shank2 유전자 결실을 최초로 확인한 후에, Shank2 ^+/- 마우스는 5 세대 이상 동안 C57BL/6 마우스에 대한 역교배로 생산 및 유지되었다. 마우스는 연세의료원 및 KAIST, 서울대학교 동물연구 조건에 따라 생산 및 유지되었고, 모든 절차는 연세의료원(프로토콜 번호 09-127) 및 KAIST(KA2010-18), 서울대학교(SNU-110809-1)의 동물연구 위원회에 의해 승인되었다. 마우스는 자유식으로 먹이고 12 시간 빛 사이클로 사육하였다. 행동실험을 위해 헤테로 x 헤테로 번식과 엄격한 sex-matched 대조군을 사용하였다.

Shank2 ^-/- 마우스의 특징( Characterization )

서던 블로팅 분석을 위해 J1 배아 줄기세포와 마우스로부터 수득한 게놈 DNA는 녹아웃 벡터의 3'- 숏 암의 바로 바깥 영역을 덮는 프로브에 의해 스크리닝되었다. 947bp의 서던 프로브는 올리고뉴클레오티드 프라이머(5'- CAC AGA GTG CCA GGA ATT CTG-3', 5'-TGG AGG GAG CAG TAG TAT TGG-3')를 이용한 PCR에 의해 생산되었다. 야생형 및 돌연변이 마우스 대립유전자는 지노타이핑 올리고뉴클레오티드 프라이머 두 쌍에 의해 확인되었다: 야생형, 5'-GCT AGC ATG ACG TGT GTT GTG-3', 5'-CCG ACT GCA TCT GCG TGT TC- 3' (PCR product size: 525 bp); Shank2 ^-/-, 5'- CCA CTG CAT CTG CGT GTT C-3', 5'- CCG ACT GCA TCT GCG TGT TC-3' (PCR 산물 크기: 591 bp).

RNA 추출, cDNA 합성, RT - PCR , 및 정량적 real - time PCR

전체 RNA는 야생형 및 Shank2 ^-/- 마우스의 췌장 및 뇌 조직으로부터 추출하였다. 정제된 RNA 샘플은 iScript^TM Select cDNA 합성 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 역전사하였다. RT-PCR 검출법에 사용된 프라이머는 프라이머 1 (엑손 6 센스: GAC AAG ACG GTG GTC CTG), 프라이머 2 (엑손 7 센스 TGC AGT ACC TGG AGT CCG), 및 프라이머 3 (엑손 12 안티센스: GGA CCG TGG GCG TCA TTA)이다. 엑손 번호는 Shank2b (NM_001113373)에 기초하고 있다. 42℃에서 60분 동안 역전사를 하고, 뒤이어 PCR 30회 수행하였다. PCR 산물은 2% 아가로스 겔에서 브롬화 에티듐으로 염색하여 시각화하였다. 정량적 RT-PCR은 TaqMan Gene Expression Assay Kit(Applied Biosystems)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 수행되었다. 간단히, 1 mL의 cDNA를 2배 농축의 TaqMan Universal Master Mix 10 mL 및 20배 농축의 TaqMan Gene Expression Assay 1 mL와 혼합하고, RNase-free water와 함께 총 부피 20 mL가 되었다. 표적 증폭은 StepOnePlus^TM Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 이용하여 96-웰 플레이트에서 수행되었다. Shank2 (Mm01163746_mH 및 Mm01163737_m1) 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로제네이즈(Gapdh) (Mm99999915_g1)에 대한 TaqMan 프로브는 Applied Biosystems에서 구입하였다. Mm01163746_mH 프로브는 엑손 3-4을 인식하고, 반면에 Mm01163737_m1은 엑손 15-16을 인식한다. PCR 온도 사이클링 조건은 AmpliTaq Gold DNA 중합효소를 활성화시키는 데 95℃에서 초기 10분, 뒤이어 변성(95?에서 15초) 40회 및 어닐링/프라이머 연장(60℃에서 15초)이 이루어졌다. 모든 샘플은 3중으로 수행되었다. 상대적인 RNA 발현 수준은 대조군으로 Gapdh을 사용하여 상대적인 threshold cycle(C_t) 방법을 통해 계산되었다:?t=Ct(Gapdh)-C_t(Shank2). Gapdh로 표준화되고 대조군 샘플에 대해 상대적인 유전자 발현의 폴드 변화(fold change)는 2^{-컴 Ct}로 계산되었다.

홈 케이지 안에서의 사회적 상호작용 분석

2-4 개월된 외래 마우스를 투명한 플라스틱 장치(15×8×12 cm) 안에 위치시켰다. 처음에는, 외래 마우스가 없는 비어있는 장치를 시험 마우스(야생형 또는 Shank2 ^-/- 마우스)의 홈 케이지 내에 놓았다. 시험 마우스가 용기를 자유 탐구한 지 10분 후에 외래 마우스를 장치 안에 넣고, 10분 동안 외래 마우스를 탐구하도록 하였다. 탐구는 야생형 또는 Shank2 ^-/- 마우스가 외래 마우스의 냄새를 맡기 위해 시도하거나 외래 마우스에게 코를 향하고 가까이 다가가는 경우로 정의하였다. 실험 및 분석은 블라인드 방식으로 독립적인 연구자에 의해 수행되었다.

3- 챔버 사회적 상호작용 분석

3-챔버 사회적 상호작용 분석은 세 가지 단계로 구성된다. 첫 번째 단계에서, 야생형 또는 Shank2 ^-/- 마우스는 왼편 또는 오른편(중앙이 아닌) 챔버에 두 개의 작은 용기가 있는 3-챔버 장치 안에 위치시키고, 둔감화를 위해 10분 동안 자유롭게 주위환경을 탐구하도록 하였다. 10분 후, 야생형 또는 Shank2 ^-/- 마우스를 중앙 챔버로 유도하고 중앙 챔버의 두 출입문을 차단하였다. 한편, 생기없는 물체(inaminate object:Object)과 외래 마우스1(stranger 1)는 두 개의 용기에 위치시켰다. 그 후, 두 출입문을 열어 중앙에 있는 마우스가 10분 동안 자유롭게 새로운 주위환경을 탐구할 수 있도록 하였다. 세 번째 단계에서, 시험 마우스는 출입문을 봉쇄하고 다시 중앙 챔버로 유도되었다. 상기 물체는 외래 마우스 2(stranger 2)로 치환시키고, 뒤이어 시험 마우스가 10분 동안 외래 마우스 1 및 2를 탐구할 수 있도록 하였다. 탐구는 야생형 또는 Shank2 ^-/- 마우스가 물체/외래 마우스의 냄새를 맡기 위해 시도하거나 물체/외래 마우스에게 코를 향하고 가까이 다가가는 경우로 정의하였다. 각 챔버에서의 소요된 시간은 Ethovision 3.1 program (Noldus)으로 측정되었다. 개개의 움직임 발자국은 Ethovision으로 분석되었고 열지도를 만들기 위해 ImageJ로 변형되었다. 챔버 또는 탐구에 소요된 시간에 추가하여, 목표물(Stranger 1 vs. Object 또는 Stranger 2 vs. Stranger 1)에 대한 탐구 시간 퍼센트의 차이를 나타내는 선호 지수를 사용하였다(Wang, X. et al. Hum Mol Genet 20, 3093-108 (2011)).

후각 기능 시험

본 실험은 이전 연구를 토대로 수행되었다(Yang, M. & Crawley, J.N., Curr Protoc Neurosci Chapter 8, Unit 8 24 (2009)). Kim-wipes는 물 또는 비사회적 신호(바나나 및 커피) 20 ml로 적셨다. 사회적 신호를 얻기 만들어내기 위하여, 일부의 Kim-wipes를 실험 이틀 전 외래 마우스의 케이지에 도입하였다. 와이퍼는 실험 바로 직전에 외래 마우스의 케이지에서 제거되고 사회적 신호로 사용되었다. 이와 같은 사회적 및 비사회적 신호는 구멍이 있는 작은 둥근 모양의 페트리접시에 담겨졌다. 야생형 또는 Shank2 ^-/- 마우스를 실험 전 30분 동안 도입하였다. 물, 비사회적 신호 및 사회적 신호를 각 6분 동안 야생형 또는 Shank2 ^-/- 마우스의 홈 케이지안에 연속하여 도입하였다. 각 시간이 지난 후에 홈 케이지로부터 신호를 제거하고 시간 간격은 1분으로 하였다. 신호가 담겨있는 페트리접시를 향한 냄새를 맡는 행동을 블라인드 방식으로 측정하였다.

모리스 수조미로 실험( Morris water maze assay )

마우스는 직경 120cm의 하얀색 플라스틱 탱크 안에 직경 10cm의 숨겨진 플랫폼을 찾아내도록 훈련되었다. 마우스는 1 시간 간격으로 하루에 3번 도전하였다. 훈련은 6일간 연속으로 수행되었고, 프로브 시험은 7일째 날(마지막 훈련 시간 이후 24시간) 수조에서 제거된 플랫폼으로 1분 동안 수행되었다. 수조의 네 개의 사분면(T:표적, O:반대, L:왼편, R:우편)에서 소요된 시간의 퍼센트, 플랫폼 영역에 대한 정확한 교차 숫자, 및 수영 속도가 Ethovision 3.1 program (Noldus)로 평가되었다.

신규 물체 탐색 분석( Novel object recognition assay )

신규 물체 탐색 시험은 오픈필드 장치에서 수행되었다. 샘플 단계에서, 마우스는 10분 동안 두 가지 동일한 물체를 탐구하도록 하였다. 실험 단계에서 두 가지 물체 중 하나가 새로운 물체로 교체된 시험 단계는 24시간 후에 수행되었고, 두 물체에 대한 탐구 시간이 측정되었다. 물체 탐구는 마우스의 코가 물체에 닿거나 물체를 향하고 물체의 2cm 이내로 들어오는 경우로 정의되었다.

Ultrasonic vocalization ( USV )

수컷 마우스에서 구애 USV를 유도하기 위하여, 암컷 마우스를 수컷 마우스가 있는 케이지 안으로 도입하였다. USV 기록은 12주령 수컷 마우스로 수행하였다. 각 수컷 마우스는 구애 USV를 녹음하기 전 적어도 3일 동안 투명한 아크릴 홈 케이지 안에 격리시켰다. 녹음하는 날, 수컷 마우스는 30분 동안 녹음 챔버 안에 위치시켰다. 5분간의 배경 녹음 이후, 무작위로 선택된 발정 B6 암컷 마우스(3-5 개월령, 4-5마리가 함께 사육된 마우스) 한 마리를 녹음 챔버 안에 위치시켰다. 발정기는 암컷 마우스에서 확인되었다. 수컷 마우스는 5분 동안 암컷 마우스를 살피도록 하였고, USV가 녹음되었다. USV는 4분의 1인치 마이크로 녹음되었고, 전치증폭기와 주요 증폭기(Bruel and Kjaer Inc., Denmark)로 증폭되었다. 신호는 1 Hz 내지 100 kHz로 필터링하고 1000 Hz 고역 디지털 필터(model 1322A, Axon Instruments, Union City, CA)를 이용하여 250 kHz의 샘플링 주파수, 샘플 당 16 비트로 디지털화하였다. 사운드 녹음은 custom Matlab 프로그램을 이용하여 진행되었다. Short-time Fourier transform 분석은 초음파를 이용한 검사도(sonogram)를 그리기 위해 수행되었다(1,024 샘플/블럭, 1/4 오버랩, 그에 따른 시간 분해능 1.02 ms 및 주파수 분해능 0.45 kHz). 35 kHz 보다 낮은 주파수는 배경 백색소음과 암컷 마우스의 가청 소음을 줄이기 위하여 필터링되었다. 기초 파워스펙트럼으로, USV가 없는 10초의 연속 파워가 샘플화되어 시간으로 평균화하였다. 기초 파워스펙트럼의 1.2배를 각 파워스펙트럼으로부터 빼고, 0 보다 적은 파워를 가지는 주파수를 0으로 정하였다. 이러한 과정은 배경 백색소음을 줄이는 데 사용되었다.

새끼 회수 분석( Pup retrieval assay )

처녀 암컷 마우스를 새끼 회수 분석 전 4일 동안 격리시켰다. 세 마리의 정상 새끼(1일령: C57BL/6N)를 시험 암컷 마우스(야생형 또는 Shank2 ^-/- 마우스)의 홈 케이지의 세 곳의 구석에 위치시키고, 암컷 마우스는 10분 동안 새끼를 찾아오도록 하였다. 새끼 회수의 효율은 첫째, 둘째, 셋째 새끼를 회수해오는 데 걸린 시간으로 측정하였다.

반복 행동

신선한 짚이 있는 홈 케이지 안에 마우스는 점핑, 똑바로 서서 긁기(upright scrabbling), 털 손질(grooming) 및 10분 동안 파기(digging)를 포함하는 반복 행동에 소요된 시간을 측정하는 데 사용되었다. 점핑은 마우스가 케이지 구석에서 또는 옆 벽을 따라 뒷다리로 곧추서고, 두 뒷다리가 동시에 바닥에서 떨어지도록 뛰는 마우스의 행동으로 정의된다. 똑바로 서서 긁기는 마우스가 케이지 구석에서 또는 옆 벽을 따라 뒷다리로 곧추서고, 두 뒷다리를 교대로 또는 대등하게 바닥을 치면서 벽을 오르려고 시도하는 마우스의 행동으로 정의된다. 털 손질은 두 앞다리로 얼굴, 머리 또는 몸을 쓰다듬거나 긁고, 또는 몸의 일부를 핥는 것으로 정의된다. 파기는 마우스가 짚을 파내거나 헝끄러트리기 위해 두 앞다리 또는 뒷다리를 이용하는 마우스의 행동으로 정의된다. Shank2 ^-/- 마우스는 똑바로 긁기 행동과 상당히 혼합된 점핑 행동을 나타내었기 때문에, 두 행동을 구별하지 않고 점핑으로 표지화하였다.

둥지 치기 분석

격리된 시험 마우스에게 둥지 치기 행동 측정 하루 전날 둥지 치기 재료로 접힌 Kimwipes 티슈를 주었다. 둥지 치기 재료의 상태를 3일 동안 매일 사진 촬영하였다. 둥지 치기는 재료가 좋게 변환되는 정도에 기초하여 점수화되었다.

오픈필드 분석

오픈필드 박스의 크기는 40×40×40 cm이고, 중앙 지역 선은 가장자리에서 10cm 떨어져있었다. 마우스는 분석 시작 시 챔버의 중앙에 위치시키고, 마우스의 움직임을 60분 동안 비디오 카메라로 기록하고 Ethovision 3.1 프로그램(Noldus)으로 분석하였다.

고가식 십자미로 실험( Elevated plus - maze )

고가식 십자미로는 바닥으로부터 50cm 높이에 있는 두 개의 오픈 암(open arm), 두 개의 클로즈 암(closed arm) 및 중앙 지역으로 구성된다. 마우스는 중앙에 위치시켜 8분 동안 공간을 탐색하도록 하였다.

명암 실험( Light - dark test )

명암 실험을 위한 장치는 서로 근접한 라이트 챔버(~600 lx) 및 다크 챔버(~5 lx)로 구성되었다. 출입문은 마우스가 라이트 챔버와 다크 챔버를 자유롭게 이동할 수 있게 하였다. 라이트 챔버의 크기는 20 x 30 x 20 cm, 다크 챔버의 크기는 20 x 13 x 20 cm으로 하였다. 라이트 챔버 안의 마우스는 머리가 다크 챔버의 반대편을 향하도록 하여 라이트 챔버 중앙에 도입하였고, 10 분 동안 자유롭게 장치를 탐색하도록 하였다. 다크 챔버로 들어가기 위한 잠복(latency), 다크 챔버와 라이트 챔버에서 보내는 시간, 및 이동 횟수를 측정하였다. 이동은 마우스의 네 발 모두가 한 챔버에서 다른 챔버로 이동하는 것으로 정의된다.

항체

GIT1 (Du139)(Premont et al., Proc Natl Acad Sci 95, 14082-7(1998))및 PLC-β3(Hwang et al., J Biol Chem 275, 16632-7(2000)) 항체는 Premont, Suh박사로부터 각각 증정받아 사용하였다. PSD-95 (#1402), Homer (#1133), 및 CaMKII (#1298)에 대한 항체는 본 실험실에서 생산하였다. 다음 항체에 대하여는 각각의 참조문헌에 기재되어 있다: Shank2 (#1136)( Han, W. et al. J Biol Chem 281, 1461-9 (2006)), βPIX (#1254)( Park, E. et al. J Biol Chem 278, 19220-9 (2003)), GKAP (#1243)(Ko, J. et al. J Biol Chem 278, 42377-85 (2003)), SynGAP (#1682)( Kim, M.H. et al. J Neurosci 29, 1586-95 (2009)), GluA1/GluR1 (#1193)( Kim, M.H. et al. J Neurosci 29, 1586-95 (2009)), 및 GluA2/GluR2 (#1195)( Ko, J. et al. J Biol Chem 278, 42377-85 (2003)), SAP97 (#1443)( Han, S. et al. J Neurosci 30, 15102-12 (2010)). 다음의 항체는 각각의 제조사로부터 구입하였다: GIT1 및 Shank2 N-term (NeuroMab); αPIX, phospho-PAK1/3 (Thr 423), ERK1/2, phospho-ERK1/2 (Thr 202, Tyr 204), mTOR, phospho-mTOR (Ser 2448), p38, 및 phospho-p38 (Thr 180, Tyr 182) (Cell Signaling); PAK1, PAK3, (Santa Cruz); GluN1/NR1, vGlut1, vGAT (SySy); glutamate, α-tubulin, -actin (Sigma); GluN2A/NR2A (Invitrogen); GluN2B/NR2B (BD Transduction Laboratories); phospho-CaMKII (Thr 286), GABA (Abcam); NeuN, GAD67, phospho-GluR1 (Ser 831), phospho-GluR1 (Ser 845), phospho-GluN2B (Ser 1303), mGluR1, mGluR5 (Millipore).

전체 뇌 파쇄액 및 시냅토솜의 준비

전체 뇌 파쇄액을 준비하기 위해, 3-4주령된 마우스의 뇌를 아주 차가운 균질화 버퍼(0.32 M 수크로즈, 10 mM HEPES pH7.4, 2 mM EDTA, 단백질분해효소 억제제, 포스파타아제 억제제)로 간단히 균질화시켰다. 단백질 농도는 Bradford 분석으로 측정되었다. α-튜불린의 상대적인 양을 로딩 대조군으로 사용하였다. 시냅토솜 부분은 이전 연구를 토대로 준비하였다(Blackstone, C.D. et al., J Neurochem 58, 1118-26 (1992)).

면역조직화학

심장 관류(4% 파라포름알데히드) 후 어른 마우스(3개월령)로부터 뇌를 분리하였다. 12 시간 동안 후-고정을 한 다음, 50㎛ 뇌 부분을 바이브라톰에 의해 수득하였다. 뇌 부분은 10분 동안 인산완충액(PBS)로 3번 세척하고, 30분 동안 0.5% TritonX-100로 투과성이 되도록 하고, 1시간 동안 5% BSA로 반응 정지시키고, 4 ℃에서 12시간 동안 일차 항체로 염색하고, 1시간 동안 이차 항체로 염색하고, Vectashield (Vector)로 시작하였다. 정량 분석을 위하여 뇌 부분 이미지를 공초점 현미경(×5 및 ×63 대물렌즈; Leica Microsystems)으로 캡쳐하고 Metamorph (Molecular Devices)를 이용하여 분석하였다.

약리학적 구조( Pharmacological rescue )

CDPPB(Ascent scientific)를 DMSO 및 폴리에틸렌 글리콜 400(DMSO:PEG 400 = 1:9), 최종 농도 6g/l 로 용해시켰다. 야생형 및 Shank2 ^-/- 마우스에 3-챔버 또는 다른 행동분석 30분 전 및 면역블롯 분석을 위한 뇌 샘플 준비 40분 전에 CDPPB(10 또는 3 mg/kg) 또는 동일 부피의 DSMO-PEG400 혼합물을 복강으로 주입하였다. D-cycloserine(Ascent Scientific)을 최종 농도 12 g/l 로 식염수에서 용해시켰다. 야생형 및 Shank2 ^-/- 마우스에 3-챔버 분석 30분 전에 D-cycloserine (20 mg/kg) 또는 동일 부피의 식염수를 복강으로 주입하였다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

Shank2 ^-/- 마우스의 제작

자폐증 환자의 일부에서 나타나는 SHANK2 유전자의 미세결실은 엑손 6 및 7의 손실과 프레임 이동을 유도하고, Shank2 단백질 내 PDZ와 그 다음 도메인의 제거를 수반한다. 이러한 SHANK2 유전자의 결실이 인간의 자폐증을 일으키는 원인이 되는지를 밝히고 자폐증의 근본적인 발병 원인을 연구하기 위하여, 인간에서의 미세결실(엑손 6 및 7의 손실과 프레임 이동)과 동일한 돌연변이를 가지는 형질전환 마우스를 제작하였다. 그리고 이러한 돌연변이는 마우스에서 Shank2의 splice variant(Shank2a 및 Shank2b)에 영향을 미친다(도 1a). SHANK2 유전자의 결실은 서던블롯과 다양한 PCR 방법으로 확인되었다. Shank2 단백질은 뇌에서 관측되지 않았고(도 1b), Shank1 또는 Shank3의 보상적인 증가도 없었다. Shank2 ^-/- 마우스는 정상적인 생식과 뇌 구조를 나타내었다.

Shank2 ^-/- 마우스의 사회적 상호작용 능력의 확인

Shank2 ^-/- 마우스가 자폐증과 같은 사회적 상호작용의 손상을 나타내는지에 관하여 실험하였다. 홈 케이지 사회적 상호작용 분석에서, Shank2 ^-/- 마우스는 야생형 마우스에 비하여 정상 타겟 마우스와 적은 상호작용을 나타내었다. 3-챔버 사회적 상호작용 분석에서, 야생형 동물은 Shank2 ^-/- 마우스에 비하여 외래 마우스 1(Stranger 1)를 탐색하는 것을 더 선호하였다(도 1의 c 및 d). 그 다음, 물체를 새로운 외래 마우스 2(Stranger 2)로 대체한 경우, Shank2 ^-/- 마우스는 야생형 동물과 마찬가지로 외래 마우스 1에 비하여 외래 마우스 2를 탐색하는 것을 더 선호하였고(도 1의 e), 이것은 사회적 신규 탐색의 정상 수준을 나타낸다. 젊은(juvenile) Shank2 ^-/- 마우스로 실험을 한 경우에도 비슷한 결과가 나타났다. Shank2 ^-/- 마우스는 정상적인 후각 기능을 가지고 있었다.

한편, Shank2 ^-/- 마우스는 신규 물체 탐색 기억에서 정상적인 결과를 나타내었지만, 모리스 수조미로 실험에서는 손상된 공간 지각 및 기억을 나타내었다. 이러한 결과는 인간에서 엑손 6 및 7의 결실이 자폐증 및 경도 지적장애를 유발하는 것과 마찬가지로, Shank2 ^-/- 마우스가 일부 손상된 지각 및 기억을 가지고 있음을 나타낸다.

Shank2 ^-/- 마우스는 USV 실험을 통해서도 사회적 상호작용의 손상을 나타내었다. Shank2 ^-/- 마우스를 신규 야생형 암컷 마우스와 접촉하게 하였을 때, Shank2 ^-/- 수컷 마우스는 야생형 동물이 하는 것에 비하여 적은 빈도로 USV 소리를 내었고, 첫 번째 소리를 내는 데 더 오랜 시간이 걸렸다(도 1의 f 내지 h). 한편, 새끼 회수 분석에서, Shank2 ^-/- 암컷 마우스의 새끼 회수 효율은 야생형 마우스가 하는 것 보다 덜 효율적이었다(도 1의 i)

Shank2 ^-/- 수컷 마우스는 다른 자폐증과 같은 비정상 행동을 나타내었다. 외래 마우스가 없는 홈 케이지 안에 Shank2 ^-/- 수컷 마우스를 혼자 두었을 때, Shank2 ^-/- 수컷 마우스는 똑바로 서서 긁기가 포함된 점핑을 더 많이 하였고, 정상 털 손질 및 감소된 파기 행동을 하였다 (도 1의 j). Shank2 ^-/- 마우스는 또한 손상된 둥지 치기, 오픈 필드 분석을 포함하는 분석에서의 과잉 활동, 고가식 십자미로 실험에서의 불안과 같은 행동, 그리고 신규 물체 탐색에서 증가된 털 손질 행동을 나타내었다. Shank2 ^-/- 암컷 마우스는 비슷하게 반복된 점핑, 오픈 필드에서의 과잉 행동 및 고가식 십자미로에서의 불안과 같은 행동을 나타내었지만, 명암 박스에서는 그렇지 않았다. 이러한 결과는 모두 Shank2 ^-/- 마우스가 자폐증과 유사한 행동을 보인다는 것을 말해준다. 과잉 행동과 불안과 같은 행동은 목적 탐색을 제한하거나 불안과 같은 반응을 불러일으켜줌으로써 Shank2 ^-/- 마우스에서 사회적 상호작용을 손상시키는 데 기여한다.

또한, 인간 유전자에서의 돌연변이가 대부분 이형접학적이므로 Shank2 ^+/- 마우스를 특징화하였다. Shank2 ^+/- 마우스는 Shank2 ^-/- 마우스와 유사하게 과잉 행동을 나타내었다. 그러나, Shank2 ^+/- 마우스는 사회적 상호작용의 비정상성, 반복 행동 또는 불안과 같은 행동은 나타내지 않았고, 이는 인간과 마우스의 본질적 차이를 나타낸다.

Shank2 ^-/- 마우스의 NMDAR 기능 저하의 확인

Shank2/ProSAP1은 흥분성 시냅스 구조 및 기능에 있어서 중요한 조절자이다(Sheng et al. J Cell Sci 113, 1851-6 (2000); Ehlers, M.D. Curr Biol 9, R848-50 (1999); Hayashi, M.K. et al. Cell 137, 159-71 (2009)). 그러나, Shank2 유전자의 결실은 시냅스의 흥분 또는 억제에 최소한의 영향을 나타내었다. 또한, 전자현미경 사진은 흥분성 시냅스 수와 시냅스 후부의 밀도 형태에는 변화가 없음을 나타내었다.

다음으로, 해마 Schaffer collaterals-CA1 피라밋 (SC-CA1) 시냅스에서의 시냅스의 전송을 측정하였다. 입출력, 쌍을 이룬 펄스(paired-pulse ratio)와 같은 기초적 흥분성 전송은 Shank2 ^-/- 마우스에서 변하지 않았다(도 2의 a, b). 또한, 자발적인 전송 및 막 흥분성은 돌연변이 동물에서 정상적이었다. 시냅스 가소성을 측정할 때, 고주파 자극 또는 세타-버스트(theta-burst) 자극에 의해 유도된 장기 상승작용(LTP)은 Shank2 ^-/- 마우스에서 심각하게 손상되었다(도 2의 c). 저주파 자극에 의해 유도된 장기 억압작용(LTD) 또한 Shank2 ^-/- 마우스에서 완전히 손상되었다(도 2의 d). 저주파 자극에 의해 유도된 LTD는 NMDA 및 대사형 글루탐산수용체(mGluR) 모두를 활성화시키므로, 바스-처리된(bath-applying)DHPG에 의한 mGluR-LTD, mGluR5의 아고니스트를 분리하였지만 유전형에 있어서 차이는 발견하지 못하였다. 이러한 결과는 LTP 와 LTD에 있어서 관측된 감소가 NMDAR의 기능저하 때문인 것을 의미한다.

이에 따라, Shank2 ^-/- SC-CA1 시냅스에서 NMDA/AMPA 비율을 측정하였다. 사실상, NMDA/AMPA 비율은 야생형 시냅스에 비하여 감소되었다(도 2의 e). 한편, NMDAR-EPSCs 및 NR2B-매개 EPSCs의 감쇠 동역학은 유전자형 간에 차이가 없었고, 이는 NR2A- 및 NR2B- 함유 NMDAR이 동등하게 영향을 받는다는 것을 나타낸다. AMPAR-매개 전송은 정상으로 나타났고(도 2a), 이러한 결과는 NMDAR-매개 전송이 선택적으로 감소하는 것을 나타낸다. 그러나, 전전두엽 안쪽에서의 NMDA/AMPA 비율은 Shank2 ^-/- 마우스에서 변경되지 않았고, 이러한 결과는 감소된 NMDA/AMPA 비율이 모든 뇌 영역에서 균일하게 일어나는 변화는 아님을 나타낸다.

Shank2 ^-/- 유전자의 결실은 또한 LTP 및 LTD를 포함하는 다양한 시냅스 현상을 조절하는 NMDAR-연관된 신호에 영향을 미친다(Zhu, J.J. et al. Cell 110, 443-55 (2002); Shepherd, J.D. & Huganir, R.L. Annu Rev Cell Dev Biol 23, 613-43 (2007)). 면역블롯 분석에서 CaMKIIa/b (T286), ERK1/2 (p42/44) 및 p38의 인산화반응은 Shank2 ^-/- 마우스의 뇌에서 상당히 감소하였다. 이와 유사한 감소가 AMPAR 서브유닛 GluA1 (S831 및 S845)의 인산화반응에서 관찰되었다. 한편, PAK1/3 및 mTOR, 글루타메이트 수용체(GluN2A, GluA2, and mGluR1/5)의 전체 수준, 또는 PSD-95, SAP97, GKAP, SynGAP, Homer, a/bPIX, GIT1, 및 PLC-b3을 포함하는 Shank2와 직,간접적으로 연관된 신호 어댑터/단백질 및 시냅스 스캐폴드의 전체 수준의 인산화반응에서는 변화가 없었다. GluN1 발현의 증가는 보충적인 증가를 나타낸다. 이러한 결과는 Shank2 단백질의 결핍이 NMDAR-연관된 신호에서 손상을 일으키는 것을 나타낸다.

Shank2 ^-/- 마우스의 NMDAR 기능 회복 실험

NMDAR 기능 및 이와 연관된 신호의 감소는 Shank2 ^-/- 마우스에서 자폐증과 같은 행동을 나타내는 데 기여한다. 이러한 가설을 직접적으로 실험하고 NMDAR 기능을 회복시키기 위하여, NMDAR의 글리신 결합 부위에 대한 부분 아고니스트인 D-사이클로세린을 사용하였고, 이는 감소된 NMDA/AMPA 비율과 연관된 뉴로리진-1-결핍된 마우스에서 반복적인 털 손질을 구제하는 것을 나타내었다(Blundell, J. et al. J Neurosci 30, 2115-29 (2010)). 그 결과, D-사이클로세린이 NMDA/AMPA 비율을 완전히 회복시키는 것을 발견하였다(도 3의 a). 또한, D-사이클로세린 처리된 Shank2 ^-/- 마우스는 3-챔버 사회적 상호작용 분석에서 향상된 결과를 나타내었다(도 3의 b 내지 d).

Shank2 ^-/- 마우스에서 감소된 NMDAR 기능과 자폐증 유사 행동 간의 연관성을 더욱 분석하기 위하여, 대사성 글루타메이트 수용체 5(mGluR5)의 막-투과성 양성 알로스테릭 조절자인 CDPPB를 이용하였고, 이는 글루타메이트에 대한 mGluR5의 반응성을 증가시키고 NMDAR의 기능을 향상시킨다(Gregory, K.J. et al. Neuropharmacology 60, 66-81 (2011); Uslaner, J.M. et al. Neuropharmacology 57, 531-8 (2009); Verpelli, C. et al. J Biol Chem 286, 34839-50 (2011)). CDPPB는 항정신병성 및 전-의식(pro-cognitive) 활성을 가지고, 행동의 융통성을 촉진한다. 또한, CDPPB는 흥분성 전송과 Shank3 유전자 넉다운에 의해 유발된 ERK 인산화반응을 회복시키고(Verpelli, C. et al. J Biol Chem 286, 34839-50 (2011)), CDPPB 및 그 유도체(VU-29)는 LTP 및 LTD 및 공간 지각을 향상시킨다(Ayala, J.E. et al. Neuropsychopharmacology 34, 2057-71 (2009)).

이전의 발견과 마찬가지로, CDPPB는 또한 Shank2 ^-/- 마우스 내 슬라이스에서 NMDA/AMPA 비율을 정상화시켰다(도 4의 a). 더욱이, CDPPB는 기초적인 시냅스 전송에 영향을 미치지 않고 SC-CA1 시냅스에서 손상된 LTP 및 LTD를 회복시켰다(도 4의 b 및 c). 생화학적으로, Shank2 ^-/- 마우스의 CDPPB의 처리는 Shank2 ^-/- 마우스의 전체 뇌와 또한 Shank2 ^-/- 마우스의 시냅토솜에서 NMDAR 신호를 완전히 정상화시켰다. 어린 마우스(3-4주령)에 비하여 나이가 든 마우스(8주령)에서의 적은 신호 결함 정도는 NMDAR-매개 전류의 나이-의존적 감소, 및/또는 NMDAR 신호의 보충적 변화를 나타낸다.

행동적인 면에서, CDPPB 처리된 Shank2 ^-/- 마우스는 D-사이클로세린 보다 더 큰 정도로 사회적 상호작용의 회복을 나타내었다. 그러나, 사회적 신규 탐색에는 영향을 미치지 않았다. CDPPB는 용량 의존적으로, 적은 용량의 CDPPB는 손상된 사회적 상호작용을 구제하지 못하였다. 특히, CDPPB는 손상된 새끼 회수 분석, 반복 점핑, 불안과 같은 행동 및 과잉 행동을 구제하지 못하였다. D-사이클로세린의 결과와 함께 이러한 결과는 감소된 NMDAR 기능과 신호는 Shank2 ^-/- 마우스에서 손상된 사회적 상호작용을 유발한다는 것을 나타낸다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (21)

1. Shank2 유전자가 결실되고 NMDA 수용체의 기능이 저하된 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 자폐증 모델 형질전환체.
   
2. 제 1항에 있어서,
   Shank2 유전자의 엑손 6 및 7 영역이 결실된 것을 특징으로 하는 자폐증 모델 형질전환체.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 형질전환체는 마우스인 것을 특징으로 하는 자폐증 모델 형질전환체.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 형질전환체는 자폐증의 임상적 특징인 사회성 결핍 행동, 의사소통 장애 행동, 반복행동 및 과잉행동으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는 자폐증 모델 형질전환체.
   
5. (a) Shank2 유전자가 결실된 자폐증 유발용 형질전환벡터를 제조하는 단계; 및
   (b) 상기 형질전환벡터를 인간을 제외한 동물의 수정란에 도입하여 NMDA 수용체의 기능이 저하된 인간을 제외한 동물을 생산하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 자폐증 모델 형질전환체를 제조하는 방법.
   
6. 제 5항에 있어서,
   Shank2 유전자의 엑손 6 및 7 영역이 결실된 것을 특징으로 하는 자폐증 모델 형질전환체를 제조하는 방법.
   
7. 제 5항에 있어서,
   상기 형질전환체는 자폐증의 임상적 특징인 사회성 결핍 행동, 의사소통 장애 행동, 반복행동 및 과잉행동으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는 자폐증 모델 형질전환체를 제조하는 방법.
   
8. (a) 제 1항 또는 제 2항의 자폐증 모델 형질전환체에 피검 화합물 또는 조성물을 투여하는 단계;
   (b) 상기 피검 화합물 또는 조성물이 처리된 형질전환체(실험군)와 피검 화합물 또는 조성물을 미처리한 형질전환체(대조군)로부터 각각 자폐증 증상을 측정하는 단계; 및
   (c) 대조군에 비하여 실험군에서 자폐증 증상이 감소된 피검화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 자폐증 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법.
   
9. 제 8항에 있어서,
   상기 피검화합물 또는 조성물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자페증 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법.
   
10. 제 8항에 있어서,
    상기 자폐증 모델 형질전환체는 마우스인 것을 특징으로 하는 자페증 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법.
    
11. 제 8항에 있어서,
    상기 자폐증 모델 형질전환체는 결핍 행동, 의사소통 장애 행동, 반복행동 및 과잉행동으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 증상을 나타내는 것을 특징으로 하는 자페증 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법.
    
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 대사성 글루타메이트 수용체 5(mGluR5)에 대한 양성 알로스테릭 조절자인 CDPPB를 포함하는 자폐증 치료용 약학조성물.
    
18. 삭제
19. 삭제
20. 제 17항에 있어서,
    상기 조성물은 현탁액, 산제, 분말제, 과립제, 정제, 서방형 제제, 주사제, 연고제 및 캡슐제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 자폐증 치료용 약학조성물.
    
21. 제 17항에 있어서,
    상기 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는 자폐증 치료용 약학조성물.

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