KR101436684B1 - 저산소성 허혈 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 저산소성 허혈 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 Bag3 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 저산소성 허혈 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 저산소성 허혈 이후 성상세포에서 발현이 증가하는 Bag3 유전자를 저산소성 허혈을 진단할 수 있는 마커로 사용할 수 있고, Bag3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 저산소성 허혈로 인해 손상된 뇌에서 우수한 신경세포 보호 효과를 나타내므로 저산소성 허혈의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 저산소성 허혈 예방 또는 치료용 조성물, 허혈 질환의 진단용 조성물, 허혈 진환의 진단방법, 저산소성 허혈의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝용 조성물 및 저산소성 허혈의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
우리나라 사망 원인 중 2위를 차지하는 질환인 뇌혈관 질환이란 흔히 뇌졸중이라고도 하며, 뇌에 있는 혈관이 막히거나 터져서 발생하는 병으로, 크게 뇌경색과 뇌출혈의 두 가지 유형으로 나눌 수 있다.
뇌경색은 허혈성 뇌혈관 질환이라고도 하며, 뇌혈관이 막혀서 뇌에 혈액과 산소 공급이 되지 못하여 뇌세포가 죽게 되어 발생하는 질환을 의미한다. 상기 뇌출혈은 출혈성 뇌혈관 질환이라고도 하며, 뇌혈관이 터져 피가 흐르고 고여서 뇌 손상이 오는 경우를 의미한다. 이러한 뇌경색이나 뇌출혈로 인해 뇌의 기능을 잃게 되면 외견상 반신마비, 언어 장애 및 의식 장애 등의 신체증상이 나타나기도 하며, 심한 경우에는 사망할 수도 있다.
이 중 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌의 혈류가 감소되어 뇌세포에 산소와 포도당의 공급이 이루어지지 않아 해마 CA1 영역에 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)가 유발되어 발생되는 질환을 의미한다. 또한, 허혈성 뇌질환은 뇌졸중이나 심장마비와 같은 병리학적 상황에서 뇌에 혈액이 공급되지 않음으로써 유발되는 것으로 알려져 있다. 또한, 허혈성 뇌질환은 혈전증(thrombosis), 색전증(em bolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack) 및 소경색(lacune) 등으로 세분할 수 있다.
또한, 일시적인 뇌허혈 및 재관류(reperfusion)에 의해 발생되는 해마 CA1영역에서의 지연성 신경세포사의 원인은 세포 내로 칼슘의 과다유입이나 프리 라디칼(free radical) 관련 신경세포 손상 및 글루타메이트-수용체 매개 신경세포 손상이라고 알려져 있다. 즉, 뇌허혈이 발생하면 신경세포의 탈분극이 일어나고, 시냅스의 글루타메이트가 유리되어 세포 외 글루타메이트의 농도가 증가한다. 또한, ATP(Adenosine Triphosphate)의 감소로 인해 발생하는 능동수송의 역전은 세포 외 글루타메이트의 축적을 가속시킨다. 세포 외 글루타메이트의 축적은 NMDA(N-methyl-D-aspartic Acid), AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4 -isoxazole-propionic acid) 및 메타보트로픽 글루타메이트 수용체(metabotropic glutamate receptor)의 연속적인 활성을 유도하여, 칼슘의 세포 내 과다 유입을 초래한다. 칼슘의 세포 내 유입은 특히 칼슘 의존성 프로테아제, 리파제 및 모듈레이터의 활동을 촉발시키고, 결국 프리 라디칼을 포함하는 세포 독성분자가 생성되어 DNA 및 세포막 등의 세포 구조물을 파괴하여 신경세포사가 유발되는 것으로 알려져 있다.
한편, 지금까지 뇌허혈성 질환 치료를 위해 사용되고 있는 치료약으로는 티크로피딘(ticlopidine), 시로스타졸(cilostazole) 및 프로스타시크린(prostacycline)과 같은 혈소판 응집 억제제나 항트롬빈제제가 있다. 그러나 이러한 약제는 종종 두통, 심계항진 및 간에 부담을 주는 등 부작용을 나타내는 단점이 있어 그 사용에 제한이 따른다.
특히 국내의 경우, 뇌허혈에 의한 뇌신경세포 손상의 예방 및 치료에 대한 약효가 입증되지 않았음에도 불구하고, 노화 관련 건강식품인 DHEA 및 멜라토닌(Melatonine)을 남용하기도 한다.
또한, 뇌졸중 치료에는 급성기 치료와 재발 방지를 위한 예방 치료가 있는데, 뇌졸중이 발생한 3시간 이내에 병원에 가서 급성 뇌졸중 치료를 받아야 치료 효과를 볼 수 있으며, 이보다 늦어지면 치료 효과를 보기 힘든 것으로 알려져 있다. 즉, 일단 뇌혈관 질환에 이환되면 비가역적인 신경세포 손상으로 인해, 운동능력 저하, 성적능력 저하, 기억력 감퇴 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라, 최근 뇌신경 세포의 재생이 가능하다는 것이 보고되기는 하였으나, 이러한 뇌신경 세포의 재생은 그 조직학적 특성을 고려하면 쉽지만은 않은 문제점이 있다.
또한, 허혈성 뇌질환은 아직도 발병 원인 및 치료 등에 어려움이 존재하고 있으며, 허혈성 뇌 손상에는 다양한 병태 생리학적 기전이 관여하고 있어 이와 같은 허혈성 뇌질환의 특성을 고려하면, 치료보다는 예방이 강조되어야 하며 나아가 허혈질환의 예방 또는 치료 효과가 우수한 새로운 치료제의 발굴이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 Bag3이 저산소증 허혈 이후에 뇌에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 저산소증 허혈 유도 마우스 모델을 이용하여 Bag3 결핍이 저산소증 허혈 후에 해마 세포 사멸에 어떠한 영향을 미치는지 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 Bag3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 저산소성 허혈 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 저산소성 허혈 진단에 이용하고자 Bag3 유전자 또는 단백질을 포함하는 저산소성 허혈 질환의 진단용 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 진단용 조성물을 이용하여 저산소성 허혈 질환의 진단 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 저산소성 허혈 치료제 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Bag3 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 저산소성 허혈 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 Bag3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 miRNA로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 Bag3 유전자로부터 발현된 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 저산소성 허혈성 손상으로부터 신경세포 보호효과를 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 Bag3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 저산소성 허혈 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Bag3는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 Bag3 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 Bag3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Bag3 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 수준은 성상세포(astrocyte)에서의 수준을 측정하는 것일 수 있다.
다른 관점에서 본 발명은 Bag3 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질을 표적 물질로서 포함하는 저산소성 허혈의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 상기 스크리닝용 조성물과 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 조성물과 시험물질 사이의 반응을 확인하여, 상기 Bag3를 암호화하는 유전자의 발현 또는 Bag3 단백질의 활성을 저해하는지를 결정하는 단계를 포함하는 저산소성 허혈의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
한편, 또 다른 관점에서 본 발명은 a) Bag3 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 발현 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계; b) 상기 세포의 Bag3 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 상기 Bag3 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 시험물질을 처리하지 않은 정상 대조군에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 저산소성 허혈의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 저산소성 허혈 이후 성상세포에서 발현이 증가하는 Bag3 유전자를 저산소성 허혈을 진단할 수 있는 마커로 사용할 수 있고, Bag3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 저산소성 허혈로 인해 손상된 뇌에서 우수한 신경세포 보호 효과를 나타내므로 저산소성 허혈의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 저산소증 허혈 후 크레실 바이올렛 염색을 통해 측정한 세포사멸을 결과를 나타낸 것이다. F = 200 um.
도 2는 저산소증 허혈 후에 해마에서 Bag3의 발현을 나타낸 것이다. A:웨스턴 블롯, B:면역조직화학법. B = 100 um.
도 3은 성상교세포에서 Bag3의 발현을 측정한 결과를 나타낸 것이다. H = 20 um.
도 4는 저산소증 허혈 후에 Bag3 (+/+)와 Bag3 (-/-) 해마에서의 신경세포사멸을 분석한 결과를 나타낸 것이다. A:웨스턴 블럿 분석으로 분석한 Bag3 항체 특이성, B:면역조직화학법으로 분석한 Bag3 항체 특이성, C:저산소증 허혈 후 7일째에 NeuN 염색을 통해 확인한 신경세포사멸, D: 저산소증 허혈 후 해마의 추상 세포 층에 있는 NeuN 양성 세포의 수, E: GFAP의 면역조직화학법 염색에 의해 측정된 활성 성상교세포의 GFAP 양성 세포의 수. B, C, E= 20um, 200um, 50um.
도 5는 저산소증 허혈 후 Bag3가 조절되는 해마에서의 대규모 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. A: 통제없는 계통 클러스터링 및 2차원 계통도. B: Welch's T-test에 따른 Volcano 분석과 1.5 폴드 발현 변화의 cut-off 기준 .
도 6은 유전자의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 저산소증 허혈 후에 해마에서 Bag3의 발현을 나타낸 것이다. A:웨스턴 블롯, B:면역조직화학법. B = 100 um.
도 3은 성상교세포에서 Bag3의 발현을 측정한 결과를 나타낸 것이다. H = 20 um.
도 4는 저산소증 허혈 후에 Bag3 (+/+)와 Bag3 (-/-) 해마에서의 신경세포사멸을 분석한 결과를 나타낸 것이다. A:웨스턴 블럿 분석으로 분석한 Bag3 항체 특이성, B:면역조직화학법으로 분석한 Bag3 항체 특이성, C:저산소증 허혈 후 7일째에 NeuN 염색을 통해 확인한 신경세포사멸, D: 저산소증 허혈 후 해마의 추상 세포 층에 있는 NeuN 양성 세포의 수, E: GFAP의 면역조직화학법 염색에 의해 측정된 활성 성상교세포의 GFAP 양성 세포의 수. B, C, E= 20um, 200um, 50um.
도 5는 저산소증 허혈 후 Bag3가 조절되는 해마에서의 대규모 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. A: 통제없는 계통 클러스터링 및 2차원 계통도. B: Welch's T-test에 따른 Volcano 분석과 1.5 폴드 발현 변화의 cut-off 기준 .
도 6은 유전자의 qRT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 저산소성 허혈 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, Bag3 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 저산소성 허혈 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다는 점에 그 특징이 있다.
출생 후 중앙 신경 조직에서 Bag3라고 불리는 Bcl-2 상호작용 세포사멸 억제자(Bis)는 대뇌피질(cortical)과 해마 신경에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 또한 Bag3 단백질은 문측이동성유동(rostral migratory stream, RMS)의 성상교세포에서 발현되며, 몇몇의 뇌에서 국소적인 전외 허혈 또는 카이닌산(Kainic acid)-유도 발작(Seizure)과 같은 몇몇 뇌손상 후에 성숙한 활성 성상교세포에서 발현된다.
이러한 Bag3는 세포사멸 저해와 스트레스 저해 활성을 나타낸다고 알려져 있다. 그러나 현재까지 출생 후 저산소증 허혈이 발생된 뇌에서 Bag3 발현에 대해서는 보고된 바 없다.
따라서, 본 발명자들은 Bag3이 저산소증 허혈 이후에 뇌에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 저산소증 허혈 유도 마우스 모델을 이용하여 Bag3 결핍이 저산소증 허혈 후에 해마 세포 사멸에 어떠한 영향을 미치는지를 연구하였다.
이에 본 발명자들은 Bag3 유전자를 겹핍시킨 마우스와 정상 마우스를 대상으로 저산소증을 유발시킨 후, 신경세포 내에서의 Bag3 유전자의 발현 정도를 관찰하였다. 그 결과, 대조군인 정상 마우스에서는 저산소증 유발 후 3일과 7일째 Bag3 유전자의 발현이 증가하는 동시에 신경세포가 사멸되는 것으로 나타났으며, Bag3 유전자를 결핍시킨 마우스는 저산소성 허혈로부터 신경세포가 보호되고 있는 것을 발견하였다.
즉, Bag3은 신생아 저산소증 허혈 후에 성상교세포에서 상향 조절되는데, Bag3가 결핍되는 경우 저산소증 허혈에 저항하여 해마 신경보호 효과를 이끈다는 것을 규명하였다. 이는 Bag3 유전자를 겹핍시킨 마우스에서 갈렉틴 3(galectin 3)와 필라민 C(filamin C)의 유도가 약화된 것과 관련이 있다.
따라서 본 발명에서는 저산소증 허혈 질환과 Bag3의 발현 변화의 관련성에 대해 최초로 규명하였다.
그러므로, Bag3 유전자는 저산소성 허혈을 진단할 수 있는 진단 마커로 사용할 수 있고, 나아가 Bag3 유전자 또는 단백질 발현 또는 활성 억제제는 해마 신경세포 보호 효과를 나타내므로 저산소성 허혈의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 "허혈"은 혈액을 공급하는 혈관의 수축, 폐색 또는 차단에 의해 야기되는, 신체 부위로 혈액의 부적절한 유입 또는 부족을 의미한다. 상기 허혈은 조직 저산소증을 야기한다. "저산소증"은 혈액 또는 조직에서 불충분한 산소 수준(예를 들면, 심근경색)을 의미하는데, 예를 들면, 혈관 폐색에 의해 야기되는 혈액 공급의 부족의 결과일 수 있다. 이는 혈전, 임의의 외부 순환 물질에 의한 색전, 또는 동맥경화와 같은 혈관 질환에 의한 혈동맥 또는 정맥의 방해로 일어날 수 있는 것이다.
상기 허혈성 질환은 산소에 대한 타겟 조직 요구량이 공급에 비하여 상대적으로 증가될 때 발생될 수 있다. 혈류에서의 감소는 갑작스럽게 시작되고 짧게 지속될 수 있거나(급성 허혈증) 또는 느리게 개시되고 길게 지속되거나 또는 빈번하게 나타날 수 있다(만성 허혈증). 급성 허혈증은 종종, 국소적이고, 비가역적 조직 괴사와 관련되고(경색), 반면에 만성 허혈증은 통상적으로 일시적 저산소증 손상과 연관이 있다.
즉, 본 발명은 따라서 급성, 일시적 또는 만성이든지 간에, 임의의 허혈성 질환과 관련된 의학적 상처를 치료하는 것에 적용된다. 허혈 질환은 저산소증 또는 허혈증, 감소된 조직 관혈류 또는 저혈류를 포함하는데, 인급성 허혈성 사건은 수술, 장기 이식, 경색 (예, 뇌, 내장, 심근, 폐 등), 외상, 모욕 또는 상해 등과 관련된 것들을 포함할 수 있다. 허혈증과 연관된 만성적 사건들은 고혈압, 당뇨병,폐색성 동맥 질환, 만성정맥 부전증, 레이노 병 (Raynaud's disease), 간경변, 선천성 심장 질환, 전신성 경화증, 각종 암(종양) 등을 포함할 수 있다.
허혈증과 연관된 다른 질병 또는 질환들은 상처 치유, 위내장 병변, 자가면역 질환 및 신경변성 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특수 조건의 예는, 상처 치유, 허혈성 발작, 허혈성 뇌졸중, 허혈성 심장 질환, 말초 혈관 질환, 신장 동맥 질환, 위내장 병변, 화상, 피부 이식, 혈관 이식물, 장기 치료, 골 회복 질환, 간질환, 자궁 질환, 망막 혈관형성 질환, 골 재생 질환, 연골 재생 질환, 및 평활근 세포 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명은 Bag3 유전자의 발현을 저해하는 억제제를 포함하거나, 이러한 Bag3 유전자로부터 발현된 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 억제제를 포함하는 저산소성 허혈 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 Bag3는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 조성물에 포함되는 Bag3 유전자의 발현을 저해하는 억제제는 Bag3 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 핵산, siRNA(small interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 miRNA(micro RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
또한, 상기 Bag3 유전자로부터 발현된 단백질의 발현 또는 활성을 저해하는 억제제는 Bag3 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, “안티센스 핵산”은 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체인 핵산서열을 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징을 가진다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 당업계에서 생체 내뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 사용되는 것으로, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막을 수 있다.
본 발명의 안티센스 서열은 Bag3 mRNA에 상보적이고 Bag3 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, Bag3 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 서열과 길이는 특별히 제한되지 않으며, mRNA에 대응하지 않는 일부의 서열을 포함할 수있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.
따라서 본 발명에서 사용될 수 있는 안티센스 핵산은 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 핵산을 포함한다. 또한 상기 핵산은 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당 분야에 알려진 방법에 의해 변형될 수 있으며, 이들 변형은 당 분야에 널리 알려져 있으며 핵산 백본의 변형, 당 모이어티(moiety)의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "siRNA"는 표적 유전자의 mRNA에 특이적으로 작용하여 RNA 간섭(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료의 방법으로 제공될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 siRNA 분자는 Bag3 유전자에 의해 코딩되는 mRNA의 일부 영역과 동일한 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 Bag3 유전자에 의해 코딩되는 mRNA의 일부 영역에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 20 내지 70염기이다. siRNA 말단 구조는 표적유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
또한 siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중 사슬 RNA 일반의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스텝 루프형 구조일 수도 있다.
자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다. 이러한 siRNA는 화학적 합성, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제함으로써 얻어질 수 있다.
본 발명에서 용어 "miRNA"는 세포 내에서 자연적으로 만들어지는데, 단백질을 생성하는 유전정보를 갖지 못한 RNA를 말한다. miRNA는 다음과 같이 형성된다. 핵에서 유전자에 의해 일차 miRNA(primary miRNA)로 전사된 후 드로샤(drosha)에 의해 절단되어 짧은 머리핀(short hairpin) 형태의 전구체 miRNA(precursor miRNA)가 되고, 이후 핵에서 세포질로 이동한다. 세포질 내에서 리보뉴클라아제의 일종인 다이서(dicer) 효소에 의하여 전구체 miRNA의 작은 줄기 루프가 절단되면서 단일가닥의 miRNA로 성숙된다.
siRNA는 RISC(RNA-Induced Silencing Complex)를 통해 RNA의 분해를 유도하여 유전자 기능을 억제하는 반면, miRNA는 mRNA의 번역을 방해하는 과정-표적 mRNA의 3'-UTR(untranslated region)의 염기서열에 상보적으로 결합하여 리보솜에서 mRNA가 단백질로 번역되는 과정을 억제-을 통해 유전자 기능을 억제한다.
또한, 본 발명의 저산소성 허혈 예방 또는 치료용 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 기존의 저산소성 허혈 예방 및/또는 치료용 제제 또는 방법과 병용하여 사용할 수 있으며, 이 경우 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 저산소성 혀혈과 관련이 있는 질병을 앓고 있는 개체의 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여가 가능한 개체는 인간뿐만 아니라 새, 가금류, 가축 등의 동물도 포함한다. 본 발명에서, 치료는 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 감소시키거나, 경감시키거나, 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 포함한다.
본 발명의 조성물은 표면에 전달하는 임의의 방식으로 개체에게 투여될 수 있다. 적합한 비경구 투여 경로는 혈관내 투여(예, 정맥 내 볼루스 주사, 정맥 내 주입, 동맥 내 볼루스 주사, 동맥 내 주입, 맥관 내로의 카테터 점적주입), 피하 주입을 포함하는 피하 주사 또는 침착(deposition)(예를 들면 삼투압 펌프 이용), 조직 주위 및 조직 내 투여(예: 종양주위 및 종양내 주사) 또는 침착 등을 포함한다.
본 발명의 조성물에 함유되는 Bag3 유전자 또는 Bag3 유전자로부터 발현된 단백질의 발현을 저해하거나, 활성을 저해하는 물질의 유효 투여량의 범위는 개체의 성별, 중증도, 연령, 건강상태, 체중, 투여방법과 횟수, 표적세포나 세포 및 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 유효량은 Bag3 발현을 억제시키기에 충분한 양 또는 Bag3 작용을 억제하기에 충분한 양이다. 각 치료에 요구되는 총 용량은 수회 용량 또는 일회량으로 투여될 수 있다.
한편, 다른 관점에서 본 발명은 Bag3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 저산소성 허혈 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 Bag3 유전자는 저산소성 허혈 질환이 있는 환자의 성상세포에서 상향조절되어 발현되는 것을 특징으로 하며, Bag3의 성상세포에서의 상향조절 확인을 통해 저산소성 허혈 질환의 발병 여부를 확인할 수 있다.
상기 Bag3 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 Bag3 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함할 수 있으며, Bag3 유전자로부터 발현된 단백질의 수준을 측정하는 제제는 Bag3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.
생물학적 시료, 바람직하게는 성상세포 중의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다.
mRNA 발현수준 측정이란 허혈 질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사중합효소반응(RTPCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
또한, 단백질 발현수준 측정이란 허혈질환을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 허혈질환 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명은 저산소성 허혈 진단 방법 또는 저산소성 허혈 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다. 이러한 방법은 구체적으로, 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Bag3 유전자의 발현수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 단백질의 수준을 정상 대조군 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함한다. 특히, 상기 유전자들의 성상세포(astrocyte)에서의 발현수준을 측정하는 것을 특징으로 한다. 기타 사항은 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 상기 방법에서는 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Bag3 유전자의 발현수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 수준을 측정하고, 이를 정상대조군 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하여 Bag3 유전자의 발현수준이 높은 경우 저산소성 허혈 질환으로 진단할 수 있다.
나아가, 본 발명은 저산소성 허혈의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 이러한 스크리닝 방법은 구체적으로 a) Bag3 유전자 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 발현 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계; b) 상기 세포의 Bag3 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 c) 상기 Bag3 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 시험물질을 처리하지 않은 정상 대조군에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함한다.
이렇게 해서 Bag3 유전자의 발현수준 또는 그 발현 단백질의 양을 감소시키는 시험물질을 저산소성 허혈의 치료제로 선택할 수 있다.
상기 b) 단계의 유전자 또는 단백질의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블럿(Western Blot), 노던 블럿(Northern Blot), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지는 않는다.
또한, 다른 관점에서 본 발명은 Bag3를 암호화하는 유전자 또는 Bag3 단백질을 표적 물질로서 포함하는 저산소성 허혈의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝용 조성물을 제공한다.
그리고, 이러한 스크리닝용 조성물을 표적 물질로서 이용함을 특징으로 하는 저산소성 허혈 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 a) 상기 조성물과 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 조성물과 시험물질 사이의 반응을 확인하여, 상기 Bag3를 암호화하는 유전자의 발현 또는 Bag3 단백질의 활성을 저해하는지를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, Bag3를 포함하는 조성물과 시험물질 사이의 반응 확인은 단백질-단백질간 또는 단백질-화합물간의 반응 여부를 확인하는데 통상 사용되는 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어 Bag3와 시험물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), Bag3에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS 또는 세포 기반 스크리닝(cell-based screening) 등을 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있으나, 이러한 방법에 제한되는 것은 아니다.
또한, Bag3를 암호화하는 유전자를 포함하는 조성물과 시험물질 사이의 반응 확인은 DNA-DNA, DNA-RNA,DNA-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어 인 비트로에서 상기 유전자와 시험물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류 세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있으나, 이러한 방법에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험물질은 통상적인 선정방식에 따라 저산소성 허혈 관련 질환의 예방 또는 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.
이러한 스크리닝 방법에 의하여 얻어진 물질은 이후의 당뇨병 또는 비만 예방 또는 치료제 개발 과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도 물질이 Bag3 유전자 또는 이의 발현 단백질에 대한 저해 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 저산소성 허혈의 예방 또는 치료제를 개발 할 수 있으며, 이러한 물질은 Bag3 유전자 또는 이의 발현 단백질에 대해 부분적 또는 완전한 활성 억제 효과를 나타내게 되므로 저산소성 허혈 관련 질환들을 예방 또는 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명의 스크리닝 방법은 저산소성 허혈 관련 질환의 예방 또는 치료제의 탐색 및 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<
실시예
1>
<1-1>
저산소성
허혈 유도
Bag3 유전자를 녹아웃시킨 마우스는 본 발명자들이 이전에 공지한 방법에 따라 제조하였다(Youn DY et al., 2008).
생후 7일된 야생형 마우스와 Bag3 녹아웃 마우스 새끼를 2% 할로테인(halothane)으로 마취한 후, 우측 총경동맥(right common carotid artery)을 절개하였다. 어미와 함께 2시간 동안 회복시킨 후, 항습온조에서 저산소 상태(8% 산소 및 잔여 질소)에 37℃에서 35분간 노출시켜 저산소증을 유발시켰다. 이후, 새끼는 6시간 후에 희생되었다.
정상대조군은 우측 총경동맥(right common carotid artery)을 절개하고 저산소증을 유발시킨 것만 제외하고는 동일하게 만들었다.
<1-2>
RNA
분리
신생 저산소증 허혈을 유발시키고 6시간 후에 새끼는 희생되었으며, 총 RNA는 제조사의 지침에 따라 우측 해마로부터 TRI 시약을 사용하여 분리하였다.
조직은 액체 질소에서 동결시켰으며, 1ml TRI 시약에서 분쇄하고, 균질화한 후 상온에서 5분 동안 배양하였다. 이후, 200ml 클로로포름을 추가하고 강하게 혼합한 후, 상온에서 3분 간 배양하였다. 샘플은 14,000rpm으로 20분 동안 원심분리하고, 상등액을 동등한 양의 이소프로판올과 함께 새로운 튜브로 옮기고 30분 간 얼음속에서 배양하였다. 이후 14,000rpm으로 15분간 원심분리한 후 RNA 펠렛을 75% 에탄올로 세퍽하고, RNase-free 물에 용해하였다. RNA의 질은 Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)를 사용하여 측정하였으며, 농도는 ND-1000 분광 광도계를 사용하여 측정하였다.
RNA 샘플은 28S/18S 비율이 최소한 1.6 이상인 것으로 선정하여 사용하였다.
<1-3> 통계처리
결과는 평균±표준오차(SE)로 나타내었으며, Duncan's post-hoc test에 따른 one-way analysis of variance(ANOVA)에 의해 분석하였다. P<0.05는 유의적으로 차이의 있음을 나타낸다.
<
실시예
2>
조직염색법을 이용한 세포사멸 확인
크레실 바이올렛(cresyl violet) 염색을 통해 세포사멸 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 정상 대조군(A), 저산소증 그룹(B), 허혈 그룹(C)에서는 세포사멸이 일어나지 않았다. 그러나, 신생 저산소증 허혈 후 1일째(D), 3일째(E), 7일째(F) 해마에서 많은 핵농축(pyknotic) 세포가 발견되었다.
이러한 결과를 통해 저산소증 허혈이 Bag3 (+/+) 마우스의 해마에서 점진적 세포사멸을 유발하는 것으로 나타났다. 또한, Bag3는 미세아교세포(microglia)가 아닌 성상교세포(astrocytes)에서 발현되고, 저산소증 허혈 후에 현저하게 강화된다는 것을 알 수 있었다.
<
실시예
3>
웨스턴
블랏
(
Western
blot
) 분석
저산소증 허혈 유발군과 정상대조군의 6시간, 1일, 3일, 7일에 해마로부터 추출된 단백질과 항-래빗 Bag3(1:10000) 및 항-마우스 β-tubulin(1: 200)을 저산소증-허혈 후에 해마에서 Bag3 발현의 정량분석에 사용하였다.
그 결과, 도 2(A)에 나타낸 바와 같이, 저산소증 허혈 유발군에서는 정상대조군과 비교하여 저산소증-허혈 이후 3일째와 7일째에 동측(ipsilateral) 해마에서 Bag3이 상당히 증가하는 것으로 나타났다. 더욱이, 신생(neonatal) 저산소증 허혈 후에 동측 Bag3의 발현은 대측성(contralateral)의 것과 비교하여 1일, 3일, 7일에 상당히 증가하는 것으로 나타났다.
또한, 저산소증 허혈 후 7일 째에 Bag3 (-/-) 마우스는 저산소증 허혈에 대하여 주목할말한 저항을 보여주었고(도 4A 및 4B 참조), Bag3 (+/+) 마우스보다도 해마의 추상세포(pyramidal cell)에서 NeuN-positive 세포의 수가 많은 것으로 나타났다(도 4C 참조). 이는 갈렉틴 3(galectin 3) 및/또는 필라민 C(filamin C)의 유도가 약화된 것과 관련이 있다.
<
실시예
4>
면역조직화학 분석(
Immunohistochemistry
)
면역조직화학 분석을 수행하기 위해, 항-래빗 Bag3 (1: 500), 항-마우스 GFAP (1: 400), Alexa Fluor 48이 결합된 항-Ox-42(1:100), 항-마우스 NeuN을 사용하였다.
그 결과, 도 2(B)에 나타낸 바와 같이, Bag3이 정상대조군 해마에서 발현되며, 신생 저산소증 허혈 후에 상당히 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 3배 면역 형광법을 통해 Bag3-양성 세포가 글리아(glia) 유사 형태를 갖는다는 것을 알 수 있었다.
한편, 도 3에 나타낸 바와 같이, 성상교세포에서 Bag3의 발현을 확인한 결과, 3배 면역 형광법을 통해 정상대조군과 저산소증-허혈 그룹에서 모두 Bag3의 면역활성이 GFAP, 성상교세포 마커, Ox-42, 미세아교세포 마커와 동일 세포에서 함께 일어나는(colocalized) 것으로 나타났다.
또한, 저산소증 허혈 후 7일째에 NeuN 염색을 통해 확인한 결과, Bag3 (+/+) 마우스에서 신생아 저산소증 허혈이 추상 세포사멸을 유도하는 반면, Bag3의 결핍이 신생아 저산소증 허혈로부터 신경세포 사멸을 보호한다는 것으로 나타났다(도 4C 참조).
그리고, GFAP의 면역조직화학법 염색에 의해 측정된 활성 성상교세포는 GFAP 양성 세포가 신생아 저산소증 허혈 후에 증가하는 것을 나타낸다(도 4E 참조).
<
실시예
5>
Bag3
(-/-)에서 저산소증-허혈에 저항하는 유전자 선별
<5-1>
마이크로어레이를
이용한 유전체 분석
Bag3 (-/-) 해마의 저산소증 허혈에 저항하는 적절한 유전자를 찾기 위해 저산소증 유발 6시간 후의 해마로 유전체(transcriptomic) 분석을 수행하였다.
교잡을 위한 cRNA를 생성하고 증폭하기 위해 Illumina TotalPrep RNA 증폭 키트와 Illumina BeadChip 어레이를 사용하였다. in vitro 전사 및 정화 후에 cRNA는 46,000 이상의 유전자를 시험할 수 있는 Mouse-6 발현 BeadChip 상에서 혼성화되고 정량화되었다. cDNA를 58℃에서 20시간 동안 배양한 후에, BeadChip을 세척, 블럭화하고, 제조자의 설명서에 따라 세척하고, 블럭화하고, 상온에서 streptavidin-Cy3 포함 용액(Illumina)과 함께 배양하였다. 형광 신호는 BeadStation 500GX 유전 분석 시스템(Illumina)으로 스캔하였으며, 이미지 등록과 데이터 추출은 BeadStudio 3.1.1(Illumina)로 자동화하였다.
이에 신생 저산소증-허혈 후에 해마에서 Bag3 유전자가 조절되는 대규모 유전자 발현 프로파일을 도 5에 나타내었다. 그 결과, 신호 대 잡음 비율 < 1.5를 적용하여 선정된 17907 유전 성분의 통제없는 계통 클러스터링을 나타내었고, 정상 대조군에서는 Bag3(+/+)와 Bag3(-/-) 마우스 사이에 전사 변화가 나타나지 않으며, Bag3 유전자 녹아웃이 신생아 저산소증 허혈 후에 다른 유전자 발현을 유도하는 것을 보여준다(5A 참조).
또한, 마우스 해마에서의 Welch's T-test에 따른 Volcano 분석 결과, 4개 그룹에서 저산소증 허헐 후에 상당한 유전자 발현 변화가 나타났으며, 이러한 결과로부터 4개의 그룹 중에 서로 다른 2개 그룹의 다른 발현 유전자(DEG)를 비교하여 상당한 양의 국외자(outlier) 유전자를 확인하였다. Bag3 유전자 녹아웃은 유의있는 변화를 보이지 않았으나(①), Bag3 유전자 녹아웃은 신생 저산소증 허혈 발생 6시간 후에 312 유전자 발현 변화를 유도하였다(②). 더욱 Bag3(+/+) 해마에서는 저산소증 허혈에 의해 1073 유전자가 조절되었으며(③), Bag3(-/-) 해마에서 저산소증 허혈에 의해 428 유전자가 상향조절되거나 하향조절되었다(④).
또한, 밴다이어그램을 사용하여 1073 및 428 유전자의 분석을 진행하였는데, 총 160 유전자가 Bag3 유전자 녹아웃 때문에 별도로 발현하는 것이 가능하고, 268 유전자는 뇌손상에 의해 조절되는 것으로 나타났다(도 5B 참조).
<5-2>
qRT
-
PCR
분석
Bag3 또는 저산소증-허혈에 의해 조절된 유전자들 중에서 몇몇 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인하였다. RNA는 동측 저산소성 허혈 또는 정상대조군(sham) 해마에서 추출하였으며, qRT-PCR은 MX3000P 시스템을 이용하여 SYBR green으로 수행하였다.
| 프라이머 | 프라이머 서열 | 서열번호 |
| galectin 3(forward) | 5'-AAGTCCTGGTTGAAGCTGACCACT-3' | 2 |
| galectin 3(reverse) | 5'-TTAGCGCTGGTGAGGGTTATGTCA-3' | 3 |
| filamin C(forward) | 5'-AAGGTGAAAGCATTTGGACCTGGC-3' | 4 |
| filamin C(reverse) | 5'-ATCTGCATCCTGGGCATAGAGCTT-3' | 5 |
| midkine(forward) | 5'-TACGCTGAGACATCGGTTCCAAGT-3' | 6 |
| midkine(reverse) | 5'-GGTGCTGCATCTTGTCCCACTTT-3' | 7 |
| HSPB6(forward) | 5'-TCCTACCGCACTTGTAACCTGTGT-3' | 8 |
| HSPB6(reverse) | 5'-ACTGGTGGACTAGGCTTGGATGTT-3' | 9 |
| GAPDH(forward) | 5'-TCAACAGCAACTCCCACTCTTCCA-3' | 10 |
| GAPDH(reverse) | 5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCA-3' | 11 |
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 유전자의 qRT PCR 분석은 신생아 저산소증 허혈 및 Bag3 삭제에 의해 변화하였다. galectin 3(A) 및 filamin C(B)는 신생 저산소증 허혈 후에 Bag3 (-/-) 마우스에서 Bag3 (+/+) 마우스보다 더 적게 증가하는 것으로 나타났다. 또한, midkine(C)와 HSPB6(D)의 발현은 저산소증 허혈 발생 6시간 후에 Bag3 (-/-) 마우스와 Bag3 (+/+) 마우스에서 모두 유사하게 증가하는 것으로 나타났다.
상기와 같은 결과들을 종합해보면, Bag3은 신생 저산소증 허혈 후에 성상교세포에서 상향 조절되고(up-regulated), Bag3의 결핍은 저산소증 허혈에 저항하여 해마 신경보호 효과를 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION
<120> Composition for preventing or treating of neonatal
hypoxia-ischemia
<130> NP11-1275
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1734
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bag3 amino acid sequence
<400> 1
Ala Thr Gly Ala Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys
1 5 10 15
Ala Ala Thr Cys Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala
20 25 30
Gly Ala Thr Gly Gly Cys Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys
35 40 45
Gly Gly Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Ala Gly
50 55 60
Ala Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly
65 70 75 80
Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Thr Cys
85 90 95
Gly Ala Cys Cys Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Thr
100 105 110
Gly Gly Cys Cys Cys Thr Thr Cys Thr Thr Cys Gly Thr Gly Gly Ala
115 120 125
Cys Cys Ala Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys
130 135 140
Ala Cys Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Cys Gly Ala Cys Cys
145 150 155 160
Cys Gly Cys Gly Thr Gly Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Gly Ala
165 170 175
Gly Gly Gly Cys Cys Cys Thr Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Thr
180 185 190
Gly Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Cys Ala Ala Thr Gly
195 200 205
Gly Cys Cys Cys Thr Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Thr Gly Gly
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225 230 235 240
Ala Thr Thr Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys
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Cys Cys Ala Thr Ala Thr Ala Cys Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Thr
260 265 270
Cys Cys Gly Ala Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Thr Thr
275 280 285
Cys Cys Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys
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Ala Thr Gly Ala Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Ala Gly Ala Ala
305 310 315 320
Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr
325 330 335
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Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Ala Cys Thr Cys Cys Gly Cys
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Cys Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly Cys Cys
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Thr Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly Ala Thr Ala Cys Ala Thr Gly Ala
645 650 655
Gly Cys Ala Gly Ala Ala Thr Ala Thr Cys Ala Cys Cys Cys Gly Gly
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Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Thr
675 680 685
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900 905 910
Gly Thr Thr Gly Ala Cys Ala Gly Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Cys
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930 935 940
Gly Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Gly Thr Thr Ala Cys Cys
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Cys Ala Ala Cys Cys Cys Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys
965 970 975
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980 985 990
Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys
995 1000 1005
Cys Thr Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Cys Ala
1010 1015 1020
Thr Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ala Gly Thr Gly Ala Thr
1025 1030 1035 1040
Cys Cys Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Gly Ala Cys
1045 1050 1055
Thr Cys Thr Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Cys
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Ala Gly Ala Ala Gly Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys
1075 1080 1085
Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Thr Ala Gly Ala Ala
1090 1095 1100
Gly Thr Ala Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly
1105 1110 1115 1120
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Cys Cys Thr Thr Cys Gly Gly Cys Thr Gly Thr Cys Cys Cys Thr Thr
1155 1160 1165
Cys Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Thr
1170 1175 1180
Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Gly
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Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly
1205 1210 1215
Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Cys Thr Gly Cys
1220 1225 1230
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Gly Gly Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Thr Ala
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Ala Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys
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1410 1415 1420
Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala Gly Cys Thr Gly Ala Thr
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Gly Thr Gly Cys Gly Gly Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala
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Gly Ala Gly Ala Thr Gly Gly Cys Gly Thr Cys Ala Gly Gly Ala Ala
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Gly Gly Thr Thr Cys Ala Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Thr Gly
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Gly Ala Ala Ala Ala Ala Cys Thr Thr Gly Ala Gly Cys Ala Gly Ala
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Ala Ala Ala Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly
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1650 1655 1660
Ala Gly Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Cys Ala
1665 1670 1675 1680
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Thr Gly Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Cys Thr
1715 1720 1725
Cys Cys Cys Thr Ala Gly
1730
Claims (13)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Bag3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 저산소성 허혈 질환의 진단용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제5항에 있어서,
상기 Bag3 단백질은 성상세포(astrocyte)에서의 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 저산소성 허혈 질환의 진단용 조성물. - 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Bag3 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및
상기 단백질의 수준을 정상 대조군 시료의 Bag3 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 저산소성 허혈 진단을 위한 정보 제공 방법. - 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Bag3 단백질을 표적 물질로서 포함하는 저산소성 허혈의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝용 조성물.
- a) 상기 제11항에 따른 조성물과 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 조성물과 시험물질 사이의 반응을 확인하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Bag3 단백질의 활성을 저해하는지를 결정하는 단계를 포함하는 저산소성 허혈의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법. - a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Bag3 단백질의 발현 세포에 분석하고자 하는 시험물질을 처리하는 단계;
b) 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Bag3 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
c) 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 Bag3 단백질의 양이 시험물질을 처리하지 않은 정상 대조군에 비해 감소한 시험물질을 선별하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 저산소성 허혈의 예방 또는 치료 활성 물질의 스크리닝 방법.
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