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KR101399946B1 - 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 - Google Patents

시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시나필 알콜에 대한 뛰어난 효소 특이성으로 시린진 합성 능력이 우수한 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 유전자, 페닐프로파노이드 생합성 경로에 관여하는 F5H, CHS 유전자 및 리그닌 생합성 경로에 관여하는 유전자의 양성 조절 전사인자인 Myb58 유전자를 이용한 대사공학적 방법으로 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체를 제조하는 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 본 발명을 통해 약리적으로 응용성이 많은 시린진을 다양한 식물체에서 효과적으로 대량생산할 수 있으므로 식·의학적으로 고부가 가치의 농업생물 소재산업의 발달을 가능하게 할 것으로 기대된다.

Description

시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체{Method for producing transgenic plant with increased syringin production and the plant thereof}
본 발명은 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체 및 상기 형질전환 식물체의 제조 방법; UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, F5H 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 Myb58 또는 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체 및 상기 형질전환 식물체의 제조 방법; 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 CHS(chalcone synthase) 단백질을 코딩하는 유전자를 녹아웃(knock-out)시키는 침묵 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체 및 상기 형질전환 식물체의 제조 방법; 상기 각각의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.
시린진(syringin)은 리그닌계 배당체로 페닐프로파노이드 합성 경로를 통해서 생성된 리그닌 구성 성분인 시나필 알콜(sinapyl alcohol, s type monolignol)이 당전이 효소(UGTase; UDP-dependent glucosyltransferase)에 의해서 배당체가 됨으로써 생성된다. 따라서 식물체 내에서 페닐프로파노이드 합성 경로를 통해서 시린진을 효과적으로 생산하기 위해서는 시린진의 전구체인 시나필 알콜(sinapyl alcohol)에 대한 기질 특이성이 있으면서 당전이 활성이 강한 당전이 효소 및 식물세포 내에 미량으로 존재하는 시나필 알콜의 함량을 증가시킬 수 있는 대사공학적 기술이 필요하다.
스트레스는 만병의 근원이다. 만성적인 스트레스는 다양한 생리적, 기능적 장애를 유발하고 신경성 노이로제, 우울증, 만성피로, 심혈질환 및 대사장애에 의한 비만 등의 질병을 발생하게 할 뿐만 아니라 부신에서 과다하게 지속적으로 분비된 스테로이드 호르몬이 면역기능을 약화시킨다. 특히 세포성 독성 T-세포에 의한 세포성 면역작용에 의한 암 억제 효과가 약화되어 암세포의 생장이 촉진된다고 보고된 바 있다. 그러나 오늘날 경쟁적 사회 구조에서 스트레스로부터 완전히 해방된 생활은 불가능하므로 현대인들은 스트레스를 줄이면서 스트레스에 대한 적응력을 높여 건강한 삶을 영유하기 위해 노력하고 있다. 이러한 건강에 대한 관심은 스트레스에 대한 우수한 정신적, 육체적 및 적응력 향상에 효능이 있는 천연 약리성분인 적응원(Adaptogen)에 대한 연구와 산업적 이용성에 대한 연구가 활발히 진행 중이다.
적응원이란 다양한 스트레스에 반응하여 부작용 없이 생체의 비특이성 저항력을 증가시켜서 스트레스 상황에 대한 적응력 향상을 유도하는 식물 이차대사 산물을 일컫는 말이다. 일반적으로 적응원 성분이 많은 오미자, 홍경천, 가시오가피 식물체의 추출 혼합물이 전통적으로 이용되고 있다. 특히 가시오가피는 장기 복용 시 노화를 막을 뿐만 아니라 식욕을 돋우고, 기력이 강해지고 기억력이 좋아지는 천연 자양강장제로서의 기능을 하는 것으로 유명하다. 이와 같이 가시오가피가 인삼이나 산삼에 버금가는 뛰어난 약리효과가 있는 것으로 알려짐에 따라 최근에는 오가피를 이용하여 각종 건강식품을 개발하고자 하는 노력이 활발해지고 있으나, 단순히 오가피의 액상추출물이나 오가피주(酒)가 주종을 이루고 있는 실정이다. 가시오가피의 이러한 약리효과의 중요 화학적 성분들에 대한 연구는 1970년대 러시아 우주비행사의 스트레스 극복용으로 가시오가피가 이용되면서 본격적으로 연구되었다. 가시오가피의 뿌리와 껍질이 약재로 사용되는데 그 화학적 성분을 살펴보면 엘류테로사이드(Eleutheroside) A, B, C, D, K, L 및 M 등의 리그닌 계열의 복합배당체들이 중요 성분이다. 특히 엘류테로사이드 B(Syringin) 및 E(Acanthoside D)가 매우 우수한 적응원 기능을 하는 것이 임상적으로 확인되었다.
특히 엘류테로사이드 B(시린진)이 현대 도시인의 건강에 가장 문제가 되고 있는 당뇨병과 우울증 치료에도 우수한 효능을 보이는 것으로 보고됨으로써 그 응용성이 더욱 확대되고 있다. 그러나 가시오가피의 재배 지역이 제한적이며 재배 지역에 따른 약리성분의 차이가 많아 상업적 이용을 위한 시린진 생산에 필요한 가시오가피의 안정적 공급이 어렵다. 따라서 생명공학 기술을 이용한 식물대사 경로의 조절을 통하여 시린진과 같은 고부가 가치 산물인 식물 이차대사 산물의 안정적 생산기술 개발이 필요하다.
한편, 한국공개특허 제2004-0004764호에는 '간독성에 대한 보호 활성을 갖는 가시오가피 추출물 또는 이로부터 부탄올로 분획한 분획층과 부탄올 분획층에서 분리한 시린진과 시린가레시놀-디-오-베타-글루코피라노사이드를 함유하는 항산화작용과 간독성 보호 활성을 갖는 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제1998-0072707호에는 '간기능보호작용을 가지는 시린진의 약학적 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 식물체 내의 대사경로 조절을 통해 시린진의 생산을 증가시키기 위하여 페닐프로파노이드 합성 경로에서 기질들의 흐름 조절에 중요한 단계를 조절하는 F5H 및 HCT 유전자를 과발현하는 형질전환체 및 CHS 유전자 기능이 결함된 형질전환체를 각각 제작하였고, 상기 형질전환체와 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2를 과발현시킨 형질전환체를 교배시킨 후 시린진의 합성 효율을 정량적으로 비교한 결과, UGT72E3/2와 F5H가 함께 과발현하는 형질전환 식물체에서 시린진의 생산량이 현저히 증가된 것을 확인하였다. 또한, 리그닌 합성 경로의 양성 조절 전사인자인 Myb58을 과발현하는 애기장대 형질전환체를 제조하여 UGT72E3/2 및 F5H가 과발현하는 형질전환체와 교배시킨 후 시린진의 합성 효율을 정량적으로 비교한 결과, 새롭게 제조된 UGT72E3/2, F5H 및 Myb58 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체에서 시린진의 생산량이 UGT72E3/2 단백질만이 과발현될 때에 비해 10배 이상 증가된 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 CHS(chalcone synthase) 단백질을 코딩하는 유전자를 녹아웃(knock-out)시키는 침묵 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체와 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체와 Myb58 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질, F5H 단백질 및 Myb58 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체와 Myb63 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질, F5H 단백질 및 Myb63 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체와 CHS 단백질 코딩 유전자가 녹아웃된 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질을 과발현하고, CHS 단백질의 발현이 억제된 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 각각의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 식물체의 종자를 제공한다.
본 발명에 의하면, 식물체 내에서 페닐프로파노이드 합성 경로에 관여하는 F5H, CHS 및 Myb58 유전자 조절을 통한 대사공학적 방법에 의한 시린진의 전구체인 시나필 알콜의 충분한 생산 및 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2를 이용한 당전이 활성의 강화에 의한 시너지 효과는 약리적으로 응용성이 많은 시린진을 다양한 식물체에서 효과적으로 대량생산할 수 있는 새로운 방법을 제공함으로써 식·의학적으로 고부가 가치의 농업생물 소재산업의 발달을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 당전이 효소 UGT72E2, UGT72E3, UGT72E2/3 및 UGT72E3/2 유전자를 각각 과발현하는 애기장대 형질전환체 및 야생형 잎에서 제작한 단백질 추출물에 존재하는 당전이 효소 활성을 비교한 결과로서, 형질전환 식물체의 잎의 단백질 추출물에 코니페릴알콜 또는 시나필알콜을 첨가하고 60분간 반응 후 생성되는 코니페린과 시린진을 측정함으로써 각 형질전환체의 단백질 추출물에 존재하는 당전이 효소의 활성을 간접적으로 측정한 것이다. (A) 코니페린 생성량, (B) 시린진 생성량.
도 2는 시린진 합성을 위한 페닐프로파노이드 합성 경로 및 본 발명에서 사용한 유전자의 조절 부위를 나타낸다.
도 3은 HCT, F5H 및 Myb58 유전자를 각각 과발현하는 애기장대 형질전환체에서 각 유전자의 발현량을 RT-PCR로 확인한 결과이다. 대조구로 액틴2 유전자를 사용하였다.
도 4는 당전이 효소 UGT72E3/2 유전자와 페닐프로파노이드 합성 경로의 HCT, F5H 및 CHS 유전자의 시너지 효과를 조사하기 위해서 야생형을 포함하여 다양한 조합의 유전자가 발현되는 형질전환체 잎에서의 코니페린(A) 및 시린진(B) 생산의 정량적 HPLC 분석을 나타낸다. (C) 각 크로마토그램의 피크 1은 코니페릴 알콜 4-O-글루코시드(코니페린)을 나타내고, 피크 2는 시나필 알콜 4-O-글루코시드(시린진)를 나타낸다.
도 5는 당전이 효소 UGT72E3/2 유전자와 페닐프로파노이드 합성 경로의 HCT, F5H 및 CHS 유전자의 시너지 효과를 조사하기 위해서 야생형을 포함하여 다양한 조합의 유전자가 발현되는 형질전환체 뿌리에서의 코니페린(A) 및 시린진(B) 생산의 정량적 HPLC 분석을 나타낸다. (C) 각 크로마토그램의 피크 1은 코니페릴 알콜 4-O-글루코시드(코니페린)을 나타내고, 피크 2는 시나필 알콜 4-O-글루코시드(시린진)를 나타낸다.
도 6은 당전이 효소 UGT72E3/2 유전자와 페닐프로파노이드 합성 경로의 F5H 유전자 및 리그닌 합성 경로에 관여하는 유전자들의 양성 조절 전사인자인 Myb58 유전자의 피라미딩에 의한 시너지 효과에 의해서 형질전환체 잎에서 코니페린(A) 및 시린진(B) 생산이 획기적으로 증가되는 것을 정량적 HPLC 분석으로 나타낸 결과이다. (C) 각 크로마토그램의 피크 1은 코니페릴 알콜 4-O-글루코시드(코니페린)을 나타내고, 피크 2는 시나필 알콜 4-O-글루코시드(시린진)를 나타낸다.
도 7은 당전이 효소 UGT72E3/2 유전자와 페닐프로파노이드 합성 경로의 F5H 유전자 및 리그닌 합성 경로에 관여하는 유전자들의 양성 조절 전사인자인 Myb58 유전자의 축적에 의한 시너지 효과가 형질전환체의 뿌리에서는 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 HPLC 분석으로 나타낸 결과이다. (C) 각 크로마토그램의 피크 1은 코니페릴 알콜 4-O-글루코시드(코니페린)을 나타내고, 피크 2는 시나필 알콜 4-O-글루코시드(시린진)를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CHS(chalcone synthase) 단백질을 코딩하는 유전자를 녹아웃(knock-out)시키는 침묵 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
선행 발명에서 애기장대에서 분리된 당전이 효소(UGTase; UDP-dependent glucosyltransferase) UGT72E2는 당전이 효율은 매우 우수하나 코니페릴 알콜(coniferyl alcohol)에 대한 기질 특이성이 약한 반면, 당전이 효소 UGT72E3는 시나필 알콜(sinapyl alcohol)에 대한 기질 특이성은 우수하나 당전이 효율은 낮은 단점이 있어 산업적 응용성이 제한되는 단점을 발견하였고, 이를 극복하고자 기질 특이성은 강하게 유지되면서 당전이 활성이 강화된 새로운 재조합 당전이 효소를 제조하기 위해서 UGT72E2와 UGT72E3 유전자들로부터 도메인 스와핑(domain swapping) 방법을 이용해서 재조합 유전자 UGT72E2/3와 UGT72E3/2를 제조하였다.
구체적으로, 본 발명에서는 UGT72E2 및 UGT72E3 유전자들을 각각 아미노 말단의 1번에서 344번까지의 아미노산을 포함하는 아미노 단편과 345번부터 카르복시 말단의 481번까지의 아미노산을 포함하는 카르복시 단편으로 이분하였다. 아미노 단편은 기질인식 특이성을 결정하는 영역을 포함하고 카르복시 말단은 당전이 활성에 중요한 PSPG 모티프를 포함하고 있다. 식물체 내에서 시린진을 효율적으로 생산하기 위해서는 기질 특이성이 당전이 활성보다 중요하므로 정확히 이등분하지 않고 아미노 단편을 전체의 3/4 정도로 크게 하고 카르복시 단편은 PSPG 모티프를 포함하는 최소 크기로 나누었다.
본 발명에서 사용한 재조합 UGT72E2/3 유전자는 UGT72E2의 아미노 말단의 1번에서 344번까지의 아미노산을 포함하는 아미노 단편과 UGT72E3의 345번부터 카르복시 말단의 481번까지의 아미노산을 포함하는 카르복시 단편을 코딩하는 유전자를 연결하여 제조하였고, 재조합 UGT72E3/2 유전자는 UGT72E3의 아미노 말단의 1번에서 344번까지의 아미노산을 포함하는 아미노 단편과 UGT72E2의 345번부터 카르복시 말단의 481번까지의 아미노산을 포함하는 카르복시 단편을 코딩하는 유전자를 연결하여 제조하였다.
제조된 재조합 유전자들의 효소적 특성을 조사하기 위해서 아그로박테리움을 이용하여 UGT72E2, UGT72E3, UGT72E2/3 및 UGT72E3/2 유전자들을 각각 과발현하는 애기장대 형질전환체를 제조하였고, 시린진의 합성 효율을 정량적으로 각각 비교한 결과, 새롭게 제조된 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2이 야생형에 비해 시린진 합성이 현저히 증가된 것을 확인하였고, 본 발명에서 UGT72E3/2를 이용하여 식물 대사공학적 방법으로 고효율의 시린진 생산 방법을 개발하였다.
본 발명에서는 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2를 과발현하는 형질전환체에 시린진의 기질인 시나필 알콜을 효율적으로 공급하기 위하여 시린진 합성 경로의 각 단계별 과정 및 작용 효소들을 이용하였는데, 쿠마릴(coumaryl)-CoA의 페닐프로파노이드 합성 경로 진입을 강화하기 위해서 HCT(hydroxycinamoyl-CoA:shikimate/quinqte hydroxycinamoyl transferase) 유전자를 과발현시키고, 코니페릴 알콜로 전환되는 코니페릴 알데하이드의 양을 줄이고 시나필 알콜로의 전환을 촉진하기 위하여 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 유전자를 과발현시켰다. 또한, 시린진 합성 경로 중에서 쿠마릴-CoA가 플라보노이드(flavonoid) 경로로 빠져나가는 양을 감소시키기 위해서 CHS(chalcone synthase) 유전자 기능이 결함된 돌연변이체를 사용하였다. 상기 CHS 유전자를 녹아웃(knock-out)시키기 위해 침묵 벡터(silencing vector)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "녹아웃(knock-out)"은 염기서열 중 특정 유전자가 발현될 수 없도록 이를 변형 또는 제거하는 것을 의미하며 일반적으로 유전자의 발현이 하향조절(downregulation) 또는 완전히 억제(suppression)되는 현상을 말한다.
본 발명의 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드와 함께 존재시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB(right border)와 LB(left border)를 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, 엠피실린(Ampicillin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한,
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
(b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (a)단계의 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체와 상기 (b)단계의 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
(b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
(c) 상기 (a)단계의 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체와 상기 (b)단계의 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계;
(d) 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 Myb58 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
(e) 상기 (c)단계의 선발된 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체와 상기 (d)단계의 Myb58 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질, F5H 단백질 및 Myb58 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
(b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
(c) 상기 (a)단계의 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체와 상기 (b)단계의 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계;
(d) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 Myb63 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
(e) 상기 (c)단계의 선발된 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체와 상기 (d)단계의 Myb63 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질, F5H 단백질 및 Myb63 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한,
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
(b) 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CHS(chalcone synthase) 단백질을 코딩하는 유전자가 녹아웃(knock-out)된 식물체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (a)단계의 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체와 상기 (b)단계의 CHS 단백질 코딩 유전자가 녹아웃된 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질을 과발현하고, CHS 단백질의 발현이 억제된 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 바람직하게는 잎 또는 뿌리에서 시린진 합성이 증가되고, 가장 바람직하게는 잎에서 시린진 합성이 증가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
본 발명에서 사용한 Myb58 유전자는 페닐프로파노이드 생합성 경로에 관여하는 유전자들을 양성 조절하는 전사인자로서, 이와 유사 기능을 수행하는 것으로 알려진 Myb63 또한 시린진 생산 과정에서 시너지 효과를 발생할 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명은 또한, 상기 각각의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체에서, 상기 식물체는 바람직하게는 애기장대, 담배, 가지, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갯무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두인 쌍자엽 식물일 수 있고, 가장 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용한 유전자 및 염기서열 정보
본 발명에 사용한 유전자 및 염기서열 정보는 하기 표 1과 같다.
유전자명 염기서열 번호 아미노산 서열 번호
UGT72E3/2 1 2
F5H 3 4
Myb58 5 6
Myb63 7 8
CHS 9 10
HCT 11 12
실시예 1. 당전이 효소 UGT72E2 , UGT72E3 , UGT72E2 /3, UGT72E3 /2 유전자들을 각각 과발현하는 애기장대 형질전환체 및 야생형 잎에서 제작한 단백질 추출물에 존재하는 당전이 효소들의 활성 비교
일반적으로 속씨식물 잎의 페닐프로파노이드 합성 경로의 활성화에 의해 생성되는 모노리그놀(monolignol)의 대부분은 코니페릴 알콜(coniferyl alcohol)이 코니페린으로 전환되고, 극히 일부의 코니페릴 알콜만이 F5H(furulate 5-hydroxylase), COMT(caffeic acid 3-O-methyltransferase) 및 CAD에 의한 연속적인 효소 작용에 의해서 시린진의 전구물질인 시나필 알콜(sinapyl alcohol)로 전환된다. 따라서 당전이 효소의 활성과 더불어 기질인 시나필 알콜의 공급은 시린진 생산의 중요한 결정요인이다.
당전이 효소들의 활성을 비교하기 위해 당전이 효소 UGT72E2, UGT72E3, UGT72E2/3 및 UGT72E3/2 유전자들을 각각 과발현하는 애기장대 형질전환체 및 야생형 잎에서 제작한 단백질 추출물에 기질로서 코니페릴 알콜 또는 시나필 알콜 1mM 및 UDP-글루코스 5mM을 첨가하고 22℃에서 60분간 반응시켰다. 그 후, 반응액에 2배 부피의 메탄올을 첨가하여 반응을 정지시키고, HPLC를 이용하여 반응 전과 후에 생성된 코니페린 및 시린진을 정량화하였다. 이미 생체 내(in vivo) 조건에서 확인된 선행 결과와 같이 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2는 시나필 알콜에 대한 강한 기질 특이성이 있으면서 당전이 활성이 높았다. 특히 UGT72E3/2는 기질 첨가에 따른 시린진의 생성 속도가 다른 당전이 효소에 비해 우수하였다(도 1).
상기 결과는 UGT72E3/2를 과발현하는 형질전환체에 대사공학적 방법으로 시나필 알콜의 공급을 증가시키는 방법을 함께 사용한다면 식물체에서 고효율의 시린진 생성이 가능하다는 것을 나타낸다.
실시예 2. 시린진 합성을 위한 페닐프로파노이드 합성 경로 및 유전자 조절 부위
대사공학적 방법을 이용해서 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2를 과발현하는 형질전환체에 시린진의 기질인 시나필 알콜을 효율적으로 공급하기 위하여 페닐프로파노이드 합성 경로의 각 단계별 과정 및 작용 효소들을 이용하였다. 시린진 합성 경로 중에서 쿠마릴(coumaryl)-CoA가 플라보노이드(flavonoid) 경로로 빠져나가는 양을 감소시키기 위해서 CHS(chalcone synthase) 유전자가 결함이 된 돌연변이체를 사용하였다. 또한, 쿠마릴-CoA의 페닐프로파노이드 합성 경로 진입을 강화하기 위해서 HCT(hydroxycinamoyl-CoA:shikimate/quinqte hydroxycinamoyl transferase) 유전자를 과발현시키고, 코니페릴 알콜로 전환되는 코니페릴 알데하이드의 양을 줄이고 시나필 알콜로의 전환을 촉진하기 위하여 F5H(ferulate 5-hydroxylase) 유전자를 과발현시키는 전략을 이용하였다(도 2).
실시예 3. 페닐프로파노이드 합성 경로 조절 유전자 HCT , F5H 및 Myb58 과발현 애기장대 형질전환체 제작 및 각 유전자의 발현량 확인
애기장대의 HCT, F5H 및 Myb58 유전자 코딩 영역을 수퍼프로모터에 의해 조절되도록 바이너리 벡터를 제작한 후, 상기 벡터를 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105에 도입한 후에 상기 박테리아를 사용하여 인 플랜타(in planta) 방법으로 애기장대를 형질전환시켰다. 이때 이미 하이그로마이신 저항성 선발 마커로 제작된 UGT72E3/2 과발현 형질전환체에 상기 HCT, F5H 및 Myb58 유전자들을 향후 교배 선발 방식을 통한 피라미드식으로 축적시킬 목적으로 카나마이신(HCT 및 F5H) 또는 제초제(Myb58) 저항성 선발 마커를 이용하여 각각 애기장대 형질전환체를 제작하였다.
형질전환체의 표현형은 도입된 전이 유전자의 발현 정도에 의해 크게 영향을 받기 때문에 선발된 형질전환체 중에서 HCT, F5H 및 Myb58 유전자가 안정적으로 유전체에 삽입되어 발현되는 양을 RT-PCR 방법을 이용하여 확인하였다. RT-PCR 분석시 도입된 유전자를 특이적으로 증폭하기 위해서 HCT 유전자 특이적 정방향 프라이머 HCT-F(5'-CTGGTTACTTTGGGAATGTGATATTCAC-3'; 서열번호 13), F5H 유전자 특이적 정방향 프라이머 F5H-F(5'-CAGACGAGTTGAAGAATCCGACATCGAG-3'; 서열번호 14) 및 Myb58 유전자 특이적 정방향 프라이머 Myb58-F(5'-CAGACGAGTTGAAGAATCCGACATCGAG-3'; 서열번호 15)를 이용하였고, 역방향 프라이머로는 벡터의 3' UTR 영역에 특이적인 프라이머 UTR-R(5'-TTAAAGCAGGGCATGCCTGC-3'; 서열번호 16)을 이용하였다. RNA의 상대적인 양을 보정하기 위해서 항상 일정하게 발현하는 애기장대의 액틴2 유전자를 참고 유전자로 사용하였다. 각각의 유전자당 10개 씩의 형질전환체를 조사하였고, 이 중에서 HCT, F5H 및 Myb58 유전자 발현이 우수한 형질전환체 라인을 최종 확보하였다(도 3). 또한, 애기장대에는 단 하나의 CHS 유전자가 존재하는데, 상기 유전자가 결함되면 씨앗 껍질의 색이 노란색으로 변하게 된다. 이와 같은 표현형의 차이를 이용하여 순종 형질전환체를 분리하였다.
실시예 4. 형질전환체의 잎 및 뿌리에서의 코니페린과 시린진 생성의 정량적 HPLC 분석
속씨식물은 페닐프로파노이드 합성 경로를 통해서 다음과 같은 3종류의 모노리그놀(monolignol)을 생성한다. p-쿠마릴 알콜(coumaryl alcohol)을 이용한 H 모노리그놀, 코니페릴 알콜을 이용한 G 모노리그놀 및 시나필 알콜을 이용한 S 모노리그놀이 생성된다. 그러나 대부분이 G 모노리그놀 형태이므로 식물세포 내의 코니페릴 알콜의 농도가 상대적으로 가장 높다. 당전이 효소 UGT72E2의 과발현은 고농도의 코니페릴 알콜을 코니페린으로 전환시킨다. 일부의 코니페릴 알콜은 F5H 및 COMT(caffeic acid 3-O-methyltransferase)의 효소적 작용에 의해서 시나필 알콜로 전환되기 때문에 식물내포 내의 시린진 전구물질인 시나필 알콜의 농도는 매우 낮다. 식물체 내에서 고효율의 시린진을 생성하기 위해서는 고효율의 당전이 효소 UGT72E3/2와 함께 시나필 알콜의 농도를 높일 수 있는 대사공학적 조절이 필요하다.
당전이 효소 UGT72E3/2 유전자와 페닐프로파노이드의 HCT, F5H 및 CHS 유전자의 시너지 효과 조사를 위하여 형질전환체의 잎과 뿌리에서 코니페린과 시린진 생성의 정량적 HPLC 분석을 수행하였다. 페닐프로파노이드 합성 경로의 중요 단계를 조절하는 HCT 및 F5H 유전자를 과발현하는 형질전환체를 각각 제작하고, 고효율 당전이 유전자 UGT72E3/2를 과발현하는 형질전환체와 교배를 시켰다. 그 후 F2 세대에서 HCT와 UGT72E3/2 또는 F5H와 UGT72E3/2 유전자를 함께 과발현하는 형질전환체를 각각 분리하고, 다음 세대에서 순종 라인을 확보하였다. 또한 페닐프로파노이드 경로의 중요 전구물질인 p-쿠마릴-CoA가 플라보노이드 합성 경로로 빠져나가는 것을 막기 위해서 p-쿠마릴-CoA를 칼콘(chalcone)으로 전환하는 CHS(chalcone synthase)가 결함이 된 돌연변이체와 UGT72E3/2를 과발현하는 형질전환체와 교배를 시키고, F2 세대에서 CHS 유전자가 녹아웃(knock-out)되고 UGT72E3/2 유전자가 과발현된 형질을 함께 가지는 라인을 분리한 후에 다음 세대에서 순종을 확인하였다.
상기 형질전환체의 잎과 뿌리에서 HPLC를 이용한 시린진의 합성 효율을 조사한 결과, UGT72E3/2 유전자만 단독으로 과발현된 형질전환체에 비해 HCT 또는 F5H 유전자의 과발현 그리고 CHS 유전자 기능 결함이 첨가된 식물체 라인의 잎에서 각각 시린진의 합성이 17.3%, 71.3% 및 64.6%씩 증가되는 양상을 나타내었다(도 4).
그러나 뿌리에서는 UGT72E3/2 유전자만 단독으로 과발현된 형질전환체에 비해 UGT72E3/2와 F5H 유전자가 과발현된 형질전환체 라인에서만 시린진 합성이 약간 증가된 것으로 나타났다(도 5).
실시예 5. UGT72E3 /2, F5H 및 Myb58 유전자의 피라미딩을 이용한 시너지 효과에 의한 형질전환체의 잎 및 뿌리에서 시린진 생성의 정량적 HPLC 분석
효소공학 방법으로 개발한 시나필 알콜에 대한 특이성이 강한 새로운 당전이 유전자 UGT72E3/2와 페닐프로파노이드 경로 중의 코니페릴 알콜에서 시나필 알콜로의 전환에 관여하는 F5H 유전자의 과발현의 축적은 시린진의 생성율을 크게 증가하는 효과를 나타내었다. 그러나 식물의 뿌리는 빛에 노출이 되면 빛 신호전달 기작에 의해서 페닐프로파노이드 합성 경로에 관여하는 다양한 유전자의 발현이 증가된다. 그 결과 많은 양의 코니페릴 알콜 및 시나필 알콜을 포함하는 모노리그놀의 합성이 증가되기 때문에 야생형 뿌리에서의 시린진 합성량은 잎에 비해 36배 이상 많았다. UGT72E3/2와 F5H 유전자들을 과발현하는 형질전환체의 잎에서 시린진의 생성량이 야생형의 잎에서 보다 16배 이상 증가하는 효과를 보였으나 형질전환체의 뿌리에서 생성되는 시린진의 양에 비교하면 여전히 4배 이상 낮았다. 잎에서 시린진의 생산량을 증가시킨다는 것은 뿌리에서와는 달리 식물체의 파괴 없이 대량 재배가 가능한 이점이 있다. 따라서 잎에서도 빛에 노출된 뿌리처럼 페닐프로파노이드 경로에 관여하는 많은 유전자의 발현을 증가시키는 방법이 필요하다.
상기 문제를 해결하기 위해 본 발명에서는 당전이 효소 UGT72E3/2 유전자, 페닐프로파노이드 합성 경로의 F5H 유전자 및 리그닌 합성 경로에 관여하는 유전자의 양성 조절 전사인자인 Myb58 유전자의 피라미딩을 이용한 시너지 효과에 의한 형질전환체의 시린진 생성을 정량적 HPLC 분석을 통해 측정하였다.
Myb58 유전자를 이용한 시너지 효과를 확인하기 위해 애기장대에서 리그닌 생합성 경로를 특이적으로 양성 조절하는 전사인자인 Myb58 유전자를 과발현하는 형질전환체를 제작하였다. Myb58 유전자는 F5H 유전자의 발현을 향상시킬 수 없으므로 UGT72E3/2와 F5H 유전자를 모두 과발현하는 형질전환체와 교배하여 F2 세대에서 Myb58, UGT72E3/2 및 F5H 유전자를 모두 과발현하는 형질전환체 라인을 선별하고 다음 세대에서 순종을 확보하였다. 이들 형질전환체의 잎과 뿌리에서 HPLC를 이용한 시린진의 합성 효율을 조사한 결과, UGT72E3/2, F5H 및 Myb58 유전자가 모두 과발현된 형질전환체의 잎에서 시린진의 생산량이 UGT72E3/2 및 F5H 유전자가 과발현된 형질전환체에 비해 8배, UGT72E3/2만 단독으로 과발현된 형질전환체에 비해서는 10배 증가하는 탁월한 효과를 확인하였다. 더욱이 상기 형질전환체의 잎에서의 시린진 생산량은 뿌리에서의 생산량보다도 약 2배 이상 증가한 것으로 나타났다. UGT72E3/2, F5H 및 Myb58 유전자의 과발현에 의한 시너지 효과로서 가장 이상적으로 뿌리에서의 시린진 생성이 2배 정도 감소하고 잎에서의 시린진 생성이 크게 증가하는 것을 확인하였고, 상기 방법으로 시린진을 대량 생산하는 식물 형질전환체를 완성하였다.
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Claims (12)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체.
  2. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체.
  3. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체.
  4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CHS(chalcone synthase) 단백질을 코딩하는 유전자를 녹아웃(knock-out)시키는 침묵 벡터로 형질전환되어 야생형에 비해 시린진 생산이 증가된 형질전환 식물체.
  5. (a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
    (b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 (a)단계의 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체와 상기 (b)단계의 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  6. (a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
    (b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 (a)단계의 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체와 상기 (b)단계의 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계;
    (d) 서열번호 6으로 이루어진 Myb58 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 Myb58 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
    (e) 상기 (c)단계의 선발된 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체와 상기 (d)단계의 Myb58 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질, F5H 단백질 및 Myb58 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  7. (a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
    (b) 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 F5H(furulate 5-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 (a)단계의 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체와 상기 (b)단계의 F5H 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계;
    (d) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 Myb63 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 Myb63 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
    (e) 상기 (c)단계의 선발된 UGT72E3/2 단백질 및 F5H 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체와 상기 (d)단계의 Myb63 단백질 과발현 형질전환 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질, F5H 단백질 및 Myb63 단백질을 동시에 과발현하는 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  8. (a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 당전이 효소 UGT72E3/2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물체를 형질전환시켜 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체를 제조하는 단계;
    (b) 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 CHS(chalcone synthase) 단백질을 코딩하는 유전자가 녹아웃(knock-out)된 식물체를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 (a)단계의 UGT72E3/2 단백질 과발현 형질전환 식물체와 상기 (b)단계의 CHS 단백질 코딩 유전자가 녹아웃된 식물체를 교배하여 UGT72E3/2 단백질을 과발현하고, CHS 단백질의 발현이 억제된 형질전환 식물체를 선발하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시린진(syringin) 생산이 증가된 형질전환 식물체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  11. 제9항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  12. 제9항에 따른 형질전환 식물체의 종자.
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