KR101399242B1

KR101399242B1 - 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소

Info

Publication number: KR101399242B1
Application number: KR1020127007297A
Authority: KR
Inventors: 미사 오치아이
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2009-09-18
Filing date: 2010-09-21
Publication date: 2014-05-27
Anticipated expiration: 2030-09-21
Also published as: CN102753685A; AU2010296296B2; JP5193371B2; WO2011034199A1; AU2010296296A1; EP2479271A1; DK2479271T3; RU2499835C1; US20130252308A1; BR112012005913A2; CA2774408A1; EP2479271A4; KR20120048023A; RU2012115455A; US8980607B2; EP2479271B1; CN102753685B; JPWO2011034199A1; CA2774408C

Abstract

본 발명은 신규한 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소를 제공하는 것을 목적으로 하며, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소, 그것을 코드하는 폴리뉴클레오티드 등에 관한 것이다. 본 발명은 예컨대, 서열번호 1 또는 4의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터 및 형질전환체, 그 형질전환체를 이용하는 식품 등의 제조 방법, 또는 그와 같은 제조법에 따라 제조된 식품 등을 제공한다.

Description

글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소{GLYCEROL-3-PHOSPHATE ACYL TRANSFERASE}

본 발명은 신규한 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 그 이용 방법에 관한 것이다.

지방산은, 인지질이나 트리아실글리세롤 등 지질을 구성하는 중요한 성분이다. 불포화 결합을 2개소 이상 함유하는 지방산은, 고도 불포화 지방산(PUFA)이라고 총칭되고, 구체예로서는, 아라키돈산이나 디호모γ리놀렌산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 등이 알려져 있다. 이 고도 불포화 지방산 중, 몇개의 종류는, 동물이 체내에서 합성할 수 없다. 따라서, 이러한 고도 불포화 지방산에 대해서는, 필수 지방산으로서 음식물로부터 섭취할 필요가 있다.

동물 체내에 있어서, 고도 불포화 지방산은 다종 다양한 장기 및 조직에 포함되어 있다. 예컨대, 아라키돈산은 동물의 부신선이나 간장으로부터 추출한 지질로부터 분리된다. 그러나, 동물 장기에는 고도 불포화 지방산은 소량밖에 포함되어 있지 않기 때문에, 동물 장기로부터 추출·분리되는 고도 불포화 지방산만으로는, 충분한 공급량을 얻을 수 없다. 그 때문에, 여러가지 미생물을 배양하여 고도 불포화 지방산을 획득하는 방법이 개발되어 왔다. 그 중에서도 모르티에렐라(Mortierella)속 미생물은, 아라키돈산 등의 고도 불포화 지방산 함유 지질을 효율적으로 생산하는 미생물로서 알려져 있다. 또한, 식물에서 고도 불포화 지방산을 생산시키는 시도도 이루어져 있다. 고도 불포화 지방산은, 트리아실글리세롤 등의 저장 지질을 구성하며, 미생물의 균체 내 혹은 식물 종자 중에 축적되는 것이 알려져 있다.

저장 지질인 트리아실글리세롤은, 생체 내에서 이하와 같이 생성된다. 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소에 의해 글리세롤-3-인산에 아실기가 전이되어 리소포스파티딘산이 생긴다. 다음에, 리소포스파티딘산아실기 전이 효소에 의해 리소포스파티딘산에 아실기가 전이되어 포스파티딘산이 생긴다. 그리고, 포스파티딘산이, 포스파티딘산포스파타아제에 의해 탈인산화됨으로써 디아실글리세롤이 생긴다. 마지막으로, 디아실글리세롤아실기 전이 효소에 의해 디아실글리세롤에 아실기가 전이되어 트리아실글리세롤이 생긴다.

상기 트리아실글리세롤 생합성 경로나 인지질 생합성 경로에 있어서, 글리세롤-3-인산의 아실화에 의해 리소포스파티딘산(lysophosphatidic acid)이 생성되는 반응에는, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소(이하, 「GPAT」라고 기재하는 경우도 있음: EC 2.3.1.15)가 개재하는 것이 알려져 있다.

GPAT 유전자의 존재는 지금까지 몇개의 생물에서 보고되어 있다. 포유 동물 유래의 GPAT 유전자로서, 소포체형(막 결합형)과 미토콘드리아형(막 결합형)의 2종류가 클론화되어 있다(비특허문헌 2). 또한, 식물 유래의 GPAT 유전자로서 소포체형(막 결합형), 미토콘드리아형(막 결합형) 및 엽록체형(유리형)의 3종류가 클론화되어 있다(비특허문헌 3).

진균인 Saccharomyces cerevisiae 유래의 GPAT 유전자로서, 소포체형(막 결합형)의 GPT2/GAT1(YKR067w)과 SCT1/GAT2(YBL011w)의 2종류가 클론화되어 있고, 이들을 동시에 결실시키면 치사인 것이 알려져 있다(비특허문헌 4). 여기서, GPT2는 팔미틴산(16:0)부터 올레인산(18:1)에 이르기까지, 폭넓은 범위의 지방산을 기질로 하는 활성을 갖는데 대하여, SCT1은 팔미틴산(16:0), 팔미톨레산(16:1)이라고 하는 탄소수 16의 지방산을 기질로 하는 것에 강한 선택성을 갖는 것이 나타나 있다(비특허문헌 4).

상기 외에도 많은 생물종으로부터 GPAT 유전자는 클론화되어 있다. 특히, 지질 생산균인 모르티에렐라(Mortierella)속 미생물 유래의 GPAT에 대해서도 이하와 같은 보고가 있다.

Mortierella ramanniana 유래의 GPAT에 대해서는, 소포체형 GPAT가 단리되고, 이것이 팔미틴산(16:0)보다도 올레인산(18:1)을 5.4배 높은 선택성을 가지고 아실 도너(donor)로서 이용하는 것이 나타나 있다(비특허문헌 5). Mortierella alpina(이하, 「M. alpina」라고 기재하는 경우도 있음) 유래의 GPAT에 대해서는, 마이크로솜 분획에 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성이 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 6).

M. alpina의 마이크로솜에 존재하는 GPAT(막에 결합하고 있는 상태)와 여러가지 아실 CoA를 인비트로(in vitro)에서 반응시키면, GPAT는, 높은 활성을 유지한 채로, 올레인산(18:1), 리놀산(18:2), 디호모γ리놀렌산(DGLA)(20:3), 아라키돈산(20:4)이라고 하는 고도 불포화 지방산을 널리 기질로서 이용하는 것이 나타나 있다(특허문헌1).

M. alpina(ATCC #16266)로부터 클로닝된 GPAT(이하, 본 명세서에서는 MaGPAT1(ATCC #16266)로 기재함)를, 에이코사펜타엔산(EPA)까지 생합성할 수 있도록 형질전환된 Yarrowia lipolytica 내에서 발현시킨 바, 총지방산 중, 디호모γ리놀렌산(DGLA)(20:3)의 조성이 증가하고, 올레인산(18:1)의 조성이 감소하는 것이 나타났다. 이 결과는, 보다 장쇄이며 불포화도가 높은 고도 불포화 지방산이 선택적으로 취입되어 있는 것을 나타내는 것이다(특허문헌 2).

최근, M. alpina(1S-4)로부터 GPAT 호몰로그(homologue)인 MaGPAT2가 단리되고, MaGPAT1과는 다른 기질 특이성을 나타내는 것이 보고되어 있다(특허문헌 3). 즉, MaGPAT1은 팔미틴산에 대한 특이성이 높고, MaGPAT2는 올레인산에 대한 특이성이 높은 것이 시사되어 있다.

특허문헌 1: 국제 공개 제WO2004/087902호 팜플렛 특허문헌 2: 미국 특허 출원 공개 제2006/0094091호 명세서 특허문헌 3: 국제 공개 제WO2008/156026호 팜플렛

비특허문헌 1: Lipids, 39, 1147(2004) 비특허문헌 2: Biochimica et Biophysica Acta, 1348, 17-26, 1997 비특허문헌 3: Biochimica et Biophysica Acta, 1348, 10-16, 1997 비특허문헌 4: The Journal of Biological Chemistry, 276(45), 41710-41716, 2001 비특허문헌 5: The Biochemical Journal, 355, 315-322, 2001 비특허문헌 6: Biochemical Society Transactions, 28, 707-709, 2000

전술한 바와 같은 상황 하에서, 리소포스파티딘산, 및 이것을 기초로 생성되는 트리아실글리세롤을 효율적으로 생산함으로써, 지방산 생산 경로의 추가의 활성화 및 효율화에 기여하는 새로운 GPAT 호몰로그가 요구되고 있다.

본 발명자들은 예의 연구한 결과, 지질 생산균인 M. alpina의 제3 GPAT 호몰로그(MaGPAT3)를 코드하는 유전자를 클로닝하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 발명은 이하의 폴리뉴클레오티드, 단백질, 발현 벡터, 형질전환체, 그 형질전환체를 이용하는 식품 등의 제조 방법, 및 그와 같은 제조법에 따라 제조된 식품 등을 제공한다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 이하의 (a)∼(e)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드:

(a) 서열번호 1 또는 4의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;

(c) 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 1∼100개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드;

(d) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대하여, 85％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 또한 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및

(e) 서열번호 1 또는 4의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드로서, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.

[2] 이하의 (f) 또는 (g) 중 어느 하나에 기재된 상기 [1]에 기재된 폴리뉴클레오티드:

(f) 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및

(g) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대하여, 90％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 또한 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.

[3] 서열번호 1 또는 4의 염기 서열을 함유하는, 상기 [1]에 기재된 폴리뉴클레오티드.

[4] 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는, 상기 [1]에 기재된 폴리뉴클레오티드.

[5] DNA인, 상기 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드.

[6] 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질.

[7] 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.

[8] 상기 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 비인간 형질전환체.

[9] 상기 [7]에 기재된 벡터가 도입된 비인간 형질전환체.

[10] 상기 형질전환체가 지질 생산균인, 상기 [8] 또는 [9]에 기재된 형질전환체.

[11] 상기 지질 생산균이, 모르티에렐라·알피나(Mortierella alpina)인, 상기 [10]에 기재된 형질전환체.

[12] 상기 [8]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 형질전환체의 배양물로부터, 지질 또는 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는, 지질 또는 지방산 조성물의 제조 방법.

[13] 상기 [12]에 기재된 제조 방법에 따라 채취된 지질 또는 지방산 조성물을 함유하는 식품, 의약품, 화장품 또는 비누.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 지질 생산균(예컨대, M. alpina), 효모, 식물 등의 형질전환에 이용할 수 있고, 그와 같이 하여 얻어지는 형질전환 지질 생산균, 형질전환 효모 또는 형질전환 식물 등은 지방산 조성물, 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 제조에 이용할 수 있다.

보다 구체적으로는, 본 발명의 형질전환체는, 트리글리세리드의 생산 효율이 매우 높고, 형질전환체에 있어서 보여지는 지방산 증가의 대부분은, 트리글리세리드 중의 지방산이 증가한 것에 기인한 것이다. 따라서, 본 발명은 대량의 트리글리세리드나 지방산을 필요로 하는 의약품 혹은 건강 식품의 제조에 유효하게 사용할 수 있다.

도 1a은 MaGPAT3의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 나타내는 도면이다.
도 1b는 도 1a의 계속이다.
도 1c은 도 1b의 계속이다.
도 2a은 MaGPAT3(1S-4)의 CDS 서열과 추정 아미노산 서열을 나타내는 도면이다.
도 2b는 도 2a의 계속이다.
도 3은 MaGPAT1((1S-4) 및 (ACTT #16266))과 MaGPAT3(1S-4)의 아미노산 서열의 얼라이먼트를 나타내는 도면이다.
도 4는 각종 GPAT 호몰로그 단백질(MaGPAT1, MaGPAT3, ScSCT1 및 ScGPT2)의 아미노산 서열의 얼라인먼트를 나타내는 도면이다. GPAT 호몰로그로 보존되어 있는 4개의 도메인과 그 도메인 중, GPAT 활성에 중요하다고 하는 아미노산 잔기(*표) 및 글리세롤-3-인산과의 결합에 중요한 아미노산 잔기(+표)가, GPAT3에 있어서도 보존되어 있었다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 이하의 실시의 형태는, 본 발명을 설명하기 위한 예시이며, 본 발명을 이 실시형태에만 한정하는 취지가 아니다. 본 발명은, 그 요지를 일탈하지 않는 한, 여러가지 형태로 실시를 할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용한 모든 문헌, 및 공개 공보, 특허 공보 그 외의 특허문헌은, 참조로서 본 명세서에 편입되는 것으로 한다. 또한, 본 명세서는, 2009년 9월 18일에 출원된 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본국 특허 출원(특허 출원 제2009-217646호)의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.

본 발명자들은 후술하는 실시예에 있어서 상세하게 기재하는 바와 같이, 지질 생산균인 M. alpina 유래의 제3번째의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 호몰로그의 유전자(MaGPAT3)의 전장 cDNA의 클로닝에 처음으로 성공하였다. 또한, 본 발명자들은 M. alpina 유래의 MaGPAT3의 게놈 DNA의 염기 서열, 및 추정 아미노산 서열도 동정하였다. MaGPAT3의 ORF 서열, MaGPAT3의 추정 아미노산 서열, MaGPAT3의 CDS 서열 및 MaGPAT3의 게놈 서열은, 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4이다. 또한, M. alpina 유래의 MaGPAT1의 게놈 서열을 서열번호 5로 나타낸다. 이들 폴리뉴클레오티드 및 효소는, 후술하는 실시예에 기재한 방법, 공지의 유전자 공학적 방법, 공지의 합성 방법 등에 의해 취득하는 것이 가능하다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오티드

우선, 본 발명은 이하의 (a)∼(e)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 명세서 중, 「폴리뉴클레오티드」란, DNA 또는 RNA를 의미한다.

본 명세서 중, 「스트린젠트한 조건 하에서 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드」란, 예컨대, 서열번호 1 또는 4의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 프로브로서, 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법 또는 서던 하이브리다이제이션법 등을 이용함으로써 얻어지는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 하이브리다이제이션의 방법으로서는, 예컨대, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001" 및 "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997" 등에 기재되어 있는 방법을 이용할 수 있다.

본 명세서 중, 「스트린젠트한 조건」이란, 저스트린젠트한 조건, 중스트린젠트한 조건 및 고스트린젠트한 조건 중 어느 것이라도 좋다. 「저스트린젠트한 조건」은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5％ SDS, 50％ 포름아미드, 32℃의 조건이다. 또한, 「중스트린젠트한 조건」은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5％ SDS, 50％ 포름아미드, 42℃의 조건이다. 「고스트린젠트한 조건」은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5％ SDS, 50％ 포름아미드, 50℃의 조건이다. 이들 조건에 있어서, 온도를 올릴수록 높은 동일성을 갖는 DNA가 효율적으로 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단, 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 주는 요소로서는 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 이온 강도, 시간, 염농도 등의 복수의 요소가 생각되고, 당업자이면 이들 요소를 적절하게 선택함으로써 동일한 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.

또한, 하이브리다이제이션에 시판 키트를 이용하는 경우는, 예컨대 Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)을 이용할 수 있다. 이 경우는, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라, 표지한 프로브와의 인큐베이션을 하룻밤 행한 후, 멤브레인을 55℃의 조건 하에서 0.1％(w/v) SDS를 포함하는 1차 세정 버퍼로 세정 후, 하이브리드화한 DNA를 검출할 수 있다.

상기 이외에 하이브리드화 가능한 폴리뉴클레오티드로서는, FASTA, BLAST 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해, 디폴트의 파라미터를 이용하여 계산하였을 때에, 서열번호 1 또는 4의 DNA, 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코드하는 DNA와 74％ 이상, 75％ 이상, 76％ 이상, 77％ 이상, 78％ 이상, 79％ 이상, 80％ 이상, 81％ 이상, 82％ 이상, 83％ 이상, 84％ 이상, 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상, 99.1％ 이상, 99.2％ 이상, 99.3％ 이상, 99.4％ 이상, 99.5％ 이상, 99.6％ 이상, 99.7％ 이상, 99.8％ 이상, 또는 99.9％ 이상의 동일성을 갖는 DNA를 들 수 있다.

또한, 아미노산 서열이나 염기 서열의 동일성은, FASTA(Science 227(4693): 1435-1441, (1985))나, 카린 및 아서에 의한 알고리즘 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993)를 이용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘에 기초한 BLASTN, BLASTX나 BLASTP라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990). BLASTN을 이용하여 염기 서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예컨대 score=100, wordlength=12로 한다. 또한, BLASTP를 이용하여 아미노산 서열을 해석하는 경우는, 파라미터는, 예컨대 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 이용한다.

상기한 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 공지의 유전자 공학적 방법 또는 공지의 합성 방법에 의해 취득하는 것이 가능하다.

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 다음에 나타내는 단백질을 제공한다.

(i) 상기 (a)∼(e) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질.

(ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(iii) 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서의 1 혹은 복수개의 아미노산이, 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하며, 또한 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질.

(iv) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대하여 85％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 또한 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질.

상기 (iii) 또는 (iv)에 기재된 단백질은, 대표적으로는, 천연에 존재하는 서열번호 2의 단백질의 변이체이지만, 예컨대, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", "Nuc. Acids. Res., 10, 6487(1982)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)", "Gene, 34, 315(1985)", "Nuc. Acids. Res., 13, 4431(1985)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)" 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 이용하여, 인위적으로 취득할 수 있는 것도 포함된다.

본 명세서 중, 「서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서의 1 혹은 복수개의 아미노산이, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질」로서는, 서열번호 2의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대, 1∼100개, 1∼90개, 1∼80개, 1∼70개, 1∼60개, 1∼50개, 1∼40개, 1∼39개, 1∼38개, 1∼37개, 1∼36개, 1∼35개, 1∼34개, 1∼33개, 1∼32개, 1∼31개, 1∼30개, 1∼29개, 1∼28개, 1∼27개, 1∼26개, 1∼25개, 1∼24개, 1∼23개, 1∼22개, 1∼21개, 1∼20개, 1∼19개, 1∼18개, 1∼17개, 1∼16개, 1∼15개, 1∼14개, 1∼13개, 1∼12개, 1∼11개, 1∼10개, 1∼9개(1∼수개), 1∼8개, 1∼7개, 1∼6개, 1∼5개, 1∼4개, 1∼3개, 1∼2개, 또는 1개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수는, 일반적으로는 적을수록 바람직하다.

또한, 이러한 단백질로서는, 서열번호 2의 아미노산 서열과 85％ 이상, 86％ 이상, 87％ 이상, 88％ 이상, 89％ 이상, 90％ 이상, 91％ 이상, 92％ 이상, 93％ 이상, 94％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상, 99％ 이상, 99.1％ 이상, 99.2％ 이상, 99.3％ 이상, 99.4％ 이상, 99.5％ 이상, 99.6％ 이상, 99.7％ 이상, 99.8％ 이상, 또는 99.9％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지고, 또한 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 동일성의 수치는 일반적으로 클수록 바람직하다.

또한, 글리세롤-3-인산 아실기 전이 활성은, 예컨대, J.B.C. 276(45), 41710-41716(2001)에 기재된 방법에 따라 측정할 수 있다. 또한, GPAT 활성을 확인하는 방법으로서는, 효모의 Δgpt2, Δsct1주를 이용한 상보 실험을 들 수 있다. 해당 효소를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 Δgpt2, Δsct1주 중(GPT2 및 SCT1은, 동시에 결실시키면 치사임)에서 발현시킨 경우에, Δgpt2, Δsct1주가 증식할 수 있으면, 그 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질 또는 펩티드는 GPAT 활성을 갖는다고 하는 것이 가능하다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되었다고 하는 것은, 동일 서열 중의 임의의 1 혹은 복수의 아미노산 서열 중의 위치에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가가 있는 것을 의미하고, 결실, 치환, 삽입 및 부가 중 2종 이상이 동시에 생겨도 좋다.

이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 예를 나타낸다. 동일 군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다. A군: 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; B군: 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디핀산, 2-아미노수베린산; C군: 아스파라긴, 글루타민; D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산; E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; F군: 세린, 트레오닌, 호모세린; G군: 페닐알라닌, 티로신.

또한, 본 발명의 단백질은, Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, Advanced Automation Peptide Protein Technologies사 제조, Perkin Elmer사 제조, Protein Technologies사 제조, PerSeptive사 제조, Applied Biosystems사 제조, SHIMADZU사 제조 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

3. 본 발명의 벡터 및 이것을 도입한 형질전환 체

본 발명은 또한, 별도의 실시형태에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터는, 통상, (i) 숙주 세포 내에서 전사 가능한 프로모터; (ii) 그 프로모터에 결합하는, 상기 (a)∼(g) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드; 및 (iii) RNA 분자의 전사 종결 및 폴리아데닐화에 관한 것으로, 숙주 세포 내에서 기능하는 시그널을 구성 요소로서 포함하는 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 이와 같이 구축되는 벡터는, 숙주 세포에 도입된다. 본 발명에 있어서 사용되는 적절한 숙주 세포의 예로서는, 지질 생산균, 효모 등을 들 수 있다.

지질 생산균으로서는, 예컨대, MYCOTAXON, Vol. XLIV, No. 2, pp. 257-265(1992)에 기재되어 있는 균주를 사용할 수 있고, 구체적으로는, 모르티에렐라(Mortierella)속에 속하는 미생물, 예컨대, 모르티에렐라·엘롱가타(Mortierella elongata) IFO8570, 모르티에렐라·엑시구아(Mortierella exigua) IFO8571, 모르티에렐라·하이그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941, 모르티에렐라·알피나(Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등의 모르티에렐라 아속(subgenus Mortierella)에 속하는 미생물, 또는 모르티에렐라·이사벨리나(Mortierella isabellina) CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, 모르티에렐라·나나(Mortierella nana) IFO8190, 모르티에렐라·라만니아나(Mortierella ramanniana) IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287, 모르티에렐라·비나세아(Mortierella vinacea) CBS236.82 등의 마이크로뮤코 아속(subgenus Micromucor)에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 특히, 모르티에렐라·알피나(Mortierella alpina)가 바람직하다.

또한, 효모의 예로서는, 사카로마이시스·세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954 등을 들 수 있다.

또한, 효모 내에 본 발명의 벡터를 도입하여, 그 벡터가 코드하는 GPAT3 단백질의 글리세롤-3-인산 아실기 전이 활성을 조사하는 경우, 숙주 세포로서 이용하는 효모의 GPAT 유전자(Gpt2p 및 Sct1p)가 결손하고 있으면, 그 GPAT3 단백질의 효소 활성만을 평가하는 것이 가능해진다. 따라서, 본 발명의 일양태에 있어서는, 숙주 세포로서의 효모는, Gpt2p 유전자 및 Sct1p 유전자가 결손하고 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 벡터로 형질전환된 이들 숙주 세포는, 본 발명의 벡터로 형질전환되어 있지 않은 숙주 세포에 비해서, 보다 많은 양의 트리글리세리드를 생성한다. 본 발명의 벡터의 도입에 의해 증가하는 지방산의 대부분은 트리글리세리드를 구성하는 지방산이다.

지질 생산균에 도입할 때에 이용하는 벡터로서는, 예컨대, pDura5(Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004))가 이용 가능하지만, 이것에 한정되지 않는다.

효모에 도입할 때에 이용하는 벡터로서는, 효모 세포 내에서 인서트를 발현하는 활성을 갖는 벡터이면 특별히 한정되지 않지만, 예로서는, pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)을 들 수 있다.

숙주 세포 중에서의 유전자 발현을 조절하기 위한 프로모터/터미네이터로서는, 숙주 세포 중에서 기능하는 한, 임의의 조합이어도 좋다. 예컨대, 지질 생산균에서 이용하는 경우는 histon H4.1 유전자의 프로모터, 글리세르알데히드-3-인산디히드로게나아제 유전자의 프로모터 등을 이용 가능하다.

형질전환 시에 이용하는 선택 마커로서는, 영양 요구성 마커(ura5, niaD), 약제 내성 마커(hygromycine, 제오신), 제네티신 내성 유전자(G418r), 구리 내성 유전자(CUP1)(Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984), 세룰레닌 내성 유전자(fas2m, PDR4)(각각 이노코시 쥰지 등, 생화학, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991) 등이 이용 가능하다.

숙주 세포의 형질전환 방법으로서는, 일반적으로 이용되는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 지질 생산균의 경우, 일렉트로포레이션법(Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000)이나 파티클 딜리버리법(일본 특허 공개 제2005-287403호 「지질 생산균의 육종 방법」에 기재된 방법)을 이용할 수 있다. 또한, 효모의 경우는, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)), 초산리튬법(J. Bacteriology, 153, p163(1983)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 등에 기재된 방법으로 실시 가능하지만, 이들에 한정되지 않는다.

그 외, 일반적인 클로닝 기술에 관해서는, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Methods in Yeast Genitics, A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)" 등을 참조할 수 있다.

4. 본 발명의 지질 또는 지방산 조성물의 제조 방법

본 발명은 또한, 별도의 실시형태에 있어서, 상기 형질전환 지질 생산균 또는 효모를 이용하는 지질 또는 지방산 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 명세서 중, 「지질」이란, 지방산과 알코올이 에스테르 결합한 화합물(예컨대, 글리세리드) 또는 그 유사체(예컨대, 콜레스테롤에스테르) 등을 포함하는 단순 지질, 단순 지질의 일부에 추가로 인산, 아미노산, 당 등이 결합한 복합 지질, 및 지질의 가수 분해물로 물에 녹지 않는 유도 지질을 말하는 것으로 한다.

본 명세서 중, 「유지」란, 글리세롤과 지방산의 에스테르(글리세리드)를 말한다.

본 명세서 중, 「지방산」이란, 일반식 RCOOH(R은 알킬기)로 나타내는 지방족 모노카르복실산(카르복실기를 1개 가지며, 탄소 원자가 쇄형으로 연결된 카르복실산)을 말한다. 지방산에는, 탄화 수소쇄 중에 이중 결합을 갖지 않는 포화 지방산과, 이중 결합을 포함하는 불포화 지방산이 포함된다.

본 발명의 지질 또는 지방산 조성물은, 본 발명에 따라 형질전환한 세포로부터 이하와 같이 하여 추출할 수 있다. 생물(예컨대, 지질 생산균 또는 효모)의 형질전환주에 대해서, 배양 종료 후, 원심 분리법, 여과 등의 통상법에 따라 배양 세포를 얻는다. 세포를 충분히 수세하고, 바람직하게는 건조한다. 건조는, 동결 건조, 풍건 등에 의해 행할 수 있다. 건조 세포를, 필요에 따라, 다이노밀이나 초음파 등에 의해 파쇄한 후, 바람직하게는 질소 기류 하에서 유기 용매에 의해 추출 처리한다. 유기 용매로서는 에테르, 헥산, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 석유에테르 등을 이용할 수 있고, 또는 메탄올 및 석유에테르의 교대 추출 또는 클로로포름-메탄올-물의 1층계의 용매를 이용한 추출에 의해서도 양호한 결과를 얻을 수 있다. 추출물로부터 감압 하에서 유기 용매를 증류함으로써, 지방산을 함유하는 지질을 얻을 수 있다. 추출한 지방산은, 염산메탄올법 등에 따라 메틸에스테르화하여도 좋다.

또한, 상기 지방산을 함유하는 지질로부터의 지방산의 분리는, 혼합 지방산 또는 혼합 지방산 에스테르의 상태에서, 통상법(예컨대, 요소 부가법, 냉각 분리법, 컬럼크로마토그래피법 등)에 따라 농축 분리함으로써 행할 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 따라 얻어진 지질 또는 지방산 조성물은, 통상법에 따라, 예컨대, 유지를 포함하는 식품, 의약품, 공업 원료(화장료, 비누 등의 원료)의 제조 등의 용도에 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 별도의 실시형태에 있어서, 본 발명의 형질전환 지질 생산균 또는 형질전환 효모를 이용하는 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은, 본 발명의 형질전환 지질 생산균 또는 형질전환 효모를 이용하여 지질 또는 지방산을 생성하는 공정을 포함한다. 생성된 지질 또는 지방산을 함유하는 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 조제는, 통상법에 따른다. 이와 같이, 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 식품, 화장료, 의약, 비누 등은, 본 발명의 형질전환 지질 생산균 또는 형질전환 효모를 이용하여 생성된 지질 또는 지방산을 함유한다. 본 발명은 또한, 그와 같은 방법에 따라 제조된 식품, 화장료, 의약, 비누 등을 제공한다.

본 발명의 화장품(조성물) 또는 의약품(조성물)의 제형은, 특별히 한정되지 않고, 용액형, 페이스트형, 겔형, 고체형, 분말형 등 임의의 제형을 취할 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물 또는 의약 조성물은, 오일, 로션, 크림, 유액, 겔, 샴푸, 헤어 린스, 헤어 컨디셔너, 에나멜, 파운데이션, 립스틱, 분, 팩, 연고, 향수, 파우더, 오데코롱, 치약, 비누, 에어로졸, 클렌징폼 등의 화장료 혹은 피부 외용약 외에, 피부 노화 방지 개선제, 피부 염증 방지 개선제, 목욕용제, 양모제, 피부 미용액, 햇볕 그을림 방지제 혹은, 외상, 살갖 틈, 손발 틈 등에 의한 피부 거칠음의 방지 개선제 등에 이용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은, 필요에 따라 추가로, 그 외의 유지, 및/또는 색소, 향료, 방부제, 계면 활성제, 안료, 산화 방지제 등을 적절하게 배합할 수 있다. 이들의 배합 비율은, 목적에 따라 당업자가 적절하게 결정할 수 있다(예컨대, 유지는, 조성물 중에, 1∼99.99 중량％, 바람직하게는, 5∼99.99 중량％, 보다 바람직하게는, 10∼99.95 중량％ 함유될 수 있음). 또한, 본 발명의 의약 조성물은, 필요에 따라 추가로, 그 외의 의약 활성 성분(예컨대, 소염 성분) 또는 보조 성분(예컨대, 윤활 성분, 담체 성분)을 포함하고 있어도 좋다. 예컨대, 화장료 혹은 피부 외용약에 있어서의 그 외의 상용 성분으로서는, 여드름용 약제, 비듬·가려움 방지제, 제한 방취제, 열상용 약제, 진드기·이 방지제, 각질 연화제, 건피증용 약제, 항바이러스제, 경피 흡수 촉진제 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품의 예로서는, 영양 보조 식품, 건강 식품, 기능성 식품, 유아용 식품, 유아용 조제유, 미숙아용 조제유, 노인용 식품 등을 들 수 있다. 본 명세서 중, 식품은, 고체, 유동체, 및 액체, 및 이들의 혼합물로서, 섭식 가능한 것의 총칭이다.

영양 보조 식품이란, 특정 영양 성분이 강화되어 있는 식품을 말한다. 건강 식품이란, 건강적인 또는 건강에 좋다고 하는 식품을 말하며, 영양 보조 식품, 자연 식품, 다이어트 식품 등을 포함한다. 기능성 식품이란, 몸의 조절 기능을 달성하는 영양 성분을 보급하기 위한 식품을 말하며, 특정 보건 용도 식품과 동의이다. 유아용 식품이란, 약 6세까지의 아이에게 부여하기 위한 식품을 말한다. 노인용 식품이란, 무처리 식품과 비교하여 소화 및 흡수가 용이하도록 처리된 식품을 말한다. 유아용 조제유란, 약 1세까지의 아이에게 부여하기 위한 조제유를 말한다. 미숙아용 조제유란, 미숙아가 생후 약 6개월이 될 때까지 부여하기 위한 조제유를 말한다.

이들 식품의 형태의 예로서는, 고기, 생선, 넛츠 등의 천연 식품(유지로 처리한 것), 중화 요리, 라면, 스프 등의 조리 시에 유지를 부가하는 식품, 프리터, 프라이, 유부, 볶음밥, 도넛, 튀긴 밀가루 과자 등의 열매체로서 유지를 이용한 식품, 버터, 마가린, 마요네즈, 드레싱, 초콜렛, 즉석 라면, 캬라멜, 비스켓, 쿠키, 케이크, 아이스크림 등의 유지 식품 또는 가공 시에 유지를 부가한 가공 식품, 튀긴 쌀과자, 하드 비스켓, 팥빵 등의 가공 마무리 시에 유지를 분무 또는 도포한 식품 등을 들 수 있다. 그러나, 유지를 포함하는 식품에 한정되는 것은 아니고, 예컨대, 빵, 면류, 밥, 과자류(캔디, 츄잉 검, 구미, 정제형 과자, 화과자), 두부 및 그 가공품 등의 농산 식품, 청주, 약용주, 미림, 식초, 간장, 된장 등의 발효 식품, 요구르트, 햄, 베이컨, 소시지 등의 축산 식품, 카마보코, 튀긴 어묵, 한펜 식품 등의 수산 식품, 과즙 음료, 청량 음료, 스포츠 음료, 알코올 음료, 차 등이어도 좋다.

본 발명의 식품은 또한, 캡슐 등의 의약 제제의 형태, 또는 단백질, 당류, 지방, 미량 원소, 비타민류, 유화제, 향료 등에 본 발명의 유지가 배합된 자연 유동식, 반소화 형태 영양식, 및 성분 영양식, 드링크제, 경장 영양제 등의 가공 형태여도 좋다.

이상에 기재한 바와 같이, 본 발명의 GPAT3 유전자를 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써, 효율적으로 지방산을 생성시키는 것이 가능하다.

또한, 해당 유전자의 발현량을 지표로 하여, 지방산 생산을 효율적으로 행하기 위한 배양 조건의 검토, 배양 관리 등에도 이용할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는, 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.

[실시예 1] M. alpina 의 게놈 해석

M. alpina 1S-4주를 100 ㎖의 GY2:1 배지(2％ 글루코오스, 1％ 효모 엑기스 pH 6.0)에 식균하고, 28℃에서 2일간 진탕 배양하였다. 여과에 의해 균체를 집균하고, DNeasy(QIAGEN)를 이용하여 게놈 DNA를 조제하였다.

상기 게놈 DNA의 염기 서열을, Roche 454 Genome Sequencer FLX Standard를 이용하여 결정하였다. 그때, 프래그멘트 라이브러리의 염기 서열 결정을 2런분, 메이트페어 라이브러리의 염기 서열 결정을 3런분 행하였다. 얻어진 염기 서열을 어셈블리함으로써, 300개의 Super Contig을 얻었다.

M. alpina 1S-4주의 cDNA 의 합성

M. alpina 1S-4주를 4 ㎖의 배지(2％ 글루코오스, 1％ 효모 엑기스, pH 6.0)에 식균하고, 4일간 28℃에서 배양하였다. 균체를 여과에 의해 회수하고, RNeasy plant kit(QIAGEN)를 이용하여 RNA를 추출하였다. SuperScript First Strand System for RT-PCR(Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.

GPAT 호몰로그의 탐색

MaGPAT1(ATCC #16266)의 아미노산 서열을 M. alpina 1S-4주의 게놈 염기 서열에 대하여, tblastn 검색한 결과, 서열번호 4, 서열번호 5로 나타내는 서열을 포함하는 Super contig이 히트하였다. 서열번호 5는, M. alpina 1S-4주 유래의 GPAT1(이하, 본 명세서에서는 MaGPAT1이라고 기재함)의 게놈 서열이라고 생각되었다. 한편, 서열번호 4는, 개시 코돈, 종지 코돈의 출현이나 MaGPAT1과의 비교로부터, 새로운 GPAT 호몰로그를 코드하는 서열이라고 생각되었다. 또한, 서열번호 4의 1-3번째의 잔기가 이 호몰로그의 개시 코돈이며, 그리고 3278-3280번째의 잔기가 종지 코돈이라고 추정되었다. 이 유전자를 MaGPAT3이라고 명명하였다.

MaGPAT3 유전자의 클로닝

MaGPAT3 유전자의 CDS를 클론화하기 위해, 이하의 프라이머를 제작하였다.

Eco-MaGPAT3-F: 5'-GAATTCATGGGTCTCCAGATCTATGACTTCGTCTC-3'(서열번호 6)

Sal-MaGPAT3-R: 5'-GTCGACTTATGCCTCCTTAGACTTGACTGCATCC-3'(서열번호 7)

상기 cDNA를 주형으로서, 프라이머 Eco-MaGPAT3-F와 프라이머 Sal-MaGPAT3-R을 이용하여, KOD-Plus(TOYOBO)에 의해 PCR 증폭을 행한 바, 약 2.2 kb의 DNA 단편이 증폭되었다. 이것을 Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 클론화하고, 얻어진 플라스미드를 pCR-MAGPAT3으로 하였다. 이 플라스미드의 인서트의 서열, 즉, MaGPAT3 유전자의 CDS 서열을 서열번호 3으로 나타낸다. 또한, MaGPAT3 유전자의 ORF 서열을 서열번호 1로 나타낸다.

서열 해석

MaGPAT3 유전자의 게놈 서열(서열번호 4)과 CDS 서열(서열번호 3)을 비교한 바, 본 유전자의 게놈 서열은, EXXON 7개, 인트롬 6개로 이루어지며, 753개의 아미노산 잔기로 이루어지는 단백질을 코드하고 있다고 추정된다(도 1 및 도 2). MaGPAT3과, M. alpina 유래의 공지의 GPAT 호몰로그의 서열을 비교하였다. MaGPAT3의 CDS 서열은, GPAT1(ATCC #16266)과 73.7％, GPAT1(1S-4)과 73.2％의 동일성을 나타내었다. 또한, MaGPAT3 단백질의 아미노산 서열은, GPAT1(ATCC #16266)과 82.9％, GPAT1(1S-4)과 83.7％의 동일성을 나타내었다(도 3). 또한, MaGPAT3 단백질의 아미노산 서열은, GPAT2(1S-4)의 아미노산 서열과는, 14.4％의 동일성을 나타내었다.

MaGPAT3의 추정 아미노산 서열(서열번호 2)을 GENEBANK nr에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 BLASTp로 상동성 해석을 행하였다. 그 결과, 이 서열에 대하여 가장 E-value가 낮았던 아미노산 서열, 즉 동일성이 높았던 아미노산 서열은, 담자균 Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21 유래의 GPAT 호몰로그(GENEBANK 수탁번호 XP_569487)이고, 그 아미노산 서열의 동일성은 40.3％였다. 또한, MaGPAT3의 추정 아미노산 서열은, 효모 S. cerevisiae 유래의 GPAT인 Sct1p의 아미노산 서열과는 33.3％, Gpt2p의 아미노산 서열과는 31.5％의 동일성을 나타내었다. M. alpina 1S-4주 유래의 GPAT3 및 GPAT1, 및 S.cerevisiae 유래의 GPAT인 Sct1과 Gpt2의 아미노산 서열을 비교하였다(도 4). GPAT 호몰로그로 보존되어 있는 4개의 도메인과 그 도메인 중의, GPAT 활성에 중요하다고 생각되는 아미노산 잔기(도 4의 *표) 및 글리세롤-3-인산과의 결합에 중요한 아미노산 잔기(도 4의 +표)는, GPAT3에 있어서도 보존되어 있었다.

[실시예 2] 효모 S. cerevisiae (Δ sct1 , Δ gpt2 )의 상보 실험

효모 S. cerevisiae에서는, GPAT 활성을 담당하는 유전자로서 SCT1과 GPT2가 알려져 있고, 이들을 동시에 결실시키면 치사인 것이 알려져 있다. M. alpina 유래의 MaGPAT1, MaGPAT3에 코드되는 단백질이 GPAT 활성을 갖는지의 여부를 확인하기 위해, Δsct1, Δgpt2의 상보 실험을 행하였다. 표 1에, 본 실험에서 제작한 주의 유전자형을 정리하였다.

GP -1주의 제작

yeast knock out strain collection(Open Biosystems)의 Δgpt2 호모 접합 2배체 효모(카탈로그 No. YSC1021-663938)의 SCT1 유전자를 이하의 방법으로 파괴하였다. 최초에, S. cerevisiae S288C주의 균체로부터, Gen 토루쿤(효모용)(TAKARA BIO)을 이용하여 DNA를 추출하였다. 이것을 주형으로서, 프라이머 Xba1-Des-SCT1-F: 5'-TCTAGAATGCCTGCACCAAAACTCAC-3(서열번호 8)과 프라이머 Xba1-Des-SCT1-R: 5'-TCTAGACCACAAGGTGATCAGGAAGA-3'(서열번호 9)를 이용하여, KOD-Plus(TOYOBO)에 의해 SCT1 유전자의 부분 서열을 PCR 증폭하였다. 증폭된 약 1.3 kbp의 DNA 단편을, Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 클론화하고, 얻어진 플라스미드를 pCR-SCT1P로 하였다. 계속해서, 플라스미드 YEp13을 제한 효소 SalI 및 XhoI로 소화하여 얻어진 LEU2 유전자의 CDS를 포함하는 약 2.2 kbp의 DNA 단편과, 플라스미드 pCR-SCT1P를 SalI로 소화하여 얻어진 약 4.4 kbp의 DNA 단편을, ligation high(TOYOBO)를 이용하여 연결하고, SCT1 유전자에 대하여 LEU2 유전자가 역방향으로 삽입된 플라스미드를 제작하며, 이 플라스미드를 pCR-Δsct1: LEU2로 하였다. pCR-Δsct1: LEU2를 제한 효소 XbaI로 소화하고, 상기Δgpt2 호모 접합 2배체 효모를 초산리튬법에 따라 형질전환하여, SD-Leu(1L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 트립토판 1.2 g, 우라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g)) 한천 배지(2％ 아가(agar))에서 생육할 수 있는 것을 형질전환체로서 선발하였다. 얻어진 형질전환주의 균체로부터 전술한 방법으로 DNA를 추출하였다. (1) 프라이머 SCT1outORF-F: 5'-AGTGTAGGAAGCCCGGAATT-3(서열번호 10) 및 프라이머 SCT1inORF-R: 5'-GCGTAGATCCAACAGACTAC-3'(서열번호 11)의 조합(0.5 kbp), 및 (2) 프라이머 SCT1outORF-F1과 프라이머 LEU2 in ORF-F: 5'-TTGCCTCTTCCAAGAGCACA-3'(서열번호 12)의 조합(1.2 kbp)을 이용하여 PCR 증폭을 행함으로써 유전자형, 즉, SCT1/Δsct1: LEU2인 것을 확인하고, 이 유전자형을 갖는 형질전환 효모 세포를 GP-1주로 하였다.

MaGPAT1 -D주와 MaGPAT3 -D주의 제작

M. alpina의 GPAT 유전자인 MaGPAT1 및 MaGPAT3을, 효모의 염색체 상에 삽입하기 위해, 플라스미드 pUC-URA3-MAGPAT1과, 플라스미드 pUC-URA3-MAGPAT3을 이하와 같이 제작하였다.

플라스미드 pUC - URA3 - MAGPAT1

플라스미드 pUC18 멀티클로닝 사이트를 HindIII 사이트만을 포함하도록 개변하고, 그 HindIII 사이트에, pURA34(WO0131000)를 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.2 kbp의 DNA 단편을 삽입하여, 플라스미드 pUC-URA3을 제작하였다. pYE-MAGPAT1(WO2008156026)을 제한 효소 HindIII로 소화한 후에, Blunting Kit(TAKARA BIO)를 이용하여 말단 부분을 평활화하여 얻어진 약 3.5 kbp의 DNA 단편을, 플라스미드 pUC-URA3의 SmaI 사이트에 삽입하고, GPAT1 유전자와 URA3 유전자가 동일한 방향으로 삽입된 플라스미드를 제작하여, 이 플라스미드를 pUC-URA3-MAGPAT1로 하였다.

플라스미드 pUC - URA3 - MAGPAT3

플라스미드 pCR-MAGPAT3을 제한 효소 EcoRI와 SalI로 소화하여 얻어진 약 2.3 kbp의 DNA 단편을, 효모 발현용 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)의 EcoRI, SalI 사이트에 삽입하고, 플라스미드 pYE-MAGPAT3을 구축하였다. 계속해서, 플라스미드 pYE-MAGPAT3을 제한 효소 HindIII로 소화한 후에, Blunting Kit(TAKARA BIO)를 이용하여 말단 부분을 평활화하여 얻어진 약 3.6 kbp의 DNA 단편을, 플라스미드 pUC-URA3의 SmaI 사이트에 삽입하고, GPAT3 유전자와 URA3 유전자가 동일한 방향으로 삽입된 플라스미드를 제작하여, 이 플라스미드를 pUC-URA3-MAGPAT3으로 하였다.

각각 제한 효소 HindIII로 소화한 플라스미드 pUC-URA3-MAGPAT1 및 플라스미드 pUC-URA3-MAGPAT3에서, 전술한 GP-1주를 초산리튬법에 따라 형질전환하고, SD-Ura(1L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 트립토판 1.2 g, 류신 1.8 g을 혼합한 것) 1.3 g)) 한천 배지(2％ 아가)에서 생육할 수 있는 클론을 형질전환체로서 선발하였다. 얻어진 주 중, 임의의 주로부터 Gen 토루쿤(효모용)을 사용하여 DNA를 추출하였다. URA3-MAGPAT1을 도입한 주에 대해서는, (3) 프라이머 GPAT1-f1: 5'-GTCAAGAAGGAATTCAAGGAGCTCAAG-3'(서열번호 13) 및 프라이머 GPAT1-r2: 5'-CCTGGGATGATGGACAAGAACAATG-3'(서열번호 14)의 조합(1.1 kbp)을 이용하여 게놈 DNA를 PCR 증폭하고, URA3-MAGPAT3을 도입한 주는, (4) 프라이머 MaGPAT3-2 F: 5'-TTTTGAACGCTTAAATGCTGGC-3'(서열번호 15) 및 프라이머 MaGPAT3-3R: 5'-GGTCTTTTGAAGCTCTGCACGCGAC-3'(서열번호 16)의 조합(1.1 kbp)을 이용하여 게놈 DNA를 PCR 증폭하였다. MaGPAT1의 발현 카세트 또는 MaGPAT3의 발현 카세트의 게놈에의 삽입을 확인할 수 있었던 주를 각각 MaGPAT1-D주 또는 MaGPAT3-D주로 하였다.

포자 형성과 사분자 분석

MaGPAT1-D주와 MaGPAT3-D주를 각각 YPD 한천 배지에 도포하고, 30℃에서 2일간 배양하였다. 생육한 균체를, 포자 형성용 한천 배지(0.5％ 초산칼륨, 2％ 아가)에 도포하고, 25℃에서 4일간 배양하였다. 얻어진 균체를 적당량 긁어, 100 ㎕의 자이몰리아제 용액(0.125 ㎎/㎖ 자이몰리아제 100 T, 1M 소르비톨, 40 mM 인산칼륨 버퍼(pH 6.8))에 현탁하고, 실온에서 30분간 인큐베이트한 후에, 자이몰리아제 용액 및 균체를 포함하는 튜브를 얼음 중으로 옮겼다. 현미경 하에서, 자낭 포자가 형성되어 있는 것을 확인한 후, YPD 한천 배지 상에서 마이크로매니퓰레이션에 의해 4개의 자낭 포자를 분리하고, 30℃에서 2일간 인큐베이트하여, 각각의 포자에 유래하는 콜로니를 얻었다. 얻어진 포자 클론을, SD-Ura 한천 배지, SD-Leu 한천 배지에 복제하고, 30℃에서 3일간 인큐베이트하여, 우라실 요구성과 류신 요구성을 조사하였다. 각 플레이트에서의 생육의 가부와 클론수를 표 2에 나타낸다.

어느 쪽의 주 유래의 포자 클론에 있어서도, 우라실 비요구성과 류신 비요구성의 주:우라실 비요구성과 류신 요구성의 주:우라실 요구성과 류신 요구성의 주의 비율은 대략 1:1:1이었다. 또한, 우라실 요구성과 류신 비요구성의 주는 얻을 수 없었다. 계속해서, MaGPAT1-D주와 MaGPAT3-D주 각각으로부터 얻어진 우라실 비요구성과 류신 비요구성의 주와, 우라실 요구성과 류신 요구성의 주의 유전자형을 조사하기 위해, 상기와 마찬가지로 균체로부터 DNA를 추출하고, (1) 프라이머 SCT1outORF-F 및 프라이머 SCT1inORF-R의 조합, (2) 프라이머 SCT1outORF-F1 및 프라이머 LEU2inORF-F의 조합, 및 MaGPAT1-D주 유래의 주는, (3) 프라이머 GPAT1-f1 및 프라이머 GPAT1-r2의 조합, MaGPAT3-D주 유래의 주는, (4) 프라이머 MaGPAT3-2F 및 프라이머 MaGPAT3-3R의 조합으로 PCR을 행하였다.

우라실 비요구성과 류신 비요구성의 주에서는, (1)의 조합으로는 PCR에 의한 증폭이 보이지 않고, (2)의 조합으로는 증폭이 보였기 때문에, 이들 주는 Δsct1: LEU2인 것이 나타났다. 또한, 각각 (3) 또는 (4)의 조합으로도 증폭이 보였기 때문에, 이들 주는 MaGPAT1 또는 MaGPAT3이 삽입되어 있는 것이 나타났다.

전술한 결과로부터, S. cerevisiae에 있어서 Δgpt2, Δsct1주는 치사이지만, M. alpina 유래의 MaGPAT1 또는 MaGPAT3을 발현시킴으로써 생육 가능해지는 것이 분명해졌다. 즉, M. alpina 유래의 MaGPAT1 또는 MaGPAT3은, 효모의 Δgpt2, Δsct1을 상보할 수 있었다. 이것으로부터, M. alpina 유래의 MaGPAT1 및 MaGPAT3에 코드되는 단백질은, GPAT 활성을 갖는 것이 시사되었다.

한편, 우라실 요구성과 류신 요구성의 주에서는, (1)에서는 PCR에 의한 증폭이 보이고, (2)에서는 증폭이 보이지 않았기 때문에, 이들 주는 SCT1인 것이 나타났다. 또한 (3) 또는 (4)에서는 증폭이 보이지 않았기 때문에, M. alpina 유래의 MaGPAT1 또는 MaGPAT3은 삽입되어 있지 않은 것이 나타났다.

또한, 이들 주를 SD-Met(1L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 트립토판 1.2 g, 류신 1.8 g, 우라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g) 한천 배지(2％ 아가)와 SD-Lys(1L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 트립토판 1.2 g, 류신 1.8 g, 우라실 0.6 g을 혼합한 것)1.3 g) 한천 배지(2％ 아가)에 복제하고, 30℃에서 3일간 인큐베이트하여, 메티오닌 요구성과 리신 요구성을 조사하였다. 그 결과에 기초하여, 표 1에 나타낸 각 유전자형의 주 중, GP-11(#SC-1), MaGPAT1-11(#3b, #4a, #8a), MaGPAT3-11(#2d, #19a, #32a), GP-21,(#SC-2), MaGPAT1-21(#1a, #2d, #13a), MaGPAT3-21(#10a, #20c, #26b)을, 이하의 실험에 제공하였다.

GPAT 유전자로서, 효모 유래의 SCT1만을 갖는 주, M. alpina 유래의 GPAT1만을 갖는 주, M. alpina 유래의 GPAT3만을 갖는 주의 지방산 생산성을 비교하였다. 전술한 사분자 분석으로 얻어진 효모 유래의 SCT1만을 갖는 주인 GP-11 및 GP-21은, 함께 ura3, leu2이기 때문에, 우라실과 류신을 요구한다. 그래서, 우라실과 류신의 요구성을 상보하기 위해, GP-11 및 GP-21을 각각, 플라스미드 pESC-URA3과 플라스미드 pESC-LEU2로 동시에 형질전환하고, SD-Ura, Leu(1L당, Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 트립토판 1.2 g을 혼합한 것) 1.3 g)) 한천 배지(2％ 아가)에서 생육할 수 있는 주를 형질전환체로서 선발하여, 선발된 임의의 주 GP-12(#1, 2, 3) 및 GP-22(#1, #2, #3)를 이하의 실험에 제공하였다.

[실시예 3] 효모의 지방산 분석

전술한 바와 같이 하여 얻어진 주, GP-12(#1, 2, 3), MaGPAT1-11(#3b, #4a, #8a), MaGPAT3-11(#2d, #19a, #32a), GP-22(#1, #2, #3), MaGPAT1-21(#1a, #2d, #13a), MaGPAT3-21(#10a, #20c, #26b)을 이하와 같이 배양하였다.

SD-Ura, Leu 액체 배지 10 ㎖에 각 주를 1 백금이 식균하고, 30℃에서 1일간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액 100 ㎕를, SD-Ura, Leu 액체 배지 10 ㎖에 식균하고, 30℃에서 2일간 진탕 배양하였다. 효모의 배양액을 원심 분리함으로써, 균체를 회수하였다. 균체를 10 ㎖의 멸균수로 세정하고, 재차 원심 분리를 행하여 균체를 회수하고, 동결 건조하였다. 염산메탄올법에 따라 균체의 지방산을 메틸에스테르에 유도한 후, 헥산으로 추출하고, 헥산을 증류하여, 가스 크로마토그래피에 의해 분석을 행하였다. 지방산 조성 분석의 결과를 표 3∼8에 나타낸다.

표 3은 met15, lys2 효모의 균체 지방산 조성(％)을 나타낸다. 수치는 평균±표준 편차(SD)로 나타낸다.

표 4는 met15, lys2 효모의 배양 후의 균체 농도를 나타낸다. 수치는 평균±SD로 나타낸다.

표 5는 met15, lys2 효모의 지방산 생산량을 나타낸다. 수치는 평균±SD로 나타낸다.

표 6은 MET15, LYS2 효모의 균체 지방산 조성(％)을 나타낸다. 수치는 평균±SD로 나타낸다.

표 7은 MET15, LYS2 효모의 배양 후의 균체 농도를 나타낸다. 수치는 평균±SD로 나타낸다.

표 8은 MET15, LYS2 효모의 지방산 생산량을 나타낸다. 수치는 평균±SD로 나타낸다.

각 균체에 있어서, 균체 농도는, 영양 요구성에 의존하고 있었다. MET15, LYS2 효모의 균체 농도는, met15, lys2 효모의 균체 농도와 비교하여 5배 정도 높지만, 그 지방산 조성에 대한 GPAT 유전자의 영향은 보이지 않았다(표 3 및 6). 또한, MET15, LYS2 효모의 경우, 지방산 생산성에 대해서도, GPAT 유전자의 차이에 따른 현저한 차가 보이지 않았다.

한편, met15, lys2 효모의 경우, 지방산의 생산량은, GPAT 유전자로서 SCT1만을 갖는 GP-12주와 비교하여, M. alpina 유래의 GPAT 유전자를 갖는 MaGPAT1-11주에서는, 약 1.5배, MaGPAT3-11주에서는, 약 2.2배 많은 것이었다. 또한, MaGPAT3-11주는 MaGPAT1-11주에 비하여, 약 1.4배나 지방산 생산량이 많았다. met15, lys2 효모는 MET15, LYS2 효모에 비하여 증식은 억제되지만, M. alpina 유래의 GPAT1 유전자나 GPAT3 유전자를 발현시킴으로써, 지방산의 생산성이 현저하게 향상되는 것이 판명되었다(표 4 및 5). 지방산 조성을 비교하면, GP-12주나 MaGPAT1-11주에 비하여 MaGPAT3-11주에서는, 포화 지방산인 팔미틴산(16:0)이나 스테아린산(18:0)의 비율이 상승하고 있었다(표 3).

[실시예 4] 효모의 지질 분석

지방산 생산량에 차가 있었던 met15, lys2 효모인 GP-12(#1, 2, 3), MaGPAT1-11(#3b, #4a, #8a), MaGPAT3-11(#2d, #19a, #32a)에서, 각 지질의 양이나 지방산 조성을 조사하였다.

SD-Ura, Leu 액체 배지 10 ㎖에 각 주를 1 백금이 식균하고, 30℃에서 1일간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액 1 ㎖를, SD-Ura, Leu 액체 배지 10 ㎖에, 각 주 2개씩 식균하고, 30℃에서 1일간 진탕 배양하였다. 효모의 배양액을 원심 분리함으로써, 균체를 회수하였다. 10 ㎖의 멸균수로 세정하고, 원심 분리에 의해 재차 균체를 회수하여, 동결 건조하였다. 각 주 1개씩을 염산메탄올법에 따라 균체의 지방산을 메틸에스테르에 유도한 후, 헥산으로 추출하고, 헥산을 증류하여, 가스 크로마토그래피에 의해 분석을 행하였다.

또한, 각 주 1개씩으로부터 이하와 같이, 지질을 추출하였다. 즉, 1 ㎖의 클로로포름:메탄올(2:1)과 유리 비드를 부가하고, 비드 비터로 균체를 파쇄한 후, 원심 분리하여 상청을 회수하였다. 남은 균체에 추가로 1 ㎖의 클로로포름:메탄올(2:1)을 부가하고, 동일하게 하여, 상청을 회수하는 것을 반복하여, 총량 4 ㎖의 클로로포름:메탄올(2:1)로 지질을 회수하였다. 스피드백을 사용하여, 용매를 증류하고, 잔사를 소량의 클로로포름에 녹였다. 실리카겔 60 플레이트(Merck), 전개 용매 헥산:디에틸에테르:초산 70:30:1의 조건에서 박층 크로마토그래피를 행하여, 지질을 분획하였다. 프리물린 용액을 분무하고, 자외선을 조사함으로써 지질을 검출하였다. 트리글리세리드 분획과 인지질 분획을 각각 긁어 시험관에 모으고, 염산메탄올법에 따라 지방산을 메틸에스테르에 유도하여, 가스 크로마토그래피에 의해, 지방산 분석을 행하였다.

결과를 이하의 표에 나타낸다.

균체 농도는, GPAT 유전자에 의해, 영향을 받지 않았다. 배지당 지방산 생산량은, GPAT 유전자로서 SCT1만을 갖는 GP-12주와 비교하여, 모르티에렐라 알피나 유래의 GPAT 유전자를 갖는 MaGPAT1-11주에서 약 1.5배, MaGPAT3-11주에서 약 2배였다.

인지질의 지방산량과 지방산 조성은, GPAT 유전자에 의해, 영향을 받지 않았다. 한편, 트리글리세리드의 양은, GPAT 유전자로서 SCT1만을 갖는 GP-12주와 비교하여, 모르티에렐라 알피나 유래의 GPAT 유전자를 갖는 MaGPAT1-11주에서 약 1.6배, MaGPAT3-11주에서 약 2배였다.

총지방산의 생산량이, MaGPAT1-11주나 MaGPAT3-11주에서 증가하고 있는 것은, 주로, 트리글리세리드의 생산량이 증가하고 있기 때문인 것이 판명되었다. 또한, 트리글리세리드 중의 지방산 조성을 비교하면, MaGPAT3-11주에서는, GP-12주와 비교하여, 포화 지방산의 비율이 높아져 있었다.

MaGPAT3 유전자를 발현시킴으로써, 특히 트리글리세리드의 생산성을 향상시킬 수 있는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 적절한 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써, 숙주 세포의 증식률에 상관없이, 효율적으로 트리글리세리드를 생성시킬 수 있다. 또한, 트리글리세리드의 증가에 의해, 트리글리세리드를 구성하는 지방산도 증가한다. 본 발명에 따라 숙주 세포 내에서 생성되는 트리글리세리드나 지방산은, 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 제조에 이용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드:
(a) 서열번호 1 또는 4의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드;
(b) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드; 및
(c) 서열번호 2의 아미노산 서열에 대하여, 90％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
삭제
제1항에 있어서, 서열번호 1 또는 4의 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, DNA인 폴리뉴클레오티드.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드에 코드되는 단백질.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드가 도입된 비인간 형질전환체.
제7항에 기재된 벡터가 도입된 비인간 형질전환체.
제8항에 있어서, 상기 형질전환체가 지질 생산균인 형질전환체.
제10항에 있어서, 상기 지질 생산균이 모르티에렐라·알피나(Mortierella alpina)인 형질전환체.
제8항에 기재된 형질전환체의 배양물로부터, 지질 또는 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는, 지질 또는 지방산 조성물의 제조 방법.
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