KR101396673B1

KR101396673B1 - 측정 대상 성분의 면역 측정법

Info

Publication number: KR101396673B1
Application number: KR1020097011039A
Authority: KR
Inventors: 미즈호 가와무라; 아키히토 도미타
Original assignee: 교와 메덱스 가부시키가이샤
Priority date: 2006-11-02
Filing date: 2007-11-01
Publication date: 2014-05-16
Anticipated expiration: 2027-11-01
Also published as: US20120052591A1; CA2668001C; HK1225800A1; JP5557450B2; EP2085782B1; CN105699662A; JPWO2008053973A1; US20100068738A1; US8257935B2; KR20090086231A; EP2085782A4; WO2008053973A1; US8043822B2; EP2085782A1; CN105866401A; CA2668001A1; CN101568834A

Abstract

헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체를, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하에 반응시키는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법, 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법에 있어서의 헤모글로빈의 영향 억제 방법, 그리고 담즙산 유도체를 함유하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정용 시약.

Description

측정 대상 성분의 면역 측정법{METHOD OF IMMUNOASSAYING A COMPONENT TO BE MEASURED}

본 발명은 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법, 면역 측정용 시약, 및 면역 측정법에 있어서의 헤모글로빈의 영향 억제 방법에 관한 것이다.

혈액 중의 측정 대상 성분을 면역 측정법에 의해 측정하는 경우, 적혈구나 백혈구 등의 혈구 세포의 밖에 존재하는 측정 대상 성분에 대해서는, 전혈(全血)로부터 혈구를 제거한 혈청 또는 혈장이 시료로서 사용된다. 그러나, 혈구를 제거하기 위해서는 원심 분리기 등의 전용 장치가 필요하고, 시간이 걸리기 때문에, 직접 전혈 시료를 측정하는 방법이 제안되어 있다 (특허 문헌 1 참조). 전혈을 시료로 하는 경우, 용혈에 의해 시료에 혼입되는 헤모글로빈 등의 혈구 성분이나 혈구의 막성분이 광학적 검출계에 영향을 미치거나, 면역 반응을 저해하거나, 측정 대상 물질을 흡착함으로써, 측정에 영향이 생기는 문제가 있다. 이와 같은 문제를 회피하기 위하여, 용혈을 시키지 않고 측정하는 전혈을 시료로 하는 면역 측정 방법이 보고되어 있다 (특허 문헌 2, 3, 4 및 5 참조).

세포 내 단백질 등의 혈구 성분을 측정하는 경우에는, 혈구를 용해시킬 필요 가 있기 때문에, 상기의 용혈을 시키지 않고 측정하는 방법을 이용할 수 없다. 이 경우에는, 플로우 사이토메트리에 의해, 대상의 혈구를 분리하고 나서, 분리한 세포를 용해시켜 목적의 혈구 성분을 측정하는 방법이 취해져 왔지만, 플로우 사이토메트리를 위한 전용 장치가 필요하고, 시간이 걸린다.

한편, 세포 내 단백질의 간편한 측정법의 예로서, 계면 활성제로 전혈 중의 혈구를 용해시킨 것을 측정 시료로 한 MxA 단백질의 면역 측정법이 보고되어 있다 (비특허 문헌 1, 2).

특허 문헌 1: 일본 공개특허공보 평10-48214호

특허 문헌 2: 일본 공개특허공보 평6-265554호

특허 문헌 3: 국제 공개 제96/04558호 팜플렛

특허 문헌 4: 국제 공개 제02/73203호 팜플렛

특허 문헌 5: 일본 공개특허공보 2004-45395호

비특허 문헌 1: Journal of Interferon Research, (미국), 1992년, 제12권, 제2호, p.67-74

비특허 문헌 2: Pediatric Research, (미국), 1997년, 제41권, 제5호, p.647-650

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명의 목적은, 헤모글로빈의 영향이 억제된 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법 및 면역 측정용 시약, 그리고 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법에 있어서의 헤모글로빈의 영향 억제 방법을 제공하는 것에 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은, 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법에 있어서, 그 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체의 반응을, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하에 실시함으로써, 정확하게 그 측정 대상 성분을 측정할 수 있음을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의［1］∼［24］에 관한 것이다.

［1］헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체를, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하에 반응시키는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법.

［2］헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체를, 추가로 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제의 존재하에 반응시키는［1］에 기재된 방법.

［3］면역 측정법이 샌드위치법 또는 경합법인［1］또는［2］에 기재된 방법.

［4］측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체의 반응이, (1) 그 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 1 항체 및 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 2 항체에 표지가 결합한 표지화 항체의 반응, (2) 그 측정 대상 성분과, 경합 물질에 표지가 결합한 표지화 경합 물질 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하는 항체의 반응, 또는 (3) 그 측정 대상 성분과, 경합 물질 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하고, 또한 표지가 결합한 표지화 항체의 반응인［1］또는［2］에 기재된 방법.

［5］시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체가, 양쪽성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체인［1］∼［4］중 어느 하나에 기재된 방법.

［6］시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체가, 비이온성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체인 청구항［1］∼［4］중 어느 하나에 기재된 방법.

［7］양쪽성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체가, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]프로판술포네이트 (이하, CHAPS 라 약기한다) 또는 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시프로판술포네이트 (이하, CHAPSO 라 약기한다) 인［5］에 기재된 방법.

［8］비이온성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체가, N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)콜아미드 (이하, BIGCHAP 라 약기한다) 또는 N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)데옥시콜아미드 (이하, deoxy-BIGCHAP 라 약기한다) 인［6］에 기재된 방법.

［9］폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제가, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르인［2］∼［8］중 어느 하나에 기재된 방법.

［10］시료가 전혈인［1］∼［9］중 어느 하나에 기재된 방법.

［11］측정 대상 성분이 MxA 단백질인［1］∼［10］중 어느 하나에 기재된 방법.

［12］담즙산 유도체 및 이하의 (1) ∼ (3) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 요소를 함유하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정용 시약.

(1) 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 1 항체, 및 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 2 항체에 표지가 결합한 표지화 항체；

(2) 경합 물질에 표지가 결합한 표지화 경합 물질, 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하는 항체；또는,

(3) 경합 물질, 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하고, 또한 표지가 결합한 표지화 항체.

［13］추가로, 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제를 함유하는［12］에 기재된 시약.

［14］담즙산 유도체가 양쪽성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체인［12］또는［13］에 기재된 시약.

［15］담즙산 유도체가 비이온성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체인［12］또는［13］에 기재된 시약.

［16］양쪽성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체가 CHAPS 또는 CHAPSO 인［14］에 기재된 시약.

［17］비이온성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체가 BIGCHAP 또는 deoxy-BIGCHAP 인［15］에 기재된 시약.

［18］폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르인［13］∼［17］중 어느 하나에 기재된 시약.

［19］헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체를, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하에 반응시키는 것을 특징으로 하는, 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법에 있어서의 헤모글로빈의 영향 억제 방법.

［20］시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체가 양쪽성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체인［19］에 기재된 억제 방법.

［21］시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체가 비이온성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체인［19］에 기재된 억제 방법.

［22］양쪽성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체가 CHAPS 또는 CHAPSO 인［20］에 기재된 억제 방법.

［23］비이온성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체가 BIGCHAP 또는 deoxy-BIGCHAP 인［21］에 기재된 억제 방법.

［24］헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체를, 추가로 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제의 존재하에 반응시키는［19］∼［23］중 어느 하나에 기재된 억제 방법.

발명의 효과

본 발명에 의해, 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 정확한 측정을 가능하게 하는 면역 측정법 및 면역 측정용 시약, 그리고 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법에 있어서의 헤모글로빈의 영향 억제 방법이 제공된다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

(1) 헤모글로빈을 함유하는 시료

본 발명의 면역 측정 방법에 있어서 사용되는 헤모글로빈을 함유하는 시료로서는, 예를 들어 전혈, 전혈로부터 조제한 적혈구를 함유하는 혈구 획분, 용혈이 의심되는 혈장 또는 혈청, 적혈구, 임의의 시료에 헤모글로빈을 첨가한 시료 등, 헤모글로빈을 함유하는 시료 또는 헤모글로빈의 함유가 의심되는 시료를 들 수 있다. 전혈로서는, 피검사자로부터 채취한 혈액 자체이어도 되지만, 채취한 혈액을 처리한 것이어도 되고, 처리한 혈액이 바람직하다. 당해 처리로서는, 예를 들어 항응고 처리, 용혈 처리 등을 들 수 있고, 이들 처리를 조합해도 된다.

측정 대상 성분이 혈구의 세포 내 성분인 경우에는, 전혈로서, 용혈 처리한 혈액이 바람직하고, 항응고 처리와 용혈 처리의 양 처리를 실시한 혈액이 특히 바람직하다. 항응고 처리로서는, 예를 들어 채취한 혈액에 EDTA, 헤파린 등을 첨가하는 처리 등을 들 수 있다. 용혈 처리로서는, 예를 들어 계면 활성제 또는 사포닌류 용액의 첨가, 저장액(低張液)과의 혼합, 동결 융해, 초음파 처리 등을 들 수 있다.

(2) 측정 대상 성분

본 발명에 있어서의 측정 대상 성분은 헤모글로빈을 함유할 가능성이 있는 시료 중의 성분이면 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 핵산, 단백질, 지질, 비타민, 다당류 등을 들 수 있다. 핵산으로서는 DNA, RNA, ATP, ADP, AMP, 사이클릭 AMP 등을 들 수 있다. 또한, 단백질로서는 효소, 호르몬, 각종 펩티드 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 바람직한 측정 대상 성분은 세포 내에 함유되는 물질, 인터페론 등의 각종 사이토카인에 의해 세포 내에 유발되는 단백질을 들 수 있다.

구체적인 측정 대상 성분으로서는, I 형 인터페론에 의해 세포질 내로 유도되는 MxA 단백질 (Mol. Cell. Biol., 9, 5062-5072, 1989; J. Virol. 64, 1171-1181, 1990) 등을 들 수 있다.

(3) 담즙산 유도체

본 발명에 있어서의 담즙산 유도체는 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체이다. 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체로서는, 본 발명의 면역 측정법 및 헤모글로빈의 영향 억제 방법을 가능하게 하는 담즙산 유도체이면 특별히 제한은 없지만, 양쪽성 계면 활성제 기능 또는 비이온성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체가 바람직하다.

양쪽성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체로서는, 예를 들어 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]프로판술포네이트｛3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid, 이하, CHAPS 라 약기한다｝, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시프로판술포네이트｛3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonic acid, 이하, CHAPSO 라 약기한다｝ 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제 기능을 갖는 담즙산 유도체로서는, 예를 들어 N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)콜아미드 [N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)cholamide, 이하 BIGCHAP 라 약기한다］, N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)데옥시콜아미드 [N,N-Bis(3-D-gluconamidopropyl)deoxycholamide, 이하, deoxy-BIGCHAP 라 약기한다］등을 들 수 있다.

담즙산 유도체는, 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체의 반응에 있어서의 헤모글로빈의 영향을 억제하는 작용을 나타내고, 특히 CHAPS, CHAPSO, BIGCHAP 및 deoxy-BIGCHAP 가 바람직하게 사용된다.

담즙산 유도체의 농도로서는, 임계 미셀 농도 (cmc) 의 1 배 ∼ 50 배의 범위의 농도로 사용하면 되고, 특히 cmc 농도의 1 배 ∼ 10 배가 바람직하다. 본 발명에 있어서는, 담즙산 유도체를 단독 (1 종류) 으로 사용할 수도 있지만, 2 종 이상 조합하여 사용할 수도 있다.

(4) 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제

폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제는, 본 발명의 면역 측정법에 있어서, 측정 감도를 향상시키는 작용이 있어, 면역 반응에 공존시키는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서의 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제로서는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르 등을 들 수 있고, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르가 바람직하다. 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르에 있어서의 알킬로서는, 예를 들어 옥틸, 노닐 등을 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르의 구체예 (시판품) 로서는, 예를 들어 노니뎃 P-40 (폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서는, 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제를 단독 (1 종류) 으로 사용할 수도 있지만, 2 종 이상 조합하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 면역 측정법에 있어서는, 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제의 농도는 0.01 ∼ 2.0% 가 바람직하고, 0.05 ∼ 1.8% 가 보다 바람직하고, 0.1 ∼ 1.4% 가 특히 바람직하다.

(5) 항체 및 표지화 항체

본 발명의 측정 방법에 있어서 사용되는 항체로서는, 측정 대상 성분에 특이적으로 결합하는 항체이면 특별히 제한은 없고, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 모두 사용할 수 있지만, 모노클로날 항체가 바람직하다. 또한, 본 발명에 사용하는 항체로서는, 항체 단편을 포함한다. 구체적으로는, 항체를 파파인 처리에 의해 얻어지는 Fab, 펩신 처리에 의해 얻어지는 F(ab')₂, 펩신 처리 - 환원 처리에 의해 얻어지는 Fab' 등의 Fc 부분을 제거한 항체 단편을 들 수 있다. 항체 단편으로서는 F(ab')₂ 가 특히 바람직하다.

본 발명에 있어서 사용하는 항체는, 측정 대상 성분 또는 그 일부분을 항원으로서 이용하여 통상적인 방법에 의해 취득할 수 있는데, 시판품으로서도 입수 가능하다.

측정 대상 성분이 MxA 단백질인 경우, MxA 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로서는, 예를 들어 국제 공개 공보 WO96/05230 에 기재된, 하이브리도마 세포주 KM1122, KM1123, KM1124 (FERM BP-4729), KM1125, KM1126, KM1127, KM1128, KM1129, KM1130, KM1131, KM1132 (FERM BP-4730), KM1133, KM1134, KM1135 (FERM BP-4731) 가 각각 생산하는 항인간 MxA 단백질 모노클로날 항체 KM1122, KM1123, KM1124, KM1125, KM1126, KM1127, KM1128, KM1129, KM1130, KM1131, KM1132, KM1133, KM1134, KM1135 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 표지화 항체는 본 발명의 측정 대상 성분의 면역 측정에 사용될 수 있는 것으로서, 본 발명에 사용되는 항체와 후술하는 표지 물질을 이용하여, 후술하는 방법에 의해 제조되는 것이다.

(6) 경합 물질 및 표지화 경합 물질

본 발명에 있어서 「경합 물질」이란, 본 발명의 면역 측정법에 있어서 사용하는 「측정 대상 성분에 결합하는 항체」에 결합할 수 있는 물질이며, 또한 그 결합이, 그 측정 대상 성분과 경합적인 물질을 의미하고, 측정 대상 성분 자체도 포함된다. 「경합 물질」은 시료 중의 측정 대상 성분을 경합법에 의해 측정할 때에 사용되는 것이다. 따라서, 경합법에 있어서 사용하는 측정 대상 성분에 결합하는 항체는, 측정 대상 성분, 경합 물질 및 표지화 경합 물질에 결합하는 항체이며, 그 측정 대상 성분과 결합하여 면역 복합체를 생성함과 함께, 경합 물질과도 결합하여 면역 복합체를 생성한다.

경합 물질로서는, 측정 대상 성분에 결합하는 항체가 인식하는 에피토프의 구조와 동일한 구조를 갖고 있는 물질이 바람직하고, 또한 측정 대상 성분에 결합하는 항체에 대한 결합의 강도가 그 항체에 대한 그 측정 대상 성분의 결합의 강도와 동일한 정도인 것이 바람직하다. 측정 대상 성분 자체가 경합 물질로서 바람직하다.

본 발명에 있어서의 표지화 경합 물질은, 본 발명의 측정 대상 성분의 면역 측정에 사용될 수 있는 것이며, 상기의 경합 물질과 후술하는 표지 물질을 이용하여, 후술하는 방법에 의해 제조되는 것이다.

(7) 면역 측정법

본 발명의 면역 측정법은, 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체의 반응을, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하에 실시하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법이다.

헤모글로빈을 함유하는 시료와, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 혼합비는 1：1 ∼ 1：1000 이 바람직하고, 헤모글로빈을 함유하는 시료가 전혈인 경우에는, 1：2 ∼ 1：49 의 혼합비가 좋고, 1：4 ∼ 1：9 가 특히 바람직하다. 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체를 헤모글로빈을 함유하는 시료에 첨가하는 경우, 첨가시의 온도로서는 약 2℃ ∼ 40℃ 가 바람직하고, 첨가 후 24 시간 이내에 측정하는 것이 바람직하다.

면역 측정법으로서는, 항원 항체 반응에 근거하는 방법이면 특별히 제한이 없고, 조작 방법, 표지 물질의 유무, 표지 물질의 종류, 담체, B/F 분리의 유무는 한정되지 않는다.

항원 항체 반응으로서는, 경합 반응법 및 비경합 반응법 중 어느 것이어도 된다.

검출 방법으로서는, 항원 항체 반응의 결과를 응집 등에 의해 직접 검출하는 비표지법, 표지 물질을 사용하여 검출하는 표지법 중 어느 것이어도 되지만, 측정 감도의 점에서 특히 표지법이 바람직하다.

본 발명의 면역 측정법으로서는, B/F 분리를 실시할 필요가 있는 헤테로지니어스법, 및 B/F 분리를 실시할 필요가 없는 호모지니어스법을 모두 사용할 수 있다.

반응상으로서는, 전체 반응이 액상에서 행해지는 액상법과 면역 반응의 상대를 고상화하여 반응을 실시하는 고상법 중 어느 방법을 이용해도 된다.

구체적인 측정 방법으로서는, 「바이오 검사약 개발 매뉴얼」CMC, 이시카와 에이지 등 공동 편찬 「효소 면역 측정법」 제 3 판 의학서원, 문헌 일본 임상 ｖol.53 No.9 등에 기재되어 있는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 측정법의 구체예로서, 이하의 측정 방법 1 ∼ 4 의 방법을 들 수 있지만, 본 발명은 이들 방법에 한정되는 것은 아니다. 측정 방법 1 은 비경합 반응법인 샌드위치법, 측정 방법 2 및 3 은 시료 중의 측정 대상 성분과 경합 물질을 경합시키는 경합법, 측정 방법 4 는 면역 복합체와 면역 복합체에 포함되지 않는 표지화 항체 또는 표지화 경합 물질과의 분리 (B/F 분리) 를 실시하지 않는 호모지니어스법이다.

측정 방법 1

이하의 (a) ∼ (e) 의 공정을 순차 실시하는 측정 방법.

(a) 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분과, 그 측정 대상 성분에 특이적으로 결합하는 제 1 항체를, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하, 또는 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체와 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제의 존재하에 반응시켜, 제 1 항체와 그 측정 대상 성분으로 이루어지는 면역 복합체를 생성시키는 공정；

(b) 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하, 또는 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체와 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제의 존재하에, (a) 공정에서 생성된 면역 복합체와, 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 2 항체에 표지가 결합한 표지화 항체를 반응시켜, 제 1 항체, 그 측정 대상 성분 및 표지화 항체로 이루어지는 면역 복합체를 생성시키는 공정；

(c) (b) 공정에서 생성된 면역 복합체와 그 면역 복합체에 포함되지 않는 표지화 항체를 분리하는 공정；

(d) (b) 공정에서 생성된 면역 복합체 중의 표지의 양을 측정하는 공정；및,

(e) (d) 공정에서 측정한 그 면역 복합체 중의 표지의 양으로부터, 그 시료 중의 그 측정 대상 성분의 농도를 결정하는 공정.

제 1 항체는 불용성 담체에 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 공정 (a) 와 공정 (b) 는 순차 실시해도 되고, 동시에 실시해도 된다. 제 1 항체와 결합한 그 측정 대상 성분에 제 2 항체가 결합할 수 있으면, 제 1 항체가 인식하는 그 측정 대상 성분의 부위와 제 2 항체가 인식하는 그 측정 대상 성분의 부위는 동일해도 되고 상이해도 되지만, 상이한 것이 바람직하다. 또한, 후술하는 바와 같이, (e) 공정에 있어서, 이미 알려진 농도의 측정 대상 성분을 이용하여 미리 작성한 그 측정 대상 성분 농도와 측정치 (표지 유래의 정보량) 의 관계를 나타내는 검량선을 사용함으로써, 그 시료 중의 측정 대상 성분의 농도를 결정할 수 있다.

측정 방법 2

이하의 (a) ∼ (d) 의 공정을 순차 실시하는 측정 방법.

(a) 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분, 표지화 경합 물질을, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하, 또는 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체와 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제의 존재하에, 그 측정 대상 성분 및 그 표지화 경합 물질에 결합하는 항체와 반응시켜, 그 항체와 그 표지화 경합 물질로 이루어지는 면역 복합체, 및 그 항체와 그 측정 대상 성분으로 이루어지는 면역 복합체를 생성시키는 공정；

(b) 그 항체와 그 표지화 경합 물질로 이루어지는 면역 복합체를, 미반응의 표지화 경합 물질로부터 분리하는 공정；

(c) (a) 공정에서 생성된 그 항체와 그 표지화 경합 물질로 이루어지는 면역 복합체 중의 표지의 양을 측정하는 공정；및,

(d) (c) 공정에서 측정한 그 면역 복합체 중의 표지의 양으로부터, 그 시료 중의 그 측정 대상 성분의 농도를 결정하는 공정.

그 항체는 불용성 담체에 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 후술하는 바와 같이, (d) 공정에 있어서, 이미 알려진 농도의 측정 대상 성분을 이용하여 미리 작성한 그 측정 대상 성분 농도와 측정치 (표지 유래의 정보량) 의 관계를 나타내는 검량선을 사용함으로써, 그 시료 중의 측정 대상 성분의 농도를 결정할 수 있다.

측정 방법 3

이하의 (a) ∼ (d) 의 공정을 순차 실시하는 측정 방법.

(a) 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분, 경합 물질을, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하, 또는 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체와 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제의 존재하에, 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하는 항체에 표지가 결합한 표지화 항체와 반응시켜, 그 표지화 항체와 그 경합 물질로 이루어지는 면역 복합체, 및 그 표지화 항체와 그 측정 대상 성분으로 이루어지는 면역 복합체를 생성시키는 공정；

(b) 그 표지화 항체와 그 경합 물질로 이루어지는 면역 복합체를, 미반응의 표지화 항체, 및 그 표지화 항체와 그 측정 대상 성분으로 이루어지는 면역 복합체로부터 분리하는 공정；

(c) 그 표지화 항체와 그 경합 물질로 이루어지는 면역 복합체 중의 표지의 양을 측정하는 공정；및,

그 경합 물질은 불용성 담체에 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 그 경합 물질이 그 측정 대상 성분과 동일한 구조인 경우에는, (a) 의 공정에 있어서 불용성 담체에 고정화된 경합 물질을 사용한다. 또한, 후술하는 바와 같이, (d) 공정에 있어서, 이미 알려진 농도의 측정 대상 성분을 이용하여 미리 작성한 그 측정 대상 성분 농도와 측정치 (표지 유래의 정보량) 의 관계를 나타내는 검량선을 사용함으로써, 그 시료 중의 측정 대상 성분의 농도를 결정할 수 있다.

측정 방법 4

이하의 (a) ∼ (c) 의 공정을 갖는 측정 방법.

(a) 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분을, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하, 또는 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체와 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제의 존재하에, 그 측정 대상 성분에 특이적으로 결합하는 제 1 항체를 표지 물질 1 로 표지한 표지화 항체 1, 및 그 측정 대상 성분에 특이적으로 결합하는 제 2 항체를 표지 물질 1 과는 상이한 표지 물질 2 로 표지한 표지화 항체 2 와 반응시켜, 표지화 항체 1, 측정 대상 성분 및 표지화 항체 2 로 이루어지는 면역 복합체를 생성시키는 공정；

(b) (a) 공정에서 생성된 그 면역 복합체에 있어서의 표지 물질 1 과 표지 물질 2 의 상호 작용의 변화량을 측정하는 공정；및

(c) (b) 공정에서 측정한 상호작용의 변화량으로부터 시료 중의 그 측정 대상 성분의 양을 결정하는 공정.

제 2 항체는, 제 1 항체와 결합한 측정 대상 성분에 결합할 수 있으면, 제 1 항체가 인식하는 그 측정 대상 성분의 부위와 제 2 항체가 인식하는 그 측정 대상 성분의 부위는 동일해도 되고 상이해도 되지만, 상이한 것이 바람직하다. 또한, 후술하는 바와 같이, (c) 공정에 있어서, 이미 알려진 농도의 측정 대상 성분을 이용하여 미리 작성한 그 측정 대상 성분 농도와 측정치 (표지 유래의 정보량) 의 관계를 나타내는 검량선을 사용함으로써, 그 시료 중의 측정 대상 성분의 농도를 결정할 수 있다.

상기와 같이, 측정 방법 1 ∼ 3 은 B/F 분리를 수반하는 헤테로지니어스법이다. 측정 방법 1 의 공정 (c), 측정 방법 2 및 3 의 공정 (b) 가 B/F 분리의 공정이다. 이 B/F 분리는 항체 또는 경합 물질이 불용성 담체에 고정화되어 있는 경우에는, 반응 용액을 제거한 후, 불용성 담체를 세정함으로써 용이하게 실시할 수 있다. 즉, 항원 항체 반응 후에 반응 용액을 제거하고, 불용성 담체를 세정액에 의해 세정함으로써, 불용성 담체 상에 생성된 면역 복합체와 미반응의 표지체 (표지화 항체, 표지화 경합 물질) 를 분리할 수 있다.

세정액으로서는, 인산 완충화 생리 식염수 (0.15mol/ℓ 염화나트륨을 함유하는 10mmol/ℓ 인산 완충액, pH 7.2, 이하, PBS 라고 기재한다), 계면 활성제를 함유하는 PBS, 후술하는 수성 매체 등을 들 수 있다. 당해 계면 활성제로서는, 예를 들어 트윈 (Tween) 20 등의 비이온성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

또한, 측정 방법 1 에 있어서, 제 1 항체가 불용성 담체에 고정화되어 있는 경우에는, 공정 (a) 와 공정 (b) 사이에, 미반응의 반응물을 제거하기 위하여, 불용성 담체를 세정하는 공정을 삽입할 수도 있다. 이 경우, 공정 (b) 는 (a) 공정에서 생성된 면역 복합체와, 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 2 항체에 표지가 결합한 표지화 항체를 반응시켜, 제 1 항체, 그 측정 대상 성분 및 표지화 항체로 이루어지는 면역 복합체를 생성시키는 공정이 된다.

측정 방법 2 에 있어서, 측정 대상 성분에 결합하는 항체가 불용성 담체에 고정화되어 있지 않은 경우에는, (c) 공정에서 표지화 경합 물질에 결합하지 않고, 그 항체에 결합하는 결합성 물질을 고정화시킨 불용성 담체를 그 면역 복합체에 작용시켜, 그 면역 복합체를 불용성 담체에 결합시킨 후, 반응 용액을 제거하고, 추가로 불용성 담체를 세정함으로써, 그 면역 복합체와, 그 면역 복합체에 포함되지 않는 표지화 경합 물질을 분리할 수 있다. 또한, 표지화 경합 물질에 결합하지 않고, 그 항체에 결합하는 결합성 물질을 고정화시킨 불용성 담체의 존재하에서, (a) 공정의 면역 복합체를 생성시키는 반응을 실시하여, 면역 복합체의 생성과 면역 복합체의 불용성 담체에 대한 고정화를 동시에 실시한 후, 반응 용액을 제거하고, 추가로 불용성 담체를 세정함으로써, 면역 복합체와, 면역 복합체에 포함되지 않는 표지화 경합 물질을 분리할 수 있다. 표지화 경합 물질에 결합하지 않고, 그 항체에 결합하는 결합성 물질로서는, 예를 들어 그 항체의 정상 영역과 결합하는 항체 등을 들 수 있다. 또 측정 대상 성분이 단백질이 아닌 경우에는, (c) 공정에서, 황산암모늄, 폴리에틸렌글리콜 등의 단백질 침전제를 첨가하여, 면역 복합체만을 침전시킨 후, 원심 분리함으로써, 면역 복합체와 면역 복합체에 포함되지 않는 표지화 경합 물질을 분리할 수 있다.

측정 방법 1 의 방법에 있어서, 제 1 항체가 불용성 담체에 고정화되어 있지 않은 경우에는, B/F 분리의 공정에 있어서, 표지화 항체에 결합하지 않고, 제 1 항체에 결합하는 결합성 물질을 고정화시킨 불용성 담체를 첨가하거나, 혹은 면역 복합체를 생성시키는 공정을, 표지화 항체에 결합하지 않고, 제 1 항체에 결합하는 결합성 물질을 고정화시킨 불용성 담체의 존재하에서 실시하고, 각각 반응 용액을 제거한 후, 불용성 담체를 세정함으로써, 면역 복합체 중의 표지화 항체와 면역 복합체에 포함되지 않는 표지화 항체를 분리할 수 있다. 표지화 항체에 결합하지 않고, 제 1 항체에 결합하는 결합성 물질로서는, 예를 들어 제 1 항체의 제조에 사용한 동물종과 표지화 항체에 사용되는 항체 (제 2 항체) 의 제조에 사용한 동물종이 상이한 경우에는, 제 1 항체의 제조에 사용한 동물종의 면역 글로불린에 대한 항체 등을 들 수 있고, 제 1 항체가 정상 영역을 갖는 항체이고, 표지화 항체가 Fab 나 F(ab')₂, Fab' 등의 정상 영역을 갖지 않는 항체 단편인 경우이면, 제 1 항체의 정상 영역에 특이적으로 결합하는 항체 등을 들 수 있다.

(8) 불용성 담체

항체 또는 경합 물질을 고정화시키기 위한 불용성 담체로서는, 항체 또는 경합 물질을 안정적으로 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것도 포함된다. 불용성 담체의 바람직한 소재로서는 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐톨루엔, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리염화비닐, 나일론, 폴리메타크릴레이트, 젤라틴, 아가로오스, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 아세트산셀룰로오스, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등의 고분자 소재, 유리, 세라믹스, 자성 입자나 금속 등을 들 수 있다. 불용성 담체의 바람직한 형상으로서는 튜브, 비즈, 플레이트, 라텍스 등의 미립자, 스틱 등을 들 수 있다. 예를 들어, 1 장에 96 웰을 갖는 폴리스티렌제의 마이크로타이터 플레이트 등이 바람직하다.

(9) 항체 또는 경합 물질의 불용성 담체에 대한 고정화

항체 또는 경합 물질의 불용성 담체에 대한 고정화 방법으로서는, 물리학적 결합을 이용한 방법과 화학적 결합을 이용한 방법 또는 이들의 병용 등, 공지된 방법이 사용된다. 물리학적 결합으로서는, 예를 들어 정전적 결합, 수소 결합, 소수 결합 등을 들 수 있다. 화학적 결합으로서는, 예를 들어 공유 결합, 배위 결합 등을 들 수 있다. 예를 들어, 폴리스티렌제 면역 측정용 마이크로타이터 플레이트를 불용성 담체로서 사용하는 경우에는, 플레이트 내의 웰에 항체 또는 경합 물질의 용액을 첨가하고, 1 시간 내지 1 일간, 4℃ ∼ 30℃ 에서 인큐베이트함으로써, 물리 흡착시켜 고정화시키는 방법을 들 수 있다.

항체 또는 경합 물질은 직접 불용성 담체에 고정화시켜도 되고, 간접적으로 불용성 담체에 고정화시켜도 된다. 간접적인 고정화 방법으로서는, 예를 들어 아비딘을 고정화시킨 불용성 담체에 비오틴화시킨 항체 또는 경합 물질을 첨가하고, 비오틴과 아비딘의 특이적 결합을 개재하여, 항체 또는 경합 물질을 불용성 담체에 고정화시키는 방법을 들 수 있다. 또한, 불용성 담체에, 항체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 경합 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 고정화시키고, 이 항체를 개재하여 항체 또는 경합 물질을 불용성 담체에 고정화시켜도 된다. 혹은, 항체 또는 경합 물질은 링커를 개재한 공유 결합에 의해 불용성 담체에 고정화시켜도 된다.

링커로서는, 예를 들어 항체 또는 측정 대상 성분의 관능기와 불용성 담체의 측사슬의 관능기의 양자와 공유 결합할 수 있는 분자이면 어떠한 것이어도 된다. 바람직한 양태는, 예를 들어 항체 또는 측정 대상 성분이 갖는 관능기와 반응할 수 있는 제 1 반응 활성기와, 불용성 담체의 측사슬의 관능기와 반응할 수 있는 제 2 반응 활성기를 동시에 갖는 분자이며, 제 1 반응 활성기와 제 2 반응 활성기가 상이한 기인 것이 바람직하다. 항체 또는 경합 물질의 관능기 및 불용성 담체가 그 표면에 유지되어 있는 관능기로서는 예를 들어, 카르복시기나 아미노기, 글리시딜기, 술프히드릴기, 수산기, 아미드기, 이미노기, N-히드록시숙시닐기, 말레이미드기 등을 들 수 있다. 링커에 있어서의 활성 반응성기로서는, 예를 들어 알릴아지드, 카르보디이미드, 히드라지드, 알데히드, 히드록시메틸포스핀, 이미드에스테르, 이소시아네이트, 말레이미드, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르, 펜타플루오로페닐 (PFP) 에스테르, 소랄렌, 피리딜디술파이드, 비닐술폰 등의 기를 들 수 있다.

(10) 항체 또는 측정 대상 성분의 표지

항체 또는 측정 대상 성분을 표지하는 표지 물질로서는 효소, 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위 원소, 비오틴, 디곡시제닌, 태그 배열을 포함하는 폴리펩티드, 금속 콜로이드 입자, 착색 라텍스 입자 등을 들 수 있다.

효소로서는, 예를 들어 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 갈락토시다아제, 글루쿠로니다아제, 루시페라아제 등을 들 수 있다.

형광 물질로서는, 예를 들어, FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트), RITC (로다민 B-이소티오시아네이트) 등을 들 수 있다. 그 밖의 형광 물질로서, 예를 들어 quantum dot (Science, 281, 2016-2018, 1998), 피코에리트린 등의 피코빌리 단백질, GFP (Green fluorescent Protein), RFP (Red fluorescent Protein), YFP (Yellow fluorescent Protein), BFP (Blue fluorescent Protein) 등의 형광을 발하는 단백질을 들 수 있다.

발광 물질로서는, 예를 들어 아크리디늄 및 그 유도체, 루테늄 착물 화합물, 로핀 등을 들 수 있다. 또한 루테늄 착물 화합물로서는, 전자 공여체와 함께 전기 화학적으로 발광하는, Clin. Chem. 37, 9, 1534-1539, 1991 에 개시된 것이 바람직하다.

방사성 동위 원소로서는, 예를 들어 ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ³²P, ¹²⁵I, ¹³¹I 등을 들 수 있다.

태그 배열을 포함하는 폴리펩티드로서는, FLAG 펩티드 (FLAG 태그, Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys), 폴리히스티딘 (His 태그, His His His His His His), myc 에피토프 펩티드 (myc 태그, Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu), 헤마글루티닌 에피토프 펩티드 (HA 태그, Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala) 등을 들 수 있다.

항체 또는 측정 대상 성분의 표지화는, 항체 또는 측정 대상 성분과 표지 물질 각각이 갖는 관능기 사이에서, 링커를 개재하거나 또는 개재하지 않고 공유 결합을 일으키는 반응에 의해 실시할 수 있다. 관능기로서는, 카르복실기나 아미노기, 글리시딜기, 술프히드릴기, 수산기, 아미드기, 이미노기, 히드록시숙시닐에스테르기, 말레이미드기, 이소티오시아네이트기 등을 들 수 있다. 이 관능기끼리의 사이에서 축합 반응을 실시하는 것이 가능하다.

링커를 개재하지 않는 결합 방법으로서는 예를 들어, EDC 등의 카르보디이미드 화합물을 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 이 경우, NHS 또는 그 유도체 등의 활성 에스테르를 사용하는 것도 가능하다. 이소티오시아네이트기와 아미노기 사이의 축합 반응은, 다른 시약을 필요로 하지 않고, 중성 ∼ 약알칼리성의 조건으로 혼합하는 것만으로 진행되기 때문에 바람직하다.

링커로서는, 예를 들어 표지 물질과 항체를 각각의 관능기를 개재하여 결합시킬 수 있는 분자이면 어떠한 것이어도 된다. 바람직한 양태는, 예를 들어 항체의 아미노산 잔기와 반응할 수 있는 제 1 관능기와, 표지 물질의 측사슬의 관능기와 반응할 수 있는 제 2 관능기를 동일 분자 내에 갖는 분자이며, 제 1 관능기와 제 2 관능기가 상이한 기인 것이 바람직하다. 링커의 관능기로서는, 예를 들어 전술한 관능기를 들 수 있다.

방사성 동위 원소를 화학적으로 결합시키는 방법으로서는, 예를 들어 문헌 (Antibody Immunoconj. Radiopharm., 3, 60, 1990) 에 기재된 방법을 들 수 있다.

표지 물질이 효소, 아비딘, 형광을 발하는 단백질, 피코빌리 단백질, 태그 배열을 포함하는 폴리펩티드 등의 폴리펩티드인 경우에는, 공지된 유전자 재조합 기술 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) 에 따라, 표지 물질과 항체의 융합 단백질을 코드하는 DNA 를 함유하는 발현 벡터를 제조하고, 발현 벡터를 적당한 숙주에 도입하고, 숙주을 배양함으로써 제조할 수 있다. 융합 단백질을 코드하는 DNA 는 항체 및 표지 물질을 각각 코드하는 DNA 를 PCR 등으로 클로닝하고, 각각의 DNA 를 리가아제 반응에 의해 연결함으로써 얻을 수 있다.

전술한 (6) 의 측정 방법 4 에 기재된 호모지니어스법에 사용되는 표지 물질 1 과 2 로서는, 1 개의 측정 대상 성분에 결합하여 근접함으로써 상호 작용을 일으키는 표지 물질을 들 수 있다. 이와 같은 표지 물질로서, 형광 공명 에너지 이동 (FRET:fluorescence resonance energy transfer) 을 일으키는 형광 물질을 들 수 있다. FRET 란, 제 1 형광 물질이 여기광을 수광함으로써 발생된 형광 에너지가 근접하는 제 2 형광 물질의 형광 에너지로서 이용되는 현상이며, 2 종류의 형광 물질이 1 ∼ 10㎚ 까지 근접함으로써 일어난다. FRET 를 일으키는 형광 물질의 조합으로서는, 일방의 형광 파장의 스펙트럼과 타방의 여기 파장의 스펙트럼에 중첩이 있는 조합을 들 수 있다. 형광 물질로서는, 형광 단백질, 저분자 유기 형광 색소, 무기 화합물 등을 들 수 있다. FRET 를 일으키는 형광 단백질의 조합으로서는, 예를 들어 YFP［녹색 형광 단백질 (GFP) 의 황색 변이체］와 CFP［녹색 형광 단백질 (GFP) 의 시안색 변이체］의 조합 등을 들 수 있다. 저분자 유기 형광 색소의 조합으로서는, 예를 들어 Cy3 과 Cy5 의 조합을 들 수 있다. 무기 화합물로서는 예를 들어 quantum dot (Science, 281, 2016-2018, 1998) 을 들 수 있다.

또한, 호모지니어스법에서의 그 표지 물질의 조합으로서, 바이오 루미네선스 공명 에너지 이동 (BRET：bioluminescence resonance energy transfer) 을 일으키는, 화학 발광을 발생시키는 효소와 형광 물질의 조합도 들 수 있다. BRET 를 일으키는 효소와 형광 물질의 조합으로서는, 효소가 기질을 분해하여 발생하는 발광 파장의 스펙트럼과, 형광 물질의 여기 파장의 스펙트럼에 중첩이 있는 조합을 들 수 있다. 예를 들어, 효소로서 바다표고버섯 루시페라아제 (Rluc), 기질로서 예를 들어 딥 블루 C［Deep Blue C, 팩커드 바이오사이언스 (Packard BioScience) 사 제조］, 형광 물질로서 GFP 를 사용하는 조합 등을 들 수 있다. 이 경우, Rluc 에 의한 기질의 분해에 의해 395㎚ 의 파장의 광이 발생하고, Rluc 에 GFP 가 근접함으로써, GFP 가 이 광의 에너지를 받아 발하는 510㎚ 의 파장의 형광을 검출할 수 있다.

또한, 호모지니어스법에서의 그 표지 물질의 조합으로서, 표지 물질 1 과 표지 물질 2 가 근접하고, 어느 배향성을 갖고 결합했을 때에 효소 활성을 발생시키는 물질의 조합을 들 수 있다. 예를 들어, 표지 물질의 조합으로서는, 표지 물질 1 로서 β-갈락토시다아제의 Δα 서브유닛, 표지 물질 2 로서 β-갈락토시다아제의 Δω 서브유닛을 사용하는 조합, 표지 물질 1 로서 Rluc 의 N 말단측 도메인, 표지 물질 2 로서 Rluc 의 C 말단측 도메인을 사용하는 조합 등을 들 수 있다.

(11) 항원 항체 반응

항원 항체 반응은 수성 매체 중에서 행해지는 것이 바람직하다. 반응 온도로서는, 예를 들어 0 ∼ 50℃ 를 들 수 있고, 4℃ ∼ 40℃ 가 바람직하다. 반응 시간으로서는 5 분간 ∼ 20 시간이 바람직하다.

(12) 표지량의 측정

면역 복합체의 표지의 양의 측정 방법은 표지 물질에 따라 적절한 것을 선택할 수 있다. 즉, 표지 물질이 발색 물질 즉 어느 파장의 광을 흡수하는 물질인 경우, 혹은 응집 등에 의해 발생하는 탁도 (흡광도) 변화량인 경우, 분광 광도계나 멀티웰 플레이트 리더 등을 사용할 수 있다. 표지 물질이 형광 물질인 경우에는, 형광 광도계나 형광 멀티웰 플레이트 리더 등을 사용할 수 있다. 표지 물질이 발광 물질인 경우에는, 발광 광도계나 발광 멀티웰 플레이트 리더 등을 사용할 수 있다. 표지 물질이 방사성 동위 원소인 경우, 방사성 동위 원소의 양은 방사 활성을 신틸레이션 카운터, γ-웰 카운터 등에 의해 측정할 수 있다.

표지가 효소인 경우, 표지량은 효소 활성을 측정함으로써 정량할 수 있다. 예를 들어 효소의 기질을 당해 효소와 반응시키고, 생성된 물질을 측정함으로써, 표지량을 측정할 수 있다.

효소가 퍼옥시다아제인 경우에는, 예를 들어 흡광도법, 형광법 등에 의해 퍼옥시다아제 활성을 측정할 수 있다. 흡광도법에 의해 퍼옥시다아제 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어 퍼옥시다아제와 그 기질인 과산화수소 및 산화 발색형 색원체의 조합을 반응시켜, 반응액의 흡광도를 분광 광도계나 멀티웰 플레이트 리더 등으로 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 산화 발색형 색원체로서는, 예를 들어 로이코형 색원체, 산화 커플링 발색형 색원체 등을 들 수 있다.

로이코형 색원체는 과산화수소 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재하에서 단독으로 색소로 변환되는 물질이다. 구체적으로는, 테트라메틸벤지딘, o-페닐렌디아민, 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스〔3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐〕아민 (BCMA) 등을 들 수 있다.

산화 커플링 발색형 색원체는 과산화수소 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재하, 2 개의 화합물이 산화적 커플링하여 색소를 생성하는 물질이다. 2 개의 화합물의 조합으로서는, 커플러와 아닐린류 (트린더 시약) 의 조합, 커플러와 페놀류의 조합 등을 들 수 있다. 커플러로서는, 예를 들어 4-아미노안티피린 (4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라진 등을 들 수 있다. 아닐린류로서는, N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-비스(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS) 등을 들 수 있다. 페놀류로서는, 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-히드록시-2,4,6-트리요오드벤조산 (HTIB) 등을 들 수 있다.

형광법에 의해 퍼옥시다아제 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어 퍼옥시다아제와 그 기질인 과산화수소 및 형광 물질의 조합을 반응시켜, 형광 광도계나 형광 멀티웰 플레이트 리더 등에 의해 생성된 형광의 강도를 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 당해 형광 물질로서는, 예를 들어 4-히드록시페닐아세트산, 3-(4-히드록시페닐)프로피온산, 쿠마린 등을 들 수 있다.

발광법에 의한 퍼옥시다아제 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어 퍼옥시다아제와 그 기질인 과산화수소 및 발광 물질의 조합을 반응시켜, 발광 강도계나 발광 멀티웰 플레이트 리더 등에 의해 생성된 발광의 강도를 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 당해 발광 물질로서는, 예를 들어 루미놀 화합물, 루시게닌 화합물 등을 들 수 있다.

효소가 알칼리포스파타아제인 경우에는, 예를 들어 발광법 등에 의해 알칼리포스파타아제 활성을 측정할 수 있다. 발광법에 의해 알칼리포스파타아제 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어 알칼리포스파타아제와 그 기질을 반응시키고, 생성된 발광의 발광 강도를 발광 강도계나 발광 멀티웰 플레이트 리더 등으로 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 알칼리포스파타아제의 기질로서는, 예를 들어 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3'-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄·2나트륨염(AMPPD), 2-클로로-5-｛4-메톡시스피로［1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로［3.3.1.13,7］데칸]-4-일｝페닐포스페이트·2나트륨염(CDP-Star^TM), 3-｛4-메톡시스피로［1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로［3.3.1.13,7］데칸]-4-일｝페닐포스페이트·2나트륨염(CSPD^TM),［10-메틸-9(10H)-아크리디닐이덴］페녹시메틸인산·2나트륨염(Lumigen^TM APS-5) 등을 들 수 있다.

효소가 β-D-갈락토시다아제인 경우에는, 예를 들어 흡광도법 (비색법), 발광법 또는 형광법 등에 의해 β-D-갈락토시다아제 활성을 측정할 수 있다. 흡광도법 (비색법) 에 의해 β-D-갈락토시다아제 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 등을 들 수 있다. 발광법에 의해 β-D-갈락토시다아제 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어 β-D-갈락토시다아제와 그 기질을 반응시켜, 반응액의 발광도를 발광 강도계나 발광 멀티웰 플레이트 리더 등으로 측정하는 방법 등을 들 수 있다. β-D-갈락토시다아제의 기질로서는, 예를 들어 갈락톤 플러스［Galacton-Plus, 어플라이드 바이오 시스템즈 (Applied Biosystems) 사 제조］또는 그 유사 화합물 등을 들 수 있다. 형광법에 의해 β-D-갈락토시다아제 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어 β-D-갈락토시다아제와 그 기질을 반응시켜, 반응액의 형광도를 형광 광도계나 형광 멀티웰 플레이트 리더 등으로 측정하는 방법 등을 들 수 있다. β-D-갈락토시다아제의 기질로서는, 예를 들어 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토피라노시드 등을 들 수 있다.

효소가 루시페라아제인 경우에는, 예를 들어 발광법 등에 의해 루시페라아제 활성을 측정할 수 있다. 발광법에 의해 루시페라아제 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어 루시페라아제와 그 기질을 반응시켜, 반응액의 발광도를 발광 강도계나 발광 멀티웰 플레이트 리더 등으로 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 루시페라아제의 기질로서는, 예를 들어 루시페린, 셀렌테라진 등을 들 수 있다.

표지 물질이 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위 원소 및 효소 이외인 경우에는, 당해 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질을 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위 원소, 효소 등으로 표지한 표지체와, 면역 복합체 중의 표지화 항체 또는 표지화 경합 물질을 구성하고 있는 당해 표지 물질을 결합시키고, 당해 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질을 표지하고 있는 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위 원소 또는 효소를 이용하여, 상기의 기재와 동일하게 하여 검출을 실시할 수 있다. 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질로서는, 표지 물질을 특이적으로 결합하는 항체, 또한 표지 물질이 비오틴인 경우에는, 아비딘이나 스트렙토아비딘 등을 들 수 있다. 또한, 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질 (표지 물질에 특이적으로 결합하는 항체, 아비딘 또는 스트렙토아비딘 등) 을 이용하여, 면역 복합체 중의 표지 물질과 결합시킨 후, 표지 물질에 특이적으로 결합하는 물질에 결합하는 항체, 예를 들어 항체의 정상 영역에 특이적으로 결합하는 항체 또는 아비딘 또는 스트렙토아비딘에 특이적으로 결합하는 항체를 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위 원소 또는 효소로 표지한 것을 결합시키고, 이들 항체를 표지하고 있는 형광 물질, 발광 물질, 방사성 동위 원소 또는 효소를 이용하여, 상기의 기재와 동일하게 하여 검출을 실시할 수도 있다.

이들 검출에 사용하는 항체, 아비딘 또는 스트렙토아비딘이나 표지 물질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 정상 영역에 특이적으로 결합하는 항체, 아비딘 또는 스트렙토아비딘에 특이적으로 결합하는 항체는, 폴리클로날 항체이어도 되고 모노클로날 항체이어도 되며, 혹은 Fab, 펩신 처리에 의해 얻어지는 F(ab')₂, 펩신 처리-환원 처리에 의해 얻어지는 Fab' 등의 Fc 부분을 제거한 항체 프래그먼트이어도 된다.

(13) 측정 대상 성분의 정량

측정 대상 성분의 정량에 있어서는, 표준 물질, 즉 이미 알려진 농도의 그 측정 대상 성분의 용액을 이용하여 그 측정 대상 성분의 농도와 측정치 (표지 유래의 정보량) 의 관계를 나타내는 검량선을 작성할 필요가 있다. 검량선을 작성한 후, 시료를 이용하여 측정을 실시하고, 얻어진 측정치와 미리 작성된 검량선으로부터, 그 시료 중의 그 측정 대상 성분의 농도를 결정할 수 있다.

(14) 수성 매체 및 그 밖의 공존물

본 발명의 면역 측정법에 있어서 사용되는 수성 매체로서는, 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있고, 완충액이 바람직하다. 완충액의 조제에 사용되는 완충제로서는, 완충능을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, pH 1 ∼ 11 의 예를 들어 락트산 완충제, 시트르산 완충제, 아세트산 완충제, 숙신산 완충제, 프탈산 완충제, 인산 완충제, 트리에탄올아민 완충제, 디에탄올아민 완충제, 리신 완충제, 바르비튜레이트 완충제, 이미다졸 완충제, 말산 완충제, 옥살산 완충제, 글리신 완충제, 붕산 완충제, 탄산 완충제, 글리신 완충제, 굿 완충제 등을 들 수 있다.

굿 완충제로서는, 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 완충제, 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (Bis-Tris) 완충제, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (Tris) 완충제, N-(2-아세트아미드)이미노2아세트산 (ADA) 완충제, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES) 완충제, 2-［N-(2-아세트아미드)아미노］에탄술폰산 (ACES) 완충제, 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO) 완충제, 2-［N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노］에탄술폰산 (BES) 완충제, 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS) 완충제, 2-｛N-［트리스(히드록시메틸)메틸］아미노｝에탄술폰산 (TES) 완충제, N-(2-히드록시에틸)-N'-(2-술포에틸)피페라진 (HEPES) 완충제, 3-［N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO) 완충제, 2-히드록시-3-｛［N-트리스(히드록시메틸)메틸］아미노｝프로판술폰산 (TAPSO) 완충제, 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판-3-술폰산) (POPSO) 완충제, N-(2-히드록시에틸)-N'-(2-히드록시-3-술포프로필)피페라진 (HEPPSO) 완충제, N-(2-히드록시에틸)-N'-(3-술포프로필)피페라진 (EPPS) 완충제, 트리신［N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신］완충제, 비신［N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신］완충제, 3-［N-트리스(히드록시메틸)메틸］아미노프로판술폰산 (TAPS) 완충제, 2-(N-시클로헥실아미노)에탄술폰산 (CHES) 완충제, 3-(N-시클로헥실아미노)-2-히드록시프로판술폰산 (CAPSO) 완충제, 3-(N-시클로헥실아미노)프로판술폰산 (CAPS) 완충제 등을 들 수 있다.

완충액의 농도는 측정에 적절한 농도이면 특별히 제한은 되지 않지만, 0.001 ∼ 2.0mol/ℓ 가 바람직하고, 0.005 ∼ 1.0mol/ℓ 가 보다 바람직하고, 0.01 ∼ 0.1mol/ℓ 가 특히 바람직하다.

본 발명의 면역 측정법에 있어서는, 금속 이온, 염류, 당류, 계면 활성제, 방부제, 단백질, 단백질 안정화제 등을 공존시킬 수 있다.

금속 이온으로서는, 예를 들어 마그네슘 이온, 망간 이온, 아연 이온 등을 들 수 있다.

염류로서는, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼륨 등을 들 수 있다.

당류로서는, 예를 들어 만니톨, 소르비톨 등을 들 수 있다.

방부제로서는, 예를 들어 아지화나트륨, 항생 물질 (스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 바이오에이스, 프로클린 300, 프록셀 (Proxel) GXL 등을 들 수 있다.

단백질로서는, 예를 들어 소 혈청 알부민 (BSA), 소 태아 혈청 (FBS), 카세인, 블록에이스 (다이닛폰 제약사 제조) 등을 들 수 있다.

단백질 안정화제로서는, 예를 들어 퍼옥시다아제 안정화 완충액［Peroxidase Stabilizing Buffer, 다코사이토메이션 (DakoCytomation) 사 제조］등을 들 수 있다.

(15) 면역 측정용 시약

본 발명의 면역 측정용 시약은, 본 발명의 면역 측정법에 사용될 수 있는 것으로서, 상기 (3) 에 기재한 담즙산 유도체, 요컨대, 추가로 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제를 함유한다. 구체적으로는, 본 발명의 면역 측정용 시약으로서는, 예를 들어 (3) 에 기재한 담즙산 유도체, 요컨대 추가로 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제를 함유함과 함께, 이하의 (i) ∼ (iii) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 요소를 함유하는 것을 특징으로 하는 시약을 들 수 있다.

(i) 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 1 항체, 및 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 2 항체에 표지가 결합한 표지화 항체；

(ii) 경합 물질에 표지가 결합한 표지화 경합 물질, 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하는 항체；또는,

(iii) 경합 물질, 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하고, 또한 표지가 결합한 표지화 항체.

본 발명의 면역 측정용 시약의 형상은, 본 발명의 면역 측정법을 가능하게 하는 형상이면 특별히 제한은 없다. 시약의 형상으로서는, 예를 들어 액상이나 동결 건조 상태 등의 형상을 들 수 있다. 동결 건조 상태의 시약을 사용하는 경우에는, 측정 전에 전술한 수성 매체 등으로 용해하여 측정에 제공한다.

본 발명의 면역 측정용 시약에 있어서 사용되는 담즙산 유도체, 측정 대상 성분에 결합하는 항체, 경합 물질, 측정 대상 성분에 결합하는 항체에 표지가 결합한 표지화 항체, 표지화 경합 물질로서는, 예를 들어 각각 전술한 담즙산 유도체, 측정 대상 성분에 결합하는 항체, 경합 물질, 측정 대상 성분에 결합하는 항체에 표지가 결합한 표지화 항체, 표지화 경합 물질을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 면역 측정용 시약은, 필요에 따라 전술한 수성 매체, 금속 이온, 염류, 당류, 계면 활성제, 방부제, 단백질, 단백질 안정화제 등을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 면역 측정용 시약은 키트의 형태로 보존, 유통되어도 된다. 키트로서는, 2 시약계, 3 시약계 등의 형태를 들 수 있지만, 키트를 구성하는 각 시약 중의 구성 요소는 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 담즙산 유도체를 수성 매체에 용해하여 조제한 용액을 시료 희석액으로 하여 키트 중의 하나의 구성 시약으로 할 수 있다.

(16) 시료 중의 헤모글로빈의 영향 억제 방법

본 발명은, 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법에 있어서의, 헤모글로빈의 영향을 억제하는 방법을 제공한다. 헤모글로빈의 영향은, 시료 중의 측정 대상 성분을 면역 측정법에 의해 측정할 때, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체를 존재시킴으로써 억제된다. 시료 중의 측정 대상 성분의 측정에 있어서, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체를 존재시킴으로써, 시료에 함유되는 헤모글로빈의 영향이 억제되기 때문에, 측정 대상 성분의 정확한 측정이 가능해진다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 전혀 한정하는 것이 아니다.

실시예 1

［1］항 MxA 단백질 모노클로날 항체의 조제

프리스탄 처리한 8 주령 누드 암컷 마우스 (Balb/c) 에 모노클로날 항체 KM1124 를 생산하는 하이브리도마주 KM1124 (FERM BP-4729) 및 모노클로날 항체 KM1135 를 생산하는 하이브리도마주 KM1135 (FERM BP-4731) 를 각각 5 ∼ 20×10⁶ 세포/마리씩 복강 내 주사하였다. 10 ∼ 21 일 후에, 하이브리도마주가 복수암화되어, 복수가 고인 마우스로부터 복수를 채취하였다. 채취한 복수를 3000rpm 으로 5 분간, 원심 분리하여 고형분을 제거하고, 상청을 회수하였다. 이 상청으로부터, 카프릴산 침전법 (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 에 의해 모노클로날 항체를 정제하고, 각각 모노클로날 항체 KM1124 및 모노클로날 항체 KM1135 를 취득하였다.

또한, KM1124 는 인간 MxA 단백질의 아미노 말단으로부터 220 ∼ 297 잔기 중에 존재하는 에피토프, KM1135 는 인간 MxA 단백질의 아미노 말단으로부터 10 ∼ 220 잔기 중에 존재하는 에피토프와 각각 결합하는 마우스 모노클로날 항체이다.

［2］리콤비넌트 MxA 단백질의 조제

인간 MxA 단백질을 코드하는 cDNA 를 함유하는 NdeI-BamHI 단편을, 벡터 pET-14b［노바젠 (Novagen), EMD 바이오사이언시즈 (EMD Biosciences) 사 제조］의 NdeI-BamHI 사이에 삽입하여 제조한 인간 MxA 단백질 발현 벡터 pET14b-MxA (Nucleic Acids Res, 32, 643-652, 2004) 로 Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS 주를 형질 전환하였다. 이 형질 전환체는 N 말단에 His 태그가 부가된 MxA 단백질을 발현한다.

얻어진 형질 전환체를, 암피실린을 함유하는 LB 배지 5㎖ 에 식균하고, 600㎚ 의 흡광도 (OD600) 가 0.5 가 될 때까지 37℃ 에서 진탕 배양하였다. 이 배양액을 암피실린을 함유하는 LB 배지 250㎖ 에 식균하고, 600㎚ 에서의 흡광도가 0.3 ∼ 0.5 가 될 때까지 37℃ 에서 진탕 배양하였다. 여기에, 이소프로필티오갈락토시드 (IPTG) 를 최종 농도 0.4mmol/ℓ 가 되도록 첨가하고, 다시 37℃ 에서 2 시간 진탕 배양하고 배양을 종료하였다. 배양액을 4℃ 에서 3000rpm, 10 분간 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 균체는 MxA 단백질의 조제까지 -80℃ 에서 보존하였다.

MxA 단백질은 균체 내에 불용체 (inclusion body) 상태로 존재하고 있었으므로, 균체를 빙상에서 융해시키고, 빙랭된 결합 완충액 (5mmol/ℓ 이미다졸, 0.5mol/ℓ 염화나트륨, 20mmol/ℓ Tris-HCl, pH 7.9) 20㎖ 를 첨가하고, 현탁시켰다. 균체 현탁액에 30 초씩 5 회의 초음파 처리를 하여 균체를 파쇄한 후, 4℃ 에서 4000rpm 으로 10 분간 원심 분리를 실시하였다. 상청을 제거하고, 침전에 빙랭된 결합 완충액 20㎖ 를 첨가하여 현탁시키고, 다시 동일하게 초음파 처리와 원심 분리를 실시하였다. 상청을 제거하고, 침전에 6mol/ℓ 우레아를 함유하는 결합 완충액 20㎖ 를 첨가하여, 현탁시켰다. 동일하게 초음파 처리를 실시한 후, 빙상에서 30 분간 정치(靜置)하여 불용체를 용해시키고, 4℃ 에서 10000rpm 으로 30 분간 원심 분리를 실시하였다. 상청을 회수하고 0.45㎚ 밀리포어 필터로 여과하였다.

얻어진 용액에 Ni-NTA His·Bind 레진 (노바젠, EMD 바이오사이언시즈사 제 조) 0.5㎖ 를 첨가하고, 4℃ 에서 2 시간 회전시키면서 혼화시키고, His 태그를 개재하여 레진에 MxA 단백질을 결합시켰다. 4℃ 에서 3000rpm 으로 2 분간 원심 분리하고, 레진을 회수하였다. 레진에 빙랭된 6mol/ℓ 우레아를 함유하는 결합 완충액 10㎖ 를 첨가한 후, 4℃ 에서 3000rpm 으로 2 분간 원심 분리하고, 레진을 회수하였다. 이 세정 조작을 다시 반복한 후, 추가로 레진에 빙랭된 세정 완충액 (6mol/ℓ 우레아, 60mmol/ℓ 이미다졸, 0.5mol/ℓ 염화나트륨, 20mmol/ℓ Tris-HCl, pH 7.9) 10㎖ 를 첨가하고, 4℃ 에서 3000rpm 으로 2 분간 원심 분리하고, 레진을 회수하였다.

레진에 빙랭된 용출 완충액 (6mol/ℓ 우레아, 1mol/ℓ 이미다졸, 0.5mol/ℓ 염화나트륨, 20mmol/ℓ Tris-HCl, pH 7.9) 10㎖ 를 첨가하고, 4℃ 에서 2 시간 회전시키면서 혼화시키고, 레진으로부터 MxA 단백질을 용출시키고, 이어서 4℃ 에서 3000rpm 으로 2 분간 원심 분리하고, 상청을 MxA 단백질 용액으로서 회수하였다.

［3］항 MxA 단백질 항체 고상화 플레이트의 조제

［1］에서 조제한 항 MxA 단백질 모노클로날 항체 KM1135 를 5㎍/㎖ 가 되도록 PBS 로 희석하고, 96 웰 마이크로타이터 플레이트［Nalge Nunc International 사 제조］에 100㎕/웰의 양으로 분주(分注)하였다. 3 일간 방치 후, 상청을 흡인 제거하고, 25% 블록에이스 (다이닛폰 제약사 제조), PBS 300㎕ 를 분주하고 실온에서 하룻밤 정치시켜 블로킹하였다. 블로킹액을 제거한 후, PBS 로 세정하였다. 진공 건조기로 3 일간 건조시킨 것을 항 MxA 단백질 모노클로날 항체 고상화 플레이트로 하여 사용하였다.

［4］퍼옥시다아제 표지 항 MxA 단백질 항체의 조제

［1］에서 조제한 항 MxA 단백질 모노클로날 항체 KM1124 를 이하와 같이 하여 말레이미드법으로 퍼옥시다아제 (이하, POD 라 약기) 와 결합시켜, POD 표지 항 MxA 단백질 항체를 제조하였다.

먼저, 항 MxA 단백질 항체 KM1124 2㎎ 을 함유하는 용액의 용매를 0.1mol/ℓ붕산 완충액 (pH 8.0) 으로 치환하고, 0.086㎎ 의 2-이미노티올란염산염［피어스 (Pierce) 사 제조］을 첨가하고, 교반 후 30℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 0.1mol/ℓ 의 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 평형화한 세파덱스 (Sephadex) G25 (아머샴·바이오사시언스사 제조) 칼럼 (직경 1.5㎝×30㎝) 을 이용하여, 반응 용액 중의 미반응의 2-이미노티올란을 제거하고, 술프히드릴화한 KM1124 를 회수하였다.

한편, 항 MxA 단백질 항체 KM1124 에 대하여 몰비로 5 배량에 해당하는 POD (도요 방적사 제조, 퍼옥시다아제 I-C) 2.5㎎ 을 0.1mol/ℓ 인산 완충액 (pH 7.0) 250㎕ 에 용해시켰다. 이 용액을 30℃ 에서 5 분간 가온한 후, N,N-디메틸포름아미드 (나칼라이 테스크사 제조) 에 용해시킨 0.72㎎ 의 N-(6-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드 (EMCS, 도진 화학 연구소사 제조) 를 첨가하여 교반하고, 30℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 0.1mol/ℓ 인산 완충액 (pH 6.0) 으로 평형화한 세파덱스 G25 칼럼 (직경 1.5㎝×30㎝) 를 이용하여, 반응 후의 용액의 겔 여과를 실시하여, 미반응의 EMCS 를 제거하고, 말레이미드화한 POD 를 회수하였다.

상기에서 얻어진 술프히드릴화한 항 MxA 단백질 항체 KM1124 의 용액과 말레이미드화한 POD 의 용액을 혼합하여, 30℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 얻어진 표 지화 항체는, POD 표지 희석액 (액상 조성) 완충액｛50mmol/ℓ Bis-Tris (도진 화학 연구소사 제조), 0.1% BSA［인터젠 (InterGen) 사 제조］｝에 의해 800 배로 희석하여 사용하였다.

［5］시료 희석액의 조제

이하의 조성으로 이루어지는 시료 희석액을 각각 조제하였다.

HEPES (pH 8.0) 0.1mol/ℓ

계면 활성제 (표 1 에 기재된 종류와 농도)

NaCl 1.5mol/ℓ

BSA 0.1%

아지화나트륨 0.1%

［6］샌드위치 ELISA 에 의한 MxA 단백질 측정계의 구축

상기［2］에서 조제한 MxA 단백질 용액을 상기［5］에서 조제한 시료 희석액으로 희석하고, MxA 단백질의 0 (완충액만), 3.2, 6.3, 12.5, 25, 50, 100, 200ng/㎖ 의 각 농도의 용액을 조제하여, 측정 시료로 하였다.

상기［3］에서 제조한 항 MxA 단백질 항체 고정화 플레이트에 100㎕ 의 측정 시료를 첨가하고, 실온에서 1 시간 인큐베이트하고, 항체에 측정 시료 중의 MxA 단백질을 결합시켰다. 측정 시료를 제거한 후, 세정액［0.05% 트윈 20 (칸토 화학사 제조) 을 함유하는 PBS］을 400㎕ 첨가하여 제거하는 세정 조작을 5 회 실시하였다. 이어서,［4］에서 제조한 POD 표지 항 MxA 단백질 항체 용액을 100㎕ 첨가하고 실온에서 30 분간 반응시켰다. 표지화 항체를 제거하고, 세정액을 400㎕ 첨가하여 제거하는 세정 조작을 5 회 실시하였다. 어두운 곳에서, 0.05% 테트라메틸벤지딘 및 과산화수소를 함유하는 POD 의 발색 기질 TMBlue［세로로지컬 (Serological) 사 제조］를 100㎕ 첨가하고, 실온에서 10 분간 반응시켰다. 0.5mol/ℓ 황산을 100㎕ 첨가하여 실온에서 10 분간 인큐베이션하고 반응을 정지시켰다. 파장 450㎚ 의 흡광도를 플레이트 리더로 측정하였다. 그 결과, 측정 시료 중의 MxA 단백질의 농도의 상승에 따라, 흡광도의 상승이 보여져, MxA 단백질을 측정할 수 있음을 나타내었다.

또한, 실제로 혈액 중의 MxA 단백질을 측정하는 경우에는, 이와 같이 하여 얻어진 표준 곡선을 이용하여 혈액 중의 MxA 단백질을 환산함으로써 실시한다.

［7］혈액을 사용한 MxA 단백질의 첨가 회수 시험

바이러스 감염이 관찰되어 MxA 양성을 나타내는 환자 2 예와, 정상인 3 예로부터 EDTA·2Na 채혈관을 이용하여 채취한 혈액을 사용하였다.

이 혈액을 [5] 의 시료 희석액으로 10 배 희석시킨 시료를, [6] 에 기재된 방법으로 각 시료 중의 MxA 단백질 농도를 측정하고, MxA 단백질 무첨가 시료 중의 MxA 단백질 농도 (이하, A 라 약기한다) 로 하였다.

다음으로 이 시료 용액 9 용량에 대하여, 상기［2］에서 조제한 500ng/㎖ 의 MxA 단백질 용액을 1 용량 첨가한 시료를, [6] 에 기재된 방법으로 각 시료 중의 MxA 단백질 농도를 측정하고, MxA 단백질 첨가 시료 중의 MxA 단백질 농도 (이하, B 라 약기한다) 로 하여, 다음 식에 의해 MxA 단백질 회수율(%) 을 계산하였다.

MxA 단백질 회수율(%)=(B-A)/50*100 (식 1)

MxA 단백질 회수율(%) 은 헤모글로빈에 의한 영향이 완전하게 억제되었을 때에 이론적으로 100% 가 되고, 헤모글로빈의 영향이 발생함에 따라, 낮은 값이 된다.

비교예 1

실시예 1 의 [5] 의 조성으로부터 계면 활성제를 제거한 것을 시료 희석액으로서 사용하는 것 이외에는 실시예 1 과 동일한 방법에 의해, 첨가 회수 시험을 실시하였다.

비교예 2

실시예 1 의 [5] 의 조성 중, 계면 활성제를 0.2% 노니뎃 P40 으로 하는 것 이외에는 실시예 1 과 동일한 방법에 의해, 첨가 회수 시험을 실시하였다.

표 1 에 나타내는 바와 같이, 담즙산 유도체를 첨가하여 측정함으로써 MxA 단백질 회수율의 값은 상승하여, 헤모글로빈의 영향을 억제하고 있음을 알 수 있다.

실시예 2

4.9% CHAPS 를 함유하는 상기［5］에 기재된 시료 희석액 조성에 노니뎃 P-40 을 첨가하는 것에 의한 감도의 검토를 실시하였다. 상기［5］에 기재된 시료 희석액에 노니뎃 P-40 을 0, 0.2%, 1%, 1.4% 첨가하고, 상기［2］에서 조제한 MxA 단백질 0 (완충액만), 3.2, 6.3, 12.5, 25, 50, 100, 200ng/㎖ 의 각 농도의 용액을 조제하고, 실시예 1 의［6］에 기재된 방법으로 흡광도 (Abs) 를 측정하였다. 결과를 표 2 에 나타낸다.

표 2 에 나타내는 바와 같이, 노니뎃 P-40 의 첨가량에 의존한 흡광도의 상승이 관찰되어 측정 감도가 상승하는 것을 알 수 있다.

실시예 3

바이러스 감염이 관찰되어 MxA 단백질 양성을 나타내는 환자 2 예와, 정상인 3 예로부터 EDTA·2Na 채혈관을 이용하여 채혈한 혈액을 시료로서 사용하였다.

시료 희석액으로서, 4.9% CHAPS 를 함유하는 시료 희석액 및 4.9% CHAPS 및 1.4% 노니뎃 P-40 을 함유하는 시료 희석액을 사용하는 것 이외에 실시예 1 과 동일하게 하여 MxA 단백질 회수율을 구하였다. 결과를 표 3 에 나타낸다.

표 3 에 나타내는 바와 같이, 첨가 회수율은 노니뎃 P-40 을 첨가해도 저하되지 않음을 알 수 있다.

본 발명에 의해, 임상 진단에 유용한, 헤모글로빈의 영향이 억제된, 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정법 등이 제공된다.

Claims

헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체를, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하에 반응시키는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정 방법으로서,

시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체가, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]프로판술포네이트, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시프로판술포네이트, N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)콜아미드 또는 N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)데옥시콜아미드인 방법.
제 1 항에 있어서,

헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체를, 추가로 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제의 존재하에 반응시키는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

면역 측정 방법이 샌드위치법 또는 경합법인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체의 반응이, (1) 그 측정 대상 성분과, 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 1 항체 및 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 2 항체에 표지가 결합한 표지화 항체의 반응, (2) 그 측정 대상 성분과, 경합 물질에 표지가 결합한 표지화 경합 물질 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하는 항체의 반응, 또는 (3) 그 측정 대상 성분과, 경합 물질 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하고, 또한 표지가 결합한 표지화 항체의 반응인 방법.
제 2 항에 있어서,

폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

시료가 전혈(全血)인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

측정 대상 성분이 MxA 단백질인 방법.
담즙산 유도체 및 하기의 (1) ∼ (3) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 요소를 함유하는 것을 특징으로 하는 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정용 시약으로서,

담즙산 유도체가, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]프로판술포네이트, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시프로판술포네이트, N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)콜아미드 또는 N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)데옥시콜아미드인 면역 측정용 시약:

(1) 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 1 항체, 및 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 2 항체에 표지가 결합한 표지화 항체；

(2) 경합 물질에 표지가 결합한 표지화 경합 물질, 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하는 항체；또는

(3) 경합 물질, 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하고, 또한 표지가 결합한 표지화 항체.
제 8 항에 있어서,

추가로, 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제를 함유하는 시약.
제 9 항에 있어서,

폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르인 시약.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,

시약이 전혈(全血)인 시약.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,

측정 대상 성분이 MxA 단백질인 시약.
헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체를, 시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체의 존재하에 반응시키는 것을 특징으로 하는, 헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분의 면역 측정 방법에 있어서의 헤모글로빈의 영향 억제 방법으로서,

시료 유래의 담즙산 유도체와는 다른 담즙산 유도체가, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]프로판술포네이트, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시프로판술포네이트, N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)콜아미드 또는 N,N-비스(3-D-글루콘아미도프로필)데옥시콜아미드인 억제 방법.
제 13 항에 있어서,

면역 측정 방법이 샌드위치법 또는 경합법인 억제 방법.
제 13 항에 있어서,

측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체의 반응이, (1) 그 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 1 항체 및 그 측정 대상 성분에 결합하는 제 2 항체에 표지가 결합한 표지화 항체의 반응, (2) 그 측정 대상 성분과, 경합 물질에 표지가 결합한 표지화 경합 물질 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하는 항체의 반응, 또는 (3) 그 측정 대상 성분과, 경합 물질 그리고 그 측정 대상 성분 및 그 경합 물질에 결합하고, 또한 표지가 결합한 표지화 항체의 반응인, 억제 방법.
제 13 항에 있어서,

헤모글로빈을 함유하는 시료 중의 측정 대상 성분과 그 측정 대상 성분에 결합하는 항체를, 추가로 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제의 존재하에 반응시키는 억제 방법.
제 16 항에 있어서,

폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르인 억제 방법.
제 13 항 또는 제 16 항에 있어서,

시료가 전혈(全血)인 억제 방법.
제 13 항 또는 제 16 항에 있어서,

측정 대상 성분이 MxA 단백질인 억제 방법.
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