KR101386799B1

KR101386799B1 - 생분해성 색전술용 미소구체

Info

Publication number: KR101386799B1
Application number: KR1020127011638A
Authority: KR
Inventors: 리후이 웽; 자파 골자리안
Original assignee: 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타
Priority date: 2009-10-06
Filing date: 2010-10-06
Publication date: 2014-04-21
Anticipated expiration: 2030-10-06
Also published as: EP2803370B1; US8617132B2; CN102905733A; AU2010303552B2; CA2777083C; EP2626088A1; KR20140006117A; US20110082427A1; US11439725B2; EP2485777B1; US20190091368A1; EP2485777A1; US20140099374A1; CN102905733B; US20230095373A1; ES2531488T3; ES2445164T3; EP2626088B1; KR20120093924A; AU2010303552A1

Abstract

본 발명은 일반적으로 미소구체 또는 복수의 미소구체 형태의 색전성 물질에 관한 것이다. 상기 색전성 물질은 일반적으로 카복시메틸 셀룰로스(CMC)로 가교결합된 카복시메틸 키토산(CCN)을 포함한다. 일부 실시양태에 있어서, 상기 색전성 물질은 치료제, 예컨대 독소루비신을 추가로 포함할 수 있다.

Description

생분해성 색전술용 미소구체{BIORESORBABLE EMBOLIZATION MICROSPHERES}

본 발명은 색전성 물질에 관한 것이다.

경도관 동맥 색전술(TAE)은 종양, 혈관성 병변 및 출혈을 비롯하여 다양한 질환을 치료하는데 있어 그의 효능이 널리 인정되고 있다. 안전하면서 효과적인 치료를 위해, 적절한 색전성 물질을 선택하는 것이 중요하다.

일반적으로, 본 발명은 카복시메틸 셀룰로스(CMC)로 가교결합된 카복시메틸 키토산(CCN)을 포함하는 색전성 물질에 관한 것이다. 색전성 물질은 직경 약 50 마이크로미터(㎛) 내지 약 2,200 ㎛의 미소구체로 형성될 수 있다. CCN 및 CMC는 각각 생분해성 및 생체적합성이다. 색전성 물질 제조시에, CCN은 소분자 가교제의 사용없이 부분 산화된 CMC로 가교될 수 있다. 이 때문에, 색전성 물질은 생분해성 및 생체적합성일 것으로 여겨진다. 또한, 색전성 물질은 CMC에 의해 가교결합된 CCN의 삼차원 네트워크를 포함하기 때문에, 예를 들어 색전성 미소구체의 압축성 등과 같은 기계적 특성은 주사기, 카테터 등을 통해 미소구체가 환자의 동맥으로 도입 가능하기에 충분할 수 있다.

일부 실시양태에 있어서, 색전성 미소구체는 항암제와 같은 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 색전성 미소구체에 적재될 수 있는 치료제의 일례는 독소루비신이다.

일 양태로, 본 발명은 직경이 약 50 ㎛ 내지 약 2,200 ㎛인 미소구체를 포함하는 색전성 물질로서, 상기 미소구체는 카복시메틸 셀룰로스에 의해 가교결합된 카복시메틸 키토산을 포함하는 것인 색전성 물질에 관한 것이다.

다른 양태로, 본 발명은 용매 및 용매에 현탁된 복수의 미소구체를 포함하는 색전술용 현탁액에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 양태에 따라, 복수의 미소구체 중 적어도 하나는 약 50 ㎛ 내지 약 2,200 ㎛의 직경을 포함하고, 복수의 미소구체 중 적어도 하나는 카복시메틸 셀룰로스에 의해 가교결합된 카복시메틸 키토산을 포함한다.

또 다른 양태로, 본 발명은 복수의 미소구체를 포함하며, 상기 복수의 미소구체 중 적어도 하나는 약 50 ㎛ 내지 약 2,200 ㎛의 직경을 포함하고, 상기 복수의 미소구체 중 적어도 하나는 카복시메틸 셀룰로스에 의해 가교결합된 카복시메틸 키토산을 포함하는 키트에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 양태에 따라, 키트는 추가로 복수의 미소구체가 배치된 주사기 또는 바이알을 포함한다.

또 다른 양태로, 본 발명은 색전성 미소구체의 형성 방법에 관한 것이다. 이 방법은 카복시메틸 셀룰로스(CMC)를 적어도 부분적으로 산화하여 부분 산화된 CMC를 형성하는 단계; 부분 산화된 CMC, 카복시메틸 키토산(CCN), 물 및 오일의 에멀션을 형성하는 단계; 및 CCN을 CMC에 의해 가교결합하여 색전성 미소구체를 형성하는 단계를 포함한다.

추가의 다른 양태로, 본 발명은 카복시메틸 셀룰로스에 의해 가교결합된 카복시메틸 키토산을 포함하는 색전성 미소구체를 환자의 혈관에 주입하여 환자의 동맥을 폐쇄하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 카복시메틸 셀룰로스에 의해 가교결합된 카복시메틸 키토산을 포함하는 색전성 미소구체를 제조하기 위한 기술의 일례를 나타내는 흐름도이다.
도 2a 및 도 2b는 각각 본 발명의 일 양태에 따른 미소구체의 사진 및 광학 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 양태에 따라 형성된 미소구체 외면에 대한 주사전자 현미경 사진의 일례이다.
도 4a 및 도 4b는 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 제조된 하이드로겔 횡단면에 대한 SEM 이미지의 예이다.
도 5a 내지 도 5f는 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체에 염료 적재를 보여주는 광학 현미경 사진이다.
도 6a 내지 도 6c는 다양한 염료의 적재 후 본 발명의 일 양태에 따른 미소구체의 예들을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7d는 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체에 독소루비신이 적재된 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다.
도 8은 용매 혼합물에 현탁된 독소루비신이 적재된 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체의 일례를 보여주는 이미지이다.
도 9는 다양한 크기의 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체로 독소루비신이 적재되는 역학 실시예를 보여주는 산포도이다.
도 10은 다양한 크기의 미소구체로 독소루비신이 적재되는 역학 실시예를 보여주는 산포도이다.
도 11은 독소루비신의 적재동안 상이한 초기 직경의 미소구체에 대한 직경 변화 실시예를 보여주는 산포도이다.
도 12는 독소루비신이 적재된 미소구체의 형광 현미경 사진에 대한 일례이다.
도 13은 단일 독소루비신-적재 미소구체에 대해 형광 강도를 거리의 함수로 나타낸 이미지의 일례이다.
도 14는 본 발명에 따른 특성이 상이한 복수의 미소구체 각 샘플에 대해 시간의 함수로서 방출된 독소루비신의 퍼센트 예들을 나타낸 산포도이다.
도 15는 본 발명에 따른 특성이 상이한 복수의 미소구체 각 샘플에 대해 시간의 함수로서 방출된 독소루비신의 양의 예들을 나타낸 산포도이다.
도 16은 본 발명에 따른 특성이 상이한 복수의 미소구체 각 샘플에 대해 시간의 함수로서 염수 매질 중에 방출된 독소루비신의 양의 예들을 나타낸 산포도이다.
도 17은 본 발명에 따른 특성이 상이한 복수의 미소구체 각 샘플에 대해 시간의 함수로서 염수 매질 중에 방출된 독소루비신의 양의 예들을 나타낸 산포도이다.
도 18은 본 발명에 따른 특성이 상이한 복수의 미소구체 각 샘플에 대해 시간의 함수로서 염수 매질 중에 방출된 독소루비신의 양의 예들을 나타낸 산포도이다.
도 19는 두 상이한 직경 범위의 미소구체간 독소루비신 방출 속도를 비교한 예를 나타낸 직선도이다.
도 20은 상이한 매질에서 미소구체로부터 독소루비신의 방출예를 나타낸 직선도이다.
도 21은 CMC의 산화도가 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체로부터 독소루비신의 방출 속도에 영향을 미칠 수 있다는 예를 나타낸 직선도이다.
도 22는 미소구체로부터 독소루비신의 방출에 미치는 매질의 효과에 대한 일례를 나타낸 직선도이다.
도 23은 본 발명의 양태에 따른 미소구체로부터 독소루비신의 방출 속도와 DC Beads^TM으로부터 독소루비신의 방출 속도를 비교한 예를 나타낸 직선도이다.
도 24는 직경 약 715 ㎛의 단일 미소구체에 대한 압축력 대 거리의 플롯 일예이다
도 25a 내지 도 25c는 미소구체가 폴리에틸렌 튜브를 통과할 때 (에반스 블루로 염색된) CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체의 압축성의 일례를 나타내는 광학 현미경 사진이다.
도 26a 내지 도 26c는 미소구체가 폴리에틸렌 튜브를 통과할 때 (에반스 블루로 염색된) CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체의 압축성의 다른 예를 보여주는 광학 현미경 사진이다.
도 27a 및 도 27b는 (에반스 블루로 염색된) CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체의 탄성의 일례를 나타낸다.
도 28은 내경이 약 667 ㎛(2 프렌치(French))인 카테터를 통해 주입된 후, CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하고 직경이 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛인 미소구체의 일례에 대한 광학 현미경 사진이다.
도 29a 및 도 29b는 내경이 약 1 mm(3 프렌치)인 카테터를 통해 주입된 후, CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하고 직경이 약 800 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛인 미소구체의 일례에 대한 광학 현미경 사진이다.
도 30a 및 도 30b는 카테터를 통과하는 동안 및 카테터를 통과한 후, CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하고 독소루비신이 적재된 미소구체의 일례에 대한 광학 현미경 사진이다.
도 31a 및 도 31b는 폴리에틸렌 튜브를 통과하는 동안 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하고 독소루비신이 적재된 미소구체의 일례에 대한 광학 현미경 사진이다.
도 32a 및 도 32b는 두 4:6 조영제/염수 혼합물에 현탁된 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체를 나타낸 이미지이다.
도 33은 물에서 2 개월간 저장 후, CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 복수의 미소구체 일례의 광학 현미경 사진이다.
도 34a 내지 도 34e는 리소자임 존재하에 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 복수의 미소구체의 분해 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다.
도 35a 내지 도 35c는 리소자임 존재하에 독소루비신이 적재된 복수의 미소구체의 분해 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다.
도 36a 및 도 36b는 본 발명의 일 양태에 따른 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체와 함께 배양된 인간 피부 섬유모세포의 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다.
도 37a 및 도 37b는 배양된 인간 섬유모세포를 포함하는 대조군의 일례 및 본 발명의 일 양태에 따른 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체와 함께 배양된 인간 섬유모세포를 포함하는 샘플의 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다.
도 38a 내지 도 38c는 크리스탈 바이올렛으로 염색된 인간 피부 섬유모세포의 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다.
도 39a 내지 도 39c는 본 발명의 일 양태에 따른 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체와 함께 배양된 인간 피부 섬유모세포를 포함하는 샘플의 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다.
도 40은 MTS로 처리된 후, 인간 피부 섬유모세포와 함께 배양된 배지의 약 490 nm 파장에서의 흡광도의 일례를 나타내는 막대 그래프이다.
도 41은 3쌍의 토끼 신장을 직경 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛의 미소구체로 색전술한 후, 미소구체의 동맥 분포 일례를 나타내는 막대 그래프이다.
도 42는 Embospheres^®과 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체에 대해서 색전술 수술 동안 폐쇄된 혈관의 평균 직경을 비교한 일례를 나타내는 막대 도표이다.
도 43은 도 43에 예시된 결과를 생성하는 색전술 수술에 사용된 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체의 측정된 평균 직경의 일례를 나타내는 막대 도표이다.
도 44 및 도 45는 본 발명의 양태에 따른 색전성 미소구체로 폐쇄된 토끼의 신장내 활꼴 동맥을 나타내는 신장 조직의 조직 절개물을 예시한 것이다.

본 발명은 일반적으로 일부 실시양태에 있어서, 미소구체 또는 복수의 미소구체 형태로 존재할 수 있는 색전성 물질에 관한 것이다. 색전성 물질은 일반적으로 카복시메틸 셀룰로스(CMC)로 가교결합된 카복시메틸 키토산(CCN)을 포함한다.

임시 색전술은 구형의 생체적합성, 생분해성 및 압축성인 물질로 수행될 수 있다. 그러나, 이러한 특성들은 단일 색전성 미소구체에서 용이하게 이룰 수 없다. 예를 들어, 중합체의 가교결합은 글루타르알데히드와 같은 소분자 가교제를 사용하여 수행될 수 있다. 소분자 가교제의 사용은 목적하는 가교결합 반응을 촉진하지만, 가교결합 중합체가 생분해성이어서 환자의 체내에서 분해되면, 일부 소분자 가교제는 독성으로 될 수 있거나, 또는 환자 체내의 세포 또는 조직에 불리한 영향을 미칠 수도 있다.

이러한 본 발명의 양태에 따라, CCN 및 CMC를 소분자 가교제의 사용없이 가교결합하여 소분자 가교제가 실질적으로 없는 색전성 미소구체를 형성할 수 있다. 실제로, 일부 실시양태에 있어서, CMC와 CCN 간 가교결합 반응은 소분자 가교제없이 물 및 오일 에멀션 중에서 비교적 저온(예를 들면, 약 50℃)으로 수행될 수 있다. CCN은 실질적으로 비독성이며 생분해성이다. 키토산은 체내에서 글루코사민으로 분해되어 환자의 체내로 실질적으로 완전히 흡수될 수 있다. 마찬가지로, CMC도 실질적으로 비독성이며 생분해성이다. 따라서, CCN 및 CMC로 형성된 가교결합 중합체는 실질적으로 비독성(즉, 생체적합성) 및 생분해성(또는 생분해성)일 것으로 여겨진다. 또한, 가교결합 CCN 및 CMC 미소구체는 두 중합체로부터 형성되기 때문에, 가교결합 분자의 기계적 특성, 예컨대 압축성은 주사기 또는 카테터를 통해 가교결합 분자를 주입하기에 충분할 것으로 예상된다.

CCN 및 CMC 간 가교겨랍 반응은 비교적 저온에서 수행될 수 있기 때문에, 가교결합 반응은 일부의 경우 비교적 천천히 일어날 수 있다. 예를 들어, 가교결합 반응은 밤새(예를 들면, 적어도 약 12 시간에 걸쳐) 수행될 수 있다. 이러한 반응은 거의 구형에 가까운 가교결합 입자(미소구체)로 이어질 수 있다. 일부 예로, 미소구체의 평균 직경은 반응 조건(예를 들면, 교반 속도, 반응물의 초기 농도, 시간, 온도 등)에 따라 약 50 ㎛ 내지 약 2,200 ㎛일 수 있다.

일부 실시양태에 있어서, CCN 및 CMC를 포함하는 미소구체는 도 1에 예시된 기술에 따라 형성될 수 있다. 먼저, CMC를 적어도 부분적으로 산화시켜 부분 산화된 CMC를 형성한다 (12). CMC를 적어도 부분적으로 산화시키는 반응의 일례를 하기 반응 1에 나타내었다:

반응 1

반응 1에서, n개의 반복 단위를 포함하는 사슬 부분인 단일 CMC 단량체(반복 단위)를 약 25℃에서 NaI0₄(과요오드산나트륨)와 반응시켜 하이드록실 기에 결합된 탄소 원자간 C-C 결합을 산화시켜 카보닐(보다 특히 알데히드) 기를 형성한다. 반응 1은 CMC 중합체의 단일 반복 단위만을 나타낸다. 일부 실시양태에 있어서, CMC 중합체내 모든 반복 단위가 산화될 수 있는 것은 아니다. 예를 들어, 일부 반복 단위는 전혀 산화될 수 없고, 반응 1의 수행후에도 여전히 두 하이드록실 기를 포함할 수 있다. 반응 1에 예시된 바와 같이, 다른 단량체가 산화될 수 있으며, 두 카보닐 기를 포함할 수 있다. CMC는 약 50,000 달톤(Da; 몰당 그램(g/mol)에 상응) 내지 약 800,000 Da의 중량 평균 분자량을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, CMC의 중량 평균 분자량은 약 700,000 g/mol일 수 있다.

CMC의 산화도는, 예를 들어, NaI0₄ 대 CMC 반복 단위의 몰비에 영향을 받을 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, NaI0₄분자대 CMC 반복 단위의 몰비는 약 0.1:1 내지 약 0.5:1 (NaI0₄:CMC)일 수 있다. NaI0₄분자 대 CMC 반복 단위의 몰비의 특정 예는 약 0.1:1, 약 0.25:1 및 약 0.5:1을 포함할 수 있다. NaI0₄ 분자 대 CMC 반복 단위의 몰비가 증가하면 CMC의 산화도가 높아질 수 있으며, 이에 따라 CMC가 CCN과 반응하여 색전성 미소구체를 형성하는 경우, 가교결합 밀도가 더 커질 수 있다. 반대로, NaI0₄ 분자 대 CMC 반복 단위의 몰비가 감소하면 CMC의 산화도가 작아질 수 있으며, 이에 따라 CMC가 CCN과 반응하여 색전성 미소구체를 형성하는 경우, 가교결합 밀도가 더 낮아질 수 있다. 일부 예에서, 가교결합 밀도는 CMC의 산화도에 거의 비례할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 더 큰 가교결합 밀도는 더 큰 기계적 강도(예를 들면, 파괴 변형)로 이어질 수 있다.

그 다음으로, 반응 2에 예시 바와 같이 (14), 아민 기 또는 하이드록실 기 중 하나의 수소 원자 대신 -CH₂COO^- 기가 부착되도록 키토산을 반응시켜 CCN을 제조할 수 있다.

반응 2

반응 2의 생성물에서, 각 R은 독립적으로 H 또는 -CH₂COO^-이다. 반응 1에 예시된 CMC의 산화와 유사하게, -CH₂COO^-의 부가 정도는 CCN이 부분 산화된 CMC와 반응하여 색전성 미소구체를 형성하는 경우, 가교 밀도에 영향을 줄 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, x:y의 비는 약 3:1이다 (즉, "x" 단량체는 키토산의 약 75%를 형성하고, "y" 단량체는 키토산의 약 25%를 형성한다). 일부 실시양태에 있어서, 키토산 출발물질은 분자량이 약 190,000 g/mol 내지 약 375,000 g/mol일 수 있다. 일부 예로, 반응 2는 반응 혼합물을 약 25℃에서 500 rpm으로 약 24 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 약 50℃에서 500 rpm으로 약 4 시간 동안 교반함으로써 수행될 수 있다.

부분 산화된 CMC 및 CCN이 제조되면, 각각을 각량의 용매, 예컨대 물에서 혼합한다 (16), (18). 예를 들어, 0.1 밀리그램(mg)의 부분 산화된 CMC를 5 밀리리터(mL)의 물에서 혼합하여 제1의 2% 중량/부피(w/v) 용액을 제조할 수 있다. 유사하게, 0.1 mg의 CCN을 5 mL의 물에서 혼합하여 제2의 2% w/v 용액을 제조할 수 있다. 물론, 물 이외의 다른 용매도 사용될 수 있으며, 각각 다른 농도의 부분 산화된 CMC 또는 CCN의 용액이 이용될 수 있다. 예를 들어, 염수 또는 인산 완충 염수(PBS)가 대안적인 용매로서 사용될 수 있다. 부분 산화된 CMC 용액에 사용된 용매는 CCN 용액에 사용된 용매와 동일하거나 상이할 수 있다. 용액에서 부분 산화된 CMC 또는 CCN의 농도는 약 0.5% w/v 내지 약 3% w/v일 수 있다. 부분 산화된 CMC 용액의 농도는 CCN 용액의 농도와 동일하거나 상이할 수 있다.

이어, 제1 및 제2 용액을 다른 용매에 첨가하여 에멀션을 형성할 수 있다 (20). 물이 부분 산화된 CMC 및 CCN의 용매로 사용된 예에서, 다른 용매는 오일, 예를 들어, 광유 등일 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 다른 용매는 계면활성제를 혼합하여 포함할 수 있다. 적합한 계면활성제의 일례로 시그마-알드리히사(Sigma-Aldrich)(St. Louis, Missouri)에 의해 S6760 또는 Span^® 80의 상품명으로 입수할 수 있는 소르비탄 모노올레에이트를 들 수 있다. 일 실시양태로, 0.5 mL의 소르비탄 모노올레에이트를 50 mL의 광유에서 혼합한 후, 부분 산화된 CMC 2% w/v 용액 5 mL 및 CCN 2% w/v 용액 5 mL와 혼합할 수 있다.

그 다음에, 에멀션을 적어도 약 12 시간(예를 들면, 적어도 밤새) 방치하여 부분 산화된 CMC 및 CCN이 변형된 에멀션-가교결합 반응으로 반응되도록 하였다 (22). 특히, CCN 상의 아미노 기가 부분 산화된 CMC 상의 알데히드 기와 반응하여 쉬프 염기(Schiff base)(즉, N=C 이중 결합)를 형성하고, CMC 및 CCN을 가교결합시킬 수 있다. 이러한 가교결합 반응의 일례를 하기 반응 3에 예시하였다.

반응 3

상술한 바와 같이, CMC와 CCN의 가교결합 반응은 소분자 가교제, 예컨대 글루타르알데히드의 사용없이 진행될 수 있다. 이는 일부 실시양태에 있어서, 소분자 가교제는 색전성 미소구체가 사용되는 환자에 독성일 수 있기 때문에, 유리할 수 있다. 따라서, CMC에 의해 가교결합된 CCN으로부터 형성된 미소구체는 실질적으로 어떤 소분자 가교제도 함유하지 않을 수 있다.

일부 예에서, CMC와 CCN 간 가교결합 반응은 비교적 온화한 조건하에 진행될 수 있다. 예를 들어, 가교결합 반응은 주변 압력 및 주변 온도(예를 들면, 실온)에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 반응은 주변보다 높은 온도, 예를 들어, 50℃ 등에서 수행될 수도 있다. 가교결합 반응이 수행될 수 있는 예시적인 온도 범위는 약 20℃ 내지 약 70℃ 및 약 50℃를 들 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 반응 온도가 낮으면 실질적으로 유사한 직경 미소구체를 제공하기에 더 긴 반응을 필요로 할 수 있거나, 또는 유사 시간 경과 후 더 작은 미소구체가 형성될 수 있다.

반응을 실온보다 높은 온도에서 수행하는 경우 이점은 반응 과정중에 반응 혼합물로부터 물이 제거될 수 있다는 것이다. 예를 들어, 가교결합 반응을 약 50℃의 온도에서 수행하면 가교결합 반응이 진행됨에 따라 물이 증발할 수 있다.

CMC 및 CCN 분자간 가교결합도는 생성된 미소구체의 기계적 특성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 가교결합 밀도가 크면 일반적으로 기계적 강도(예를 들면, 파괴 변형률)가 더 커질 수 있는 반면, 가교결합 밀도가 낮으면 일반적으로 기계적 강도(예를 들면, 파괴 변형률)가 더 낮아질 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 가교결합 밀도는 도 24와 관련하여 후술하는 바와 같이, 약 70% 내지 약 90%의 파괴 변형률을 제공하도록 조정될 수 있다. 가교결합 밀도는 또한 미소구체의 분해 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 가교결합 밀도가 크면 분해 시간이 더 길어질 수 있는 반면에, 가교결합 밀도가 낮으면 분해 시간이 더 짧아질 수 있다. 일부 예에서, 가교 결합은 C=N 이중 결합의 가수분해를 통해 분해될 수 있다.

상술한 바와 같이, CMC와 CCN 간 가교결합 반응은 변형된 에멀션-가교결합 반응이다. 일부 예로, CMC 및 CCN 분자의 이동으로 에멀션-가교결합 반응의 속도를 제한할 수 있으며, 반응 생성물(가교결합된 CMC 및 CCN)이 미소구체로 되는 것에 중요한 역할을 할 수 있다.

미소구체의 크기는 반응 조건, 예를 들어, 교반 속도, 반응 온도, 반응 에멀션 중 CMC 및 CCN 분자의 농도, 에멀션의 혼합량, 또는 에멀션 중 계면활성제의 농도에 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, CMC의 산화도를 약 25%(총 100개의 반복 단위당 약 25개의 산화된 반복 단위), 교반 속도를 600 분당회전수(rpm), 온도를 약 50℃, 반응 시간을 약 12 시간 및 Span 80의 양을 약 0.3 mL/50 mL 광유로 유지하면서 각 CMC 및 CCN의 용액의 농도를 1.5% w/v 에서 2% w/v로 증가시키게 되면, 미소구체의 평균 직경은 약 600 ㎛ 에서 약 1,100 ㎛로 증가할 수 있다. 다른 예로, 각 CMC 및 CCN 용액의 농도를 약 1.5% w/v, 교반 속도를 600 rpm, 온도를 약 50℃, 반응 시간을 약 12 시간 및 Span 80의 양을 약 0.3 mL/50 mL 광유로 유지하면서 CMC의 산화도를 약 10% 에서 약 25%로 증가시키게 되면, 미소구체의 평균 직경은 약 510 ㎛ 에서 약 600 ㎛로 증가할 수 있다.

일부 실시양태에 있어서, 반응 조건은 미소구체의 평균 또는 중간 직경이 약 50 ㎛ 내지 약 2,200 ㎛가 되도록 선택될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 반응 조건은 미소구체의 평균 또는 중간 직경이 약 2,000 ㎛ 미만, 미소구체의 평균 또는 중간 직경이 약 100 ㎛ 내지 약 1,200 ㎛, 미소구체의 평균 또는 중간 직경이 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 미소구체의 평균 또는 중간 직경이 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 미소구체의 평균 또는 중간 직경이 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛, 미소구체의 평균 또는 중간 직경이 약 700 ㎛ 내지 약 900 ㎛, 미소구체의 평균 또는 중간 직경이 약 900 ㎛ 내지 약 1,200 ㎛, 또는 미소구체의 평균 또는 중간 직경이 약 1,600 ㎛ 내지 약 2,000 ㎛가 되도록 선택될 수 있다.

일부 예에서, 평균 또는 중간 직경이 상이한 미소구체는 상이한 응용에 이용될 수 있다. 예를 들어, 일부 예에 있어서, 평균 또는 중간 직경이 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛인 미소구체에 치료제, 예컨대 후술하는 바와 같은 화학요법제가 적재될 수 있고 치료제를 치료 부위에 전달하면서 또한 미소구체의 평균 또는 중간 직경과 유사한 직경을 갖는 혈관을 색전 형성할 수 있도록 사용될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 평균 또는 중간 직경이 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛인 미소구체가 유사하게 사용될 수 있으며, 치료제가 적재될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 더 큰 평균 또는 중간 직경의 미소구체가 색전술용 물질로 사용될 수 있으며 치료제는 적재되지 않을 수 있다.

반응이 소정 시간 진행되어 목적하는 평균 또는 중간 직경의 미소구체를 제공한 경우, 물이 가교결합 반응동안 증발되지 않았다면 에멀션 중의 물을 실질적으로 완전히 제거할 수 있다. 이어 미소구체를 용매, 예컨대 이소프로판올로 침전시킬 수 있다. 그 다음으로, 오일상을 경사분리 또는 원심분리로 제거하고, 미소구체를 세척할 수 있다 (24). 예를 들어, 미소구체는 헥산 및 아세톤으로 세척될 수 있다. 마지막으로, 미소구체를 공기중 또는 진공하에 건조시킬 수 있다 (26).

일부 실시양태에 있어서, 가교결합 반응으로 평균 또는 중간이 분산된 직경의 복수의 미소구체가 생성될 수 있다. 일부 경우, 더 작은 범위내 직경의 미소구체 또는 실질적으로 단일 직경의 미소구체를 분리하는 것이 유리할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 미소구체를 예정 메쉬 크기(들)의 체(들)를 통해 생리식염수 중에서 습식 체질하여 직경에 따라 분리할 수 있다.

미소구체는 유통을 위해 다양한 방식으로 포장될 수 있다. 예를 들어, 미소구체는 키트의 일부로서 유통될 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 키트는 주사기 또는 바이알에 배치된 미소구체를 포함할 수 있다. 키트는 임의로 카테터, 가이드 와이어 및/또는 미소구체가 현탁될 용액의 콘테이너를 포함할 수 있다. 환자의 혈관으로 미소구체를 주입하기 위해 카테터가 이용될 수 있다. 가이드 와이어는 카테터를 혈관내에 위치시키는데 사용될 수 있다.

일부 실시양태에 있어서, 키트는 대량 출혈 외상에서 급하게 색전을 형성하기 위한 응급 외상용 키트일 수 있다. 이러한 키트는, 예를 들어, 주사기 또는 바이알 및 주사기 또는 바이알에 배치된 복수의 미소구체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 미소구체는 약 1,600 ㎛ 내지 약 2,000 ㎛의 평균 직경을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에 있어서, 미소구체는 상이한 평균 직경, 예컨대 본 출원의 다른 곳에서 열거된 평균 직경을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 키트는 추가로 카테터, 환자의 혈관, 예컨대 동맥내에 카테터를 위치시키기 위한 가이드 와이어, 및/또는 미소구체가 현탁될 용액의 콘테이너를 포함할 수 있다. 미소구체를 주입하기 전에, 용액을 주사기에 흡입하여 용액중에 미소구체의 현탁액을 형성할 수 있다.

미소구체는 예를 들어, 동정맥기형, 뇌동맥류, 위장 출혈, 코피, 원발성 분만 후 출혈 등을 비롯하여, 다양한 증상을 치료하기 위해 동맥을 색전술하는 데에 이용될 수 있다.

도 2a 및 도 2b는 본 발명의 일 양태에 따른 미소구체의 사진 및 광학 현미경 사진이다. 도 2a는 실질적으로 구형일 수 있는 본 발명에 따른 미소구체를 나타낸다. 도 2b는 미소구체의 직경 범위가 약 900 ㎛ 내지 약 1,200 ㎛인 예를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 양태에 따라 형성된 미소구체 외면에 대한 주사전자 현미경(SEM) 이미지의 일례이다. SEM 이미지를 수집하기 전에, 미소구체를 동결건조시켰다. 동결건조(냉동 건조) 전에, 미소구체를 탈이온수로 반복 세척하여 미소구체로부터 염수를 제거하였다. 생성된 미소구체를 액체 질소에서 냉동시키고 동결건조하여 미소구체의 기공으로부터 남아 있는 모든 물을 제거하였다. SEM 이미지를 JEOL JSM-6700 SEM(제올 유에스에이사(JEOL USA, Inc.)(Peabody, Massachusetts)에서 입수가능)을 사용하여 얻었다. 도 3은 2.0 킬로볼트(kV)에서 55배 확대율로 수집한 것이다. 도 3에서의 미소구체는 직경이 약 1,100 ㎛이다.

도 4a 및 도 4b는 본 발명의 양태에 따른 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 제조된 하이드로겔에 대한 SEM 이미지의 예이다. 하이드로겔을 절단하여 하이드로겔 내부를 노출시키고, 하이드로겔의 다공성 구조를 확인하였다. JEOL JSM-6700 SEM을 사용하여 SEM 이미지를 수집하였다. 도 4a는 500배 확대율로 수집한 것인 반면, 도 4b는 1000배 확대율로 수집한 것이다. 하이드로겔은 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 사용하여 제조되었기 때문에, 본 발명에 따라 형성된 미소구체의 내부 구조도 마찬가지로 다공성일 것으로 판단된다.

일부 예로, 색전술제로서 이용되는 것 외에, 미소구체는 치료제를 치료 부위에 전달하도록 이용될 수 있다. CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체는 CMC에 의해 가교결합된 CCN 상의 작용 기로 인해 치료제를 운반할 수 있다. 예를 들어, 미소구체에 치료제, 예컨대 화학요법제를 적재한 후 화학요법제를 종양에 전달하고/하거나 종양에 공급된 동맥을 색전술하는데 이용될 수 있다. 다른 실시양태에 있어서, 미소구체에 세포, 생체활성 분자 또는 다른 약물이 적재될 수 있다.

미소구체에 적재될 수 있는 치료제의 일례는 독소루비신(셀렉 케미칼즈사(Selleck Chemicals LLC)(Houston, Texas, U.S.A.)로부터 아드리아마이신 상품명으로 입수가능)이다. 독소루비신은 미소구체에서 작용 기, 예컨대 카복실 기와 상호작용하여 이온 상호작용을 통해 미소구체에 결합할 수 있는 프로톤화된 아미노 기 및 다수의 하이드록실 기를 포함한다. 독소루비신이 본 발명의 미소구체에 적재될 수 있는 치료제의 일례로 제시되었으나, 다른 치료제가 미소구체와 함께 사용될 수도 있다. 예를 들어, 친수성 치료제가 본 발명에 따른 미소구체와 함께 사용될 수 있다. 특히, 카복실 기, 하이드록실 기 또는 알데히드 기와 상호작용하는 적어도 하나의 작용 기를 포함하는 치료제는 본 발명의 미소구체와 상용성일 것으로 판단된다. 이러한 치료제의 예로는 이리노테칸(화이저사(Pfizer)(New York, New York, U.S.A)로부터 Camptosar^® 상품명으로 입수가능), 암브록솔 및 적어도 하나의 양전하 작용 기를 가지는 그밖의 다른 치료제를 들 수 있다. 일부 실시양태에 있어서, 치료제와 CMC에 의해 가교결합된 CCN 간의 이온성 상호작용 외에, 치료제는 미소구체로 흡수되거나, 흡착될 수 있다.

일부 실시양태에 있어서, 치료제는 미소구체의 형성동안, 즉 CCN이 부분 산화된 CMC로 가교결합되는 동안 미소구체에 적재될 수 있다. 이러한 실시양태에 있어서, 치료제는 CCN 및 산화된 CMC와 함께 에멀션에 침착될 수 있다. 미소구체가 형성될 때, 치료제가 미소구체에 적재될 수 있다.

다른 실시양태에 있어서, 치료제는 미소구체의 형성후에 미소구체에 적재될 수 있다. 예를 들어, 미소구체를 용매, 예컨대 염수 또는 염수와 조영제(contrast medium) 혼합물중의 치료제 용액에 침지시켜 치료제를 미소구체에 적재시킬 수 있다. 일부 예로, 치료제 용액은 농도가 용매 1 mL당 치료제 약 1 mg (mg/mL) 내지 약 2 mg/mL일 수 있다.

일부 예로, 치료제는 미소구체에 건조 미소구체 1 mg 당 치료제 약 0.3 mg(mg/mg) 내지 약 0.75 mg/mg의 농도로 적재될 수 있다.

도 5a 내지 도 5f는 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체에 염료(에반스 블루) 적재의 예를 보여주는 광학 현미경 사진이다. 도 5a는 염료가 미소구체에 적재되기 전, 생리식염수에 현탁된 복수의 미소구체를 나타낸다. 에반스 블루를 도입하기 전에 마이크로피펫을 사용하여 염수를 실제가능한 정도까지 제거하여 습윤 미소구체를 남긴다. 염수 중 에반스 블루 1% w/v 용액 약 1 mL를 약 50 mg의 습윤 미소구체에 첨가한다. 도 5b는 에반스 블루 용액을 도입하고 약 50 초 후에 수집한 것이며, 미소구체에 염료의 적재가 시작되었음을 보여준다. 도 5c는 에반스 블루 용액을 도입하고 약 4 분이 경과한 것이며, 추가의 염료가 미소구체로 적재되었음을 보여준다. 도 5d는 에반스 블루 용액을 도입하고 약 16 분 후에 수집한 것이며, 미소구체에 의해 추가의 염료 흡수를 보여준다. 마지막으로, 도 5e 및 도 5f는 에반스 블루 용액으로부터 제거된 후, 생리식염수에 현탁된 염료가 미소구체에 적재되었음을 나타낸다.

도 6a 내지 도 6c는 다양한 염료의 적재 후 본 발명의 일 양태에 따른 미소구체의 예들을 나타낸다. 구체적으로, 도 6a는 시폼그린(seafoam green) 식품 착색제가 적재된 복수의 미소구체를 나타낸다, 도 6b는 FD&C 적색 염료 #40이 적재된 복수의 미소구체를 나타내고, 도 6c는 FD&C 황색 염료 #5가 적재된 복수의 미소구체를 나타낸다. 도 6a 내지 도 6c에 예시된 이미지를 수집하기 전에, 미소구체에 염료를 도 5a 내지 도 5f와 관련하여 상술된 것과 유사한 방식으로 적재하였다: 마이크로피펫을 이용하여 염수 중 미소구체의 현탁액로부터 염수를 제거하고, 염수 중 염료 1% w/v 용액 약 1 mL를 약 50 mg의 습윤 미소구체에 첨가하였다. 미소구체에 염료 적재 후, 남은 염료 용액을 마이크로피펫을 이용하여 제거하고, 염료-적재된 미소구체를 염수에 현탁시켰다. 도 5a 내지 도 5f 및 도 6a 내지 도 6c는 미소구체에 상이한 작용 기를 가지는 염료가 적재될 수 있으며, 이는 미소구체에 상이한 작용 기를 포함하는 치료제도 또한 적재될 수 있음을 제시한다.

도 7a 내지 도 7d는 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체에 독소루비신이 적재된 일례를 보여주는 광학 현미경으로 촬영한 이미지이다. 도 7a는 독소루비신이 미소구체에 적재되기 전, 생리식염수에 현탁된 복수의 미소구체를 나타낸다. 독소루비신을 도입하기 전에, 마이크로피펫을 사용하여 염수를 실제가능한 정도까지 제거하여 습윤 미소구체를 남긴다. 약 50 마이크로미터(㎕)의 시판 독소루비신 용액(용매 1 mL당 독소루비신 2 mg; 플랜텍스 유에스에이사(Plantex USA)(Woodcliff Lake, New Jersey, U.S.A.)로부터 입수가능)을 약 200 ㎕의 염수에 용해시켜 독소루비신 용액을 준비하였다. 생성된 250 ㎕의 용액을 약 20 mg의 습윤 미소구체에 첨가하였다. 도 7b는 독소루비신 용액을 도입하고 약 45 초후에 수집한 것이며, 미소구체에 독소루비신이 적재되기 시작하였음을 보여준다. 도 7c는 독소루비신 용액을 도입하고 약 10 분후에 촬영한 것이며, 추가의 독소루비신이 미소구체에 적재되었고, 매질내 독소루비신의 농도가 감소되었음을 보여준다. 도 7d는 독소루비신 용액을 도입하고 약 30 분 후에 수집한 것이며, 미소구체에 의해 추가의 독소루비신이 흡수되었고, 매질에 독소루비신이 고갈되었음을 보여준다. 마지막으로, 도 8은 새로운 용매 혼합물(4:6, 조영제:염수)에 현탁된 독소루비신이 미소구체에 적재되었음을 나타낸다.

도 9는 다양한 크기의 미소구체로 독소루비신이 적재되는 역학 실시예를 보여주는 산포도이다. 미소구체로의 독소루비신 적재를 염수 매질 중에서 수행하였다. 도 9에서, 세모는 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 직경을 가지는 복수의 미소구체에 독소루비신의 적재를 나타내고, 네모는 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛의 직경을 가지는 복수의 미소구체에 독소루비신의 적재를 나타내며, 다이아몬드는 약 700 ㎛ 내지 약 850 ㎛의 직경을 가지는 복수의 미소구체에 독소루비신의 적재를 나타낸다. 세로 좌표는 건조 미소구체 밀리그램당 독소루비신의 밀리그램 양을 나타낸다. 가로 좌표는 적재 시간을 분으로 나타낸 것이다.

도 10은 다양한 크기의 미소구체로 독소루비신이 적재되는 역학 실시예를 보여주는 산포도이다. 미소구체로의 독소루비신 적재를 염수 매질 중에서 수행하였다. 도 10에서, 하향 삼각형은 약 700 ㎛ 내지 약 850 ㎛의 직경을 가지는 복수의 미소구체에 독소루비신의 적재를 나타내고, 상향 삼각형은 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛의 직경을 가지는 복수의 미소구체에 독소루비신의 적재를 나타내며, 원은 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 직경을 가지는 복수의 미소구체에 독소루비신의 적재를 나타내고, 네모는 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛의 직경을 가지는 복수의 미소구체에 독소루비신의 적재를 나타낸다. 도 9와 마찬가지로, 세로 좌표는 건조 미소구체 밀리그램당 독소루비신의 밀리그램 양을 나타낸다. 가로 좌표는 적재 시간을 분으로 나타낸 것이다. 도 9 및 도 10 모두 일부 실시양태에 있어서, 더 높은 농도의 독소루비신이 작은 직경의 미소구체에 적재될 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 독소루비신은 직경 약 700 ㎛ 내지 약 850 ㎛의 미소구체에서 보다 직경 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛의 미소구체에 더 높은 농도로 적재될 수 있다.

도 11은 독소루비신의 적재동안 상이한 초기 직경의 미소구체에 대한 직경 변화를 예시하는 산포도이다. 도 11에 나타내어진 바와 같이, 미소구체의 직경은 독소루비신의 적재동안 처음에 감소되다가 결국에는 실질적으로 일정한 직경에 이르게 된다. 이론적인 결부없이, 이는 미소구체가 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성되는 동안 독소루비신 분자가 양전하 작용 기를 갖고, CCN 및 CMC는 음전하를 갖는 작용 기를 포함하기 때문일 수 있다. 따라서, 독소루비신 분자가 없으면, CMC에 의해 가교결합된 CCN 상에 음전하를 갖는 작용 기는 서로 반발할 수 있다. 미소구체 내부에 독소루비신이 존재하면 미소구체 내부의 순 전하가 0에 가까워지고 따라서 미소구체내 정전 반발이 감소됨에 따라 미소구체의 직경을 감소시킬 수 있다.

도 11에서, 네모는 초기 직경이 약 280 ㎛인 미소구체를 나타내고, 원은 초기 직경이 약 490 ㎛인 미소구체를 나타내며, 다이아몬드는 초기 직경이 약 610 ㎛인 미소구체를 나타내고, 세모는 초기 직경이 약 610 ㎛인 미소구체를 나타낸다.

도 12는 독소루비신이 적재된 미소구체의 형광 현미경 사진에 대한 일례이다. 도 13은 단일 독소루비신-적재 미소구체에 대해 형광 강도를 거리의 함수로 나타낸 이미지의 일례이다. 독소루비신은 여기하에 형광을 낸다. 도 13은 미소구체의 표면에 걸쳐 실질적으로 유사한 형광이 일어나며, 이는 미소구체의 표면에 걸쳐 실질적으로 유사한 독소루비신이 적재되었음을 의미할 수 있다. 도 12 및 13에 나타내어진 미소구체는 부분 산화된 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 것이다.

도 14는 특성이 상이한 복수의 미소구체 각 샘플에 대해서 시간(분으로 측정)의 함수로서 방출된 독소루비신의 퍼센트의 예들을 나타낸 산포도이다. 각 샘플을 측정 기간동안 약 2 mL의 염수에 두었다. 측정동안 염수는 변화가 없었다. 상이한 미소구체 샘플은 상이한 직경 범위 및 상이한 초기 중량(독소루비신이 적재된 미소구체의 총 초기 중량)을 포함하였다. 예를 들어, 4개의 샘플은 직경이 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛인 미소구체를 포함하였다. 이들 샘플중 첫번째 것은 작은 하향 세모로 표시하였고, 복수의 미소구체는 평균 초기 중량이 약 5.3 mg이었다; 이들 샘플중 두번째 것은 작은 네모로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3.7 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다; 이들 샘플중 세번째 것은 작은 다이아몬드로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3.6 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다; 이들 샘플중 네번째 것은 긴 가로선으로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3.3 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다.

4개의 추가의 샘플은 직경이 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛인 미소구체를 포함하였다. 이들 샘플중 첫번째 것은 짧은 가로선으로 표시하였고, 복수의 미소구체는 평균 초기 중량이 약 4.5 mg이었다; 이들 샘플중 두번째 것은 십자로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 4 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다; 이들 샘플중 세번째 것은 원으로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3.5 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다; 이들 샘플중 네번째 것은 별표로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3.2 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다.

4개의 추가의 샘플은 직경이 약 700 ㎛ 내지 약 850 ㎛인 미소구체를 포함하였다. 이들 샘플중 첫번째 것은 ×로 표시하였고, 복수의 미소구체는 평균 초기 중량이 약 5 mg이었다; 이들 샘플중 두번째 것은 더 큰 상향 세모로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 4.9 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다; 이들 샘플중 세번째 것은 더 큰 네모로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3.2 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다; 이들 샘플중 네번째 것은 더 큰 다이아몬드로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다.

도 15는 특성이 상이한 복수의 미소구체 각 샘플에 대해서 시간(일로 측정)의 함수로서 방출된 독소루비신의 양(밀리그램)의 예들을 나타낸 산포도이다. 각 샘플을 약 2 mL 염수를 채운 큐벳에 위치시켰다. 일부 샘플에 대해, 미소구체를 측정 기간동안 동일 부피의 염수에 두었다. 다른 샘플에 대해서는, 독소루비신이 적재된 미소구체가 있는 염수를 주기적으로 변경하였다. 특히, 염수를 1 일, 3 일, 6 일, 12 일, 19 일 및 26 일후에 변경하였다. 또한, 염수를 주기적으로 변경시킨 샘플의 경우에는, 미소구체 및 염수가 위치한 큐벳을 12 일 및 26 일후에 변경시켰다.

상이한 미소구체 샘플은 (독소루비신이 적재된 미소구체의) 상이한 직경 범위 및 상이한 초기 중량을 포함하였다. 예를 들어, 4개의 샘플은 직경이 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛인 미소구체를 포함하였다. 이들 샘플중 첫번째 것은 작은 하향 세모로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 4.8 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제1 샘플이 있는 염수를 상술한 바와 같이 변경시켰다). 이들 샘플중 두번째 것은 큰 네모로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 4.3 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제2 샘플이 있는 염수는 변경시키지 않았다). 이들 샘플중 세번째 것은 작은 다이아몬드로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3.3 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제3 샘플이 있는 염수를 상술한 바와 같이 변경시켰다). 이들 샘플중 네번째 것은 긴 가로선으로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3.1 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제4 샘플이 있는 염수는 변경시키지 않았다).

도 15에 예시된 4개의 추가 샘플은 직경이 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛인 미소구체를 포함하였다. 이들 샘플중 첫번째 것은 짧은 가로선으로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 4.8 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제1 샘플이 있는 염수를 상술한 바와 같이 변경시켰다). 이들 샘플중 두번째 것은 십자로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 4.5 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제2 샘플이 있는 염수는 변경시키지 않았다). 이들 샘플중 세번째 것은 원으로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3.7 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제3 샘플이 있는 염수를 상술한 바와 같이 변경시켰다). 이들 샘플중 네번째 것은 별표로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3.4 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제4 샘플이 있는 염수는 변경시키지 않았다).

도 15에 예시된 4개의 추가 샘플은 직경이 약 700 ㎛ 내지 약 850 ㎛인 미소구체를 포함하였다. 이들 샘플중 첫번째 것은 ×로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 4.5 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제1 샘플이 있는 염수를 상술한 바와 같이 변경시켰다). 이들 샘플중 두번째 것은 큰 상향 세모로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 4.2 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제2 샘플이 있는 염수는 변경시키지 않았다). 이들 샘플중 세번째 것은 작은 네모로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 4.0 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제3 샘플이 있는 염수를 상술한 바와 같이 변경시켰다). 이들 샘플중 네번째 것은 큰 다이아몬드로 표시하였고, 평균 초기 중량이 약 3.2 mg인 복수의 미소구체를 포함하였다(제4 샘플이 있는 염수는 변경시키지 않았다).

도 16은 특성이 상이한 복수의 미소구체 각 샘플에 대해서 시간(일로 측정)의 함수로서 염수 매질 중에 방출된 독소루비신의 양의 예들을 나타낸 산포도이다. 각 샘플을 약 2 mL 염수를 채운 큐벳에 위치시켰다. 제1 샘플의 경우, 복수의 미소구체는 직경이 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛이었고, 미소구체의 평균 초기 중량은 약 4.3 mg(독소루비신이 적재된 미소구체의 중량)이었다. 제1 샘플(네모로 표시)을 측정 기간동안 동일한 염수에 두었다. 제2 샘플(세모로 표시)에 대해서는, 독소루비신이 적재된 미소구체가 있는 염수를 주기적으로 변경하였다. 특히, 염수를 1 일, 3 일, 6 일, 12 일, 19 일 및 26 일후에 변경하였다. 또한, 제2 샘플이 위치한 큐벳을 12 일 및 26 일후에 변경시켰다. 제2 샘플은 직경이 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛인 미소구체를 포함하였고, 미소구체의 평균 초기 중량은 약 4.8 mg이었다.

도 17은 특성이 상이한 복수의 미소구체 각 샘플에 대해서 시간(일로 측정)의 함수로서 염수 매질 중에 방출된 독소루비신의 양의 예들을 나타낸 산포도이다. 각 샘플을 약 2 mL 염수를 채운 큐벳에 위치시켰다. 제1 샘플(네모로 표시)의 경우, 복수의 미소구체는 직경이 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛이었고, 평균 초기 중량이 약 4.5 mg이 되도록 독소루비신이 적재되었다. 제1 샘플을 측정 기간동안 동일한 염수에 두었다. 제2 샘플에 대해서는, 독소루비신이 적재된 미소구체가 있는 염수를 주기적으로 변경하였다. 특히, 염수를 1 일, 3 일, 6 일, 12 일, 19 일 및 26 일후에 변경하였다. 또한, 제2 샘플이 위치한 큐벳을 12 일 및 26 일후에 변경시켰다. 제2 샘플은 직경이 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛인 미소구체를 포함하였고, 미소구체에는 평균 초기 중량이 약 4.8 mg이 되도록 독소루비신이 적재되었다.

도 18은 특성이 상이한 복수의 미소구체 각 샘플에 대해서 시간(일로 측정)의 함수로서 염수 매질 중에 방출된 독소루비신의 양의 예들을 나타낸 산포도이다. 각 샘플을 약 2 mL 염수를 채운 큐벳에 위치시켰다. 제1 샘플(상향 세모로 표시)의 경우, 복수의 미소구체는 직경이 약 700 ㎛ 내지 약 850 ㎛이었고, 총 평균 초기 중량이 약 4.2 mg이 되도록 독소루비신이 적재되었다. 제1 샘플을 측정 기간동안 동일한 염수에 두었다. 제2 샘플에 대해서는, 독소루비신이 적재된 미소구체가 있는 염수를 주기적으로 변경하였다. 특히, 염수를 1 일, 3 일, 6 일, 12 일, 19 일 및 26 일후에 변경하였다. 또한, 제2 샘플이 위치한 큐벳을 12 일 및 26 일후에 변경시켰다. 제2 샘플(×로 표시됨)은 직경이 약 700 ㎛ 내지 약 850 ㎛인 미소구체를 포함하였고, 미소구체는 총 평균 초기 중량이 약 4.5 mg이 되도록 적재되었다.

도 19는 두 상이한 직경 범위의 미소구체간 독소루비신의 방출 속도를 비교한 예를 나타낸 직선도이다. 각 샘플을 약 2 mL 생리식염수를 채운 큐벳에 위치시키고, 염수 중 독소루비신의 농도를 주기적으로 측정하였다. 독소루비신이 적재된 미소구체가 있는 염수를 1 일, 3 일, 6 일, 12 일, 19 일 및 26 일후에 변경하였다. 또한, 샘플이 위치한 큐벳을 12 일 및 26 일후에 변경시켰다. 제1 샘플(도 19에서 네모로 표시됨)은 직경이 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛인 미소구체를 포함하였다. 100 ㎛ 내지 300 ㎛ 미소구체의 초기 중량은 약 4.4 mg이었다. 제2 샘플(도 19에서 흰 원으로 표시됨)은 직경이 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛인 미소구체를 포함하였다. 300 ㎛ 내지 500 ㎛ 미소구체의 초기 중량은 약 4.8 mg이었다. 도 19는 본 실시예에서, 초기에 더 큰 미소구체가 더 작은 미소구체보다 다소 천천히 독소루비신을 방출하지만, 더 큰 미소구체는 독소루비신을 보다 지속적으로 방출(예를 들면, 약 20 일후에)시키는 것으로 나타낸다.

도 20은 상이한 매질에서 미소구체로부터 독소루비신의 방출예를 나타낸 직선도이다. 도 20에 네모로 표시된 데이터점은 pH가 약 5.5 내지 6.0인 생리식염수에 위치한 미소구체로부터 독소루비신의 방출을 나타낸다. 도 20에 원으로 표시된 데이터점은 pH가 약 5.2인 아세테이트 완충 염수에 위치한 미소구체로부터 독소루비신의 방출을 나타낸다. 도 20에 세모로 표시된 데이터점은 pH가 약 7.4인 PBS에 위치한 미소구체로부터 독소루비신의 방출을 나타낸다. 시험 기간동안 매질은 어느 샘플에서도 변화가 없었다.

각 샘플에서, 미소구체의 직경은 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛이었다. 각 미소구체에는 처음에 약 0.22 mg 독소루비신이 적재되었다. 도 20에서, 매질 mL당 독소루비신 mg으로 측정된 매질 중 독소루비신의 농도를 시간(일로 측정)의 함수로 플롯팅하였다.

도 20으로부터 본 실시예에서는, 주변 매질이 낮은 pH를 가지는 경우, 다량의 독소루비신이 일반적으로 미소구체로부터 방출된 것으로 나타났다. 예를 들어, 가장 높은 pH를 가지는 PBS 매질 중의 미소구체는 매질에서 독소루비신을 약 0.025 mg/mL 미만의 농도로 방출하였다. 아세테이트 완충 염수 및 생리식염수에서, 독소루비신은 미소구체로부터 매질 중에 약 0.045 mg/mL의 농도로 방출되었다.

상술한 바와 같이, CMC의 산화도는 부분 산화된 CMC를 제조할 때 초기 산화 반응중에 제어될 수 있다. 산화도는 100 반복 단위당 산화된 반복 단위의 수로서 정의될 수 있다. 상술한 바와 같이, CMC 산화도가 높으면 CCN과 반응시에 더욱 가교적으로 될 수 있다. 도 21은 CMC의 산화도가 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체로부터 독소루비신의 방출 속도에 영향을 미칠 수 있다는 예를 나타낸 직선도이다. 도 21에서, 매질 mL당 독소루비신 mg으로 측정된 매질 중 독소루비신의 농도를 시간(일로 측정)의 함수로 플롯팅하였다. 각 샘플내 미소구체는 직경이 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛이었고, 각 미소구체 샘플은 처음에 독소루비신이 평균 약 0.50 mg 적재되었다.

도 21에 네모로 나타내어진 데이터점은 산화도가 약 10%(즉, 10개의 CMC 반복 단위에서 1개가 산화)인 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체로부터 방출된 독소루비신을 나타낸다. 도 21에 원으로 나타내어진 데이터점은 산화도가 약 25%인 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체로부터 방출된 독소루비신을 나타낸다. 도 21에 세모로 나타내어진 데이터점은 산화도가 약 50%인 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체로부터 방출된 독소루비신을 나타낸다. 따라서, 도 21은 본 실시예에서 CMC 산화도가 낮을수록(낮은 가교결합 밀도와 상관관계에 있음), 더 많은 양의 독소루비신이 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체로부터 방출되었음을 입증한다.

도 22는 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체로부터 독소루비신의 방출에 매질이 미치는 효과의 일례를 나타낸 직선도이다. 도 22에서, 매질 mL당 독소루비신 mg으로 측정된 매질 중 독소루비신의 농도를 시간(일로 측정)의 함수로 플롯팅하였다. 미소구체는 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성되었으며, 직경은 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛이었다. (독소루비신을 포함한) 미소구체의 평균 초y기 중량은 약 3.1 mg이고, 독소루비신 중량이 약 0.18 mg이었다. 도 22에 예시된 바와 같이, 미소구체는 처음에 물 매질에 위치하였으며, CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체로부터 독소루비신이 거의 방출되지 않았다. 그러나, 약 2 개월 반나절 후, 미소구체를 염수 매질에 위치시켰고, 미소구체로부터 독소루비신이 다량 방출되었다. 이는 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체로부터 독소루비신의 방출에 이온 교환이 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다.

도 23은 본 발명의 일 양태에 따른 미소구체로부터 독소루비신의 방출 속도와 바이오컴패터블즈사(Biocompatibles)(Farnham, Surrey, United Kingdom)로부터 입수가능한 폴리비닐 알콜-기반 색전술용 비드인 DC Beads^TM으로부터 독소루비신의 방출 속도를 비교한 예를 나타낸 직선도이다. CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체는 직경이 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛이었고, 초기 독소루비신 적재량이 약 0.50 mg이었다. DC Beads^TM 또한 직경이 약 300 ㎛ 내지 약 500 ㎛이었으며, 평균 약 0.50 mg의 독소루비신이 적재되었다. 시험 기간동안 각 샘플을 PBS에 두었다. 도 23에서, PBS mL당 독소루비신 mg으로 측정된 PBS중 독소루비신의 농도를 시간(시간으로 측정)의 함수로 플롯팅하였다. 본 실시예에서, CMC에 의해 가교결합된 CCN 미소구체로부터 독소루비신의 방출은 DC Beads™ 미소구체로부터 독소루비신의 방출보다 더 서서히 지속적으로 일어났다.

일부 실시양태에 있어서, 미소구체에 약물의 적재 여부에 상관없이, CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체는 유리한 기계적 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 미소구체는 압축성일 수 있으며, 압축후 실질적으로 그의 원형으로 돌아갈 수 있다. 도 24는 직경 약 715 ㎛이고 가교결합 밀도가 약 10%인 단일 미소구체에 대한 압축력 대 거리의 플롯 일예이다. 압축 시험은 TA.XTPlus 텍스춰 분석기(Texture Technologies Corp., Scarsdale, New York)를 사용하여 수행하였다. 미소구체를 약 0.08 mm/s의 비율로 압축하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 미소구체는 비가역 변형전에 약 622 ㎛(0.622 mm)를 압축하여 파괴 변형률이 약 87%이었다. 또한, 파괴시 압축력은 약 65.5 g이었다. 상술한 바와 같이, CCN 및 CMC 간의 가교결합 밀도를 제어함으로써 파괴 변형률을 약 70% 내지 약 90%로 조정할 수 있다.

도 25a 내지 도 25c는 미소구체가 폴리에틸렌 튜브를 통과할 때 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체의 압축성의 일례를 나타내는 광학 현미경 사진이다. 미소구체는 직경이 약 925 ㎛이고, 카테터는 내경이 약 580 ㎛이었다 (PE-50). 도 25b 및 도 25c에 나타내어진 바와 같이, 미소구체는 변형되어 카테터의 내부강을 통과할 수 있었다.

도 26a 내지 도 26c는 미소구체가 폴리에틸렌 튜브를 통과할 때 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하고 직경이 약 860 ㎛인 미소구체의 압축성의 다른 예를 보여주는 광학 현미경 사진이다. 도 26a 내지 26C에서, 카테터는 내경이 약 580 ㎛이었다 (PE-50). 도 26b 및 도 26c에 나타내어진 바와 같이, 미소구체는 가역적으로 변형되어 카테터의 내부강을 통과하고, 카테터를 통과하기 전 미소구체의 형태 및 크기와 실질적으로 유사한 형태 및 크기로 복귀될 수 있다.

도 27a 및 도 27b는 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체의 탄성의 일례를 나타낸다. 도 27a 및 도 27b에 도시되어 있는 미소구체는 직경이 약 675 ㎛이고, 방출 전에 내경이 약 580 ㎛ (PE-50)인 폴리에틸렌 튜브에 약 24 시간 동안 유지되었다. 도 27a에 예시된 이미지는 미소구체가 PE 튜브로부터 방출되고 약 3 초후에 수집한 것이고, 도 27b에 예시된 이미지는 미소구체가 방출되고 약 5 초후에 수집한 것이다. 도 27a 및 도 27b는 미소구체가 PE 튜브로부터 방출된 후 신속히 그의 구형상 및 원래의 크기로 회복될 수 있음을 입증한다.

도 28은 미소구체를 내경이 약 480 ㎛(2 프렌치 카테터, 보스턴 사이언티픽사(Boston Scientific Corp.)(Natick, Massachusetts)로부터 입수가능)인 카테터를 통해 주입한 후 촬영한, 직경이 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛인 미소구체의 일례에 대한 광학 현미경 사진이다. 도 28에 도시된 바와 같이, 미소구체는 실질적으로 그의 원래의 구형상을 유지하였다.

도 29a 및 도 29b는 미소구체를 내경이 약 0.53 mm(3 프렌치 카테터, 테루모 메디카사(Terumo Medical Corp.)(Somerset, New Jersey)로부터 입수가능)인 카테터를 통해 주입한 후 촬영한, 직경이 약 800 ㎛ 내지 약 1,000 ㎛인 미소구체의 일례에 대한 광학 현미경 사진이다. 도 29a 및 도 29b에 도시된 바와 같이, 미소구체는 실질적으로 그의 원래의 구형상을 유지하였다.

도 30a 및 도 30b는 카테터를 통과하는 동안 및 카테터를 통과한 후, 독소루비신이 적재된 미소구체의 일례에 대한 광학 현미경 사진이다. 도 30a 및 도 30b에 도시된 미소구체는 직경이 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛이다. 도 30a에 도시된 카테터는 내경이 약 0.53 mm(3 프렌치 카테터, 테루모 메디카사(Terumo Medical Corp.)(Somerset, New Jersey)로부터 입수가능)이다. 도 30b에 도시된 바와 같이, 미소구체는 실질적으로 그의 원래의 구형상을 유지하였다.

도 31a 및 도 31b는 폴리에틸렌 튜브를 통과하는 동안 독소루비신이 적재된 미소구체의 일례에 대한 광학 현미경 사진이다. 도 31a 및 도 31b에 도시된 미소구체는 직경이 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛이다. 도 31a 및 도 31b에 도시된 카테터는 내경이 약 580 ㎛이다 (PE-50).

본 발명에 따른 미소구체는 다양한 용매에 현탁될 수 있다. 예를 들어, 도 32a 및 도 32b는 두 상이한 혼합물에 현탁된 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체를 나타내는 이미지이다. 도 32a의 경우, 미소구체는 40% 조영제 및 60% 염수의 혼합물에 현탁된다. 도 32a에 도시된 바와 같이, 미소구체는 혼합물에 현탁되고, 반투명이다. 도 32b는 50% 조영제와 50% 염수의 혼합물에 현탁된 에반스 블루로 염색된 미소구체를 나타낸다.

CMC로 가교결합 CNN을 포함하는 미소구체는 물에 저장시 다소 안정적일 수 있으나, 종국에는 분해가 시작될 수 있다. 도 33은 물에서 2 개월간 저장 후, 복수의 미소구체 일례의 광학 현미경 사진이다. 도 33에 도시된 미소구체는 가교결합 밀도가 약 10%이었다. 도 33에 도시된 미소구체는 백그라운드 매질(물)과의 콘트라스트를 증가시키기 위해 에반스 블루로 염색되었다. 도 33에 도시된 바와 같이, 미소구체는 분해되기 시작하였고, 기계적 완전성이 감소된 것으로 나타났다.

일부 예에서, CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체는 리소자임과 같은 효소의 존재하에서 보다 신속히 분해될 수 있다. 도 34a 내지 도 34e는 리소자임 존재하에 복수의 미소구체의 분해 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다. 미소구체는 약 10%의 가교결합 밀도를 갖는다. 미소구체 주변 매질은 4 mg/mL의 리소자임을 함유하였고, 미소구체 및 주변 매질은 시험 기간동안 약 37℃의 온도로 유지되었다. 도 34a는 미소구체를 매질에 위치시킨 직 후 0 일째 미소구체의 외관을 나타낸다. 도 34b는 3 일째 미소구체의 외관을 나타낸다. 도 34C는 7 일 후 미소구체의 외관을 나타낸다. 시각적으로 분해 시작이 명백히 판명되었다. 도 34d는 9 일째 미소구체의 외관을 나타낸다. 미소구체의 분해가 진행중이고, 기계적 완전성이 감소되었으며, 미소구체는 더 이상 구형이 아니었다. 마지막으로, 도 34e는 14 일째 미소구체의 외관을 나타내며, 이 시간 미소구체 조각이 매질에서 관찰되었으나, 미소구체는 더 이상 구형이 아니었다.

상술한 바와 같이, 미소구체에서 가교 밀도를 증가시키거나, 감소시킴으로써 미소구체의 분해 시간을 조절할 수 있다. 예를 들어, 부분 산화된 CMC의 산화도가 더 높은 것에 상응할 수 있는 고도의 가교 밀도는 분해 시간 증가로 이어질 수 있는데 반해, 낮은 가교 밀도(CMC의 더 낮은 산화도)는 분해 시간 감소로 이어질 수 있다.

도 35a 내지 도 35c는 리소자임 존재하에 독소루비신이 적재된 복수의 미소구체의 분해 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다. 미소구체는 OCMC-II(이후 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조) 및 CCN-III(이후 실시예 6에 기술된 바와 같이 제조)으로부터 제조되었으며, 약 500 ㎛ 내지 약 700 ㎛ 범위의 직경을 가졌다. 미소구체를 염수 중 독소루비신 2 mg/mL 용액에 약 24 시간 두어 미소구체에 독소루비신을 적재시켰다. 미소구체 주변 매질은 PBS중 4 mg/mL 리소자임을 함유하였으며, 미소구체 및 PBS는 시험 기간동안 약 37℃의 온도로 유지되었다. 도 35a는 미소구체를 PBS에 위치시킨 직 후 0 일째 미소구체의 외관을 나타낸다. 도 35b는 약 1.5 개월 후 미소구체의 외관을 나타낸다. 도 35c는 약 3 개월 후 미소구체의 외관을 나타낸다. 도 35C에서 시각적으로 분해 시작이 명백히 판명되었다.

도 36a 및 도 36b는 인간 피부 섬유모세포 34와 함께 배양된 CMC 32로 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체의 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다. 인간 피부 섬유모세포 34는 미소구체 32의 존재로 인한 불리한 효과를 명백히 보이지 않았다.

도 37a 및 도 37b는 배양된 인간 섬유모세포를 포함하는 대조군의 일례 및 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체와 함께 배양된 인간 섬유모세포를 포함하는 샘플의 일례를 각각 보여주는 광학 현미경 사진이다. 대조군 및 샘플은 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. 이 경우에도, 인간 피부 섬유모세포는 미소구체의 존재로 인한 불리한 효과를 명백히 보이지 않았다.

도 38a 내지 도 38c는 크리스탈 바이올렛으로 염색된 인간 피부 섬유모세포를 포함한 대조군의 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다. 도 38a는 섬유모세포 배양을 시작하고 약 3 일 후에 수집한 이미지이다. 도 38b는 섬유모세포 배양을 시작하고 약 7 일 후에 수집한 이미지이다. 도 38c는 섬유모세포 배양을 시작하고 약 15 일 후에 수집한 이미지이다.

도 39a 내지 도 39c는 CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체와 함께 배양된 인간 피부 섬유모세포를 포함하는 샘플의 일례를 보여주는 광학 현미경 사진이다. 미소구체는 OCMC-I(이후 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조) 및 CCN-II(이후 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조)으로부터 제조되었다. 세포는 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. 도 39a는 배양을 시작하고 약 3 일 후에 수집한 이미지이다. 도 39b는 배양을 시작하고 약 7 일 후에 수집한 이미지이다. 도 39c는 배양을 시작하고 약 15 일 후에 수집한 이미지이다. 도 38a 내지 도 38c에 예시된 대조군과 비교하여, 도 39a 내지 도 39c의 인간 피부 섬유모세포는 미소구체의 존재로 인한 불리한 효과를 명백히 보이지 않았다.

도 40은 MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내부염)로 처리된 후, 인간 피부 섬유모세포와 함께 배양된 배지의 약 490 nm 파장에서의 흡광도의 일례를 나타내는 막대 그래프이다. MTS는 생존 세포에 대한 세포 역가이며, 따라서 흡광도는 배양중인 생존 세포수에 비례한다. 대조군은 인간 피부 섬유모세포만을 포함한 반면, 배치 1 및 배치 2는 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체와 함께 배양된 인간 피부 섬유모세포를 포함하였다. 배치 1에서의 미소구체는 OCMC-I(이후 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조) 및 CCN-I(이후 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조)으로부터 제조되었다. 배치 2에서의 미소구체는 OCMC-II 및 CCN-I(이후 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조)으로부터 제조되었다. 도 40은 본 실시예에서, 6 일간에 걸쳐 세포 증식에 있어서 대조군, 배치 1 및 배치 2 사이에 유의적인 차가 없다고 나타내었다.

도 41은 3쌍의 토끼 신장을 직경 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛의 미소구체로 색전술한 후, 미소구체의 동맥 분포 일례를 나타내는 막대 그래프이다. 비교를 위해, 바이오스피어 메디칼사(BioSphere Medical, Inc.)(Rockland, Massachusetts, U.S.A.)로부터 Embosphere^®의 상품명으로 입수가능한 직경 약 100 ㎛ 내지 약 300 ㎛의 미소구체가 사용되었다. 각 실시예에서, 미소구체를 살아있는 토끼의 신장 동맥에 주입하였다. 이어, 토끼를 안락사시키고, 신장을 제거하여 색전술 결과를 평가하였다. 각 Embosphere^® 미소구체 및 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체에 대한 미소구체의 수를 엽사이 동맥의 제1 위치(주입 부위 근부), 활꼴 동맥(중간) 및 엽사이 동맥의 제2 위치(주입 부위 원위부)에서 계수하였다. 결과를 도 41에 각 위치에서 계수된 미소구체의 퍼센트로서 나타내었다.

도 42는 Embospheres^®과 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체에 대해서 색전술 수술 동안 폐쇄된 혈관의 평균 직경을 비교한 일례를 나타내는 막대 도표이다. 일부 예에서, 미소구체가 예정된 특정 직경으로 동맥을 폐쇄하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 미소구체의 크기 범위와 미소구체로 폐쇄된 평균 직경간의 관계를 이해하는 것이 바람직할 수 있다. 도 41에서와 같이, 도 42에 도시된 실시예에 사용된 Embospheres^®의 공칭 직경은 100 ㎛ 내지 300 ㎛이었다. 마찬가지로, CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체의 공칭 직경은 100 ㎛ 내지 300 ㎛이었다. Embospheres^®로 폐쇄된 평균 직경은 약 150 ㎛인 반면, CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체로 폐쇄된 평균 직경은 약 200 ㎛이었다.

도 43은 도 42에 예시된 결과를 생성하는 색전술 수술에 사용된 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체에 대해 측정된 평균 직경의 일례를 나타내는 막대 도표이다. 바에 표시된 "CMC/CN 미소구체"는 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체의 광학현미경사진으로 측정된 평균 직경을 나타낸다. 바에 표시된 "체눈(Sieve aperture)"은 하나에는 미소구체가 통과하지 못하고, 다른 하나에는 미소구체가 통과하는 상이한 눈의 체에 통과시키고 두 인접 체눈의 눈 크기를 평균내어 측정한, CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체의 보정 평균 직경을 나타낸다. 이에 의해, 체눈의 평균 직경은 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 압축 미소구체의 평균 직경으로 간주될 수 있다. 도 42 및 43에 나타내어진 바와 같이, 체눈의 평균 직경은 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체에 의해 폐쇄된 혈관의 평균 직경과 실질적으로 동일하다. 이는 CMC에 의해 가교결합된 CCN으로 형성된 미소구체의 체눈의 평균 직경을 측정함으로써 미소구체에 의해 폐쇄될 수 있는 혈관의 평균 직경을 예측할 수 있음을 나타낸다.

도 44 및 45는 본 발명의 양태에 따른 색전성 미소구체 36으로 폐쇄된 토끼의 신장내 활꼴 동맥을 나타내는 신장 조직의 조직 절개물을 예시한 것이다. 도 44 및 45에 나타내어진 바와 같이, 색전성 미소구체 36은 실질적으로 모든 동맥을 폐쇄한다. 색전성 미소구체 36과 혈관벽 사이의 작은 간격은 고정시 미소구체 36이 수축됨으로써 샘플 처리에 의한 것으로 판단된다.

본 발명에 따라 형성된 미소구체는 다수 응용에 이용될 수 있다. 예를 들어, CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 색전성 미소구체에 대한 일 응용은 간 종양의 경동맥 화학색전술(TACE)이다. 절제불가능한 간세포암종(HCC)을 위한 TACE는 정맥내 화학요법에 비해 환자 생존율을 높이는 것으로 승인된 처리 기법이다. TACE는 화학요법제의 동맥내(간동맥 경유) 주입후 종양 영양 동맥을 색전술하는 것을 포함한다. TACE 추세는 종양에 지속적으로 방출되는 화학요법제가 적재된 약물 용출 비드를 사용하는 것이다. 약물 용출 TACE는 전신 독성이 덜하며, 환자의 내용성이 더 좋다. CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체는 생분해성이며, 따라서 주입 후 경시적으로 환자의 체내로 흡수되기 때문에, 화학요법제의 방출 프로파일이 제어될 수 있다. 또한, CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체는 병용 화학요법제 담체 및 색전술제로서 작용할 수 있다. 그밖에, CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체는 생분해성이기 때문에, 흡수시 동맥 완전성이 복구될 수 있으며, 이는 일부 예에서 유리할 수 있다.

CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 미소구체의 다른 응용예는 자궁근종 색전술(UFE)이다. 자궁근종은 자궁벽에서 증식하는 양성 근종양이다. 자궁근종은 단일 종양 또는 다종양으로 증식할 수 있다. 자궁근종은 사과씨 정도로 작거나 포도만큼 클 수 있다. 드문 경우, 자궁근종은 매우 커질 수도 있다. 갈수록 인정받고 있는 자궁근종 치료 기술은 UFE이다. UFE의 주된 목적은 근종의 크기를 줄여 과다 자궁출혈을 치료하는 것이다. 실제로, UFE는 카테터를 자궁 동맥에 위치시키고, 색전술용 미소구체를 자궁 동맥에 주입하여 근종의 혈관을 차단하고, 수축을 진행시키는 것을 포함한다. CMC에 의해 가교결합된 CCN을 포함하는 생분해성 미소구체의 사용으로 색전술 후 자궁 동맥의 완전성 복구를 촉진할 수 있다.

실시예

실시예 1: 부분 산화된 CMC 제조

약 1 g의 나트륨 카복시메틸 셀룰로스(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Mw 약 700,000 g/mol) 및 80 mL 증류수를 250 mL 플라스크에 가하였다. 카복시메틸 셀룰로스가 실질적으로 완전히 용해된 후, 20 mL 증류수중 25% 몰 당량의 과요오드산나트륨을 플라스크에 가하였다. 반응을 약 25℃에서 24 시간 동안 진행시켰다. 24 시간 후, 약 0.21 g의 에틸렌 글리콜을 플라스크에 가하여 반응을 중단시켰다. 30 분 후, 혼합물을 투석관(MWCO 3500)에 부어 증류수에 3 일간 투석시켰다. 투석 용액을 동결건조시켜 건조 생성물을 수득하였다. 생성된 부분 산화된 CMC를 OCMC-II로 표시하였다.

실시예 2: 부분 산화된 CMC 제조

약 1 g의 나트륨 카복시메틸 셀룰로스(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Mw 약 700,000 g/mol) 및 80 mL 증류수를 250 mL 플라스크에 가하였다. 카복시메틸 셀룰로스가 실질적으로 완전히 용해된 후, 20 mL 증류수중 10% 몰 당량의 과요오드산나트륨을 플라스크에 가하였다. 반응을 약 25℃에서 24 시간 동안 진행시켰다. 24 시간 후, 약 0.08 g의 에틸렌 글리콜을 플라스크에 가하여 반응을 중단시켰다. 30 분 후, 혼합물을 투석관(MWCO 3500)에 부어 증류수에 3 일간 투석시켰다. 투석 용액을 동결건조시켜 건조 생성물을 수득하였다. 생성된 부분 산화된 CMC를 OCMC-I로 표시하였다.

실시예 3: 부분 산화된 CMC 제조

약 1 g의 나트륨 카복시메틸 셀룰로스(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Mw 약 700,000 g/mol) 및 80 mL 증류수를 250 mL 플라스크에 가하였다. 카복시메틸 셀룰로스가 실질적으로 완전히 용해된 후, 20 mL 증류수중 50% 몰 당량의 과요오드산나트륨을 플라스크에 가하였다. 반응을 약 25℃에서 24 시간 동안 진행시켰다. 24 시간 후, 약 0.42 g의 에틸렌 글리콜을 플라스크에 가하여 반응을 중단시켰다. 30 분 후, 혼합물을 투석관(MWCO 3500)에 부어 증류수에 3 일간 투석시켰다. 투석 용액을 동결건조시켜 건조 생성물을 수득하였다. 생성된 부분 산화된 CMC를 OCMC-III로 표시하였다.

실시예 4: CCN 제조

3-구 플라스크에서, 약 2 g의 키토산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 75% 초과 탈아세틸화)을 약 16 g 수산화나트륨, 약 20 mL 증류수 및 약 20 mL 이소프로판올의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 약 25℃에서 약 24 시간 동안 교반하였다. 카복시메틸화 전에, 플라스크를 약 50℃ 수조에서 약 1 시간 동안 유지하였다. 이어, 10 mL 이소프로판올중의 약 16 g의 모노클로로아세트산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 반응 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 약 50℃에서 4 시간 더 교반한 후, 약 80 mL의 70% 에탄올을 가하여 반응을 중단시켰다. 침전을 여과하고, 70-90% 에탄올로 철저히 세척한 다음, 실온에서 진공건조시켰다.

건조된 생성물을 약 100 mL 물에 용해시키고, 2 시간 동안 균질화시켰다. 혼합물에 존재하는 불용성 잔사를 원심분리로 제거하였다. 상등액을 MWCO 3500 투석관에서 증류수로 투석시킨 뒤, 동결건조시켰다. 생성된 CCN을 CCN-I로 표시하였다.

실시예 5: CCN 제조

3-구 플라스크에서, 약 2 g의 키토산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 75% 초과 탈아세틸화)을 약 8 g 수산화나트륨, 약 10 mL 증류수 및 약 10 mL 이소프로판올의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 약 24 시간 동안 교반하였다. 카복시메틸화 전에, 플라스크를 약 50℃ 수조에서 약 1 시간 동안 유지하였다. 이어, 5 mL 이소프로판올중의 약 8 g의 모노클로로아세트산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 반응 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 약 50℃에서 4 시간 더 교반한 후, 약 80 mL의 70% 에탄올을 가하여 반응을 중단시켰다. 침전을 여과하고, 70-90% 에탄올로 철저히 세척한 다음, 실온에서 진공건조시켰다.

건조된 생성물을 약 100 mL 물에 용해시키고, 2 시간 동안 균질화시켰다. 혼합물에 존재하는 불용성 잔사를 원심분리로 제거하였다. 상등액을 MWCO 3500 투석관에서 증류수로 투석시킨 뒤, 동결건조시켰다. 생성된 CCN을 CCN-II로 표시하였다.

실시예 6: CCN 제조

3-구 플라스크에서, 약 2 g의 키토산(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, 75% 초과 탈아세틸화)을 약 8 g 수산화나트륨, 약 8 mL 증류수 및 약 32 mL 이소프로판올의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 약 25℃에서 약 24 시간 동안 교반하였다. 카복시메틸화 전에, 플라스크를 약 50℃ 수조에서 약 1 시간 동안 유지하였다. 이어, 10 mL 이소프로판올중의 약 16 g의 모노클로로아세트산(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)을 반응 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 약 50℃에서 4 시간 더 교반한 후, 약 80 mL의 70% 에탄올을 가하여 반응을 중단시켰다. 침전을 여과하고, 70-90% 에탄올로 철저히 세척한 다음, 실온에서 진공건조시켰다.

건조된 생성물을 약 100 mL 물에 용해시키고, 2 시간 동안 균질화시켰다. 혼합물에 존재하는 불용성 잔사를 원심분리로 제거하였다. 상등액을 MWCO 3500 투석관에서 증류수로 투석시킨 뒤, 동결건조시켰다. 생성된 CCN을 CCN-III으로 표시하였다.

실시예 7: CCN 및 CMC 미소구체 제조

약 0.075 g의 CCN-I를 약 5 mL의 물에서 혼합하여 1.5% w/v CCN-I 용액을 형성하였다. 유사하게, 약 0.075 g의 OCMC-I를 약 5 ml 물에서 혼합하여 1.5% w/v OCMC-I 용액을 형성하였다. 이어, CCN-I 및 OCMC-I 용액을 혼합하였다. 혼합물을 0.2 mL 내지 0.5 mL 소르비탄 모노올레에이트를 함유하는 약 50 mL 광유에 첨가하여 에멀션을 형성하였다. 에멀션을 약 45 분간 균질화하였다. 에멀션의 수성상을 약 45℃에서 일정하게 교반하면서 밤새 증발시켰다. 가교결합 CCN 및 CMC를 이소프로판올에서 침전시킨 후, 원심분리로 오일상을 제거하여 분리하였다. 생성된 미소구체를 아세톤에서 철저히 세척한 후, 진공하에 건조시켰다. 생리식염수에서 광학 현미경으로 측정된 미소구체의 평균 직경은 약 515±3 ㎛이었다.

실시예 8: CCN 및 CMC 미소구체 제조

약 0.075 g의 CCN-I를 약 5 mL의 물에서 혼합하여 1.5% w/v CCN-I 용액을 형성하였다. 유사하게, 약 0.075 g의 OCMC-II를 약 5 ml 물에서 혼합하여 1.5% w/v OCMC-I 용액을 형성하였다. 이어, CCN-I 및 OCMC-II 용액을 혼합하였다. 혼합물을 0.2 mL 내지 0.5 mL 소르비탄 모노올레에이트를 함유하는 약 50 mL 광유에 첨가하여 에멀션을 형성하였다. 에멀션을 약 45 분간 균질화하였다. 에멀션의 수성상을 약 45℃에서 일정하게 교반하면서 밤새 증발시켰다. 가교결합 CCN 및 CMC를 이소프로판올에서 침전시킨 후, 원심분리로 오일상을 제거하여 분리하였다. 생성된 미소구체를 아세톤에서 철저히 세척한 후, 진공하에 건조시켰다. 생리식염수에서 광학 현미경으로 측정된 미소구체의 평균 직경은 약 594±3 ㎛이었다.

실시예 9: CCN 및 CMC 미소구체 제조

약 0.075 g의 CCN-I를 약 5 mL의 물에서 혼합하여 1.5% w/v CCN-I 용액을 형성하였다. 유사하게, 약 0.075 g의 OCMC-III를 약 5 ml 물에서 혼합하여 1.5% w/v OCMC-I 용액을 형성하였다. 이어, CCN-I 및 OCMC-III 용액을 혼합하였다. 혼합물을 0.2 mL 내지 0.5 mL 소르비탄 모노올레에이트를 함유하는 약 50 mL 광유에 첨가하여 에멀션을 형성하였다. 에멀션을 약 45 분간 균질화하였다. 에멀션의 수성상을 약 45℃에서 일정하게 교반하면서 밤새 증발시켰다. 가교결합 CCN 및 CMC를 이소프로판올에서 침전시킨 후, 원심분리로 오일상을 제거하여 분리하였다. 생성된 미소구체를 아세톤에서 철저히 세척한 후, 진공하에 건조시켰다. 생리식염수에서 광학 현미경으로 측정된 미소구체의 평균 직경은 약 702±3 ㎛이었다.

실시예 10: CCN 및 CMC 미소구체 제조

약 0.1 g의 CCN-II를 약 5 mL의 물에서 혼합하여 2% w/v CCN-I 용액을 형성하였다. 유사하게, 약 0.1 g의 OCMC-II 또는 0.1 g의 OCMC-III을 약 5 ml 물에서 혼합하여 2% w/v OCMC-II 용액 또는 2% w/v OCMC-III 용액을 형성하였다. 이어, CCN-I 및 OCMC-I 용액을 혼합하였다. 혼합물을 0.2 mL 내지 0.5 mL 소르비탄 모노올레에이트를 함유하는 약 50 mL 광유에 첨가하여 에멀션을 형성하였다. 에멀션을 약 45 분간 균질화하였다. 에멀션의 수성상을 약 45℃에서 일정하게 교반하면서 밤새 증발시켰다. 가교결합된 CCN 및 CMC를 이소프로판올에서 침전시킨 후, 원심분리로 오일상을 제거하여 분리하였다. 생성된 미소구체를 아세톤에서 철저히 세척한 후, 진공하에 건조시켰다. 생리식염수에서 광학 현미경으로 측정된 미소구체의 평균 직경은 약 2,000 ㎛이었다.

실시예 11: 독소루비신이 적재된 미소구체의 제조

습윤 중량이 약 150 mg이고 염수 중에 있는 미소구체를 22 mL 유리 바이알에 가하였다(미소구체의 건조 중량은 약 17 mg이고, OCMC-II 및 CCN-III로부터 형성되었다). 피펫으로 과량의 염수를 제거하였다. 독소루비신을 pH 약 2.5 내지 약 4.5의 염수/염산 용액에 용해시켜 약 20 mL 독소루비신 용액(약 2 mg 독소루비신/용액 mL)을 형성하고, 바이알에 가하였다. 미소구체 적재후 적재 용액에 남아 있는 독소루비신의 양을, 482 nm에서 베크만(Beckman) 자외선-가시광선 분광광도계로 흡광도를 측정하고 기지 농도의 약물 용액으로부터 작성된 표준 곡선과 비교하여 결정하였다. 최대 적재량은 미소구체의 크기에 따라서, 건조 미소구체 1 mg당 독소루비신 약 0.3 내지 약 0.7 mg이었다.

실시예 12: 염수 중 독소루비신 방출

약 3 mg의 적재 미소구체 및 약 2 mL의 생리식염수를 일회용 플라스틱 큐벳에 가하였다. 매질에 방출된 독소루비신의 농도를 베크만 자외선-가시광선 분광광도계로 관찰하였다. 생리식염수를 정기적인 간격(1 일, 3 일, 6 일, 12 일, 19 일 및 26 일)으로 교체 및 교체하지 않고 독소루비신의 방출을 행하였다. 생리식염수를 교환하지 않은 경우, 염수는 약 2 주 내에 독소루비신으로 포화되었다. 생리식염수를 교환한 경우에는, 독소루비신 방출이 생리식염수의 포화없이 1 개월동안 지속될 수 있었다.

Claims

50 마이크로미터 내지 2,200 마이크로미터의 직경을 포함하는 미소구체를 포함하는 색전성 물질로서, 상기 미소구체는 카복시메틸 셀룰로스에 의해 가교결합된 카복시메틸 키토산을 포함하는 것인 색전성 물질.
제1항에 있어서, 미소구체는 1,600 마이크로미터 내지 2,000 마이크로미터의 직경을 포함하는 것인 색전성 물질.
제1항에 있어서, 미소구체는 500 마이크로미터 내지 700 마이크로미터의 직경을 포함하는 것인 색전성 물질.
제1항에 있어서, 미소구체는 치료제를 더 포함하는 것인 색전성 물질.
제4항에 있어서, 치료제는 독소루비신을 포함하는 것인 색전성 물질.
제1항에 있어서, 미소구체는 글루타르알데히드를 포함하지 않는 것인 색전성 물질.
제1항에 있어서, 미소구체는 압축성인 색전성 물질.
제7항에 있어서, 미소구체는 파괴 변형률이 70% 내지 90%인 색전성 물질.
용매; 및
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 색전성 물질을 포함하는 1 이상의 미소구체를 포함하는 복수의 미소구체
를 포함하는 색전술용 현탁액.
제9항에 있어서, 용매는 조영제와 염수의 혼합물을 포함하는 것인 색전술용 현탁액.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 색전성 물질을 포함하는 1 이상의 미소구체를 포함하는 복수의 미소구체; 및
복수의 미소구체가 배치된 주사기 또는 바이알
을 포함하는 키트.
제11항에 있어서, 용매 용기에 배치된 용매를 더 포함하는 키트.
제11항에 있어서, 카테터 및 가이드 와이어를 더 포함하는 키트.
카복시메틸 셀룰로스(CMC)를 부분적으로 산화시켜 부분 산화된 CMC를 형성하는 단계;
부분 산화된 CMC, 카복시메틸 키토산(CCN), 물 및 오일의 에멀션을 형성하는 단계; 및
CCN을 CMC에 의해 가교결합시켜 색전성 미소구체를 형성하는 단계
를 포함하는 색전성 미소구체의 형성 방법.
제14항에 있어서, CCN을 CMC에 의해 가교결합시켜 색전성 미소구체를 형성하는 단계는 에멀션을 20℃ 내지 70℃의 온도에서 12 시간 이상 동안 혼합하는 단계를 포함하는 것인 형성 방법.
제15항에 있어서, CCN을 CMC에 의해 가교결합시켜 색전성 미소구체를 형성하는 단계는 에멀션을 50℃의 온도에서 12 시간 이상 동안 혼합하는 단계를 포함하는 것인 형성 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, CCN을 CMC에 의해 가교결합시켜 색전성 미소구체를 형성하는 단계는 CCN을 CMC에 의해 가교결합시켜 50 ㎛ 내지 2,200 ㎛의 직경을 포함하는 색전성 미소구체를 형성하는 단계를 포함하는 것인 형성 방법.