KR101348507B1 - 변형된 거미 실크 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 거미 실크 단백질을 변형하는 방법 및 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 거미 실크 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 변형된 거미 실크 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 상기 서열을 포함하는 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 여기에서 정의된 변형된 거미 실크 단백질을 포함하는 약제학적 또는 화장료 조성물, 및 다양한 분야, 특별히 의약, 화장품 및 기술적 응용분야에서 상기 변형된 서열의 용도에 관한 것이다.
거미 실크 단백질, 벡터, 거미 실크
Description
본 발명은 거미 실크 단백질을 변형하는 방법 및 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 거미 실크 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 변형된 거미 실크 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 상기벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 여기에서 정의된 변형된 거미 실크 단백질을 포함하는 약제학적 또는 화장료 조성물, 및 다양한 분야, 특별히 의약, 화장품 및 기술적 응용분야에서 상기 변형된 서열의 용도에 관한 것이다.
거미 실크는 뛰어난 물리적 특성을 보이는 단백질 폴리머이다. 거미 실크의 다른 유형의 거미실크 중에서 드래그라인(dragline)이 가장 활발하게 연구되었다. 드래그라인 실크는 둥근 그물을 만드는 거미(orb weaving spider)가 그들의 그물로 프레임 및 방사형을 구축 하기 위해, 지속적으로 뒤로 이동할 수 있도록 하는 생명선(lifeline)이다. 이러한 목적을 위해서 높은 인장강도 및 탄력성이 요구된다. 그러한 특성이 조합되면 대부분의 다른 기존 재료 보다도 높은 인장력을 얻을수 있다. 드래그라인 실크는 일반적으로 두 개의 주요한 단백질로 구성되어 있으며, 상기 단백질들의 일차 구조는 공통의 반복 구조(common repetitive architccture)를 공유한다.
구형의 포획 나선계는, 그 일부가 편모선(flagclliform gland)에 의해 형성되는 접착성의 실크로 구성되어 있으며, 그런 까닭에 편모상 실크라고 불리며, 신축성이 있고 끊어지기전에 3배의 길이로 늘어날수 있지만, 드래그라인 실크 인장 강도의 절반 수준이다.
단일 반복 단위의 변이는 60개에 이르는 아미노산을 포함할 수 있으며, 여러번 반복되어 거미 실크 서열의 가장 큰 부분을 나타낸다. 이러한 반복 단위는 특이적인 아미노산 모티프의 제한된 세트를 포함한다. 모든 드래그라인 실크의 반복 단위에서 발견되는 하나의 모티프는 전형적으로 6 내지 9 알라닌 잔기의 블록이다. 견사(silk threads)에서는 몇몇 폴리알라닌 모티프가 결정 β-시트 스택(stacks)을 형성하고 인장강도를 갖는다.
GGX 또는 GPGXX 같은 글리신 풍부 모티프는 결정 영역을 연결하는 가요성(flexible) 나선형 구조를 채택하고 실에 탄력성을 부여한다.
생체 내(in vivo) 실크 어셈블리(assembly)는 주목할 만한 과정이다. 거미 드래그라인 실크 단백질은 소위 주요 앰풀레이트 샘(ampullatc gland)에 최대50%(w/v)의 농도로 저장된다. 비록 메이저 주요 앰풀레이트 샘 내에 있는 단백질에 대해서 “동적이고 느슨한 나선형 구조(dynamic loose helical structure)"가 제안되어 왔지만, 더 최근의 데이터는 소위 A-존(zone)의 단백질에 대한 임의의 코일 형태임을 시사하며, 이는 상기 샘의 가장 큰 부분을 나타낸다. 고농도의 단백질 용액은 실크 도프액(방사 용액)을 형성하며, 이는 액정(liquid crystal)의 특성을 보인다.
실의 어셈블리는 물, 나트륨 및 염화물의 추출을 수반하는 방사 덕트를 통해 도프액이 통과하는 동안 개시된다. 동시에, 더 많은 이액성(lytropic) 이온 칼륨 및 인산염의 농도는 증가하고, pH는 6.9에서 6.3으로 저하된다. 어셈블리는 최종적으로 거미의 배 밖으로 실을 끌어당김으로써 일어나는 기계적인 힘에 의해 유발된다.
몇 가지 목적을 위해 천연 견사(silk threads)는 직접 사용되지 않고, 용해되어 필름, 발포체, 구체, 나노피브릴, 하이드로겔 등과 같은 다른 형태로 재형성될 필요가 있다.
거미 실크 단백질의 일부 구조적 특성이 밝혀졌지만, 여전히 개개의 실크 단백질 및 일차 구조의 요소, 어셈블리 과정의 기여에 대해서는 거의 알려진 것이 없다. 정원 거미인 무당 거미(Araneous diadematus)의 두 가지 주요 드래그라인 실크 단백질 ADF-3 및 ADF-4의 비교 연구로 그들의 아미노산 서열이 어느 정도 유사함에도, 현저하게 다른 용해도 및 어셈블리 특성을 나타냄을 밝혀냈다: ADF-3은 고농도에서도 가용성인 반면, ADF-4는 실질적으로 불용성이며, 특정 조건하에서 실모양의(filamentous) 구조로 자가-어셈블리한다(공지되지 않은 결과).
과학 및 상업적인 관심은 거미 실크를 공업적 규모에서 제조하는 연구를 개시하게 했다. 천연 거미 실크 생산은 거미의 상호포식(cannibalism) 때문에 비실용적이고, 인공적 생산은 충분한 단백질 수율 및 양질의 실-어셈블리 모두를 달성함에 있어 문제점에 직면했다. 세균적 발현은 낮은 단백질 수준을 산출했는데, 이는 세균 및 거미에서의 상이한 코돈 사용에 기인한 것일 것이다. 발현 숙주에 적합하도록 한 코돈을 사용한 합성 유전자는 높은 수율을 가져오지만, 그렇게 합성된 단백질은 천연 거미 실크와 비교했을 때 상이한 특성을 보였다. 포유류 세포주에서 부분적인 드래그라인 실크 cDNA 발현은 여전히 열악한 품질이었지만, 인공적으로 '명주(silken)' 실로 방사될 수 있는 실크 단백질(예를 들어 ADF-3)을 생산했다.
발명자들은 E.coli에서 재조합 거미 실크 단백질을 생산하기 위한 시스템을 먼저 발전시켰다. 예를 들면, WO2006/008163(미국 출원번호 제60/590,196 우선권 주장)에 언급되어 있다. 이러한 발현 시스템에서, 하나의 구조 블록(=모듈)은 자유롭게 가변될 수 있어, 특별한 경우의 필요에 적합 할 수 있다. 이러한 유형의 모듈은 또한 Hummerich, D., Helsen, C.W., Oschmann, J., Rudolph, R. &Scheibel, T. (2004):"Primary structure elements of dragline silks and their contribution to protein solubility and assembly, Biochemistry 43, 13604-13612"에 기술되어 있다.
의약 분야에서 특별히 거미 실크 단백질의 적용과 높은 관련성을 가지는 하나의 목적은 약, 단백질, 화합물 등을 거미 실크 단백질과 공유적으로 결합시키는 것이다. 하지만, 현재까지, 한편으로 이러한 물질이 소정양의 거미 실크 단백질에 결합하고, 또 한편으로 거미 실크 단백질 내의 소정 위치에 결합할 수 있는 만족할만한 결합 기술이 알려지지 않았다.
따라서, 본 발명의 목적은 약물, 금속, 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 마커 분자, 양자점(quantum dots), 핵산, 지질 등의 물질에 대한 거미 실크 단백질의 표적화 결합에 사용될 수 있는 변형된 거미 실크 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 정확한 양의 상기 물질을 보유 및 운반시킬 수 있고, 상기 물질이 거미 실크 단백질 서열 내의 소정의 위치에 결합할 수 있는 변형된 거미 실크 서열을 제공하는 것이다.
상기 목적은 독립항의 대상 물질에 의해 해결된다. 바람직한 구체예는 종속항에 포함된다.
거미 실크 모듈 내의 아미노산의 결합에 있어서 주요한 관심은 모듈이 화학적으로 특이적인 아미노산 측쇄로서 어떤 것을 가지는 가인데, 현재 경우에는 시스테인의 티올 기 또는 라이신의 아미노기이다. 상기에서 언급된 거미 실크 단백질의 어떤 모듈도 현재까지 기술된 바와 같이, 시스테인이나 라이신을 포함하지 않으며, 이에 각각의 핵산 서열을 특이적 돌연변이 유발에 의해 모듈의 서열을 원하는 아미노산을 제어하는 방법을 결합하는 것이 가능하게 된다. 이러한 방법으로 변형된 모듈은 새로운 구조물로 어셈블리할 수 있으며, 그러므로 하나의 모듈 결합에 의해 하나 이상의 화학적 활성제 또는 약물이 하나의 구조물 내로 결합될 수 있다.
따라서 처음으로 재조합 거미 실크 단백질에 대한 다수 시약의 특이적 다중 결합이 가능하게 되었다. 기초적 모듈의 변형과는 별도로, 이 구조물들을 활성화시키거나 변형시키기 위해, 동일한 구성물 TAG에 의해 화학 반응성 아미노산을 겹하는 기회가 더욱 존재한다.
상기에서 언급한 바와 같이, 발명자들은 거미 실크 단백질과 유사하고, 제한된 방법으로 하나의 DNA 서열 모듈이 합성 유전자로 어셈블리할 수 있도록 하기 위한 클로닝 전략에 의해 특이적으로 영향을 받는 특성을 가지는 단백질의 효과적인 생산 방법을 제공했다((Hmmerich et al., 2004). 하나의 모듈은 외래 DNA 서열에 의해 구분되지 않는데, 이는 공지 기술의 클로닝 시스템인 경우이다. 현재 이용되는 클로닝 시스템에서, 예를 들면, 클로닝 벡터 pAZL(발명자에 의해 개발됨)를 사용할 수 있는데, 이 벡터는 정의된 클로닝 카세트를 포함한다(Figure 1). 이러한 클로닝 카세트의 가장 중요한 요소는 두 개의 제한 효소(BseRI 및 BsgI)를 위한 인식 서열이며, 이들의 제한효소 자리는 각각의 인식 서열로부터 각각 8 및 14개의 뉴클레오타이드 떨어진 곳에 위치한다.
이것으로 번역개시 및 정지코돈의 배치와 합성유전자의 직전 또는 직후에 더욱더 제한 효소 자리에 결합이 가능하게 된다.
이것으로 번역개시 및 정지코돈의 배치와 합성유전자의 직전 또는 직후에 더욱더 제한 효소 자리에 결합이 가능하게 된다.
BseRI 및 BsgI의 제한효소 자리에는 스페이서(spaccr) 영역이 클로닝 카세트 내에 존재하고 이것은 후속 공정에서 우선 단일 모듈, 그 뒤에 합성 유전자를 대체 할 수 있다. 단일 요소들의 배열은 후속 공정 내에서 유지된다(Fig.1 참조).
본 발명의 개시점을 형성하는 단량체 서열 모듈의 기본은 무당 거미(Araneous diadematus)의 ADF3 및 ADF4 유전자, 및 황금원형거미(Nephila clavipes)의 FLAG 유전자이다. 변이에 이용된 ADF3 및 ADF4의 서열은 공개적으로 이용가능하다(허가번호 U47855 및 U47856). 첫 번째 두 유전자(ADF3 및 ADF4)는 거미의 드래그라인 실을 형성하는 단백질을 코딩하기 위한 것이고, 세 번째 유전자(FLAG)는 편모성 실크(flagclliform silk)의 단백질을 코딩하기 위한 것이다. 이러한 단백질의 아미노산 서열에 기초한 몇 가지 모듈이 고안되었다.
모듈 A: GPYGPGASAA AAAAGGYGPG SGQQ (서열번호 1)
모듈 C: GSSAAAAAAA ASGPGGYGPE NQGPSGPGGY GPGGP (서열번호 3)
모듈 Q: GPGQQGPGQQ GPGQQGPGQQ (서열번호 2)
모듈 K: GPGGAGGPYG PGGAGGPYGP GGAGGPY (서열번호 4)
모듈 sp: GGTTIIEDLD ITIDGADGPI TISEELTI (서열번호 5)
모듈 X: GGAGGAGGAG GSGGAGGS (서열번호 6)
모듈 Y: GPGGAGPGGY GPGGSGPGGY GPGGSGPGGY (서열번호 7)
이들 아미노산 모듈로부터, 합성 거미 실크 단백질 구조물이 어셈블리된다. 이러한 모듈 및 이들로부터 유래한 거미 실크 단백질은 본 발명의 거미 실크 단백질을 변형시키는 방법에 있어서, 다른 것들 사이에서 개시 물질을 형성한다.
클로닝 카세트의 구조는 어떤 경우에도, 두 모듈 또는 모듈 다중결합체의 임의의 어셈블리를 가능하게 한다. 이러한 관계로서 도 2에서 DNA 분자의 다중결합의 예가 도시되어 있다.
본 발명에서 고비용의 작업 없이도 때에 따라 다른 결합 반응을 수행할 수 있는 거미 실크 단백질에 대한 여러 반응물질의 결합 시스템이 제공된다. 이는 결합된 거미 실크 단백질의 잠재적인 산업적 응용이나 생산을 위한 중요한 요건이다.
이러한 목적을 달성하기 위해, 선택되는 거미 실크 단백질의 모듈은 선택되는 아미노산 부위에 화학적 특징이 있는 측쇄를 가지는 아미노산을 도입시키기 위해 변형된다. 새롭게 도입된 아미노산은 라이신 및 시스테인이다.
본 발명은 특히 하기의 측면들 및 구체예들에 한 것이다:
첫 번째 측면에 따르면, 다음 단계들을 포함하는 거미 실크 단백질을 변형시키는 방법에 관한 것이다.
a) 거미 실크 단백질, 또는 라이신 잔기 및 시스테인 잔기를 포함하지 않는 동일한 거미 실크 단백질의 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 단계;
b) 상기 거미 실크 단백질 내 하나 또는 그 이상의 아미노산을 코딩하는 핵산을 라이신 또는 시스테인을 코딩하는 핵산 서열로 인해 교체하거나, 상기 서열에 라이신 및/또는 시스테인을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 서열을 첨가하는 단계;
c) 단계 b)에서 얻은 변형된 핵산 서열을 적합한 숙주 내에서 발현하는 단계; 및
d) 변형된 거미 실크 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는 거미 실크 단백질을 변형시키는 방법.
상기 방법은 본 발명의 변형된 거미 실크 단백질을 생산하는 가장 효과적인 방법이다. 그러나, 예를 들어 라이신 또는 시스테인 잔기(단백질 형태 내에)를 포함하지 않는 거미 실크 단백질 또는 동일한 거미 실크 단백질 단편을 제공함으로써 동일한 것을 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 아미노산들 사이에 라이신 및/또는 시스테인을 포함하는 아미노산 TAG를 상기 거미 실크 단백질에 화학적으로 결합(또는 첨가)시킬 수 있다.
더욱, 상기 방법은 치환을 통한 변형된 거미 실크 단백질 코딩 서열의 고안을 위한 옵션 및 상기 서열에 라이신 및/또는 시스테인을 적어도 한쪽을 코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 서열의 순차적 첨가를 위한 옵션을 포함한다.
단계 a)에서 사용되는 거미 실크 단백질의 종류 및 기원은 라이신 또는 시스테인 잔기를 포함하지 않는 조건을 만족하는 것이면, 제한되지 않는다. 거미 실크 단백질은 천연 유래거나 인공적인 서열인지는 중요하지 않다.
여기서 사용되는 용어 “단편(fragment)”은 거미 실크 단백질(인공의/합성의 또는 천연유래의)의 일부분을 의미하는데, 이들은 약 5 내지 50 아미노산 잔기의 길이를 가지며, 바람직하게는 10 내지 40, 예를 들면 20 내지 30 아미노산 잔기의 길이를 가진다.
바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 또한 변형된 거미 실크 단백질 내의 상기 라이신 및/또는 시스테인 분자에 결합하는 다른 물질을 포함한다. 상기에 언급된 바와 같이, 이는 상기 물질이 거미 실크 단백질에 결합시 제한적이고 표적화된 결합 패턴을 가지도록 할 수 있다.
단계 b)에서 교체되는 하나 이상의 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린, 글루타메이트, 아스파르테이트 및 트레오닌으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 그들은 통상적으로 어셈블리 작용(behaviour) 등에 있어서, 얻어지는 변형된 거미 실크 단백질을 심하게 변형시키지 않는다.
변형된 거미 실크 단백질 내의 상기 라이신 및/또는 세린을 적어도 하나에 결합되는 물질은 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 마커 분자, 양자점(quantum dots), 금속, 핵산, 지질 및 저분자 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
예를 들어, 나노금 입자는 화학적 링커를 통해 시스테인 잔기에 결합될 수 있다. 이 경우에, 공유결합은 링커의 말레이미도(maleimido)기 또는 아이오도마세타미드(iodoacctamide)기가 시스테인의 티올기에 결합함으로써 수행된다. 원래, 결합될 수 있는 모든 물질은 라이신의 아미노기나 시스테인의 티올기에 공유적으로 결합할 수 있다.
바람직하게는, 저분자 약물은 카르복시기, 카르보닐기, 이미도기 또는 티올기를 포함하는 약물에서 선택된다. 비제한적으로 선택된 약물로는 디클로페낙(diclofenac), 인도메타신, 톨메틴(tolmetine), 이부프로펜, 플러비프로렌(flurbiprofene), 페노프로펜(fenoprofene), 나프록센(naproxene), 케토프로펜(ketoprofene), 페니실린 또는 세팔로스포린이 있다.
바람직하게는, a) 단계에 제공되는 거미 실크 단백질은 드래그라인 단백질 및/또는 편모성 단백질에 기초한다. 거미 실크 서열은 예를 들면, 오르브-웹(orb-web) 거미(Araneidae and Araneiods) 유래일 수 있다.
더욱 바람직하게는 거미 실크 단백질은 다음의 거미의 하나 또는 그 이상으로부터 유래된다: Arachnura higginsi, Araneus circulissparsus, Araneus diadematus, Argiope picta, Banded Garden Spider (Argiope trifasciata), Batik Golden Web Spider (Nephila antipodiana), Beccari's Tent Spider (Cyrtophora beccarii), Bird-dropping Spider (Celaenia excavata), Black-and-White Spiny Spider (Gasteracantha kuhlii), Black-and-yellow Garden Spider (Argiope aurantia), Bolas Spider (Ordgarius furcatus), Bolas Spiders - Magnificent Spider (Ordgarius magnifcus), Brown Sailor Spider (Neoscona nautica), Brown-Legged Spider (Neoscona rufofemorata), Capped Black-Headed Spider (Zygiella calyptrata), Common Garden Spider (Parawixia dehaani), Common Orb Weaver (Neoscona oxancensis), Crab-like Spiny Orb Weaver (Gasteracantha cancriformis (elipsoides)), Curved Spiny Spider (Gasteracantha arcuata), Cyrtophora moluccensis, Cyrtophora parnasia, Dolophones conifera, Dolophones turrigera, Doria's Spiny Spider (Gasteracantha doriae), Double-Spotted Spiny Spider (Gasteracantha mammosa), Double-Tailed Tent Spider (Cyrtophora exanthematica), Aculeperia ceropegia, Eriophora pustulosa, Flat Anepsion (Anepsion depressium), Four-spined Jewel Spider (Gasteracantha quadrispinosa), Garden Orb Web Spider (Eriophora transmarina), Giant Lichen Orbweaver (Araneus bicentenarius), Golden Web Spider (Nephila maculata), Hasselt's Spiny Spider (Gasteracantha hasseltii), Tegenaria atrica, Heurodes turrita, Island Cyclosa Spider (Cyclosa insulana), Jewel or Spiny Spider (Astracantha minax), Kidney Garden Spider (Araneus mitificus), Laglaise's Garden Spider (Eriovixia laglaisei), Long-Bellied Cyclosa Spider (Cyclosa bifida), Malabar Spider (Nephilengys malabarensis), Multi-Coloured St Andrew's Cross Spider (Argiope versicolor), Ornamental Tree-Trunk Spider (Herennia ornatissima), Oval St. Andrew's Cross Spider (Argiope aemula), Red Tent Spider (Cyrtophora unicolor), Russian Tent Spider (Cyrtophora hirta), Saint Andrew's Cross Spider (Argiope keyserlingi), Scarlet Acusilas (Acusilas coccineus), Silver Argiope (Argiope argentata), Spinybacked Orbweaver (Gasteracantha cancriformis), Spotted Orbweaver (Neoscona domiciliorum), St. Andrews Cross (Argiope aetheria), St. Andrew's Cross Spider (Argiope Keyserlingi), Tree-Stump Spider (Poltys illepidus), Triangular Spider (Arkys clavatus), Triangular Spider (Arkys lancearius), Two-spined Spider (Poecilopachys australasia), Nephila species, e.g. Nephila clavipes, Nephila senegalensis, Nephila madagascariensis 및 다수 (추가의 거미종은 하기 참조).
가장 바람직하게는, 드래그라인 단백질은 무당거미(Araneus diadematus)로부터 유래되고, 편모성 단백질은 황금 원형 거미(Nephila clavipes)로부터 유래된다.
바람직하게는 드래그라인 서열은 ADF-3 및 ADF-4이다. 용어 ADF-3/-4는 무당거미(무당거미 피브로인-3/-4)에 의해 생산된 MaSp 단백질의 문맥에서 사용된다. 두 단백질 ADF-3 및 ADF-4는 모두 MaSpII 단백질(주요 앰풀레이트 스피드로인 II)의 계열(class)에 속한다.
추가의 구체예에 따르면, 상기 단편은 모듈(모듈)이고, 상기 모듈은 하나 또는 하나 이상의 폴리알라닌 함유 공통 서열(polyalanine containing containing consensus sequences)을 포함한다. 이러한 폴리알라닌 함유 공통 서열은 바람직하게는 ADF-3에서 유래되며, 서열번호1(모듈 A)의 아미노산 서열 및 그의 변이체 서열을 가진다.
추가의 구체예에 따르면, 상기 단편은 ADF-3 유래의 모듈이며, 서열번호2(모듈 Q)의 아미노산 서열 및 그들의 변이체 서열을 포함한다. 또한, 상기의 결합 서열(combined sequences)(및 여기에서 언급된 모든 다른 모듈)이 고려된다. 예를 들면, 단계 a)에서 제공되는 단편은 하나 또는 그 이상의 (AQ) 및/또는 (QAQ)을 포함한다. 바람직하게는 이러한 경우의 거미 실크 단백질은 (AQ)12, (AQ)24, (QAQ)8 또는 (QAQ)16을 포함한다.
이에, 본 발명에서 사용되는 특이적인 모듈은 또한 각각 결합될 수 있으며, 예를 들면 A와 Q, Q와 C의 결합으로 된 모듈(반복 단위) 또한 본 발명에 포함될 수 있다. 거미 실크 단백질 내에 도입된 모듈의 수가 제한되지 않음에도 불구하고, 각각의 재조합 단백질에 대한 합성 반복 서열의 많은 모듈을 사용할 수 있는데, 여기서 모듈의 수는 바람직하게는 5 내지 50 모듈, 더욱 바람직하게는 10 내지 40, 가장 바람직하게는 15 내지 35 모듈 사이이다.
또 다른 바람직한 모듈은 ADF-4 유래이고, 서열번호 3(모듈 C)의 아미노산 서열 또는 그 변이체의 아미노산 서열을 포함한다. 단계 a)에서 제공되는 결합 서열은 바람직하게는 C16 또는 C32를 포함한다.
편모성 단백질에서 유래된 바람직한 모듈은 모듈 K(서열번호 4), 모듈 sp(서열번호 5), 모듈 X(서열번호 6), 및 모듈 Y(서열번호 7)이다.
바람직한 결합은 Y8, Y16, X8, X16, K8, K16 또는 Y6X2sp1K2Y2을 포함한다.
본 발명의 방법으로 생성된 하기의 새로운 모듈이 각각의 바람직한 구체예에서 제시된다.
드래그라인 거미 실크의 모듈
모듈 Ac: GPYGPGASAA AAAAGGYGPG CGQQ (서열번호 8)
ggt ccg tac ggc cca ggt gct agc gcc gca gcg gca gcg gct ggt ggc tac ggt ccg ggc tgc ggc cag cag
모듈 Aκ: GPYGPGASAA AAAAGGYGPG KGQQ (서열번호 9)
ggt ccg tac ggc cca ggt gct agc gcc gca gcg gca gcg gct ggt ggc tac ggt ccg ggc aaa ggc cag cag
모듈 Cc: GSSAAAAAAA ASGPGGYGPE NQGPCGPGGY GPGGP (서열번호 10)
cgt tct agc gcg gct gca gcc gcg gca gct gcg tcc ggc ccg ggt ggc tac ggt ccg gaa aac cag ggt cct tgc ggc ccg ggc ggc tac ggt cca ggt ggt cca
모듈 Cκ1 : GSSAAAAAAA ASGPGGYGPE NQGPKGPGG Y GPGGP (서열번호 11)
cgt tct agc gcg gct gca gcc gcg gca gct gcg tcc ggc ccg ggt ggc tac ggt ccg gaa aac cag ggt cca aaa ggc ccg ggt ggc tac ggt cct ggc ggt ccg
모듈 CK2: GSSAAAAAAA ASGPGGYGPK NQGPSGPGGY GPGGP (서열번호 12)
cgt tct agc gcg gct gca gcc gcg gca gct gcg tcc ggc ccg ggt ggc tac ggt ccg aaa aac cag ggt cca tct ggc ccg ggt ggc tac ggt cct ggc ggt ccg
모듈 Cκc: GSSAAAAAAA ASGPGGYGPK NQGPCGPGGY GPGGP (서열번호 13)
cgt tct agc gcg gct gca gcc gcg gca gct gcg tcc ggc ccg ggt ggc tac ggt ccg aaa aac cag ggt cca tgc ggc ccg ggt ggc tac ggt ect ggc ggt ccg
편모성 거미 실크의 모듈
모듈 spc: GGTTIIEDLD ITIDGADGPI TICEELTI (서열번호 14)
ggt ggc acc acc atc att gaa gat ctg gac atc act att gat ggt gcg gac ggc ccg atc acg atc tgc gaa gag ctg acc atc
모듈 spκ: GGTTIIEDLD ITIDGADGPI TIKEELTI (서열번호 15)
ggt ggc acc acc atc att gaa gat ctg gac atc act att gat ggt gcg gac ggc ccg atc acg atc aaa gaa gag ctg acc atc
모듈 Xc: GGAGGAGGAG GCGGAGGS (서열번호 16)
ggt ggc gct ggt ggc gcc ggt ggc gca ggt ggc tgc ggc ggt gcg ggc ggt tcc
모듈 Xκ: GGAGGAGGAG GKGGAGGS (서열번호 17)
ggt ggc gct ggt ggc gcc ggt ggc gca ggt ggc aaa ggc ggt gcg ggc ggt tcc
모듈 Yc: GPGGAGPGGY GPGGSGPGGY GPGGCGPGGY (서열번호 18)
ggt ccg ggc ggt gcg ggc cca ggt ggc tat ggt ccg ggc ggt tct ggg ccg ggt ggc tac ggt cct ggc ggt tgc ggc ccg ggt ggc tac
모듈 Yκ: GPGGAGPGGY GPGGSGPGGY GPGGKGPGGY (서열번호 19)
ggt ccg ggc ggt gcg ggc cca ggt ggc tat ggt ccg ggc ggt tct ggg ccg ggt ggc tac ggt cct ggc ggt aaa ggc ccg ggt ggc tac
이러한 모듈은 목적에 따라, 특이적인 변형을 달성하기 위해 다른 모듈/거미 실크 단백질과 결합될 수 있다. 가능한 결합의 예로서, 구조물 C16을 사용할 수 있다. 이러한 면에서 모듈 Cc의 사용으로 가능한 구조물은 하기와 같다:
C16CC, CCC16, C8CCC8, C16 C, C8CC 8, CC 8C8, C4CC 8C4, CC 4C8CC 4 등
이러한 구조물은 라이신의 아미노기 뿐만 아니라 시스테인의 티올기를 통해 제한되고 표적화된 결합을 수행할 수 있다. 예를 들어, Cc 와 모듈 CK1의 결합에 의해, 시스테인의 티올기 및 라이신 측쇄의 아미노기에 물질이 정확하게 결합하도록 하는 가능성이 있다.
바람직한 구조물은 이하와 같이 고안될 수 있다: 예를 들어, 아미노산 모두 추가적인 가능성(수많은 구조물 변이체들이 발생함)을 개시할 수 있는 하나의 단일 모듈(모듈 CKC) 내에 도입된다.
단일 케이스 내에서 아미노산 교환은 어셈블리 특성의 변경 또는 구조물의 변형특성을 변형시킬 수 있다는 점을 배제할 수 없기 때문에, 더욱 바람직한 대체제로서, 본 발명은 특이적인 TAG의 사용에 관한 것이다. 이러한 태그(예를 들어, 이하의 서열번호 20 내지 28에 기재된 TAG는 상술된 시스테인 또는 라이신을 포함한다. 상기 TAG의 서열은 나머지 단백질들과의 상호작용 및 어셈블리 작용(behaviour)의 영향성을 가장 최대범위로 배제시킬 수 있도록 선택된다.
이에, 바람직한 구체예에 따르면, 단계 d)에서 회수되는 변형된 거미 실크 단백질은 하나 또는 그 이상의 서열번호 8 내지 19의 모듈을 포함한다.
이하의 TAG는 거미 실크 구조물 내에서 바람직하게 사용될 수 있도록 개발된 것이다:
아미노 말단 TAGs
NHCYS1 : GCGGGGGGSG GGG (서열번호 20)
ggt tgc ggc ggt ggc ggt ggc ggt tct ggt ggc ggt ggc
NHCYS2 : GCGGGGGG (서열번호 21)
ggt tgc ggt ggc ggt ggc ggt ggc
NHCYS3 : GCGGS GGGGS GGGG (서열번호 22)
ggt tgc ggt ggc tct ggt ggt ggc ggg tcc gga ggc ggt ggc
NHLYSI : GKGGGGGGSG GGG (서열번호 23)
ggt aaa ggc ggt ggc ggt ggc ggt tct ggt ggc ggt ggc
ggt aaa ggc ggt ggc ggt ggc ggt tct ggt ggc ggt ggc
NHLYS2: GKGGGGGG (서열번호 24)
ggt aaa ggt ggc ggt ggc ggt ggc
ggt aaa ggt ggc ggt ggc ggt ggc
카르복시 말단 TAGs
CHCYS1 : GGGGSGGGG GGCG (서열번호 25)
ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt tgc ggc
CHCYS2 : GGGGSGGCG (서열번호 26)
ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt tgc ggc
CHLYSI: GGGGSGGGGS GGKG (서열번호 27)
ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt aaa ggc
CHLYS2: GGGGSGGKG (서열번호 28)
ggc ggt ggc ggt tct ggc ggt aaa ggc
또한 상기에 언급된 예로서, 하기의 다른 변이체를 사용할 수 있다:
NHCYS1C16, C16CHCYS1, NHCYS1C16CHLYS1, NHLYS1C16CHCYS1 등
거미 실크 단백질 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열을 라이신 또는 시스테인의 핵산서열로 교체하는 것은 얻어지는 변형된 거미 실크 단백질의 특성을 변화시킬 수 있다. 원하지 않은 변형을 피하기 위해, 숙련된 당업자들은 원하지 않은 변형을 피하거나 거미 실크 단백질 서열 내로 추가적으로 요구되는 특징들을 도입시키기 위한 치환 반응의 특이적 위치를 어떻게 선택하는지 알고 있다. 그러므로, 특별히 중성의 소수성 아미노산, 예를 들면, 아미노산 측쇄의 전하를 띠지 않는 아미노산을 사용하는 것이 바람직하다. 원래의 거미 실크 단백질 서열 내로 교체되는 아미노산은 부가적으로 새롭게 도입되는 아미노산에 의한 입체적 장애를 피하기 위해 비슷한 크기여야 한다. 그러므로, 특별히 세린, 알라닌, 글리신, 글루타메이트, 아스파르테이트 또는 트레오닌을 라이신 또는 시스테인으로 치환시키는 것이 바람직하다.
이에, 단계 d)에서 회수되는 변형된 거미 실크 단백질 또는 상기 단계 a)에서 제공되는 거미 실크 단백질에 서열번호 20 내지 24에 따른 아미노 말단 TAG 및/또는 서열번호 25 내지 28의 카르복시 말단 TAG가 부가될 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 아미노산 서열은 서열번호 내에서 제공된 정확한 서열에 제한되지 않는다. 또한, 본 명세서에서 아미노산 서열은 변이체들을 포함한다. 이에, 본 발명의 단백질의 아미노산 서열은 또한 삽입, 결실 및 치환에 의해 여기서 제시되는 서열과 달라지는 모든 서열을 포함한다.
바람직하게는, 아미노산 "치환"은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 하나의 아미노산으로 대체한 결과, 다시 말해 보존성 아미노산 치환(conservative amino acid replaccment)한다. 아미노산 치환은 연관된 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성(amphipathic) 에 있어서 유사성에 기초하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산(polar neutral amino acid)은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하며; 양으로 전하된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하며; 음으로 전하된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.
"삽입" 또는 "결실"은 전형적으로 약 1 내지 5 아미노산의 범위이며, 바람직하게는 약 1, 2 또는 3 아미노산이다. 아미노산 부가(addition)는 전형적으로 100 개 이하이며, 바람직하게는 80개 이하이며, 더욱 바람직하게는 50개 이하이며, 가장 바람직하게는 20개 이하인데, 본 발명의 단백질 내로 삽입 및/또는 단백질에 연장된다. 본 발명에서는 본 명세서에 기재된 단백질의 요구되는 특성에 부정적인 영향을 미치지 않는, 그러한 부가만을 고려하고 있음을 유념할 필요가 있다.
허용되는 변형은 재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질에 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환을 체계적으로 실행하고 얻어지는 재조합 변형체의 활동성을 분석함으로서 실험적으로 결정될 수 있다. 이는 당업자로 하여금 통상적인 실험 이상의 것을 요구하는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 단계 d)에서 조재된 상기 단백질을 적절한 방법에 의해 나노섬유 및 필라멘트(filament)로 방사(spinning)시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 목적을 위해, 그 자체로 당해 기술 분야에서 공지의 방사 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 거미줄 단백질의 도프(dope) 용액을 방사 돌기(spinneret)를 통해 압출시켜 바이오필라멘트를 형성한다. 얻어지는 바이오필라멘트는 연신되거나 신장될 수 있다. 분자의 결정성 및 비결정성 배열의 분자가 바이오필라멘트에 존재하는 때에는 언제라도, 연신 또는 신장에 의해 분자를 배향(orient)시켜 충분한 단응력이 분자에 가해져서, 분자를 필라멘트의 벽에 더 평행하도록 바이오필라멘트의 인장 강도 및 강인성(toughness)를 증가시키게 된다.
바람직하게는, 도프 용액은 적어도 1%, 5%, 10%, 15% 중량/부피(w/v) 변형된 실크 단백질이다. 더욱 바람직하게는, 도프 용액은 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50% w/v로 변형된 실크 단백질이다. 바람직한 구체예에서, 도프 용액은 실질적으로 순수한 변형된 거미 실크 단백질을 함유한다. 바람직한 구체예에서, 도프는 대략 6.9의 pH를 갖는다.
"도프 용액(dope solution)"은 실크 단백질을 함유하는 모든 액체 혼합물을 의미하며, 바이오필라멘트의 형성 또는 필름 주형성형(casting)을 위해 압출성형된다. 도프 용액은 또한, 단백질 모노머(monomer) 외에도 예를 들면, 다이머, 트라이머, 및 테트라머와 같은 고차 응집체(higher order aggregatc)를 포함할 수 있다. 보통, 도프 용액은 pH 4.0 내지 12.0의 수용액이고, 40% (w/v) 미만의 유기물 또는 카오트로픽제(chaotropic agcnt)를 갖는다. 바람직하게는, 도프 용액은 유기 용매 또는 카오트로픽제를 전혀 함유하지 않지만, 용액의 보존성, 안정성 또는 작업성을 향상시키기 위한 첨가제를 포함할 수 있다.
"필라멘트"는 나노스케일 및 미시적인 길이에서 1마일(mile) 또는 그 이상의 길이에 이르는 범위의, 무한한 길이의 섬유를 의미한다. 실크는 천연 필라멘트이며, 이에 반해, 예로서 나일론 및 폴리에스테르는 합성 필라멘트이다.
거미 실크 단백질 섬유를 방사하기 위한 방법에 관한 더욱 상세한 정보는 2003. 7. 24에 공개된 국제공개공보 WO03060099(Karatzas 등)에서 찾을 수 있으며, 이는 인용에 의해 여기에 삽입된다.
더욱이, 본 발명의 변형된 거미 실크 단백질은 필름 또는 유사한 것으로, 즉 방사 단계가 요구되지 않는 거미 실크 단백질 제품으로 제공될 수 있다.
두 번째 측면에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 획득할 수 있는 변형된 실크 단백질이 제공된다.
바람직하게 변형된 거미 실크 단백질은 서열번호 8 내지 28 모듈의 하나 또는 그 이상을 포함한다.
세 번째 측면에 따르면, 본 발명의 방법의 단계 d)에서 얻어지는 변형된 거미 실크 단백질 또는 상기에서 언급되는 변형된 거미 실크 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 제공된다.
용어 "핵산 서열"은 뉴클레오티드의 헤테로폴리머(heteropolymer) 또는 이러한 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에 뉴클레오티드의 헤테로폴리머를 언급하는 것과 호환성 있게 사용된다.
본 명세서에 사용된 하이브리드화의 엄격성(stringency of hybridization)은 폴리뉴클레오티드 이중쇄(duplex)가 안정한 조건을 의미한다. 기술 분야에서의 당업자에 알려진 바와 같이, 중복부위의 안정성은 나트륨 이온 농도 및 온도의 함수이다(예를 들면, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory,(1989) 참조). 하이브리드화에 사용되는 엄격성 수준은 기술 분야의 당업자에 의해 손쉽게 변경될 수 있다.
여기서 사용된 "적당히 엄격한 조건(moderatcly stringent conditions)"은 DNA가 약 60% 동일성, 바람직하게는 약 75% 동일성, 더욱 바람직하게는 DNA에 약 85%의 동일성을 가지는 상보성 핵산에 결합하는 것을 허용하는 조건을 의미하며; 상기 DNA에 약 90% 이상의 동일성을 가지는 것이 특히 더 바람직하다. 바람직하게는, 적당히 엄격한 조건은 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x 덴하르트 용액(Denhart's solution), 5 x SSPE, 0.2% SDS에서 하이브리드화하고, 이어서 65℃에서 0.2 x SSPE, 0.2% SDS에서 세척하는 것과 동등한 조건이다.
네 번째 측면은 상기에서 정의된 핵산 서열 및 하나 또는 그 이상의 조절 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 이러한 발현벡터는 바람직하게는 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. 용어 "발현 벡터"는 일반적으로, DNA (RNA) 서열로부터 폴리펩티드/단백질을 발현하기 위한 플라스미드 또는 파지 또는 바이러스 또는 벡터를 의미한다. 발현벡터는 (1)유전자 발현에서 조절 역할을 하는 유전 요소 또는 요소들, 예를 들면, 프로모터나 인핸서(enhancer), (2)mRNA로 전사되고 단백질로 해독되는 구조서열 또는 코딩 서열, 및 (3)적절한 전사 개시 및 종결 서열의 조립체를 포함하는 전사 단위를 포함할 수 있다. 효모 또는 진핵 발현 시스템에서 사용하기 위한 구조적 단위는 바람직하게는 숙주 세포에 의해 해독된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열(leader sequence)을 포함한다. 선택적으로는, 재조합 단백질이 리더 서열 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 핵 단백질은 아미노-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 최종 생산물을 제공하기 위해서 이러한 잔기는 발현된 재조합 단백질로부터 후속하여 절단되거나 절단되지 않을 수 있다.
벡터는 바람직하게는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터이며, 바람직하게는 바쿨로바이러스(baculovirus) 시스템 또는 우두 바이러스(vaccinia virus) 벡터 시스템이다. 별개의 바이러스 벡터 시스템 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 경우에 따라서, 벡터의 변형이 필요할 수 있다. 추가의 바이러스 벡터의 예들은 아데노바이러스 및 모든 음성-가닥(negative-strand) RNA-바이러스, 예를 들면 광견병, 홍역, RSV 등이다.
즉시 사용 가능한 유전적 구조체는 다른 상업적으로 이용가능한 발현벡터, 예들 들면, pET(Novagcn, Madison, Wisconsin, USA) 또는 pQE-시스템(Qiagcn GmbH, Hilden, Germany)으로 클로닝시킬 수 있다. 클로닝에 사용하는 벡터 또는 제한 효소의 특별한 선택에 의해 다른 단백질 TAG가 단백질에 부착될 수 있다(예를 들어, T7-tag(Novagcn, Madison, Wisconsin, USA) 또는 6xhistidin-tag). 또한, 다른 프로모터들 가운데 하나를 선택할 수 있다(예를 들어, T7 또는 T5).
바람직하게는 벡터는 변형된 거미 실크 단백질을 코딩하는 상기 핵산 서열을 포함하고, 바람직하게는 서열번호 29(클로닝 벡터 pAZL) 또는 그 변이체로부터 유래된다.
본 발명의 다섯 번째 측면은 상기 벡터로 형질전환된(transformed) 숙주에 관한 것이다. 숙주는 원핵세포, 바람직하게는 대장균(E.coli) 또는 고초균(Bacillus subtilis)일 수 있다. 합성 유전자의 발현은 예를 들어 E. coli K12 또는 E. coli B 세포에서 수행될 수 있다. 발현수율은 세균 배양액 리터당 정제 단백질 약 1g 정도이다.
숙주는 또한 진핵 세포일 수 있으며, 예를 들어 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포이다. 포유동물 세포는 CHO, COS, HeLa, 293T, HEH 또는 BHK 세포, 효모세포(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia Pastoris), 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)), 인시류(Lepidoptera) 곤충 세포에서 선택되는 곤충 세포, 바람직하게는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni) 유래의 세포이며, 가장 바람직하게는 Sf9, Sf2l 또는 하이 파이브(high five) 세포, 또는 식물세포, 바람직하게는 담배, 감자, 옥수수, 완두 및 토마토 유래의 식물 세포이다.
곤충 세포 발현 시스템의 장점 중 하나는, 예를 들면 박테리아 시스템에 관해서는 생산된 단백질이 글리코실화되어(glycosylatcd), 그에 의해 미생물에 의한 분해를 위한 표적이 된다는 사실에 있다. 이러한 특성은 중요하며, 예를 들면, 의약 분야에서 실크 단백질이 생체 내(in vivo) 사용을 위한 목적인 경우에는 언제든지 생물학적 분해가 요구된다. 이러한 특성은 특히 봉합사 재료(suture matcrial) 및 창상 봉합 및 피복(coveragc) 시스템에서의 적용에서 발견할 수 있다.
본 발명의 여섯 번째 측면은 상기 변형된 거미 실크 단백질로부터 제조되는 섬유/실 또는 필라멘트에 관한 것이다.
본 명세서에 정의된 단백질, 실, 필라멘트, 필름, 발포체, 구체, 나노피브릴, 하이드로겔 등은 생물공학적 분야 및/또는 의학 분야, 바람직하게는 창상 봉합 또는 피복 시스템의 제조, 신경외과 또는 안과 분야에서 사용하기 위한 봉합사 재료의 제조용으로 사용될 수 있다. 또한, 단백질/실은 대체 재료, 바람직하게는 인공 연골 또는 힘줄(tendon) 재료의 생산을 위해 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명의 실/섬유는 의료용 접착 스트립, 피부 이식, 대체 인대, 수술용 체장막(surgical mesh) 등의 의료 기기; 의류용 직물, 방탄조끼 안감, 컨테이너 직물(container fabric), 가방 또는 지갑 끈, 케이블, 로프, 접착 결합 재료, 비-접착 결합 재료, 가죽끈 재료, 자동차 커버 및 부품, 항공기 건조(aircraft construction) 재료, 내후성 재료, 유동적인 파티션 재료, 스포츠 장비 등의 넓은 범주의 공업 및 산업 제품의 제조; 및 사실상 요구되는 특성이, 높은 인장 강도 및 탄성인, 거의 모든 섬유 또는 직물의 용도로 사용될 수 있다. 건조 분무 코팅, 비드 유사 입자 등과 같은 다른 형태에서 안정한 섬유 제품의 적응성 및 용도, 또는 다른 조성물과 함께 혼합물에서의 사용 또한 본 발명에서 고려된다.
상기에서 언급된 바와 같이, 의약적 물질은 본 발명의 변형된 거미 실크 단백질에 시스테인/라이신 잔기를 통해 결합될 수 있다. 특별히 그러한 결합 단백질은 상기 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 결합 단백질의 가능한 적용으로서, 이들로부터 만들어진 단백질/실에 부착된 항생제 또는 항염증 의약을 가지는 봉합사 재료 또는 창상 피복 시스템의 제조가 가능하다.
본 발명의 변형된 거미 실크 단백질의 가장 바람직한 적용은 의류용 직물(피륙) 및 가죽, 자동차 커버 및 부품, 항공기 건조 재료의 생산 및 처리, 및 종이의 생산 및 처리에 있음은 명백히 유념해야 한다.
본 발명의 변형된 거미 실크 단백질은 셀룰로오스 및 케라틴 및 콜라겐 제품에 첨가될 수 있으며, 따라서 본 발명은 또한 셀룰로오스 및/또는 케라틴 및/또는 콜라겐 및 본 발명의 거미줄 단백질 포함하는 종이 또는 피부 관리 및 모발 관리 제품에 관한 것이다. 본 발명의 단백질이 도입된, 종이 및 피부 관리 및 모발 관리 제품은 개선된 특성, 특히 개선된 인장 강도 또는 인열 강도(tear strength)를 나타낸다.
또한, 본 발명의 변형된 거미 실크 단백질은 직물 및 가죽 제품의 코팅으로 사용될 수 있으며, 그에 따라 코팅된 제품의 안정성 및 내구성을 부여한다. 실크 단백질은 특히 가죽 제품 코팅에 대한 적용성을 보이는데, 이러한 경우, 무두질(tanning) 및 환경에 대한 악영향을 회피하거나 또는 적어도 감소시킬 수 있기 때문이다.
그들은 또한 음식물 포장 또는 전자 기계, 예를 들어 배터리에 사용할 수 있다. 변형된 거미 실크 단백질로 구성된 필름으로 처리된 실험장치는 그들의 배터리산 내에 담굼시 산에 대한 내성, 안정성을 나타냈다.
일곱 번째 면으로서, 본 발명은 상기에서 정의된 변형된 거미 실크 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물을 제공한다.
도 1은 본 발명에서 사용된 클로닝 카세트의 도식화된 구조를 보여준다.
도 2는 본 발명의 DNA 모듈의 다중결합의 예를 도시한 것이다.
도 3은 변형된 거미 실크 단백질의 분석을 나타낸 것이다. 샘플은 환원제(2-머르캅토에탄올)의 존재(+) 및 부재(-) 하에서 분석되었다.
(A) 재조합 실크 단백질의 T7-태크는 항-T7-태그 항체로 웨스턴 블롯하여 검출하였다. (B) 단백질을 SDS-PAGE를 한 후, 은염색(silver staining)을 하였다. (C) 정제된 C16Cc (straight line), NHcys3C16 (long dashes) and CCC]6 (dotted line) 의형광 방출 스펙트럼은 275 nm 또는 295 nm 의 여기(excitation) 파장에서 각각 보여주었다. 295 nm 의 여기는 트립토판 형광의 존재를 확인하는 것이다. 그러므로, 단백질 샘플은 세균 단백질의 어떤 검출가능한 오염도 보이지 않았다.
도 4는 변형된 거미 실크 단백질의 2차 구조 분석을 나타낸 것이다. 20℃에서, CD 스펙트럼 C16 (straight line), C16CC (long dashes), NHCYS3C16 (dots and dashes) 및 CCC16 (dotted line)을 기록했다.
도 5는 변형된 합성 거미 실크 단백질의 응집도를 보여주는 것이다. 단백질의 응집도는 완충용액(buffer)에서 2시간동안 배양시킨 후, (A) 다양한 pH 또는 (B) 인산 칼륨 농도(표 2)에서 측정하였다. C16 에 대한 곡선은 정방형으로, NHCYS3C16 에 대한 것은 원형으로, CC2C16 에 대한 것은 삼각형으로, C16CC2 에 대한 것은 역삼각형으로 표시하였다.
도 6은 변형된 거미 실크 단백질의 어셈블리 형태를 보여주는 것이다. (A) C16 및 변형된 단백질의 구체 형성이 전자현미경(SEM)으로 스캔하여 가시화되었다. (B)나노피브릴이 원자력현미경에의해 가시화되었다. (C) HFIP 내의 1% w/v CC2C16 용액으로부터 주형성형된 필름이다.
도 7은 변형된 거미 실크 단백질로부터 만들어진 단백질 필름의 CD 스펙트럼을 보여준다. (A) HFIP 내의 단백질 용액은 필름 주형성형 전에 분석되었다. (B) 필름은 HFIP로부터 직접적으로 평면 석영 유리 위에 주형성형되었고, CD 분광도를 분석하였다. (C) HFIP로부터 주형성형된 필름의 CD 분석은 메탄올을 처리하여 진행되었다(전형적으로 NHCYS3C16에서 나타남). (D) 포름산으로부터 평면 석영 유리 위에 주형성형된 필름의 분석이다. 명시된 필름 두께의 부정확성 때문에,
MRW 는 측정되지 않았다.
도 8은 NHCYSC16에 대한 Rhodamine Red™ C2 maleimide 의 결합을 나타낸 것이다. 결합된 단백질은 SDS-PAGE로 분석되었다. (A)단백질은 은 염색으로 가시화되었다. (B) 로다민은 형광 이미징으로 가시화되었다.
실험 절차
재료.
화학약품은 다른 기재가 없는 경우, Merck KGaA (Darmstadt, Germany)로부터 입수했다. DNA의 조작 및 변형은 전술한 바와 같이 수행하였다(1). 제한 효소는 New England Biolabs (Beverly, MA, USA)로부터 입수했으며, 리가아제는 Promega Biosciences Inc. (San Luis Obispo, CA, USA)로부터 입수했다. DNA 정제는 Promega Biosciences Inc. (San Luis Obispo, CA, USA)의 키트를 사용했다. 합성 올리고뉴클레오티드는 MWG Biotcch AG (Ebersberg, Germany)로부터 입수했다. 모든 클로닝 단계는 Novagcn (Madison, Wl, USA)으로부터의 대장균(E. coli) 균주 DH10B로 수행했다.
pAZL 벡터내의 변형된 실크 모듈 및 TAG 클로닝.
모듈 Cc (서열번호 10)는 PCR 돌연변이를 통해 생성시켰다. 이때, 주형 뉴클레오티드 서열로서 모듈 C(서열번호 3)를 사용하였고, 프라이머로서 pAZL-fwd (CACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGA)(서열번호 30) 및 pAZLmut-rev (CTCTTAAGCTTTCATTAGCCTGGACCACCTGGACCGTAGCCGCCCGGGCCGCAAGGACCCTGG)(서열번호 31)을 사용하였다. 최적화된 프라이머를 얻기 위해, 원래의 모듈 C (CCA (Pro24)을 CCT (Pro)로, GGT (Gly28)을 GGC (GIy)로, CCT (Pro32)을 CCA (Pro)로, GGC (Gly33)을 GGT로, 및 CCG (Pro35)을 CCA (Pro))로 변이시켰다. 상기 PCR-생산물 및 pAZL 벡터(서열번호 29)는 AIwNI 및 HindIII로 절단 후, 연결(ligatc)시켰다. 모듈 NHCYS3 (GCGG S GGGG S GGGG, ggt tgc ggt ggc tct ggt ggt ggc ggg tcc gga ggc ggt ggc) (서열번호 22)는 두 개의 합성 올리고 뉴클레오티드 N1 (GATCC ATGGGTTGCGGTGGCTCTGGTGGTGGCGGGTCCG GAGGCGGTGGCTAATGAA) (서열번호 32) 및 N2 (AGCTTTCATTAGCCACCGCCTCCGGACCCGCCACCACCAGAGCCACCGCAACCCATG) (서열번호 33)을 어닐링에 의해 생성시켰다. 어닐링은 50 pmol/㎕ (각각) 올리고뉴클레오티드 용액의 온도를 0.1℃/초의 증분(increment)으로 95℃에서 20℃로 감소시켜 수행하였다. 잘못 매치된(mismatched) 이중 가닥은 70℃에서 변성시키고 이어서 다시 20℃로 온도를 감소시켰다. 20℃-70℃-20℃ 사이클을 10회 반복한 후, 65℃의 변성 온도로 추가적인 10사이클을 수행하였다. 얻어진 클로닝 카세트를 BamHI 및 HindIII로 절단된 pAZL(서열번호 29)와 연결(ligatcd)시켰다.
변형된 합성 거미 실크 유전자의 구축.
두 유전자 단편의 연결, 예를 들면 단일 모듈 또는 모듈 다량체는 클로닝 전략의 기초적인 단계를 나타낸다. 이런 목적으로, 디자인된 5'-말단 유전자 단편을 함유하는 pAZL 벡터는 BsaⅠ 및 BsgⅠ로 절단되며, 3'-말단 유전자 단편을 포함하는 벡터는 각각 BseRI 및 Bsal로 절단된다(도 1). 적절한 플라스미드 단편의 연결은 두 유전자 단편을 연결시켰고, 정확한 구조의 식별을 용이하게 하기 위한 pAZL 벡터의 앰피실린 저항성 유전자(Apr)를 재구성을 가능하게 했다.
유전자 구축을 위해, 변형된 모듈 Cc(서열번호 10) 또는 NHCYS3 (서열번호 22)가 C16 같은 반복 단위로 연결시켰다. 이후, 그들을 BamHI 및 HindIII로 pAZL 벡터로부터 잘라내고, T7-tag (MASMTGGQQMGR) (서열번호 34) 코딩 서열을 제공하면서, 마찬가지로 절단된 발현 벡터 pET21a (Novagcn)와 연결시켰다(2). 모든 구조물의 정확도는 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
유전자 발현.
모든 실크 유전자는 대장균(E.coli) 균주 BLR[DE3](Novagcn)에서 발현시켰다. 세포를 LB 배지에서 37℃ 온도로 OD600 = 0.6 내지 0.7로 배양하였다. 1 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactosid) 도입 후, 세포를 NHCYS3C16 및 C16Cc인 경우에는 25 ℃로, CcC16인 경우에는 30 ℃로 각각 되도록 하였다. NHCYS3C16을 발현하는 세포는 도입 3 내지 4시간 후에 수확된 반면, CcC16을 발현하는 세포는 4시간 후에, C16Cc을 발현하는 세포는 5시간 후에 수확되었다.
단백질 정제.
세포를 20 mM N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)(HEPES) pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.2 mg/ml 리소자임(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 함유하는 5ml/g 완충용액으로 재현탁하고, 4℃에서 30분간 배양하였다. 세포는 French Press(Basic Z Model, APV Deutschland GmbH, Lbeck, Germany)를 사용하여 고압으로 파괴하였다. 상온에서 30분간 0.1 mg/ml DNase I (Roche, Mannheim, Germany) 및 3 mM MgCl2와 함께 세포 용해물(lysatc)을 배양함으로써 게놈(genomic) DNA를 분해시켰다. 불용성 세포 단편을 30분간 50,000×g, 4℃에서 침강시켰다. 용해물의 가용성 대장균(E.coli) 단백질은 20분간 80℃에서 가열 변성에 의해 침전시켰다.
침전된 단백질은 30분 동안 50,000×g에서 침강에 의해 제거하였다. 가열 변성 중 가용성이 유지된 실크 단백질은 20% 황산암모늄(800 mM)으로 실온에서 침전시키고, 10분 동안 10,000×g에서 원심분리하여 얻었다. 펠렛은 8M 요소(urea)로 세척하고 6M 구아니디니움 티오시아네이트(GdmSCN)에서 용해하였다. 모든 단백질을 10 mM NH4HCO3에 대해 투석하였다. 투석 중 형성된 침전물은 30분 동안 50,000×g에서 침강에 의해 제거하고, 남아있는 가용성 실크 단백질을 동결건조하였다. 분석에 앞서, 동결건조된 단백질은 6M GdmSCN에서 용해하고, 이어서 적절한 완충용액에 대해 투석하였다. 응집체(aggregatc)들은 30분 동안 125,000×g에서 침강에 의해 제거하였다. 단백질 농도를 계산된 소광 계수(extinction coefficient)를 사용하여 276nm에서 1cm 경로 길이 큐벳에서 광도측정법으로(photometrically) 측정하였다(표 1)(3).
단백질의 동일성(identity)은 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-Pagc; >10% 트리스-글리신 겔)으로 확인하고, 이어서 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(Millipore, Billerica, MA, USA) 위에 블롯팅하고, 1차 항체로 마우스 항-T7 모노클로날 항체(Novagcn, 1:10,000) 및 2차 항체로 항-마우스 IgG 퍼옥시다제 컨주게이트(Sigma-Aldrich, 1:5,000)를 사용하여 검출하였다. 퍼옥시다제 활성은 Amersham Biosciences(Piscataway, NJ, USA)사의 ECLplus 웨스턴 블롯 검출 키트를 사용하여 시각화하였다.
합성 거미 실크의 흡광계수(extinction coefficients)(Gill & Hippel(3)에 따라 계산됨)
형광.
형광 스펙트럼을 FluoroMax 3 Spectrofiuorometer (Jobin Yvon Inc, Edison, NJ, USA)상에 기록하였다. 스펙트럼은 25℃, 10 mM NH4HCO3 또는 10 mM Tris(히드록시메틸)아미노메탄(Tris)/HCl(pH 8.0)에서 측정했다. 적분 시간은 1초, 단계 크기는 0.5nm이고 밴드 폭은 각각 5 nm (흡광) 및 5 nm (방출)이었다.
2차 구조 분석.
온도 조절 장치(Jasco International Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 장착한 Jasco 715 분광편광계를 이용하여 극(far)-UV 원형 광이색성(circular dichroism;CD) 스펙트럼을 얻었다. 스펙트럼은 20℃에서 0.1cm 경로 길이 석영 큐벳 내에 있는 10 mM Tris/HCl(pH 8.0)에서 150 μg/ml의 단백질 농도에서 측정되었다. 스캔 속도는 20 nm/min, 단계 사이즈는 0.2nm이고, 적분 시간(integration time)은 1초, 밴드 폭은 1nm로 설정하였다. 네번 스캔을 평균해서 완충용액에서 수정하였다.
응집도 분석.
각각 다른 pH-값 및 다른 인산 염 농도에서 단백질의 용해도를 측정하기 위해, 동결건조된 단백질을 4℃에서 6M GdmSCN에 용해시키고, 10 mM Tris/HCl (pH 8.0)에 대해 투석시켰다. 모든 샘플을 다른 완충용액(아래 표시)에서 2시간 동안 상온에서 배양하였고, 단백질 침전물은 125,000×g에서 30분 동안 침강에 의해 샘플로부터 제거시켰고, 남아있는 가용성 단백질을 광도측정법으로(photometrically) 측정하였다. 가용성 및 응집된 단백질의 합은 가용성 단백질의 최초 양과 동일하여야 하므로, 응집된 단백질의 백분율은 최초로 사용된 단백질의 양으로부터 가용성 단백질의 양을 제하고 계산하여야 한다. 대조군으서, 단백질을 10mM Tris/HCl(pH 8.0)내에서 배양하였다.
pH-값의 영향성
단백질 용액은 다른 pH(표 2)의 완충용액로 1:10으로 희석했다. 최종 단백질 농도는 NHCYS3C16 및 CCC16의 경우에는 0.2 mg/ml, C16CC의 경우에는 0.174 mg/ml 였다.
다른 pH-값에 따라 사용된 완충용액 시스템
인산 염 농도의 영향성
단백질 용액은 KxHxPO4(pH 8.0)에서 1:5로 희석했다. 최종 단백질 농도는 0.4 mg/ml 였으며, 인산 염 농도는 50mM, 100mM, 200mM, 300mM 및 500mM 였다.
티올
기에 대한
로다민
말레이미드(Rhodamine maleimido)의
결합.
작은 유기 화합물을 변형된 거미 실크 단백질에 결합시키기 위해, 형광 염료 로다민을 단백질 NHCYS3C16에 결합시켰다. DMSO 내의 1mM Rhodamine Red™ C2 maleimide (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands) 저장 용액을 10 mM Tris/HCl (pH 7.5) 내의 단백질용액에 20배 질량으로 첨가했다. 반응은 4°C 암실에서 오버나잇으로 수행했다. 남아있는 비-결합 형광 염료를 불활성화시키기 위해, 100 mM 2-머르캅토에탄올을 크기 배재 크로마토그래피(PDlO columns, Sephadex G 25, Pharmacia Biotcch, Uppsala, Sweden) 전에 반응물에 첨가했다. 분획을 모아 UV-분광계로 단백질의 존재를 검출하고, SDS- Pagc로 최종 분석했다. 단백질 및 형광물질의 가시화는 은 염색(silver staining)하고, Typhoon 9200 Variable Mode Imagcr (Molecular Dynamics, Amersham Pharmacia Biotcch, Uppsala, Sweden)을 사용하여 532 nm의 흡광 파장 및 580nm의 방출 파장 각각에서 형광 이미징함으로써 각각 수행했다.
결과
변형된 합성 거미 실크의 디자인, 합성 및 정제.
정원 거미인 무당 거미(Araneus diadematus)로부터의 드래그라인 실크 단백질 ADF-4 유래의 합성 거미 실크 모듈 C (서열번호 3)에 기초한 다른 변형된 모듈을 생성하였다. 변형은 각각의 변이체들 내에, TAG 또는 모듈 C 내에 하나의 시스테인을 포함한다. 여기서, 위치 25의 세린을 시스테인으로 변이시켰는데, 이는 비슷한 크기 및 두 아미노산 모두 극성을 가지기 때문이다. 더욱이, 이러한 변이에 대한 소수성 예측(prediction)은 모듈 C와 아주 조금 달랐을 뿐만 아니라, 상기 위치는 단백질 특성에 크게 영향을 주지 않을 것으로 생각되었다. 모듈 Cc(서열번호 10) 는 PCR 돌연변이 유발(실험적인 절차 참조)을 사용하여 얻었다. 하기의 단계에서 모듈 Cc의 뉴클레오티드 서열은 단백질 CCC16 및 C16CC을 산출하는 C16 로 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상부 또는 하부에 클로닝 벡터 pAZL (서열번호 29)를 이용하여 클로닝되었다. 게다가, 글리신, 세린 및 하나의 시스테인(NHCYS3, 서열번호 22)으로 구성되는 TAG를 코딩하는 올리고뉴클레오티드는 NHCYS3C16을 생산하기 위한 C16 에 대해 코딩하는 5’ 말단 뉴클레오티드 서열에 클로닝되었다.
세균에 합성한 후에, 가열 단계에 이어 황산암모늄 침전하여 변형된 실크 단백질을 정제하였다. 단백질의 일치는 모든 실크 단백질의 아미노 말단에 끝에 부착된, T7 펩티드 태그 서열에 대한 항체를 사용하여, 면역블롯팅(immunoblotting)으로 확인하였다. 비교로서 비변형된 단백질 C16이 적용되었다. 전체 길이의 단백질 외에도, 저분자량의 단백질 미량이 관찰되었다. C16과 비교했을 때, 각각 하나의 시스테인을 함유하는 모든 변형된 단백질은, 2-머르캅토에탄올 같은 환원제를 샘플에 첨가함으로써 제거될 수 있는 고분자량 위치(Fig. 3A and B "-")에서 부가적인 단백질 밴드를 나타냈다(Fig. 3B "+"). 그러므로 그들은 이황화결합에 의해 연결된 단백질 다이머를 나타낸다. 단백질 정제도는 형광 방출을 측정하여 결정하였다. 275 nm 의 입사광은 여기(excitation) 및 타이로신 및 트립토판의 형광 방출을 야기하였다. 295 nm 의 광은 트립토판만을 여기시켰다. 디자인된 거미 실크 단백질 중 어떤 것도 트립토판을 포함하지 않기 때문에, 295 nm로 여기할 때의 형광 방출은 대장균(E.coli) 단백질의 오염을 나타내는 것일 수 있는데, 평균적으로 1.5%의 트립토판을 함유한다(4). 모든 변형된 실크 단백질 제제의 형광 측정은, 실크 단백질에 풍부하게 나타나는 티로신의 스펙트럼과 유사한 방출 스펙트럼을 나타냈다. 대조적으로, 단백질 제제의 고순도를 나타내는 것은(도 3C) 어떠한 트립토판 형광도 검출되지 않았다. 정제된 단백질의 수율은 배양 배지 리터당 12 내지 30 mg 범위였다.
변형된
C
16
거미
실크는
비 변형된
C
16
와 동일한 2차 구조를 보였다.
2차 구조를 CD 분광법으로 조사하였다. 모든 변형된 단백질은 C16와 비슷한 스펙트럼, 본질적으로 비구조화(unstructured) 단백질의 전형적인 스펙트럼을 그렸다.(도 4)
변형된
C
16
거미
실크는
비 변형된
C
16
보다 인산 및
pH
에 대해 더 민감하다.
pH, 이온, 칼륨, 인산 및 물리적 스트레스는 천연 실크 어셈블리에 관여한다. 본 발명자들은 변형된 단백질 CcC16, C16Cc 및 NHCYS3C16의 응집 작용(behaviour)에 대한 상이한 칼륨 인산 농도 및 다양한 pH 의 영향성을 C16 과 비교하여 조사하였다. 모든 변형된 단백질들은 5.0 이하의 pH값에서 유의한 응집도(>10%)를 보였고, CCC16은 7.0 이하의 pH값에서도 pH 1에서 나타내는 응집도의 70% 이상을 보여주었지만, 이러한 조건에서는 보통의 응집도만을 나타냈다(도 5A). 대조적으로, 칼륨 인산은 낮은 농도에서 변형된 단백질의 응집도를 C16에서 관찰되는 것들보다 더 증가시켰다(도 5B). 그들의 이론상 등전점은 C16와 비교하여, 같거나(NHCYS3C16) 아주 약간 다르기(CCC16은 3.45, C16은 3.48) 때문에, 이러한 변형된 단백질의 응집도에 대한 더 큰 민감성은 단백질의 다른 전하들에 의해 설명되기는 어렵다. 그러므로, 이러한 효과는 시스테인의 존재 및 안정한 다이머를 형성하는 가능성에 기인한 것일 수 있다.
변형된 합성 거미
실크
단백질의 어셈블리
거미 실크 서열 ADF-3 및 ADF-4로부터 유래된 합성 거미 실크 단백질이 구체, 나노피브릴, 발포체, 필름 같은 형태학상 별개의 형태로 어셈블리될 수 있다. 변형된 거미 실크 단백질이 구별되는 어셈블리 거동(behaviour)에 관련하여 같은 특징을 나타내는지 확인하기 위해, 하기의 실험을 수행하였다.
1. 구체(spheres)
10 mM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) pH 8.0 내에서 1 mg/ml 의 CCC16 , C16CC, NHCYS3C16 및 C16 용액에 2.4M 황산암모늄을 첨가하여, 0.3 내지 1.5 μm 범위의 직경을 보이는 단백질 구체를 생성하였다(도 6A). 변형된 단백질 또는 C16 로부터 만들어진 구체들 사이에서 어떤 유의한 차이점도 발견되지 않았다.
2. 나노피브릴
10mM Tris pH8.0, 4℃에서의 CI6CC 및 NHCYS3C16 용액을 상온에서 3일간 배양하여 나노피브릴을 형성하였다(도 6B).
3. 필름
정원 거미인 무당 거미(Araneus diadematus)로부터의 드래그라인 실크 단백질 ADF-4 유래의 합성 거미 실크 단백질로 만들어진 필름은 헥타플루오로-2-프로판올(hexafluoro-2-propanol (HFIP)) 또는 포름산으로부터 주형성형될 수 있다. 동결건조된 단백질을 HIFP 또는 포름산에서 직접적으로 용해시켰다. CI6에서 관찰된 것과 비교하여, HFIP는 변형된 단백질 CCC16, C16CC 및 NHCYS3C16의 2차 구조의 증가를 유도했다. 10mM Tris(pH8.0) 내에서 이러한 단백질의 CD 스펙트럼은, 주로 무작위 코일 단백질의 징후인, 200 nm 이하의 파장에서만 오직 하나를 나타냈지만(도 4), HFIP 내의 단백질 용액은 202 내지 203 nm 및 증가된 α-나선 내용물의 징후인, 220 nm 더 위쪽에서 최소치 스펙트럼을 나타냈다.(도 7)
포름산 뿐만 아니라 HFIP로부터, 변형된 거미 실크 단백질에서 필름을 주형성형할 수 있다. 폴리스티렌 표면에서 필름을 주형성형하였고, 용매 증발 후, 그들은 쉽게 표면이 벗켜질 수 있다(도 6C). 필름의 2차 구조를 분석하기 위해 0.01% w/v 단백질 용액을 석영 유리로 주형성형했다. 용매를 증발시킨 후, 원편광의 2색성이 측정되었다. HFIP로부터 주형성형된 필름은 높은 α-나선 내용물의 징후인, 208 nm 및 220 nm에서 두 개의 최소치 스펙트럼을 나타냈다(도 7). HFIP로부터 주형성형된 필름이 물에 불용성을 나타내어(애즈-주형성형 필름은 이미 물과 함께 용해했다), 필름은 메탄올 처리되었다(5). 이러한 처리 후, 스펙트럼은 β-시트 풍부한 구조에 대해 전형적인, 218 nm에서 하나의 최소치를 보였다(전형적으로 도 7의 NHCYS3C16에서 나타남). 이러한 2차 구조 내 필름의 프로세싱 상의 변화는 이미 합성 거미 실크 필름에 대해 기술되어 있다(5). 흥미롭게도, 포름산으로부터 주형성형된 필름은 단백질 이용에 따른 그들의 2차 구조가 다르다. NHCYS3C16는 C16(5)과 비슷하게 β-시트 풍부 구조(CD 스펙트럼에서 218 nm을 최소치로 가짐)를 나타내는 필름을 만들어냈지만, CCCI6으로부터 만들어진 필름의 스펙트럼은 208 nm 및 220 nm에서 두 개의 최소치를 나타냈다. CI6CC 단백질 필름은 220 nm에서 하나의 최소치 CD스펙트럼을 나타냈다.
4. 변형된 합성 거미 실크의 라벨링
시스테인 또는 라이신에 의한 합성 거미 실크의 변형은 약물, 금속, 폴리펩티드, 양자점(quantum dots) 의 특이적인 결합을가능하게 할 수 있다. 시스테인의 SH-기의 유기 소분자에 대한 결합을 증명하기 위해, 형광색 소분자 로다민을 단백질 NHCYS3C16에 결합시켰다. 로다민은 말레이미드-콘주게이트 형태로 사용되었고, pH 7.0 내지 7.5 에서, 손쉽고 아주 특이적으로 SH-기와 반응했다. 효과적인 결합은 SDS-Pagc 이후, 형광 이미징 및 은 염색하여 가시화했다(도 8).
참고 문헌.
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4. Blattner, F. R., Plunkett, G., Ill, Bloch, C. A., Perna, N. T., Burland, V., Riley, M., Collado-Vides, J., Glasner, J. D., Rode, C. K., Mayhew, G. F., Gregor, J., Davis, N. W., Kirkpatrick, H. A., Goeden, M. A., Rose, D. J., Mau, B., and Shao, Y. (1997) The complete genome sequence of Escherichia coli K-12, Science 277, 1453-1474.
5. Slotta, U., Tammer, M., Kroner, F., Koelsch, P., Scheibel, T. (2006) Structural analysis of spider silk films, Siφromoleciilar chemistry 18, 465-471
본 발명의 변형된 거미 실크 단백질은 이를 포함하는 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물의 형태로 적용시킬 수 있으며, 이외에도 다양한 분야, 특별히 의약, 화장품 및 기술적 응용분야에서 유용하게 이용될 수 있다.
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<151> 2005-08-29
<160> 34
<170> KopatentIn 1.71
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20
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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
1 5 10 15
Pro Gly Gln Gln
20
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Modul C
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Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly
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Gly Gly Pro
35
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Pro Tyr Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Pro Tyr
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Gly Ser
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<213> Artificial Sequence
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Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly
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Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly Pro Gly Gly Tyr
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20
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Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly
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Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly
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Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Lys Asn Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro
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Gly Gly Pro
35
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Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Gly Pro Gly Gly
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Tyr Gly Pro Lys Asn Gln Gly Pro Cys Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro
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Gly Gly Pro
35
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Gly Gly Thr Thr Ile Ile Glu Asp Leu Asp Ile Thr Ile Asp Gly Ala
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Asp Gly Pro Ile Thr Ile Cys Glu Glu Leu Thr Ile
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<213> Artificial Sequence
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Gly Gly Thr Thr Ile Ile Glu Asp Leu Asp Ile Thr Ile Asp Gly Ala
1 5 10 15
Asp Gly Pro Ile Thr Ile Lys Glu Glu Leu Thr Ile
20 25
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<213> Artificial Sequence
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<223> Modul XC
<400> 16
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser
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<211> 18
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<213> Artificial Sequence
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Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Lys Gly Gly Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modul YC
<400> 18
Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Cys Gly Pro Gly Gly Tyr
20 25 30
<210> 19
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modul YK
<400> 19
Gly Pro Gly Gly Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Lys Gly Pro Gly Gly Tyr
20 25 30
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modul NHCYS1
<400> 20
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modul NHCYS2
<400> 21
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modul NHCYS3
<400> 22
Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modul NHLYS1
<400> 23
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modul NHLYS2
<400> 24
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
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<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Modul CHCYS1
<400> 25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Cys Gly
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modul CHCYS2
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Cys Gly
1 5
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modul CHLYS1
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Lys Gly
1 5 10
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modul CHLYS2
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Lys Gly
1 5
<210> 29
<211> 3238
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cloning vector pAZL
<400> 29
tgtcgagaag tactagagga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc 60
tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt 120
tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 180
cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 240
atcttatcat gtctggatct gatcactgct tgagcctagg agatccgaac cagataagtg 300
aaatctagtt ccaaactatt ttgtcatttt taattttcgt attagcttac gacgctacac 360
ccagttccca tctattttgt cactcttccc taaataatcc ttaaaaactc catttccacc 420
cctcccagtt cccaactatt ttgtccgccc acagcggggc atttttcttc ctgttatgtt 480
tttaatcaaa catcctgcca actccatgtg acaaaccgtc atcttcggct actttttctc 540
tgtcacagaa tgaaaatttt tctgtcatct cttcgttatt aatgtttgta attgactgaa 600
tatcaacgct tatttgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa 660
gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 720
ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 780
ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 840
aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 900
gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 960
cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 1020
attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 1080
cgtttacaat ttcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 1140
ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 1200
aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 1260
tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 1320
atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 1380
agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 1440
tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 1500
tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 1560
atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 1620
ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 1680
tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 1740
acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 1800
ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 1860
aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 1920
ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 1980
cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 2040
gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 2100
actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 2160
agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 2220
cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 2280
tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 2340
agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 2400
tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 2460
acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 2520
ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 2580
gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 2640
gtgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 2700
gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 2760
tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 2820
caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 2880
tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 2940
gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg 3000
agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt 3060
gcggtatttc acaccgcaga ccagccgcgt aacctggcaa aatcggttac ggttgagtaa 3120
taaatggatg ccctgcgtaa gcgggtgtgg gcggacaata aagtcttaaa ctgaacaaaa 3180
tagatcgagg aggatccatg ggacgaattc acggctaatg aaagcttact gcacagct 3238
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer pAZL-fwd
<400> 30
cactgagcgt cagaccccgt agaaaaga 28
<210> 31
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer pAZLmut-rev
<400> 31
ctcttaagct ttcattagcc tggaccacct ggaccgtagc cgcccgggcc gcaaggaccc 60
tgg 63
<210> 32
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide N1
<400> 32
gatccatggg ttgcggtggc tctggtggtg gcgggtccgg aggcggtggc taatgaa 57
<210> 33
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic oligonucleotide N2
<400> 33
agctttcatt agccaccgcc tccggacccg ccaccaccag agccaccgca acccatg 57
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T7-tag
<400> 34
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
1 5 10
Claims (47)
- a) 라이신 또는 시스테인 잔기를 포함하지 않는, 서열번호 1, 서열번호 3, 및 서열번호 5 내지 서열번호 7의 모듈로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 5 내지 50개의 모듈로 이루어진 거미 실크 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계;b) 단계 a)의 거미 실크 단백질의 1개 모듈 내의 하나의 세린 및/또는 글루타메이트를 코딩하는 핵산 서열을 하나의 라이신 및/또는 시스테인을 코딩하는 핵산 서열로 교체하여, 변형된 핵산 서열을 얻는 단계, 및선택적으로 라이신 또는 시스테인을 포함하는 서열번호 20 내지 서열번호 24의 아미노 말단 TAG를 코딩하는 핵산 서열을 상기 변형된 핵산 서열에 첨가하거나, 라이신 또는 시스테인을 포함하는 서열번호 25 내지 서열번호 28의 카르복시 말단 TAG를 코딩하는 핵산 서열을 상기 변형된 핵산 서열에 첨가하는 단계;c) 단계 b)에서 얻은 변형된 핵산 서열을 적합한 숙주 내에서 발현하는 단계; 및d) 상기 발현된 변형된 거미 실크 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는, 거미 실크 단백질을 변형시키는 방법.
- a) 라이신 또는 시스테인 잔기를 포함하지 않는, 서열번호 1 내지 서열번호 7의 모듈로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 5 내지 50개의 모듈로 이루어진 거미 실크 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 제공하는 단계;b) 라이신 또는 시스테인을 포함하는 서열번호 20 내지 서열번호 24의 아미노 말단 TAG를 코딩하는 핵산 서열을 상기 단계 a)에서 제공된 핵산 서열에 첨가하거나, 라이신 또는 시스테인을 포함하는 서열번호 25 내지 서열번호 28의 카르복시 말단 TAG를 코딩하는 핵산 서열을 상기 단계 a)에서 제공된 핵산 서열에 첨가하는 단계;c) 단계 b)에서 얻은 변형된 핵산 서열을 적합한 숙주 내에서 발현하는 단계; 및d) 상기 발현된 변형된 거미 실크 단백질을 회수하는 단계;를 포함하는, 거미 실크 단백질을 변형시키는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변형된 거미 실크 단백질 내의 상기 라이신 및/또는 시스테인 분자에 다른 물질을 결합시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 라이신 및/또는 시스테인에 결합되는 다른 물질은 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 마커 분자, 양자점(quantum dots), 금속, 핵산, 지질(lipids) 및 저분자 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 저분자약물은 카르복시, 카르보닐, 이미도 또는 티올기를 포함하는 약물에서 선택되는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제2항에 있어서, 상기 단계 a)에서 제공되는 거미 실크 단백질은 하나 또는 그 이상의 (AQ) 및/또는 (QAQ)을 포함하는 방법으로서, 상기 모듈 A는 서열번호 1의 아미노산 서열이고, 상기 모듈 Q는 서열번호 2의 아미노산 서열인 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 거미 실크 단백질은 (AQ)12, (AQ)24, (QAQ)8 또는 (QAQ)16을 포함하는 방법으로서, 상기 모듈 A는 서열번호 1의 아미노산 서열이고, 상기 모듈 Q는 서열번호 2의 아미노산 서열인 방법.
- 삭제
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단계 a)에서 제공되는 거미 실크 단백질은 C16 또는 C32를 포함하는 방법으로서, 상기 모듈 C는 서열번호 3의 아미노산 서열인 방법.
- 삭제
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 거미 실크 단백질은 Y8, Y16, X8, 또는 X16을 포함하는 방법으로서, 상기 모듈 Y는 서열번호 7의 아미노산 서열이고, 모듈 X는 서열번호 6의 아미노산 서열인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 d)에서 회수되는 변형된 거미 실크 단백질은 서열번호 8 내지 서열번호 19의 모듈 중 하나를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 단계 d)에서 회수되는 변형된 거미 실크 단백질은 서열번호 20 내지 서열번호 24의 아미노 말단 TAG 또는 서열번호 25 내지 서열번호 28의 카르복시 말단 TAG가 부가되는 방법.
- 제1항 또는 제2항의 방법으로 얻을 수 있는 변형된 거미 실크 단백질.
- 삭제
- 제20항의 변형된 거미 실크 단백질을 코딩하는 핵산 서열.
- 제22항의 핵산 서열 및 하나 또는 그 이상의 조절 서열을 포함하는 발현 벡터.
- 제23항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 벡터.
- 제22항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 제23항의 벡터로 형질전환된 숙주.
- 제26항에 있어서, 상기 숙주는 원핵세포인 숙주.
- 제27항에 있어서, 상기 원핵세포는 대장균(E.coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포인 숙주.
- 제26항에 있어서, 상기 숙주는 진핵세포인 숙주.
- 제29항에 있어서, 상기 진핵세포는 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포 또는 곤충 세포인 숙주.
- 제30항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 CHO, COS, HeLa, 293T, HEH 또는 BHK 세포인 숙주.
- 삭제
- 제30항에 있어서, 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 또는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 세포인 숙주.
- 제30항에 있어서, 상기 곤충 세포는 인시류(Lepidoptera) 곤충 세포인 숙주.
- 삭제
- 제30항에 있어서, 상기 식물 세포는 담배, 감자, 옥수수, 완두 또는 토마토로부터 유래된 것인 숙주.
- 제20항의 변형된 거미 실크 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물.
- 제20항의 변형된 거미 실크 단백질로부터 제조된 섬유/실, 필라멘트, 필름, 발포체(foam), 구체(sphere), 나노피브릴, 하이드로겔.
- 제20항의 변형된 거미 실크 단백질을 포함하는 제지 생산물.
- 제20항의 변형된 거미 실크 단백질을 포함하는 섬유 또는 가죽 생산물.
- 제39항의 제지 생산물에 있어서, 상기 변형된 거미 실크 단백질은 코팅제로서 제공되는 것을 특징으로 하는 생산물.
- 제20항의 변형된 거미 실크 단백질을 포함하거나 구성되는 겔 또는 발포체.
- (i) 서열번호 1, 서열번호 3, 및 서열번호 5 내지 서열번호 7의 모듈로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 5 내지 50개의 모듈로서, 상기 하나의 모듈 내의 하나의 세린 및/또는 글루타메이트가 라이신 및/또는 시스테인으로 교체된 모듈; 및(ii) 선택적으로 T7-펩티드 또는 6X-히스티딘 태그 서열;로 구성된,변형된 거미 실크 단백질로서, 상기 변형된 거미 실크 단백질은 추가의 라이신 및/또는 시스테인 잔기를 포함하지 않는 것인, 변형된 거미 실크 단백질.
- 제43항에 있어서, 상기 단백질은 C16CC 또는 CCC16이고, 상기 모듈 C는 서열번호 3의 아미노산 서열이고, 모듈 CC는 서열번호 10의 아미노산 서열인 변형된 거미 실크 단백질.
- (i) 서열번호 1, 서열번호 3, 및 서열번호 5 내지 서열번호 7의 모듈로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 5 내지 50개의 모듈로서, 상기 하나의 모듈 내의 하나의 세린 및/또는 글루타메이트가 라이신 및/또는 시스테인으로 교체된 모듈;(ii) 라이신 또는 시스테인을 포함하는 서열번호 20 내지 서열번호 24의 아미노 말단 TAG, 또는 라이신 또는 시스테인을 포함하는 서열번호 25 내지 서열번호 28의 카르복시 말단 TAG; 및(iii) 선택적으로 T7-펩티드 또는 6X-히스티딘 태그 서열;로 구성된,변형된 거미 실크 단백질로서, 상기 변형된 거미 실크 단백질은 추가의 라이신 및/또는 시스테인 잔기를 포함하지 않는 것인, 변형된 거미 실크 단백질.
- (i) 서열번호 1 내지 서열번호 7의 모듈로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 5 내지 50개의 모듈;(ii) 라이신 또는 시스테인을 포함하는 서열번호 20 내지 서열번호 24의 아미노 말단 TAG, 또는 라이신 또는 시스테인을 포함하는 서열번호 25 내지 서열번호 28의 카르복시 말단 TAG; 및(iii) 선택적으로 T7-펩티드 또는 6X-히스티딘 태그 서열;로 구성된,변형된 거미 실크 단백질로서, 상기 변형된 거미 실크 단백질은 추가의 라이신 또는 시스테인 잔기를 포함하지 않는 것인, 변형된 거미 실크 단백질.
- 제46항에 있어서, 상기 단백질은 NHCYS3C16이고, 상기 모듈 C는 서열번호 3의 아미노산 서열이고, 모듈 NHCYS3는 서열번호 22의 아미노산 서열인, 변형된 거미 실크 단백질.
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