KR101338136B1 - 금 나노입자를 이용하여 신호 증폭도가 향상된, 표적 물질의 다중화 처리 분석법과 그 시스템 - Google Patents

Abstract

금 나노입자를 이용하여 신호 증폭도가 향상된, 표적 물질의 다중화 처리 분석 방법과 그 시스템을 개시한다. 이 표적 물질의 분석 시스템은 지지체, 상기 지지체에 고정되어 있고, 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하는 포획자, 금 나노입자 복합체, 형광 RNA 탐지자 및 리보핵산 분해 효소 H를 포함한다. 이 복합체에서 검출자는 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하는, 상기 포획자와 다른 물질로서 금 나노입자의 표면에 결합하고 있다. 이 금 나노입자의 표면의 다른 영역에는 단일 가닥의 동일한 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결되어 있다. 상기 형광 RNA 탐지자는 이 상기 검출자-금 나노입자 복합체에 고유한 것으로서, 말단에 형광원과 상기 형광원에 대한 소광제가 연결된 단일 가닥의 리보뉴클레오티드를 포함하고, 상기 리보뉴클레오티드는 상기 디옥시리보뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함한다. 시료 속에 상기 포획자 및 상기 검출자의 표적 물질이 존재하면 상기 디옥시리보뉴클레오티드와 상기 리보뉴클레오티드의 혼성화가 일어나고, 이를 리보핵산 분해 효소 H가 가수분해함으로써 형광 억제가 풀려 형광 신호를 발생·증폭시킨다.

Description

금 나노입자를 이용하여 신호 증폭도가 향상된, 표적 물질의 다중화 처리 분석법과 그 시스템{Multiplex Assay for Target Substance With Enhanced Signal Amplification Using Gold Nanoparticles and System for the Same}

본 발명은 다중화 처리가 가능한 표적 물질의 검출 방법과 그 분석 시스템에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 금 나노입자를 이용하여 생분자 등의 표적 물질을 검출·정량하는 새로운 신호 증폭 방법과 그 시스템에 관한 것이다.

질병 등의 진단에 중요한 단서가 되는 생체 분자, 즉 생체 표지(biomarker)는 대부분 체내 또는 시료 속에 아주 낮은 농도로 존재하기 때문에 초고감도(ultra-high sensitivity)의 검출 방법이 필요하다. 바람직한 초고감도 생체 표지 정량 방법은 어느 특정 분자에 국한되지 않고 여러 질병, 여러 시료에 일반화할 수 있고, 고가의 장치나 복잡한 실험 과정을 요하지 않으며, 비선택적 흡착에서 비롯하는 거짓 양성 신호를 제거할 수 있고, 서로 다른 생체 표지에 대한 정량 분석을 동시에 수행할 수 있으며, 이러한 분석에 드는 비용이 과하지 않아야 한다.

현존하는 생체 분자 또는 표지의 측정 방법 중에서 위 기준에 근접하는 것으로는 면역 측정법이 있는데, 면역 측정법은 검출 감도가 매우 민감하고 선택성이 극히 높으며, 시료의 번거로운 전처리를 요하지 않고, 항체를 생성할 수 있는 물질이라면 이론적으로는 무엇이든 분석할 수 있는 일반성 면에서 장점이 있다. 이러한 면역 측정법 중 가장 대표적인 것은 효소 면역 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)이다. 일반적으로 효소 면역 분석법은 효소가 표지된 항체와 이 효소 반응을 통해 발색이 되는 기질을 사용하여 하나의 분석 물질(analyte) 또는 표적 물질(target substance)을 검출하는 과정을 수반한다.

일반적인 면역 분석 방법과 ELISA를 구분 짓는 특징 중의 하나는 효소를 통한 신호 증폭 과정의 유무이다. 대부분의 면역 분석 방법은 효소에 의한 증폭 과정을 거치지 않는다. 그러므로 신호 증폭이 없는 면역 분석 방법은 대개 상대적으로 민감성이 큰 형광 검출을 이용한 분석 방법들이 많다. 형광 신호를 면역 분석에 사용하면 다른 파장 대에서 형광을 내는 형광 물질로 표적 물질을 달리하는 항체들을 표지할 수 있으므로 여러 가지 물질을 동시에 검출해야 하는 다중화 신호 처리(multiplex signal analysis)에 용이하다. 이 때문에 현존하는 다중화 분석 방법은 형광을 이용한 면역 분석법이 주를 이룬다. 한편 ELISA로 다중화 분석을 하기 위해서는 표적 물질마다 다른 효소를 사용하여야 한다. 즉 각 표적 물질마다 항체를 갖추고 여기에 더하여 서로 다른 기질에 선택적으로 반응하여 구별할 수 있는 흡광도 또는 형광 변화를 일으키는 효소들을 갖추어야 한다. 이 때문에 시료 내의 분석 물질의 종류가 늘어날수록 여러 가지 효소-기질 쌍을 발굴하여 이용해야 하는 ELISA는 다중화 분석을 구현하는데 기술적인 어려움이 많다.

효소를 사용하지 않는 다중화 면역 분석 방법 중 가장 널리 알려진 것은 Luminex사에서 개발한 xMAP 기술이다. 이 기술에서는 각기 다른 형광 물질을 포함하는 작은 구슬(microsphere)상에 각각 표적 물질에 고유한 항체를 고정하여 구슬의 형광으로 표적 물질을 분석한다. 하지만 이 방법은 고가의 장비인 흐름 세포 분석기(flow cytometer)가 필요하기 때문에 임신 자가 키트와 같이 소형화·상업화가 비교적 용이한 ELISA에 비해 비용적인 측면에서 비효율적이다. 이와는 별개로, 다중 면역 분석을 하나의 마이크로플레이트(microplate) 상에서 수행할 수 있는 방법이 몇몇 연구 그룹에 의해서 제안된 바 있다. Swarzman 등은 직경 6 μm 정도의 폴리스티렌 구슬에 항-면역글로불린 항체(anti-IgG)를 고정한 뒤 분석 물질의 포획 항체(capture antibody)를 결합시켜 면역 분석에 사용하였다(Anal Biochem. 1999, 271, 143~151쪽). 다중화 분석을 위한 수단으로 이 방법에서는 분석 물질의 검출 항체(detection antibody)에 여러 가지 형광 물질을 부착하여 사용하였다. Nichkova 등은 분석하고자 하는 다수의 물질에 대한 각각의 항체에 각기 다른 파장에서 빛을 발산하는 Qdot들을 연결하여 한 시료 내의 여러 가지 물질에 대한 면역 분석을 형광 세기 분석을 통하여 동시에 수행하는 다중화 형광 면역 분석법(multiplex-FLISA(fluorescence-linked immunosorbent assay))을 보고하였다(Anal Lett. 2007, 40, 1423~1433쪽). 그러나 이들 방법은 효소에 의한 신호 증폭 과정이 없기 때문에 기존의 ELISA 방법에 비해서 검출 한계가 덜 민감하다는 단점이 있다. GenTel사에서는 각각의 항체에 직접적으로 각기 다른 형광 물질을 부착하여 형광 세기를 분석하는 다중 면역 분석 방법을 제공한 바 있다.

효소를 이용한 면역 분석법인 ELISA기반의 다중 분석법으로는, Quansys Biosciences사에서 제공하는 방법이 있는데 이 방법은 96-웰 마이크로플레이트의 한 웰의 바닥에 20 나노리터 부피의 점상 배열(spot array)을 만들어서 한 점이 한 표적 물질에 대한 ELISA 분석 결과를 나타내도록 하였다. 이 방법에서는 과산화효소와 기질의 반응으로 발생한 발광(luminescence) 정도를 정량함으로써 다중 ELISA (multiplex-ELISA) 포맷을 제공한다. 이 방법은 마이크로플레이트 웰 내에 미리 점상 배열작업이 되어 있는 플레이트를 사용해야만 하는 점과 이미지 획득 및 분석을 위하여 고가의 장비가 필요하다는 단점이 있다. 또 다른 다중 ELISA 방법으로는 시료 내의 두 가지 종류의 물질을 분석하기 위해서 알칼리성 인산 분해 효소(alkaline phosphatase)와 과산화효소가 각각 연결된 두 가지 항체를 사용하는 효소 신호 증폭 방법이 있다. 이 방법에서는 두 가지 물질을 동시에 검출하였다(미국 공개 공보 20040241776A1). 이 방법은 원리적인 면에서 다중 ELISA 방법으로 의미가 있으나, 실제 시료 내의 동시 분석 물질의 종류가 둘 이상으로 늘어나면 상기 과산화효소와 인산 분해 효소 외에 독립적인 반응을 촉매하는 효소를 계속적으로 찾아내어야 하는 어려움이 있을 뿐 아니라 찾아내더라도 여러 종류의 효소 사용에 따른 비경제성 문제가 남는다.

요컨대 이 분야에서는 ELISA에서 볼 수 있는 일반성과 우수한 감도, 고가의 분석 장치를 요하지 않는 장점을 유지하면서 여러 종류의 분석 물질을 동시에 정량할 수 있는 다중화 처리 방식의 분석 물질 정량 방법에 대한 수요에 아직까지는 효과적으로 대응하지 못하고 있는 실정이다.

본 발명의 기술적 과제 중 하나는 여러 표적 물질의 다중화 처리가 가능하고 효소 면역 분석법에 비견되는 수준의 감도와 광범위한 적용 가능성, 상대적으로 저렴한 분석이 가능한 다중화 처리 분석 방법을 제공하는 데에 있다. 본 발명의 기술적 과제 중 다른 하나는 이 분석 방법을 위한 분석 시스템을 제공하는 데에 있다.

전술한 기술적 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 한 측면에서는 표적 물질의 검출용 키트를 제공한다. 이 키트는 검출자(檢出子)-금 나노입자 복합체와 상기 검출자-금 나노입자 복합체에 고유한 형광 RNA 탐지자(探知子 probe)를 포함한다. 이 때 이 키트의 검출자-금 나노입자 복합체는 표적 물질에 선택적으로 결합하는 검출자가 금 나노입자의 표면에 결합하고 있고, 또한 상기 복합체 속 금 나노입자의 표면의 다른 영역에는 단일 가닥의 동일한 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결되어 있다. 전술한 형광 RNA 탐지자는 상기 디옥시리보뉴클레오티드에 상보적인 단일 가닥의 리보뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 형광 RNA 탐지자의 이 리보뉴클레오티드 서열은 형광원과 상기 형광원에 대한 소광제(消光劑 quencher)에 연결되어 있다. 한 실시 형태에서, 상기 형광원은 이 리보뉴클레오티드의 어느 한 쪽 말단에, 상기 소광제는 그 반대쪽 말단에 각각 자리잡는다.

원하는 표적 물질이 있는 시료를 이 검출용 키트에 가하고 표적 물질과 검출자의 선택적인 결합이 이루어지면, 형광 RNA 탐지자를 가함으로써 상기 디옥시리보뉴클레오티드 서열과 형광 RNA 탐지자의 리보핵산 서열 사이에 혼성 이중 가닥을 형성할 수 있다. 리보핵산 분해 효소 H(RNase H)로 이 혼성 이중 가닥 내 리보핵산 서열이 가수분해되면 형광 RNA 탐지자 내에서 소광제와 상호작용하고 있던 형광원이 분리되면서 형광 신호를 발할 수 있게 된다. 반면에 리보핵산 분해 효소 H에 의한 리보핵산 서열의 가수분해가 일어나지 않는 상태에서는 소광제의 작용에 의하여 형광 신호가 발생이 억제된다.

이 표적 검출 키트의 한 실시 형태에서는 상기 키트가 서로 종류가 다른 검출자-금 나노입자 복합체들을 함유하기 때문에 상기 복합체들의 종류만큼의 가짓수의 표적 물질들을 동시에 분석할 수 있다. 이러한 복수의 표적 물질 검출용 키트는 서로 종류가 다른 검출자-나노입자 복합체들을 함유하고, 각 종류의 복합체마다 그에 고유한 형광 RNA 탐지자를 함유한다. 이 때 이 표적 검출 키트내 어느 한 검출자-금 나노입자 복합체와 그와 종류를 달리하는 다른 검출자-금 나노입자 복합체 사이에는 서로 검출자들끼리, 또한 서로 디옥시리보뉴클레오티드들끼리 일치하지 아니한다. 그리고 서로 종류가 다른 검출자-금 나노입자들에 각각 고유한 두 형광 RNA 탐지자는 서로 리보뉴클레오티드들끼리, 또한 서로 형광원들끼리 같지 아니하다.

본 발명의 다른 한 측면에서는 표적 물질을 분석하는 시스템을 제공한다. 이 시스템은 지지체, 상기 지지체에 고정되어 있고, 표적 물질에 선택적으로 결합하는 포획자(捕獲子), 전술한 검출자-금 나노입자 복합체, 전술한 형광 RNA 탐지자와 리보핵산 분해 효소 H를 포함한다. 이 분석 시스템에서 상기 포획자는 상기 검출자와 동일하지 않은 물질이다. 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 상기 포획자와 검출자는 동일한 표적 물질에 선택적으로 결합하는 서로 다른 항체이다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에서는 시료 내 표적 물질의 분석 방법을 제공한다. 이 방법은 (1) 검출하고자 하는 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하고, 표면에 고정되어 있는 포획 항체에 상기 시료를 접촉시키는 포획 단계, (2) 전술한 검출자-금 나노입자 복합체에서 검출자가 항체인 검출 항체-금 나노입자 복합체를 상기 포획 단계를 거친 표면에 결합시키는 결합 단계, (3) 상기 결합 단계를 거친 표면을 세척하는 세척 단계, (4) 상기 표적 물질에 고유한 전술한 형광 RNA 탐지자를 상기 리보뉴클레오티드와 상기 디옥시리보뉴클레오티드 사이의 이중 가닥 형성에 적합한 조건 하에서 상기 세척 단계를 거친 표면에 가하는 혼성화 단계, (5) 상기 혼성화 단계를 거친 표면에 RNase H를 가하는 가수분해 단계와 (6) 상기 형광원의 여기 파장대의 빛을 상기 절단 단계를 거친 표면에 조사하고 형광 세기를 측정하는 형광 측정 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 다른 한 가지 측면에서는 표적 물질 농도와 형광 발생 관계의 검량 방법을 제공한다. 이 검량 방법은 (ㄱ) 농도를 알고 있는 상기 표적 물질의 시료 용액을 복수 개 제조하고, 각각의 상기 시료 용액에 대하여 전술한 표적 물질의 분석 방법을 수행하여 형광 측정값을 얻는 단계와 (ㄴ) 상기 형광 측정값과 상기 알고 있는 표적 물질의 농도로부터 검량 곡선을 산출하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 표적 물질은 특별히 한정되지 않는데, 한 구체적인 실시 형태에서는 이 표적 물질이 생체 분자이다.

본 발명의 표적 물질 분석 시스템과 분석 방법을 이용하면 ELISA에 필적하는 감도와 정확성, 재현성을 가지고 복수 표적 물질의 다중화 처리를 할 수 있다. 아울러 본 발명의 표적 물질 분석 시스템과 분석 방법은 어떠한 특정한 설계나 일부 표적 물질들에 국한되지 않고 일반적인 표적 물질들의 다중화 분석이 가능하게 하여 준다.

도 1은 본 발명의 한 실시 형태에 따른, 복수 표적 물질 분석 시스템의 작동 원리를 나타내는 모식도이다. 도 1에서 포획자와 검출자는 표적 물질에 대한 서로 다른 항체이며, 표적 물질인 AFP와 h-FABP에 각각 고유한 RNA 형광 탐지자를 사용하여 구별되는 형광 신호를 발생한다.
도 2는 본 발명의 한 실시 형태에 따른 표적 물질 분석 방법(오른쪽)과 종래 기술의 효소 면역 분석법(왼쪽), 검출자-금 나노입자 복합체 대신 바이오틴화 검출 항체와 스트렙트아비딘을 이용한 RNase H 신호 증폭 방법(가운데)의 구성을 나타낸 모식도이다.
도 3은 미리 농도를 알고 있는 디옥시리보뉴클레오티드와 본 발명에 따른 형광 RNA 탐지자를 배양한 후 이를 RNase H로 절단하여 형광 RNA 탐지자에서 분리된 형광원이 방출하는 형광의 세기를 나타낸, 디옥시리보뉴클레오티드 농도와 형광 세기의 검량 곡선이다.
도 4는 AFP(4a) 또는 h-FABP(4b)를 표적 물질로 하여 그 농도와 검출되는 형광의 세기를 나타내는 정량 곡선이다. 도 4에서 세모는 본 발명의 한 실시 형태에 따른 분석 방법을, 속이 찬 동그라미는 검출자-금 나노입자 복합체 대신 바이오틴화 검출 항체와 스트렙트아비딘을 이용한 RNase H 신호 증폭 방법을, 속이 빈 동그라미는 효소 면역 분석법을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 한 실시 형태에 따른 분석 방법으로 AFP와 h-FABP를 동시에 정량한 표적 물질 농도와 측정된 형광 세기 사이의 정량 곡선을 나타낸다. 도 5에서 동그라미는 AFP를, 세모는 h-FABP를 각각 나타낸다.

이하 본 발명에 대하여 더 상세하게 설명한다. 이하 본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어를 해석하는 데 있어서는, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 반드시 통상적이거나 사전적인 의미로만 한정해서 해석할 것이 아니며, 본 명세서에서 기재하는 바에 따라 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석하여야 한다는 것을 밝혀 둔다.

본 발명은 금 나노입자와 리보핵산 분해 효소 H에 의한 신호 증폭을 이용하여, 하나의 시료 내의 여러 가지 표적 물질을 동시에 분석할 수 있는 분석 방법과 그 표적 분석 시스템에 관한 것이다. 아울러 상기 분석 시스템의 핵심적인 부분을 이루는 표적 검출용 키트도 개시한다.

본 발명의 한 측면에서는 표적 검출용 키트를 제공한다. 이 표적 검출용 키트는 검출자(檢出子)-금 나노입자 복합체(detector-gold nanoparticle complex)와 이 검출자-금 나노입자 복합체에 고유한 형광 RNA 탐지자(探知子)(fluorescent RNA probe)를 포함한다. 그리고 상기 복합체를 이루는 금 나노입자 표면에는 상기 검출자가 결합하고 있는 곳과 다른 영역에 단일 가닥의 동일한 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결되어 있다.

본 발명에서 검출자는 검출자-금 나노입자 복합체의 한 구성 성분으로서, 상기 복합체 내에서 복합체의 일부로 존재하거나 혹은 복합체와 별도로 단독으로 존재할 때 양쪽 모두에서 어떤 표적 물질과 선택적으로, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 물질이다. 예를 들어 검출자는 해당 표적 물질에 대한 항체이거나, 해당 표적 물질을 기질로 하는 효소 또는 효소의 유도체, 해당 표적 물질을 리간드로 하는 수용체, 해당 표적 물질에 선택적으로 결합하는 리간드 등의 소형 유기 분자 등이다.

본 발명에서 분석 대상인 표적 물질은 소형 유기 물질, 무기 물질, 고분자 물질, 금속 이온 등 특별히 한정되지 않는다. 한 실시 형태에서 상기 표적 물질은 생체 분자이다. 생체 분자의 경우, 특이적인 결합(specific binding) 특성을 나타내는 다양한 예가 있으므로, 본 발명의 표적 물질로서 좋은 한 가지 예가 된다. 생체 분자 중에서는 제한이 없고 모든 생체 분자가 가능한데, 일부만 예를 들자면 자가 항체(autoantibody), 리간드, 천연 추출물, 펩티드, 항원, 항체, 항체가 아닌 단백질, 탄수화물, 탄수화물-단백질 접합체(carbohydrate-protein conjugate), 지질, 합성 약물, 천연 약물, 대사체, 유전체, 바이러스 및 바이러스에 의한 생성 물질, 및 세균 및 바이러스에 의한 생성 물질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 표적 물질로서의 생체 분자는 모든 형태의 시료, 예를 들어 세포 용해액(cell lysate), 환자의 혈액 시료, 조직 시료 등과 같은 형태의 시료 속에 단독으로, 혼합물로 또는 다른 여러 표적 물질과 함께 포함될 수 있다.

본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서 상기 표적 물질은 항체의 항원이다.

표적 물질의 효과적인 분석을 위하여 본 발명의 한 바람직한 실시 형태에서 상기 표적 물질은 고정된다. 이러한 표적 물질의 고정은 표적 물질 자체를 고상의 표면에 직접 고정하는 경우나 상기 표적 물질을 어떠한 매개체를 통하여 고상의 표면에 고정하는 경우를 망라한다. 고상의 표면에 시료를 고정화하는 전처리를 하여 이용할 수도 있다. 한 실시 형태에서 이 매개체는 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하고, 상기 검출자와 다른 물질로서, 상기 고상의 표면에 고정된 물질이다. 이를 위하여 상기 고상의 표면을 개질할 수도 있다. 표적 물질의 고정 수단은 특이적인 것이 바람직하지만, 본 발명의 검출자-금 나노입자 복합체가 표적 물질에 선택적, 바람직하게는 특이적으로 결합할 수 있는 이상, 반드시 특이적인 것일 필요는 없다. 고상의 표면에 표적 물질을 고정하는 방식은 표적 물질과 표면, 혹은 개질 표면 사이에 공유결합을 형성하거나, 비공유결합(예를 들어, 수소결합 등 분자간 힘을 이용한 결합)을 이용하여 고정하는 방식 어느 쪽이든 무방하다.

표적 물질이 고정되면 본 발명의 검출자-금 나노입자 복합체가 표적 물질과의 결합을 통하여 마찬가지로 고정될 수 있으므로, 이러한 복합체의 고정 처리 후 세척을 통하여 비선택적인 결합이나 흡착물 등을 제거할 수 있어서 거짓 양성 반응(false positives)을 크게 줄일 수 있는 이점이 생긴다. 고정된 표적 물질을 사용하면 용액상의 시료에 표적 물질이 혼합물 형태로 존재할 때와 비교하여 체액 등의 액체 시료 진단에 특히 효과적일 수 있다. 체액 등의 생체 시료 용액에는 리보핵산 분해 효소(RNase)가 있을 수 있어 상기 복합체 내의 디옥시리보뉴클레오티드와 특이적으로 결합하였는지 여부와 상관 없이 형광 RNA 탐지자를 절단하여 거짓 양성 신호를 낼 수 있기 때문이다.

상기 검출자는 금 나노입자와 복합체를 이루는 조건 하에서 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 상기 선택적인 결합은 반데르바알스 인력, 정전기적 인력, 수소 결합, 염다리 형성과 같은 비공유결합이거나 이황화결합(disulfide linkage)과 같은 공유결합일 수 있다. 특이적인 상호작용, 예를 들어 수소 결합으로 결합하거나, 고도로 선택적인 화학 반응에 의하여 결합할 수 있는 표적 물질과 검출자라면 어느 것이나 본 발명의 적용 대상이 된다. 본 발명의 한 실시 형태에서는 상기 검출자의 표적 물질에 대한 선택적인 결합이 비공유결합이다. 전술한 표적 물질에 대한 검출자의 조합의 예를 일부만 들자면, 항원과 항체, 기질(및 그 유도체)과 효소(및 효소 유도체), 효소와 억제제, 리보자임과 기질, 비펩티드 소형 유기 물질과 그 결합 단백질, 상보적인 핵산의 쌍, 압타머(aptamer)와 이 압타머가 결합하는 표적 분자, 수용체와 그 리간드, 핵산 서열과 상기 핵산 서열을 인식하는 결합 단백질, 펩티드 서열과 상기 펩티드 서열을 인식하는 결합 단백질이 있다.

본 발명의 키트의 한 실시 형태에서 상기 검출자는 표적 물질에 대한 항체이다. 본 발명의 키트의 한 실시 형태에서 상기 검출자는 항체가 아닌 단백질이거나 소형 유기 분자이다. 예를 들어 바이오틴(biotin)과 아비딘(avidin) 같이 소형 리간드와 그 단백질 수용체의 경우처럼 소형 유기 분자를 표적 물질로 삼고, 검출자는 그에 특이적으로 결합하는 비항체 단백질일 수 있다. 물론 표적 물질을 비항체 단백질로, 검출자를 소형 유기 분자로 하는 구성도 가능하다. 예를 들어FKBP12 단백질과 소형 유기 분자인 면역 억제제 타크롤리무스(tacrolimus)의 조합, 사이클로필린(cyclophilin) 단백질과 약물인 사이클로포린(cyclosporin), 글루타티온(glutathione)과 글루타티온-S-전달 효소(glutathione S-transferase)의 조합이 있다. 나아가 후술할 포획자까지 확장할 수 있는 예로서, FKBP12 단백질과 소형 유기 분자 라파마이신(rapamycin) 그리고 라파마이신-FKBP12 복합체에 결합하는 라파마이신 표적 단백질(target-of-rapamycin, TOR)과 같은 3중쌍도 들 수 있다.

혹은 본 발명의 다른 실시 형태에서는 크라운 에테르(crown ether) 또는 크립탄드(cryptand)와 그에 특이적으로 결합하는 양이온처럼 표적 물질이 무기 이온이고, 검출자가 유기 분자로 구성될 수도 있다. 또한 효소와 그 비가역적 억제제(irreversible inhibitor)의 경우(예를 들어, 사린 등의 유기인 화합물과 아세틸콜린에스테르 분해효소(acetylcholinesterase))처럼 검출자와 표적 물질 사이에 특이적 화학 반응이 일어나 공유 결합을 통하여 서로 연결되도록 구성할 수도 있다.

본 발명의 검출 키트의 다른 실시 형태에서는 상기 검출자가 당 분자이거나 핵산이다.

전술한 여러 조합의 각 쌍에서 검출자와 표적 물질이 그 쌍을 이루는 두 물질 중 어느 것에 해당하는지는 상기 각 쌍을 설명한 순서에 좌우되지 않는다. 즉 예를 들어 수용체와 리간드의 조합이라고 하면 수용체가 검출자일 수도 있고 리간드가 검출자일 수도 있다. 이 분야의 평균적 기술자라면 전술한 진술 순서에서 비용과 복합체 제조에 필요한 화학 반응 등의 현실적인 기술 수단의 제약, 원하는 검출 감도와 정확성 등의 조건에 따라 적절한 조합을 구체적으로 선택할 수 있다.

본 발명에서 금 나노입자란 나노미터 규모의 지름을 가지는 금의 입자로서, 본 명세서에서 후술하는 바와 같이 그 표면이 개질될 수 있다. 이 금 나노입자는 후술하는 검출자와 결합하여 검출자-금 나노입자 복합체를 제조할 수 있다. 금 나노입자를 사용하면 신호를 증폭하는 여러 가지 수단을 사용하기가 편리하여진다. 그리고 금 나노입자는 좁은 입자 크기 분포로 쉽게 제조할 수 있을 뿐 아니라 그 표면에 신호 전달용 분자를 많이 결부지을 수 있어서 분석 방법의 감도를 높일 수 있다.

본 발명에서 금 나노입자의 형상과 크기는 특별히 제한되지 않으며 이 분야에서 통상적으로 사용되는 형상과 크기이면 적당하다. 또한 본 발명의 검출자-금 나노입자에 쓰이는 금 나노입자는 이 기술 분야에서 흔히 사용되는 방법으로 제조할 수 있고, 그러한 통상적인 입자 크기 분포와 형상의 분포를 지니는 것이면 적당하다. 예를 들어 금 나노입자는 구형일 수 있다. 예를 들어 금 나노입자의 크기는 평균 약 2 nm 내지 약 100 nm의 범위에 있을 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서 상기 금 나노입자의 크기는 약 5 nm에서 약 50 nm 범위일 수 있다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 금 나노입자의 크기는 약 10 nm에서 약 30 nm 범위일 수 있다. 상기 금 나노입자의 크기는 나노입자의 형상에 따라 적절히 정의할 수 있는데, 예를 들어 금 나노입자가 구형이면 그 지름이 크기가 되며, 금 나노입자가 비구형이면 가장 긴 축의 칫수(dimension)로 정의할 수 있다.

본 발명 검출 키트의 한 구체적인 실시 형태에서 상기 검출자-금 나노입자 복합체 속의 금 나노입자는 구형이다. 더욱 구체적인 실시 형태에서 이 구형 금 나노입자는 평균 지름이 약 5~30 nm이다.

상기 검출자-금 나노입자 복합체 내에서 검출자는 금 나노입자에 결합(association)되어 있다. 이 검출자와 금 나노입자의 결합을 위한 상호작용은 공유결합일 수도 비공유결합일 수도 있다. 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는 상기 검출자가 복합체의 금 나노입자에 공유결합이 아닌 인력성 상호작용(attractive interaction)으로 결합하고 있다. 이러한 비공유결합의 인력성 상호작용은 예를 들어 흡착일 수 있다. 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서, 상기 검출자는 항체이고, 복합체 내에서 금 나노입자에 공유결합이 아닌 인력성 상호작용으로 결합하고 있다. 금 나노입자 표면에 항체가 인력성 상호작용으로 결합하는 것은 이 분야에서 잘 알려져 있으므로 여기서 상술하지 않는다.

본 발명의 상기 검출자-금 나노입자 복합체를 이루는 금 나노입자에는 그 표면에 검출자가 결합되어 있는 것 외에, 이 검출자와 결합하고 있지 않은 표면의 다른 영역에서 디옥시리보뉴클레오티드가 연결되어 있다. 본 발명의 검출 키트에서 이러한 디옥시리보뉴클레오티드는 각 검출자마다 고유한 염기 서열을 지니므로 표적 물질에 선택적으로 결합하는 검출자와 함께 본 발명의 검출자-금 나노입자 복합체가 표적 물질마다 고유한 것이 되도록 식별하여 주는 바코드와 같은 역할을 한다. 이렇게 검출자마다 고유한(따라서 결국 표적 물질마다 고유한) 디옥시리보뉴클레오티드가 존재하는 덕택에 본 발명은 복수의 표적 물질들에 대한 동시 다중화 분석이 가능하다. 아울러 이러한 디옥시리보뉴클레오티드는 후술하는 형광 RNA 탐지자와 DNA-RNA 혼성 가닥을 형성하므로 RNase H에 의한 절단과 형광 신호 발생을 위한 조건을 형성한다.

한 실시 형태에서 본 발명의 검출자-금 나노입자 복합체의 디옥시리보뉴클레오티드는 금 나노입자 표면에 연결되기 위하여 천연 뉴클레오티드에 존재하지 않는 작용기를 더 지닐 수 있다. 그리고 상기 디옥시리보뉴클레오티드는 이 작용기와 디옥시리보뉴클레오티드 염기 서열 사이를 연결하기 위한 연결부를 더 포함할 수 있다. 한 실시 형태에서 상기 복합체의 금 나노입자 표면은 전술한 연결용 작용기로 개질할 수 있다. 예를 들어 디옥시리보뉴클레오티드의 한 쪽 말단에 티올기 등 금 나노입자 표면을 개질하여 결합을 형성하는 것으로 알려진 작용기를 설치할 수 있다. 예를 들어 이 티올기는 알킬렌티올기의 형태로 디옥시리보뉴클레오티드의 염기 서열에 직접 또는 상기 연결부를 통하여 상기 디옥시리보뉴클레오티드에 이어질 수 있다. 이 경우에 디옥시리보뉴클레오티드는 금 나노입자의 표면과 금(Au)-황(S) 결합으로 연결된다.

한 구체적인 실시 형태에서 상기 디옥시리보뉴클레오티드의 연결부는 알킬렌기, 에테르기, 아릴렌기, 아랄킬렌기, 알카릴렌기 중에서 선택하는 작용기를 포함할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 상기 디옥시리보뉴클레오티드의 연결부가 에틸렌글리콜 반복 단위를 포함한다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서는 이 연결부가 반복 단위 수 6~18인 폴리에틸렌글리콜이다.

본 발명의 검출자-금 나노입자 복합체에서 상기 디옥시리보뉴클레오티드 염기 서열의 길이는 "바코드" 역할을 할 수 있는 길이 이상이어서 식별력을 부여할 수 있고 형광 RNA 탐지자와 RNase H의 활성 조건 하에서 DNA-RNA 혼성 이중 가닥을 형성할 수 있는 길이이면 무방하며 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어 염기 서열의 길이는 뉴클레오티드 수로 6~20개이면 적당하다. 더 구체적으로 염기 서열의 길이는 뉴클레오티드 수로 10 내지 15개인 것이 적당하다. 염기 서열이 뉴클레오티드 수로 6개 미만이면 식별력이 떨어지거나, 혼성 이중 가닥 형성이 원활하지 않을 우려가 있고, 20 개를 넘어도 식별력과 혼성 이중 가닥 형성이 더 향상되는 효과는 20개인 경우와 비교하여 미미하다.

그리고 금 나노입자와 디옥시리보뉴클레오티드가 연결되는 곳의 인접성 때문에 RNase H 작용에 방해를 받는 반응 저해 효과를 방지하기 위하여, 상기 디옥시리보뉴클레오티드는, 형광 RNA 탐지자와 혼성화하는 부위 이외에, 5' 말단에 5 내지 50개, 바람직하게는 10개 내지 30개의 염기 (A, T, C, 또는 G)가 반복된 염기 반복 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이 때, G 반복 서열의 경우에는 G-4중 나선(G-quadruplex)와 같이 원치 않는 이차 구조를 형성하여 효소 반응을 저해할 우려가 있으므로, 상기 염기 반복 서열은 A, T 또는 C만으로 이루어진 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 검출자-금 나노입자 복합체를 이루는 금 나노입자 표면의 디옥시리보뉴클레오티드 밀도는 금 나노입자 하나 당 1개 이상이면 형광 신호의 효과적인 증폭과 표적 물질의 농도에 선형적으로 또는 선형에 가깝게 비례하는 형광 신호 발현이 가능하고 밀도가 높을수록 형광 신호의 증폭이 커진다. 둘 이상의 디옥시리보뉴클레오티드를 표면에 함유하여 신호의 증폭도를 더욱 크게 할 수 있다.

본 발명의 표적 물질 검출 키트에서 형광 RNA 탐지자는 상기 복합체와 짝을 이루며, 상기 검출자-금 나노입자 복합체 내 디옥시리보뉴클레오티드의 염기 서열에 상보적인 단일 가닥 리보뉴클레오티드 서열을 포함한다. 형광 RNA 탐지자는 따라서 적절한 조건 하에서 상기 디옥시리보뉴클레오티드와 DNA-RNA 혼성 이중 가닥(hybrid)을 형성할 수 있다. 또한 형광 RNA 탐지자는 상기 리보뉴클레오티드에 소광제와 형광원이 연결되어 있어 평소에는 형광원이 여기 파장을 받아도 형광을 발하지 못하지만 상기 리보뉴클레오티드 서열이 파괴되어 소광제와 형광원이 분리되면 형광 신호를 방출하는 신호 발생 장치와 센서의 역할도 맡고 있다. 이러한 리보뉴클레오티드 서열의 파괴는 DNA-RNA 혼성 이중 가닥에서 리보뉴클레오티드 부분을 가수분해하는 리보핵산 분해 효소 H(RNase H)를 이용하여 달성할 수 있다. 형광 RNA 탐지자의 리보뉴클레오티드 서열은 어느 한 검출자-금 나노입자 복합체에 고유한 것으로서, 결국 표적 물질마다 고유한 서열을 가지도록, 그리고 그에 따라 표적 물질보다 다른 형광 파장을 발하도록 설계할 수 있다.

본 발명의 한 실시 형태에서 형광 RNA 탐지자에 연결된 형광원과 소광제는 각각 리보뉴클레오티드를 사이에 두고 양 말단에 자리잡는다. 예를 들어 형광원이 형광 RNA 탐지자의 리보뉴클레오티드 서열의 5'말단쪽에 자리잡으면 소광제는 3'말단쪽에 자리잡을 수 있다.

본 발명의 형광 RNA 탐지자에서 형광원으로는 이 분야에서 통상적으로 쓰이는 것을 사용하면 무방하며, 특별한 제약이 없다. 적절한 형광원의 예를 일부만 들자면 쿠마린(coumarin) 계열(예컨대 7-히드록시쿠마린, 4-메틸-7-히드록시쿠마린 등), 잔텐(xanthene) 계열(예컨대, ROX, TET, Texas Red, 플루오레세인(fluorescein), 테트라메틸로다민 등), 시아닌(cyanine) 계열 (예컨대, Cy3, Cy5 등), 보디피(Bodipy) 계열 (예컨대 Bodipy FL, Bodipy 530, Bodipy R6G, Bodipy TMR 등), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 계열 (예컨대, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 532등), 및 다이라이트 플루오르(DyLight Fluor) 계열의 형광원 (예컨대, DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 750, DyLight 800등)들 중에서 선택할 수 있다.

본 발명의 형광 RNA 탐지자에서 소광제로는 이 분야에서 통상적으로 쓰이는 것으로서, 채택한 형광원의 발광을 효과적으로 억제할 수 있는 것이면 무방하며, 특별히 제한되지 않는다. 서로 다른 형광원을 사용하는 두 형광 RNA 탐지자는 작용 파장대가 겹치는 한도 내에서 동일한 소광제를 사용할 수도 있다. 상기 소광제의 예를 일부만 들자면 댑실(dabsyl)화물, QSY 계열 물질(예컨대, QSY-35, QSY-7, QSY-9, QSY-21등), BHQ 계열 물질(예컨대, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3등) 및 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 물질(예컨대, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 등)로 이루어진 군에서 선택할 수 있다.

본 발명의 한 실시 형태에서는 복수의 표적 물질을 동시에 정량하기 위하여 서로 종류가 다른 검출자-금 나노입자 복합체들을 사용하고, 그에 따라 각 복합체마다 고유한 형광 RNA 탐지자를 채택할 수 있다. 이 때 상기 검출자-금 나노입자들끼리 서로 종류가 다르다는 것은 종류를 달리하는 임의의 두 검출자-나노입자 복합체끼리 비교하였을 때 검출자들끼리 동일하지 아니하며, 또한 서로 디옥시리보뉴클레오티드들끼리도 같지 아니하다는 것을 의미한다. 그리고 서로 종류가 다른 두 검출자-금 나노입자 복합체들이 있으면 각각의 종류에 고유한 두 형광 RNA 탐지자 사이에서 서로 리보뉴클레오티드 서열이, 그리고 형광원들끼리 일치하지 아니한다. 전술한 검출자, 디옥시리보뉴클레오티드 서열, 리보뉴클레오티드 서열과 형광원들은 종류를 달리하는 두 복합체 또는 두 탐지자 사이에서 일치하지 않을 뿐더러 잘못된 양성 신호를 발생할 수 있는 핵산 가닥들의 교차 혼성화(cross-hybridization)나 형광원들끼리의 파장 겹침이 일어나지 않도록 충분한 식별력, 즉 서열의 차이나, 파장의 차이가 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 측면에서는 상기 검출용 키트의 검출자-금 나노입자 복합체와 형광 RNA 탐지자를 포함하는 표적 물질의 분석 시스템을 제공한다.

이 분석 시스템은 지지체, 상기 지지체에 고정되어 있고, 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하는 포획자(捕獲子), 전술한 검출자-금 나노입자 복합체, 전술한 형광 RNA 탐지자와 리보핵산 분해 효소 H(RNase H)를 포함한다. 본 발명의 표적 물질 분석 시스템에서 상기 포획자는 상기 검출자와 동일하지 않은 물질이다.

본 발명에서 포획자는 표적 물질에 대하여 선택적으로, 바람직하게는 특이적으로 결합하는 물질로서 특별한 제한이 없으며, 검출자와 동일한 표적 물질에 결합할 수 있되, 검출자와 동일하지 않은 물질로서 지지체에 고정될 수 있는 것이면 무방하다. 본 발명의 한 실시 형태에서 상기 포획자는 표적 물질에서 검출자와 다른 영역에 선택적으로 결합한다.

본 발명의 표적 물질 분석 시스템에서 분석할 수 있는 표적 물질은 앞서 표적 물질 검출 키트에 대하여 설명한 것과 동일하다.

본 발명의 표적 물질 분석 시스템에서 포획자에 관해서는 앞서 표적 물질 검출 키트의 검출자에 대하여 설명한 것이 그대로 적용된다.

예를 들어, 상기 표적 물질과 포획자의 조합 또는 상기 포획자와 표적 물질의 조합은 항원과 항체, 기질과 효소, 효소와 억제제, 리보자임과 기질, 비펩티드 소형 유기 물질과 그 결합 단백질, 상보적인 핵산의 쌍, 압타머와 그 표적 분자, 수용체와 그 리간드, 핵산 서열과 상기 핵산 서열을 인식하는 결합 단백질, 펩티드 서열과 상기 펩티드 서열을 인식하는 결합 단백질이 될 수 있다. 본 발명의 한 실시 형태에서 상기 포획자는 표적 물질에 대한 항체이다.

본 발명의 표적 물질 분석 시스템에서 지지체는 포획자를 고정할 수 있는 고정면을 제공한다. 이러한 지지체와 포획자 덕택에 액상 시료 내 표적 물질을 고정하여 전술한 바와 같이 거짓 양성 신호 발생을 방지할 수 있다. 본 발명에서 상기 지지체는 고상으로서 그 표면에 포획자를 공유결합 또는 비공유결합을 통하여 고정시킬 수 있는 것이 특징이다.

본 발명의 분석 시스템에서 상기 지지체의 소재로는 통상적인 재료, 즉 유리, 실리콘, 금속, 반도체 또는 플라스틱을 사용할 수 있다. 한 실시 형태에서 상기 지지체는 고체 기반의 면역 분석법에 통상적으로 사용되는 모든 고체 지지체일 수 있다. 예를 들어 기존의 ELISA 방법에서 널리 쓰이는 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 웰(well)을 지지체로 사용할 수 있는데, 예컨대, 모양에 따라 납작 바닥 플레이트(flat bottom plate), U자형 바닥 플레이트(U bottom plate). 리간드 혹은 단백질의 코팅 유무에 따라서 아비딘 피복 플레이트, 스트렙트아비딘 피복 플레이트(streptavidin-coated plate), 글루타티온 피복 플레이트, 항-글루타티온-S-전달 효소(anti-GST) 피복 플레이트 등이 있고, 기판 재질에 따라 폴리스티렌 플레이트, 폴리프로필렌 플레이트 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 포획자를 지지체에 고정시키는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 고상 면역 분석 방법에 통상적으로 사용되는 모든 방법이 가능하다. 예컨대, 본 발명의 한 구체적인 실시 형태에서는 지지체에 포획자를 코팅하는 방법으로 고정시킬 수 있다.

본 발명 분석 시스템의 한 실시 형태에서는 시료가 상기와 같은 표적 물질을 포함하는지 여부를 살펴 보거나 또는 시료 내 표적 물질의 농도를 측정하는데 시료에 대한 어떤 (전)처리도 요하지 않는다. 즉 분석을 위한 시료의 (전)처리의 필요가 없이 시료를 있는 그대로 사용되거나 단지 적당한 완충 용액에 시료를 희석하는 전처리만으로 곧바로 분석할 수 있다. 예를 들어 표적 물질이 항체이고 검출자가 그에 대한 항원인 경우, 표적 물질이 리간드이고 검출자가 그 수용체인 경우 등이 그러하다.

본 발명의 분석 시스템에서 RNase H는 세포에서 추출하여 정제된 형태이거나 재조합 단백질의 형태로 발현 및 정제 된것을 사용할 수 있다. RNase H의 몇 가지 예로, 대장균에서 유래한 RNase H(gene accession number: V00337, coding region: 243-707, protein accession number: CAA23620)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

복수의 표적 물질을 동시에 다중화 분석하기 위해서 상기 분석 시스템은 표적 물질의 종류 이상의 서로 다른 포획자, 그에 따른 검출자-금 나노입자 복합체, 이 복합체에 따른 형광 RNA 탐지자를 함유할 수 있다. 즉 포획자, 검출자 및 디옥시리보뉴클레오티드의 각각은 상기 표적 물질의 종류에 따라 달라지며, 표적 물질을 달리 하는 포획 항체들끼리, 검출자들끼리, 검출자와 포획자 사이, 디옥시리보뉴클레오티드끼리, 리보뉴클레오티드끼리는 상이하다. 이렇게 함으로써 구별할 수 있는 어느 한 파장대의 형광 신호의 세기는 어느 한 표적 물질의 양에만 비례하도록 설계할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서는 시료 내 표적 물질의 분석 방법을 제공한다. 이 분석 방법은

(가) 검출하고자 하는 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하고, 표면에 고정되어 있는 포획 항체에 상기 시료를 접촉시키는 포획 단계;

(나) 상기 포획 항체와 상이한 부위에서 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하는 검출 항체가 금 나노입자의 표면에 결합하고 있는 검출 항체-금 나노입자 복합체로서, 상기 금 나노입자의 표면의 다른 영역에 서로 동일한 단일 가닥의 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결되어 있는 검출 항체-금 나노입자 복합체를 상기 포획 단계를 거친 표면에 결합시키는 결합 단계;

(다) 상기 결합 단계를 거친 표면을 세척하는 세척 단계;

(라) 상기 디옥시리보뉴클레오티드에 상보적인 단일 가닥 리보뉴클레오타이드 서열을 포함하는 형광 RNA 탐지자로서, 그 한 쪽 말단에 형광원과 그 반대쪽 말단에 상기 형광원에 대한 소광제를 포함하는 형광 RNA 탐지자를 상기 리보뉴클레오티드와 상기 디옥시리보뉴클레오티드 사이의 이중 가닥 형성에 적합한 조건 하에서 상기 세척 단계를 거친 표면에 가하는 혼성화 단계;

(마) 상기 혼성화 단계를 거친 표면에 RNase H를 가하는 뉴클레오티드 가수분해 단계; 및

(바) 상기 형광원의 여기 파장대의 빛을 상기 절단 단계를 거친 표면에 조사하고 형광 세기를 측정하는 형광 측정 단계를 포함한다.

상기 (가)와 (나) 단계는 본 발명의 분석 시스템을 적용하는 표적 물질의 분석 방법에서 포획자와 검출자가 모두 항체인 특수한 경우로 볼 수 있다.

도 1은 본 발명의 분석 방법의 한 구체적인 실시 형태를 설명하는 모식도이다. 이 실시 형태는 두 가지 표적 물질을 동시에 분석할 수 있도록 표적 물질마다 고유한 검출자-금 나노입자 복합체, 디옥시리보뉴클레오티드와 형광 RNA 탐지자를 갖추고 있다. 도 1에서 검은색 가로 막대로 나타낸 지지체 상에는 해당 표적 물질에 대한 항체인 포획자(포획 항체)가 고정되어 있고, 이 포획 항체가 고정되어 있지 않은 지지체의 표면은 비특이적인 결합을 예방하기 위하여 억제 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)으로 피복될 수 있다. 도 1에서 BSA라고 쓰인 타원이 소 혈청 알부민을 나타낸다. 도 1의 분석 시스템에서 표적 물질은 알파 페토단백질(alpha fetoprotein, AFP)과 심장 지방산 결합 단백질(heart fatty acid binding protein, h-FABP)로서, 각각 해당 포획 항체 속에 포획된 것으로 묘사되어 있다. 도 1의 분석 시스템은 AFP와 h-FABP에 대하여 구별되는 파장대의 형광 신호(그림의 제 1 형광과 제 2 형광)를 방출하는 형광 RNA 탐지자(제 1 형광 RNA 탐지자와 제 2 형광 RNA 탐지자)를 사용하며, 이러한 형광 RNA 탐지자와 상보적인 디옥시리보뉴클레오티드들(제 1과 제 2 디옥시리보뉴클레오티드)을 갖추고 있다. 포획 항체에 표적 물질이 선택적으로 결합하면 포획 항체와 표적 물질의 결합체가 지지체 위에 고정된다. 이 결합체를 본 발명에 따른 검출자-금 나노입자 복합체로 검출할 수 있다. 도 1에서 검출자는 포획자와 마찬가지로 항체인 검출 항체이다. 검출 항체가 결합하고 있는 금 나노입자(붉은색 구)의 표면에는 디옥시리보뉴클레오티드의 단일 가닥들이 뻗쳐 있다. 도 1에 나타낸 실시 형태에서 이 디옥시리보뉴클레오티드는 도 1의 왼쪽 가운데 확대도에서 볼 수 있듯이 검출 항체-금 나노입자 복합체의 금 나노입자에 금-황 결합으로 연결되어 있다. 본 발명의 더 구체적인 한 실시 형태에서 이러한 디옥시리보뉴클레오티드는 염기 서열-연결부-알킬렌티올 작용기의 구조를 취할 수 있는데, 예를 들어 에틸렌글리콜 반복 단위를 6개 지니는 폴리에틸렌글리콜을 연결부로 사용할 수 있다.

상기 검출자-금 나노입자 복합체가 포획자로 고정된 표적 물질에 결합하면 비특이적으로 결합한 물질들을 지지체에서 세척하여 씻어낼 수 있다.

본 발명의 분석 방법의 한 실시 형태에서는 이처럼 어느 한 쪽 말단에 지니는 티올기를 통하여 검출자-금 나노입자 복합체에 연결된 디옥시리보뉴클레오티드에 환원제를 가함으로써 나노입자와 디옥시리보뉴클레오티드 사이의 금-황 결합을 끊는 단계를 더 둘 수 있다. 이렇게 금-황 결합이 끊어지면 상기 디옥시리보뉴클레오티드는 검출 항체-금 나노입자 복합체로부터 떨어져 나오게 된다. 이 디옥시리보뉴클레오티드의 환원 처리는 상기 (마)의 뉴클레오티드 가수분해 단계 전후 또는 동시에 이루어질 수 있다. 즉 환원제 처리로 디옥시리보뉴클레오티드를 금 나노입자 표면에서 (마) 단계 전에 떼어내면 금 나노입자 또는 금 나노입자 표면에 연결된 인근의 디옥시리보뉴클레오티드에 의하여 형광 RNA 탐지자와의 혼성화나 RNase H 가수분해가 방해받는 것을 방지할 수 있다. 한편으로 (마) 단계의 RNase H 부가 후 금 나노입자로부터의 디옥시리보뉴클레오티드 방출이 이루어질 수도 있다. 또 한편으로 RNase H 처리, DNA-RNA 혼성 가닥 형성과 디옥시리보뉴클레오티드 방출이 동시에 일어나도록 할 수도 있다.

도 1의 금 나노입자의 윗 부분에 화살표로 처리한 DTT는 환원제인 디티오트레이톨(dithiothreitol)의 약자로서 이러한 환원제 처리를 가리킨다. 타낸다. DTT의 예를 들었지만 디옥시리보뉴클레오티드 절단을 위한 환원제로는 디티오트레이톨(dithiothreitol), β-메르캅토에탄올 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

환원제 처리로 금 나노입자 표면에서 방출된 디옥시리보뉴클레오티드는 형광 RNA 탐지자 와 혼성 이중 가닥을 형성할 수 있다. 이 때 상기 형광 RNA 탐지자의 농도는 측정할 수 있는 형광 신호를 발생하는 수준이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 값도 취할 수 있다. 전형적인 경우라면 예를 들어 RNA 탐지자의 농도가 100 nM 이상이면 적당하다. 전술한 디옥시리보뉴클레오티드와 형광 RNA 탐지자의 혼성 이중 가닥은 형광 RNA 탐지자에 표지된 형광원이 같은 탐지자 내에 표지되고, 상기 형광원에 가깝게 위치한 소광제로 인하여 형광이 소멸(quenching)되어 있는 상태이다. 여기에 RNase H와 같이 서열 특이성이 없는 RNA 분해 효소(도 1에서 조각을 잘라낸 파이 모양)를 가하면, 혼성 이중 가닥 내의 RNA 부위의 가수분해 반응이 촉발되며, 형광 물질과 소광제는 서로 떨어져 나가게 된다. 상기 RNA 분해 효소는 적절한 완충 용액과 함께 사용하여 활성화할 수 있으며, 이 때 사용 가능한 완충 용액은 이 발명이 속하는 기술 분야에 통상적으로 알려진 것을 사용할 수 있다.

즉 충분한 양의 RNase H로 충분한 반응 시간 동안 상기 혼성 이중 가닥을 처리하면 증폭된 형광 신호를 얻을 수 있다. 도 1에서 오른쪽과 왼쪽 위 부분의 순환 회로 표시가 RNase H에 의한 형광 신호 증폭 순환을 나타낸다. 각 검출자-금 나노입자 복합체에 존재하는 복수의 디옥시리보뉴클레오티드로부터 다수의 혼성 이중 가닥이 형성될 것이며, RNase H가 이 혼성 가닥을 가수분해할 때마다 형광이 발생한다. 형광 RNA 탐지자를 충분히 가하여주면 이 같은 혼성화-RNA 가수분해-발광의 순환이 도 1에 나타낸 것처럼 되풀이되면서 형광 신호가 증폭된다.

검출자에 결합된 표적 물질의 양이 시료 내 표적 물질의 양과 비례하기 때문에 세척이나 분리 등의 방법으로 비특이적인 결합을 제거하면 전술한 혼성 이중 가닥 형성량이 시료 내 표적 물질량에 비례하게끔 만들 수 있다. 요컨대 RNase H 처리에 의하여 얻는 형광 신호 세기가 시료 내 표적 물질량에 비례하도록 할 수 있으므로 본 발명의 검출 키트로 시료 내 표적 물질의 정량도 가능하다.

본 발명의 한 실시 형태에서는 환원제 처리에 의한 디옥시리보뉴클레오티드의 상기 결합 절단 단계를 상기 (라)의 혼성화 단계 전에 수행한다. (라)의 혼성화 단계와 (마)의 RNase H 부가와 환원제 처리가 동시에 일어날 수도 있다.

본 발명의 더 구체적인 실시 형태에서는 상기 (라) 단계의 형광 RNA 탐지자 부가와 (마) 단계의 RNase H의 부가는 동시에 일어날 수 있다. RNase H의 효소 작용 완충액에 형광 RNA 탐지자를 포함시켜 리보뉴클레오티드의 절단과 DNA-RNA 혼성화가 동시에 일어나도록 할 수 있다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서는 상기 형광 RNA 탐지자, RNase H 및 환원제의 부가가 동시에 일어날 수 있다. 즉 RNase H의 효소 작용 완충액에 형광 RNA 탐지자와 환원제를 모두 포함시켜 가할 수 있다.

본 발명의 분석 방법은 전술한 (다)의 세척 단계 외에 추가 세척 단계를 두어 더 정확한 검출을 꾀할 수 있다. 예를 들어

(ㄱ) 상기 포획 단계와 상기 결합 단계 사이,

(ㄴ) 상기 혼성화 단계와 상기 가수분해 단계 사이,

(ㄷ) 상기 가수분해 단계와 상기 측정 단계 사이 중 어느 한 곳 이상에 세척 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 측면에서는 표적 물질 농도와 형광 발생 관계의 검량 방법을 제공한다. 이 검량 방법은

(1) 농도를 알고 있는 상기 표적 물질의 시료 용액을 복수 개 제조하고, 각각의 상기 시료 용액에 대하여 전술한 표적 물질의 분석 방법을 수행하여 형광 측정값을 얻는 단계와

(2) 상기 형광 측정값과 상기 알고 있는 표적 물질의 농도로부터 검량 곡선을 산출하는 단계를 포함한다.

[실시예]

이하 제조예와 실험예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 아래 실시예는 본 발명을 예시로써 상세하게 설명하기 위한 것이며, 어떠한 경우라도 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도가 아니다.

본 발명의 분석 방법을 검증하기 위하여 알파 페토단백질(alpha fetoprotein, AFP)과 심장 지방산 결합 단백질(heart fatty acid binding protein, h-FABP)을 표적 물질로 하고, 검출자를 이들 단백질에 대한 단일 클론 항체로 하는 본 발명의 한 실시 형태에 따른 분석 방법으로 분석하였다.

AFP와 항AFP 단일 클론 항체는 미국 Fitzgerald사(매사추세츠 주 액튼 소재)에서 구입하였고, h-FABP와 항h-FABP 단일 클론 항체는 미국 Meridian Life Science사(테네시 주 멤피스 소재)에서 구입한 것을 사용하였다. 포획자로는 상기 단일 클론 항체들 중에서 10C-CR1007M4(AFP용)와 H01314M(h-FABP 용)을, 검출자로는 10C-CR1007M5(AFP 용)와 H01315M(h-FABP 용)을 이용하였다.

<제조예 1> 검출자-금 나노입자 복합체의 제조

검출자를 항AFP 단일 클론 항체 또는 항h-FABP 단일 클론 항체로 하여 복합체를 제조하였다. 10 nm 크기의 금 콜로이드 1 mL(영국 카디프 소재 British Biocell International사)를 해당 단일 클론 항체 14 μg과 함께 실온에서 30분 동안 가볍게 흔들어 주면서 배양하였다. Tween 20 세제와 pH 8.0의 인산염 완충액(phosphate buffer)을 최종 농도가 각각 0.05%와 10 mM이 되도록 가하여 준 다음, 4℃에서 이 금 나노입자에 100 μM의 5'말단 티올화 디옥시리보뉴클레오티드 100 μL를 가볍게 흔들어 주면서 가하여 표면을 개질하였다. 이 5'말단 티올화 디옥시리보뉴클레오티드는 5'말단 티올기와 디옥시리보뉴클레오티드 서열 사이에 에틸렌글리콜 단위가 6개 삽입된 연결부를 가지고 있었으며, 그 서열은 AFP 검출용이 5'-AGCGTTGTAG-3'이고 h-FABP 검출용이 5'-AGCGTTGTAG-3'이었다.

1시간 배양한 이 금 나노입자 용액에 5 M NaCl 20 μL를 가한 다음, 4°C에서 밤새 동안 가볍게 흔들어 주었다. 상기 표면 개질된 검출자-금 나노입자 복합체에 10% 소 혈청 알부민(BSA) 100 μL를 가하여 한 시간 동안 안정화시켰다. 이어서 이 용액을 4°C, 18,000×g에서 50분 동안 원심분리한 후 상층액은 들어내었다. 이러한 원심분리 과정을 반복하고 최종 펠렛을 0.1% BSA를 함유하는 트윈 20 함유 인산 완충 용액(Phosphate buffer) 1 mL 속에 현탁하였다. 금 나노입자의 농도는 흡광도로 측정하였다(파장 522 nm, 흡광도 계수 1.024×10⁸ M^-1cm^-1).

<제조예 2> 형광 RNA 탐지자의 제조

형광 RNA 탐지자는 바이오니어사(대전 소재)에서 합성하였다. AFP용 형광 RNA 탐지자는 5'말단에 형광원으로 테트라메틸로다민(TAMRA)을, 3'말단에 소광제로 미국 Biosearch Technologies사의 Black Hole Quencher 2(BHQ2)(등록 상표)를 지닌 5'-TAMRA-CCCAUAGAGU-BHQ2-3'을 사용하였고, h-FABP용 형광 RNA 탐지자로는 5'말단에 형광원으로 Cy5를, 3'말단에 소광제로 BHQ2를 지닌 5'-Cy5-CUACAACGCU-BHQ2-3'을 사용하였다.

<제조예 3> 검출자-금 나노입자 복합체의 디옥시리보뉴클레오티드 수 측정

디옥시리보뉴클레오티드가 연결된 검출자-금 나노입자 복합체에서 한 금 나노입자의 표면에 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드의 수를 RNase H 반응을 이용하여 측정하였다.

100 μL의 RNase H 반응 용액(제조예 2의 형광 RNA 탐지자 100 nM, Protector RNase 억제제(PRI)(독일 만하임 소재 Roche사) 0.4 단위, RNase H 6 단위, Tris-HCl 40 mM, MgCl₂ 4 mM, DTT 10 mM, BSA 0.003%, pH 7.7) 속에 연속 계열로 희석한 디옥시리보뉴클레오티드 또는 금 나노입자 복합체를 37°C에서 15분 동안 배양한 다음 Appliskan(미국 매사추세츠 주 월탄 소재 Thermo Scientific사)으로 형광 세기를 측정하였으며, TAMRA와 Cy5에 맞춰 여기/발광 필터를 각각 544/589와 590/675 nm에 설정하였다. 방출된 디옥시리보뉴클레오티드 농도는 이 표준 선형 검량 곡선으로부터 구하였다. 금 나노입자 당 평균 뉴클레오티드의 수는 상기 디옥시리보뉴클레오티드의 농도를 금 나노입자 농도로 나누어 얻었다.

도 3은 제조예 3의 실험 결과로 산출한 검량 곡선이다. 이 검량 곡선은 미리 농도를 알고 있는 디옥시리보뉴클레오티드와 형광 RNA 탐지자에 대하여 RNase H 절단 반응을 수행하여 그 형광 세기를 측정하여 얻었다. 이 검량 곡선을 이용하여 실제 검출자-금 나노입자 복합체에 결합하고 있는 디옥시리보뉴클레오티드의 수를 알 수 있는데, 상기 복합체로부터 환원제 처리 등의 방법으로 형광 RNA 탐지자와 디옥시리보뉴클레오티드의 혼성 이중 가닥을 분리해 낸 후 RNase H에 반응시켜 나오는 형광의 세기를 측정한 다음, 이 형광 세기에 해당하는 디옥시리보뉴클레오티드 농도를 검량 곡선으로부터 추정함으로써 구할 수 있다. 제조예 1에서 얻은 평균 크기 10 nm 의 금 나노입자 표면에 5' 황 원자와 금의 공유결합으로 연결된 디옥시리보뉴클레오티드의 수는 금 나노입자 당 약 75개였다.

전술한 바대로 제조한 검출자-금 나노입자 복합체를 이용한 본 발명의 한 실시 형태에 따른 표적 물질 분석 방법과 종래 기술의 ELISA및 참고예로서 검출자-금 나노입자 복합체가 없이 검출자와 RNase H를 이용하는 신호 증폭 분석 방법을 비교하였다. 도 2는 이 비교 실험에 사용된 세 방법의 구성을 나타낸 모식도이다. 상기 검출자-금 나노입자 복합체가 없이 검출자와 RNase H를 이용하는 신호 증폭 분석 방법(도 2의 가운데, "참고예 분석 방법")은 검출자-금 나노입자 대신 스트렙트아비딘에 바이오틴화 검출 항체와 바이오틴화 디옥시리보뉴클레오티드가 연결된 복합체를 사용하였다. 위 세 가지 방법에서 검출 신호는 모두 형광 신호의 세기로 측정하였다.

검출자 -금 나노입자 복합체를 이용한 분석

Maxisorp Black(상표) 96-웰 마이크로플레이트(미국 Thermo Scientific사)의 웰 마다 해당 포획자(10C-CR1007M4(AFP용)와 H01314M(h-FABP 용))의 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS) 용액(2 μg/mL) 100 μL를 가하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 각 웰을 인산 완충 식염수(300 μL)로 3회 세척하고, 200 μL의 차단 완충액(blocking buffer)을 가한 다음 실온에서 1시간 동안 배양하였다. Tween 20 함유 인산 완충 식염수(PBST)(PBS속 0.05% Tween 20) 100 μL로 3회 세척한 다음, 농도를 달리하는 표적 물질(0, 12.5, 25, 50, 100, 200 pg/mL)을 분석 완충액(PBST 속의 BSA 1%) 속에 용해시킨 용액 100 μL를 웰마다 가하고 1시간 동안 배양하였다. 이 마이크로플레이트를 PBST로 세척(3×300 μL)하고 나서 분석 완충액에 희석한 검출자-금 나노입자 복합체를 가하고(최종 흡광도 0.025, 최종 농도 약 320 pM) 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 세척(3×300 μL)한 다음, 분석 완충액에 희석한 형광 RNA 탐지자 100 μL를 가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. PBST로 세척(3×300 μL)한 다음, RNase H 반응 용액 100 μL를 가하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 형광의 세기는 Appliskan(미국 매사추세츠 주 월탄 소재 Thermo Scientific사)로 측정하였는데, 여기/방출 필터 설정은 544/589와 590/675 nm로 하였다. 모든 분석은 3중 반복 실험하였다.

<비교예 1> ELISA 실험

투명한 Maxisorp 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 3 μg/mL의 포획 항체(10C-CR1007M4(AFP용)와 H01314M(h-FABP 용)) 100 μL를 가하고 4°C에서 밤새 배양한 다음 인산 완충액으로 세척(3×300 μL)하였다. 포획 항체로 피복한 웰에 차단 완충액(PBS 속 3% BSA) 200 μL를 가하고 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 이를 300 μL의 PBST로 3회 세척하였다. 다양한 농도(0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 ng/mL)로 표적 물질을 희석한 분석 완충액(PBST 속 0.05% Tween 20) 100 μL씩 웰에 가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서 플레이트를 PBST(3×300 μL)로 세척하고 나서 바이오틴화 검출 항체 100 μL(분석 완충액 희석 3 μg/mL)를 가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 바이오틴화 검출 항체는 PBS로 희석한 1 mg/mL 검출 항체 70 μL 를 20 mM EZ-Link NHS-PEG12-바이오틴(미국 일리노이 주 록포드의 Thermo Scientific사) 0.7 μL와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하고, 이를 같은 회사의 Zeba Spin 제염 컬럼(분자량 배제점 40 kDa)으로 정제하여 얻었다. 바이오틴화 검출 항체의 농도는 Bradford 분석으로 정량하였다(미국 캘리포니아 주 허큘리스의 Bio-Rad사 Bradford 분석 용액). 이어서 마이크로플레이트의 PBST 세척(3×300 μL) 후 분석 완충액으로 2 μg/mL로 희석한 스트렙트아비딘-양고추냉이 과산화효소(streptavidin-HRP, 영국 캠브리자 Abcam사) 100 μL를 가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이 마이크로플레이트를 PBST(3×300 μL)로 더 세척하고 웰마다 100 μL의 TMB 기질 용액(미국 텍사스 주 바커의 GenDepot사)을 가하고 실온에서 10분 동안 배양하였다. TMB 반응 종료 용액(미국 텍사스 주 바커의 GenDepot사) 100 μL를 웰마다 가한 뒤 곧바로 96-웰 마이크로플레이트 판독기(미국 캘리포니아 주 서니베일의 Molecular Devices 사 SpectraMax Plus(상표))로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

<참고예 1> 검출자-금 나노입자 복합체가 없는 RNase H 신호 증폭 실험

검출자-금 나노입자 복합체가 없는 RNase H 신호 증폭 실험은 상기 분석 완충액으로 희석한 검출자-금 나노입자 복합체(최종 흡광도 0.025) 대신 바이오틴화 검출 항체, 스트렙트아비딘과 바이오틴화 디옥시리보뉴클레오티드를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 진행하였다.

구체적으로 상기 실시예 1의 표적 물질의 분석 완충액 용액 부가와 PBST 세척 후에 검출자-금 나노입자 복합체 대신 분석 완충액에 희석(3 μg/mL)한 바이오틴화 검출 항체 100 μL를 웰에 가하고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 바이오틴화 검출 항체는 비교예 1과 동일한 바이오틴화 검출 항체를 사용하였다. 이어서 PBST로 세척(3×300 μL)하고 나서 분석 완충액으로 희석(2 μg/mL)한 스트렙트아비딘 100 μL를 가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 스트렙트아비딘은 Sigma-Aldrich사 S4762 제품을 사용하였다. PBST로 세척(3×300 μL)하고나서 분석 완충액으로 희석한 바이오틴화 디옥시리보뉴클레오티드(200 nM) 100 μL를 가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 이 바이오틴화 디옥시리보뉴클레오티드는 전술한 제조예 1의 5'-말단 티올화 디옥시리보뉴클레오티드와 염기 서열은 동일하되, 그 구조에서 티올기가 바이오틴으로 바뀌었다는 점에서 다르다. 이어서 RNase H 절단 이하는 실시예 1과 같이 실시하였다.

AFP 또는 h-FABP 중 어느 한 표적 물질만의 분석에 관하여 상기 세 방법을 비교한 결과를 도 4와 도 5에 정리하였다. 도 4는 실험에 투입한 표적 물질의 농도와 검출되는 형광의 세기의 상관 관계를 나타낸다. 도 4a는 AFP를, 도 4b는 h-FABP를 각각 표적 물질로 하여 형광 세기를 측정한 결과이다. 도 4에서 세모는 본 발명의 한 실시 형태에 따른 실시예 1의 분석 결과, 속이 찬 동그라미는 검출자-금 나노입자 복합체 대신 바이오틴화 검출 항체와 스트렙트아비딘을 이용한 참고예 1의 RNase H 신호 증폭 방법을, 속이 빈 동그라미는 비교예 1의 효소 면역 분석법을 나타낸다. 도 4a에서 볼 수 있듯이 실시예 1의 본 발명에 따른 표적 물질 분석 방법은 종래 기술의 ELISA나 참고예 1의 방법과 마찬가지로 표적 물질의 농도에 형광 신호 세기가 선형 비례하였다. 도 4a에서 이러한 선형 비례 구간은 약 12.5 pg/mL에서 약 200 pg/mL였다. 그리고 이와 같은 선형 비례 관계는 도 4b에서도 볼 수 있었다.

도 4a와 4b에 나타난 데이터를 바탕으로 각 방법에 따른 검출 한계(limit of detection)를 비교하면 표 1과 같다.

표 1에 나타낸 결과로부터 본 발명의 한 실시 형태에 따른 분석 방법이 종래 기술의 ELISA보다는 70~100배 정도, 본 발명과 동일한 RNase H 신호 증폭에 의존하지만 금 나노입자를 사용하지 않는 참고예보다는 50~150배 정도 더 민감하다는 것을 알 수 있다.

검출자 -금 나노입자 복합체를 이용한 표적 물질의 다중화 분석

본 발명의 분석 방법으로 AFP와 h-FABP 두 표적 물질을 동시에 분석할 수 있는지 시험하였다. AFP와 h-FABP의 포획 항체를 함께 마이크로플레이트에 고정시켰고, 이들 각각에 대한 검출자-금 나노입자 복합체를 함께 사용한 것을 제외하면 실시예 1의 단일 표적 물질 분석 방법과 동일하게 실험하였다.

도 5는 실시예 2에 따른 형광 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5에서 동그라미는 AFP를, 세모는 h-FABP를 각각 나타낸다. 도 5의 데이터로부터 두 표적 물질을 본 발명의 분석 방법으로 동시에 분석하는 경우에도 형광 신호가 농도에 양호하게 선형 비례하는 것을 확인할 수 있다.

복수 표적 물질에 대한 다중화 분석을 하였을 때와 단일 표적 물질 분석시에 검출 한계가 달라지는지를 살펴 보기 위하여 도 5의 실험 결과로부터 검출 한계를 측정하였다. 그 결과는 표 2에 정리하였다.

표 2에 나타낸 결과는 본 발명의 표적 물질 분석 방법으로 여러 표적 물질을 동시에 다중화 분석하는 경우에도 해당 표적 물질만을 단일 분석하는 경우와 비슷한 수준의 감도를 발휘할 수 있다는 것을 보여준다.

사람 혈청 시료의 분석

본 발명의 분석 방법의 정밀도와 정확도를 평가하기 위하여 사람 혈청 시료 속의 AFP와 h-FABP를 다중화 분석하였다. 정밀도의 지표로는 백분율 변동 계수(percent coefficient of variation, %CV)를, 정확도의 지표로는 백분율 회수도(percent recovery)를 사용하였다. 건강한 사람의 혈청에 AFP와 h-FABP를 각각 1, 3, 9 ng/mL씩 가한 첨가 시료(spiked sample) 18개를 제조하여 실시예 2의 방법으로 동시에 분석하였다. 사람 혈청 시료에 대하여 측정한 AFP와 h-FABP의 정밀도와 정확도를 각각 표 3과 표 4에 정리하였다.

표 3에서 볼 수 있듯이 본 발명의 분석 방법은 백분율 변동 계수가 측정한 모든 농도에서 AFP와 h-FABP 양쪽에 대하여 10% 미만이었다. 이는 본 발명의 분석 방법의 정밀도가 임상 진단용으로 사용하기에 적당하다는 것을 가리킨다.

백분율 회수도로 나타낸 본 발명의 분석 방법의 정확도는 101.2%에서 106.1% 범위로서 실제 분석 용도로 사용하는데 적당한 정확도를 나타내었다(표 4).

상기 실시예와 비교예 결과로부터 본 발명의 표적 물질 분석 방법을 사용하면 감도, 정확도와 분석의 재현성을 희생하지 않고도 복수 표적 물질의 다중화 분석이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 바와 같이 특정 내용과 일부 실시예를 들어 본 발명을 설명하였으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 구체적인 예로써 제시한 설명일 뿐임을 밝혀 둔다. 본 발명은 전술한 실시 형태들로만 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 실시 형태에 대하여 다양한 수정 및 변형을 할 수 있고, 이러한 수정 및 변형도 본 발명의 기술 사상 속에서 망라하고 있다.

따라서 앞에서 설명한 실시 형태들과 후술하는 특허 청구의 범위는 물론, 이 특허 청구 범위의 모든 균등물이나 등가인 변경 실시 형태들도 본 발명 기술 사상의 범주에 속한다.

Claims (25)

1. 항체-금 나노입자 복합체와
   상기 항체-금 나노입자 복합체에 고유한 형광 RNA 탐지자(探知子 probe)를 포함하는 표적 물질의 검출용 키트로서,
   상기 키트의 항체-금 나노입자 복합체는 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하는 항체가 금 나노입자의 표면에 결합하고 있고, 또한 상기 금 나노입자의 표면의 다른 영역에는 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드가 결합하고,
   상기 형광 RNA 탐지자는 말단에 형광원과 상기 형광원에 대한 소광제(消光劑 quencher)가 연결되고 리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드는 상기 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함하는 표적 검출 키트.
2. 제 1항에 있어서, 상기 표적 검출 키트는 서로 종류가 다른 항체-금 나노입자 복합체들을 함유하고, 상기 항체-금 나노입자 복합체의 종류마다 그에 고유한 형광 RNA 탐지자를 함유하며,
   이 때 상기 표적 검출 키트내 어느 한 항체-나노입자 복합체와 그와 종류를 달리하는 다른 항체-나노입자 복합체 사이에는 서로 항체들끼리, 또한 서로 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드들끼리 일치하지 아니하고,
   상기 서로 종류가 다른 항체-금 나노입자들에 각각 고유한 두 형광 RNA 탐지자는 서로 리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드들끼리, 또한 서로 형광원들끼리 같지 아니한 것을 특징으로 하는 표적 검출 키트.
3. 제 1항에 있어서, 상기 표적 물질은 상기 항체에 특이적으로 결합하는 항원인 것을 특징으로 하는 표적 검출 키트.
4. 제 1항에 있어서, 상기 표적 물질과 항체의 조합은 항원과 항체인 것을 특징으로 하는 표적 검출 키트.
5. 제 1항에 있어서, 상기 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드는 어느 한 쪽 말단에 티올기를 지니고 있으며, 티올기를 통하여 상기 금 나노입자 표면에 금-황 결합으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 표적 검출 키트.
6. 제 1항에 있어서, 상기 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 부위와 티올기 사이에 알킬렌기, 에테르기, 아릴렌기, 아랄킬렌기, 알카릴렌기 중에서 선택하는 작용기를 포함하는 연결부가 존재하는 것을 특징으로 하는 표적 검출 키트.
7. 제 6항에 있어서, 상기 연결부는 에틸렌글리콜 유래 반복 단위인 것을 특징으로 하는 표적 검출 키트.
8. 제 1항에 있어서, 상기 형광원은 쿠마린(coumarin) 계열, 잔텐(xanthene) 계열, 시아닌(cyanine) 계열, 보디피(Bodipy) 계열, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 계열, 및 다이라이트 플루오르(DyLight Fluor) 계열의 형광원들로 이루어진 군에서 선택하는 것을 특징으로 하는 표적 검출 키트.
9. 제 1항에 있어서, 상기 소광제는 댑실(dabsyl)화물, QSY 계열 물질, BHQ 계열 물질 및 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 물질로 이루어진 군에서 선택하는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출 키트.
10. 제 1항에 있어서, 상기 항체는 상기 금 나노입자에 공유결합이 아닌 인력성 상호작용으로 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출 키트.
11. 제 1항에 있어서, 상기 금 나노입자는 구형이며, 평균 지름이 5 내지 30 nm인 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출 키트.
12. 제 11항에 있어서, 상기 금 나노입자 표면은 상기 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드가 나노입자 하나 당 둘 이상 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 표적 물질 검출 키트.
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 시료 내 표적 물질의 분석 방법으로서,
    검출하고자 하는 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하고, 표면에 고정되어 있는 포획 항체에 상기 시료를 접촉시키는 포획 단계;
    상기 포획 항체와 상이한 부위에서 상기 표적 물질에 선택적으로 결합하는 검출 항체가 금 나노입자의 표면에 결합하고 있는 검출 항체-금 나노입자 복합체로서, 상기 금 나노입자의 표면의 다른 영역에 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드가 결합한 검출 항체-금 나노입자 복합체를 상기 포획 단계를 거친 표면에 결합시키는 결합 단계;
    상기 결합 단계를 거친 표면을 세척하는 세척 단계;
    상기 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 리보뉴클레오타이드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형광 RNA 탐지자로서, 그 한 쪽 말단에 형광원과 그 반대쪽 말단에 상기 형광원에 대한 소광제를 포함하는 형광 RNA 탐지자를 상기 리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드와 상기 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드 사이의 이중 가닥이 형성될 수 있는 조건 하에서 상기 세척 단계를 거친 표면에 가하는 혼성화 단계;
    상기 혼성화 단계를 거친 표면에 RNase H를 가하는 리보뉴클레오티드 가수분해 단계; 및
    상기 형광원의 여기 파장대의 빛을 상기 가수분해 단계를 거친 표면에 조사하고 형광 세기를 측정하는 형광 측정 단계를 포함하는 표적 물질의 분석 방법.
18. 제 17항에 있어서, 상기 디옥시리보뉴클레오티드가 복수 개 연결된 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드는 어느 한 쪽 말단에 티올기를 지니고 있고, 이 티올기를 통하여 상기 금 나노입자 표면에 금-황 결합으로 연결되며,
    상기 분석 방법이 상기 가수분해 단계 전에 환원제 처리로 상기 금-황 결합을 끊는 절단 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 분석 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 절단 단계를 상기 혼성화 단계 전에 수행하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 분석 방법.
20. 제 17항에 있어서, 상기 형광 RNA 탐지자와 RNase H의 부가는 동시에 일어나는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 분석 방법.
21. 제 18항에 있어서, 상기 형광 RNA 탐지자, RNase H와 환원제의 부가는 동시에 일어나는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 분석 방법.
22. 제 18항에 있어서, 상기 환원제는 디티오트레이톨(dithiothreitol), β-메르캅토에탄올 및 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 분석 방법.
23. 제 17항에 있어서, 아래 (ㄱ) 내지 (ㄷ) 중 적어도 한 곳에 상기 표면을 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 분석 방법:
    (ㄱ) 상기 포획 단계와 상기 결합 단계 사이,
    (ㄴ) 상기 혼성화 단계와 상기 가수분해 단계 사이,
    (ㄷ) 상기 가수분해 단계와 상기 측정 단계 사이.
24. 제 17항에 있어서, 상기 형광 RNA 탐지자 농도는 100 nM 이상인 것을 특징으로 하는 표적 물질의 분석 방법.
25. 표적 물질 농도와 형광 발생 관계의 검량 방법으로서,
    농도를 알고 있는 상기 표적 물질의 시료 용액을 복수 개 제조하고, 각각의 상기 시료 용액에 대하여 제 17항의 표적 물질 분석 방법을 수행하여 형광 측정값을 얻는 단계; 및
    상기 형광 측정값과 상기 알고 있는 표적 물질의 농도로부터 검량 곡선을 산출하는 단계를 포함하는 표적 물질 농도의 검량 방법.

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