KR101327542B1

KR101327542B1 - 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법

Info

Publication number: KR101327542B1
Application number: KR1020120026621A
Authority: KR
Inventors: 김인수; 유혜원; 김란희; 김성조
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2013-11-08
Anticipated expiration: 2032-03-15
Also published as: KR20130104779A

Abstract

본 발명은 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, 폴리스티렌 비드에 검출 대상이 되는 각각의 항원이 결합된 각각의 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체들을 제조하는 단계; 양자점에 상기 검출 대상이 되는 각각의 항원과 항원-항체 면역반응을 수행할 수 있는 각각의 항체가 결합된 각각의 양자점 검출 탐침자들을 제조하는 단계; 상기 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체들을 분석 대상 시료액에 가해주는 단계; 상기 양자점 검출 탐침자들을 상기 분석 대상 시료액에 가해주는 단계; 및 상기 분석 대상 시료액을 유세포 분석장치 중에서 분석하는 단계를 포함하는 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 현탁 비드 기반의 경쟁적 면역반응과 우수한 처리량 및 처리속도를 갖는 유세포 분석 판독법에 기초하여, 종래의 분석방법에 비해, 감도 증강 (LOD 감소와 측정범위 확장), 분석시간 단축 및 조작 단순화를 도모할 수 있으며, 따라서 시료 내 위험인자들을 고감도로 빠르면서 이용하기에 용이하게 진단할 수 있다.

Description

양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법 {Method for detecting contaminants from samples using quantum dot based competitive immunoassay and multiplexed flow cytometric readout}

본 발명은 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용하여 시료 중으로부터 오염물질을 다중 검출하는 방법에 관한 것이다.

환경 오염물질의 검출은 음용수 관련 공중위생에 있어서 큰 관심사이며, 이는 주로 미생물과 화학적 위험인자에 인체가 노출되는 것과 관련된다. 음용수의 안전성을 효과적으로 보장하기 위해서는 엄격한 수질 기준 및 요구 사항을 만족해야 하며, 이를 위해서는 종래 분석기술의 단점을 극복하면서, 환경 오염물질을 고감도로, 신속하게, 또한 사용하기 쉽게 진단하기 위한 더욱 강력한 분석 장치가 필요하다. 더 나아가, 실제 현장 분석을 위해서는, 복잡한 물 시료 내 여러 특정 표적 화합물들을 동시에 측정할 수 있어야 한다.

현재 다중 분석을 위한 2 가지 주요 방법으로는, 반응 부위 및 분석물질의 식별방법에 따라서, 평면 배열법과 비드 기반의 배열법이 있다 (Braeckmans, K.; De Smedt, S. C.; Leblans, M.; Pauwels, R.; Demeester, J., Encoding microcarriers: present and future technologies. Nat Rev Drug Discov 2002, 1, (6), 447-456). 먼저, 평면 배열법에서는 표적 분자들이 평면 상에서 반응하고 코딩되며, 마이크로칩과 같은 정확한 위치 (x, y 좌표)에 따라 검출된다. 다음으로, 다중 분석법에서는 반응이 마이크로비드 (microsphere) 상에서 일어나며, 코딩된 비드 특성에 따라서 반응을 추적한다. 비드를 이용하는 분석법은 분자 반응 속도가 빠르고 및 신속한 판독 성능을 갖기 때문에 평면 미소배열법에 비해 상당한 이점이 있다 (Deng, W.; Drozdowicz-Tomsia, K.; Jin, D.; Goldys, E. M., Enhanced Flow Cytometry-Based Bead Immunoassays Using Metal Nanostructures. Analytical Chemistry 2009, 81, (17), 7248-7255). 이 분석법은 복잡한 혼합물 중에서 다중의 표적 성분들을 동시에 검출할 수 있으며 (다중화 검출), 이는 광학적으로 코딩된 마이크로비드를, 생체분자가 코팅된 형광물질로 표지하여 형광 검출 장비 (예를 들어 유세포 분석기)로 검출함으로써 가능하다.

유세포 분석법 (flow cytometry)은, 단일 유체 흐름에 존재하는 대량의 세포 및 기타 미소입자들에 대한 다중 특성을 신속하게 분석하기 위한 강력한 기술로서 (Soman, C. P.; Giorgio, T. D., Quantum Dot Self-Assembly for Protein Detection with Sub-Picomolar Sensitivity. Langmuir 2008, 24, (8), 4399-4404), 생의학 연구분야 (즉, 종양학, 면역학 및 독성학)에서는 통상적인 기술이지만 (Hahn, M. A.; Keng, P. C.; Krauss, T. D., Flow Cytometric Analysis To Detect Pathogens in Bacterial Cell Mixtures Using Semiconductor Quantum Dots. Analytical Chemistry 2008, 80, (3), 864-872), 환경 및 미생물학과 같은 다른 분야에서는 상대적으로 연구가 적다 (Anderson, G. P.; Lamar, J. D.; Charles, P. T., Development of a Luminex Based Competitive Immunoassay for 2,4,6-Trinitrotoluene (TNT). Environmental Science & Technology 2007, 41, (8), 2888-2893 등). 전체 시료의 평균 분광특성을 측정하는 다른 형광 분석기들과는 달리, 유세포 분석법은 시료 내 거의 모든 개별 입자들을 조사할 수 있고, 광 산란 (크기 및 과립도) 및 다양한 파장에서의 형광 세기와 같은 다중 특성들을 동시에 측정한다. 이러한 장점으로 인해서, 유세포 분석법은 전체 집단에서 다중 파라미터 분석으로 특정 개체를 명확하게 구별할 수 있다.

유세포 분석법에서는 필수적으로, 표적 화합물에 대해 특이적인 생체 분자와 접합한 형광색소 (형광 표지자 또는 탐침)가 사용되는데, 이는 특정 세포 집단을 인식하고 정량화하기 위해 필요하다. 이를 위해서 통상적으로 유기 염료가 사용되지만, 다중 표적을 분석하기 위해 동시에 여러 유기 염료를 사용할 때에는 하기와 같이 일부 심각한 단점과 한계가 존재한다; (1) 유기 염료가 갖는 좁은 흡수 스펙트럼을 분석하기 위해서는 다파장 레이저 또는 형광 공명 에너지 이동 (Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET) 시스템과 같은 보조 여기원을 필요로 하므로, 실험 장치가 복잡해지고 비용이 증가되며, (2) 유기 염료의 넓은 방출 특성은 형광색소 간 스펙트럼 중첩을 야기하여 추가적인 색 보상 및 보정 과정을 필요로 하고, (3) 낮은 양자 효율을 갖는다는 문제점이 있다 (Chattopadhyay, P. K.; Price, D. A.; Harper, T. F.; Betts, M. R.; Yu, J.; Gostick, E.; Perfetto, S. P.; Goepfert, P.; Koup, R. A.; De Rosa, S. C.; Bruchez, M. P.; Roederer, M., Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine 2006, 12, (8), 972-977 등).

따라서, 전술한 문제점들을 개선하기 위해서 이러한 형광색소 대신 반도체 나노입자인 양자점 (Quantum Dot: QD)을 사용하고자 하는 연구가 보고된 바 있다 (Chattopadhyay, P. K.; Perfetto, S. P.; Yu, J.; Roederer, M., The use of quantum dot nanocrystals in multicolor flow cytometry. Wiley Interdisciplinary Reviews : Nanomedicine and Nanobiotechnology 2010, 2, (4), 334-348 등). QD는 유기 염료와 달리 넓은 흡광 스펙트럼을 갖기 때문에, FRET 유도물질이 필요 없고 하나의 여기원 만으로도 실험 장치를 구성할 수 있다. 또한, QD의 방출 스펙트럼 (반치폭 ~ 24-40 nm)은 좁고 대칭적이어서 스펙트럼 중복 현상이 거의 없어 색상 보정과정이 불필요하다. 더 나아가, QD는 높은 양자 수율 및 높은 몰 소광계수 (유기염료의 ~10 - 100배)를 갖기 때문에, 바탕신호와 염색된 집단을 구별하는 능력, 즉 감도가 개선된다.

따라서, 본 발명에서는 여러 분석 물질을 동시에 검출하기 위해 유세포 분석 판독법과 병합한 양자점 기반의 경쟁 면역분석법을 제공함으로써, 환경 오염 물질을 고감도 및 고속으로, 용이하게 검출하기 위한 장치를 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서,

폴리스티렌 비드에 검출 대상이 되는 각각의 항원이 결합된 각각의 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체들을 제조하는 단계;

양자점에 상기 검출 대상이 되는 각각의 항원과 항원-항체 면역반응을 수행할 수 있는 각각의 항체가 결합된 각각의 양자점 검출 탐침자들을 제조하는 단계;

상기 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체들을 분석 대상 시료액에 가해주는 단계;

상기 양자점 검출 탐침자들을 상기 분석 대상 시료액에 가해주는 단계; 및

상기 분석 대상 시료액을 유세포 분석장치 중에서 분석하는 단계를 포함하는 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체는 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 비드와 바이오틴화된 검출 항원의 접합 반응에 의해서 형성될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 양자점 검출 탐침자들은 상기 검출 대상이 되는 항원에 대한 단일 클론 항체를 상기 양자점 표면에 코팅함으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 양자점 검출 탐침자들을 상기 분석 대상 시료액에 가해준 이후에는, 상기 분석 대상 시료액 중의 검출 대상 항원과 상기 양자점 검출 탐침자에 결합된 항체와의 경쟁적인 항원-항체 면역반응 및 상기 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체에 결합된 항원과 상기 양자점 검출 탐침자에 결합된 항체와의 항원-항체 면역반응이 평형상태에 이르도록 방치하는 단계를 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 유세포 분석장치는 전기적 부피의 크기 파라미터, 측면 산란의 과립도 구별 파라미터 및 형광 파라미터에 관한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 검출 대상이 되는 각각의 항원은 마이크로시스틴-LR 및 벤조[a]피렌일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 양자점은 525nm에서 형광을 방출하는 양자점 및 655nm에서 형광을 방출하는 양자점일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 양자점 검출 탐침자는 상기 525nm에서 형광을 방출하는 양자점에 상기 마이크로시스틴-LR 항체가 부착된 양자점 검출 탐침자 및 상기 655nm에서 형광을 방출하는 양자점에 상기 벤조[a]피렌 항체가 부착된 양자점 검출 탐침자일 수 있다.

본 발명에 따르면, 우수한 처리량 및 처리속도를 갖는 유세포 분석 판독법에 기초하여, 종래의 분석방법에 비해, 감도 개선 (검출한계 감소와 측정범위 확장), 분석시간 단축 및 조작 단순화를 도모할 수 있으며, 따라서 시료 내 위험인자들을 동시에 고감도 및 고속으로, 용이하게 다중 검출할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 오염물질의 다중 검출 방법에 대한 개략적인 공정도이다.
도 2는 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체 및 양자점 검출 탐침자에 대한 게이트된 영역들을 나타낸 도면으로서, 도 2a는 전기적 부피에 대한 히스토그램을, 도 2b는 게이트된 영역 1 (삽입 도면)에서의 전기적 부피, 측면 산란 및 형광 히스토그램에 대한 밀도 플롯을 나타낸 도면이다.
도 3은 마이크로시스틴-LR 및 벤조[a]피렌의 검출을 위한 경쟁 면역분석법에서, 배양시간 최적화 과정을 위한 그래프이다.
도 4a (표준 마이크로시스틴-LR) 및 4b (표준 벤조[a]피렌은 QD 형광세기와 표준 분석물질 농도의 로그 사이의 관계를 보여주는 검량 곡선을 나타낸 그래프이고, 삽입도면은 항원 농도와 QD 형광강도 사이의 선형 관계를 보여주는 측정범위이다.
도 5는 폴리스티렌 비드 경쟁자에 결합된 QD 검출 탐침의 시각화를 위한 공초점 레이저 스캐닝 현미경 영상들로서, 도 5 중, (a) 및 (c)는 순수 폴리스티렌 비드-항체 경쟁 복합체 및 이에 결합된 QD 검출 탐침자에 대한 차별 간섭 대조 (differential interference contrast) 모드 영상이고, (b) 및 (d)는 순수 폴리스티렌 비드-항체 경쟁 복합체 및 이에 결합된 QD 검출 탐침자에 대한 형광 모드 영상이며, (a+b) 및 (c+d)는 각각 a와 b를 합한 영상 및 c와 d를 합한 영상이다.
도 6은 마이크로시스틴-LR 및 벤조[a]피렌이 동시에 존재하는 시료 중에서 QD 형광세기와 표준 분석물질 농도의 로그 사이의 관계를 보여주는 검량 곡선을 나타낸 그래프로서, 도 6a는 벤조[a]피렌 존재 하에서의 마이크로시스틴-LR 검출을 위한 그래프이고, 도 6b는 마이크로시스틴-LR 존재 하에서의 벤조[a]피렌 검출을 위한 그래프이다.
도 7은 FL1과 FL3 채널에서 각각 검출되고 스필오버된 형광값(%)으로서 계산되는 2개의 QD525/Ab_{마이크로시스틴-} _LR와 QD655/Ab_{벤조[a]피렌} 검출 탐침의 발광 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

본 발명에서는 유세포 분석법에 기반한 정량분석을 위해서 다른 색상을 갖는 2개의 감지 요소 (항체-코팅된 QD 검출 탐침자와 항원-고정된 폴리스티렌 비드)를 사용하여 특이적 면역반응을 동시에 수행한다. 상기 2개의 감지 요소는 각 표적 화합물에 대해서 경쟁 면역방식으로 반응한다. 표적물질에 따라 여러 색상의 QD로 특이적으로 염색된 마이크로비드들은 유세포 분석법을 이용하여 동시에 특성 분석 및 해석이 이루어지는데, 이때 유세포 분석법은 특이적으로 코딩된 대상 마이크로비드를 선택적으로 판별하고 형광을 측정할 수 있다. 특정 검출기에 기록된 각 QD의 형광 세기는 각 표적 분자에 대한 정성적 및 정량적 정보를 직접 제공한다.

본 발명에 따른 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법은, 폴리스티렌 비드에 검출 대상이 되는 각각의 항원이 결합된 각각의 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체들을 제조하는 단계; 양자점에 상기 검출 대상이 되는 각각의 항원과 항원-항체 면역반응을 수행할 수 있는 각각의 항체가 결합된 각각의 양자점 검출 탐침자들을 제조하는 단계; 상기 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체들을 분석 대상 시료액에 가해주는 단계; 상기 양자점 검출 탐침자들을 상기 분석 대상 시료액에 가해주는 단계; 및 상기 분석 대상 시료액을 유세포 분석장치 중에서 분석하는 단계를 포함한다.

도 1에는 본 발명에 따른 오염물질의 검출 방법에 대한 개략적인 공정도를 도시하였다. 도 1에는 2가지 종류의 항원 (도면에서 노란색 구체 및 보라색 구체로 표시)을 포함하는 분석 대상 시료 (도 1, 단계 1)에 대한 방법을 도시하였으며, 도 1을 참조하면, 분석 대상 시료 중의 오염물질 (항원)과 경쟁적 면역 반응을 수행하게 되는 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체를 제조하게 된다. 이와 더불어, 양자점에 분석 대상 시료 중의 오염물질 (항원) 또는 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체 중의 항원과 항원-항체 면역반응을 수행할 수 있는 항체가 결합된 양자점 검출 탐침자도 제조한다. 이와 같이 제조된 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체를 분석 대상 시료에 첨가한다 (도 1, 단계 2). 다음으로, 상기 제조된 양자점 검출 탐침자를 분석 대상 시료에 첨가한다 (도 1, 단계 3). 이와 같이 분석 대상 시료에 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체 및 양자점 검출 탐침자를 첨가하게 되면, 분석 대상 시료 중의 오염물질들 (항원들)과 양자점 검출 탐침자와의 항원-항체 반응과, 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체의 항원들과 양자점 검출 탐침자와의 항원-항체 반응이 경쟁적으로 이루어지게 된다 (도 1, 단계 4). 이후, 최종적으로 상기 분석 대상 시료를 유세포 분석장치 중에서 분석함으로써 분석 대상 시료 중의 오염물질 (항원)을 정성 및 정량적으로 분석할 수 있게 된다.

상기 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체는, 폴리스티렌 비드 상에 검출 대상이 되는 항원을 부착시키는 다양한 방법에 의해서 제조될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 비드와 바이오틴화된 검출 항원의 접합 반응에 의해서 제조할 수 있다.

또한, 상기 양자점 검출 탐침자들은 상기 검출 대상이 되는 항원에 대한 단일 클론 항체를 상기 양자점 표면에 코팅함으로써 제조될 수 있다.

한편, 상기 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체 및 상기 양자점 검출 탐침자들을 분석 대상 시료액에 가해준 이후에는, 양자점 검출 탐침자에 결합된 항체가 검출 대상 항원 및 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체와 경쟁적인 항원-항체 면역반응을 하여, 항원-항체 면역반응이 평형상태에 이르도록 일정 시간 동안 방치하는 단계가 더 포함될 수도 있다 (도 1, 단계 4 이후 방치).

본 발명에 있어서, 유세포 분석장치로 이송된 분석 대상 시료에 대해서는 분석 대상 시료 중의 오염물질에 대한 다양한 정보가 제공된다. 이러한 정보에 대한 비제한적인 예로는, 전기적 부피의 크기 파라미터, 측면 산란의 과립도 구별 파라미터 및 형광 파라미터에 관한 정보를 들 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 제한되는 것은 아니다.

실시예

이하, 하기 실시예에서는 음용수 내 환경 위험인자 중 2개의 예시 표적 분자로서 미생물로부터 비롯된 물질 (남조류 독소인 마이크로시스틴-LR)과 화합물로부터 비롯된 물질 (다환 방향족 탄화수소(PAH)인 벤조[a]피렌)을 이용하여 본 발명에 따른 방법을 수행하였다.

양자점 ( QD )/항체 ( Ab ) 검출 탐침자의 제조

면역학적 인식용 색상 표지 (녹색 또는 적색)를 만들기 위해, 마이크로시스틴-LR (마이크로시스틴-LR, MC10E7, 엔조 라이프 사이언시스)와 벤조[a]피렌 (22F12, 독일 뮌헨공대 제공)에 대한 단일 클론 항체 (mAbs)를 제조사 지침에 따라 QD (Qdot525 및 QD655 항체 접합 키트, 인비트로젠)의 표면에 각각 코팅하였다. 합성한 QD525/Ab_{마이크로시스틴-} _LR 검출 탐침자의 결합능은 탐침 하나 당 마이크로시스틴-LR 분자 10개인 것으로 이미 평가되었지만 (Yu, H. W.; Lee, J.; Kim, S.; Kim, S. J.; Kim, I. S., Photoelectronic characterization of IgG antibody molecule-quantum dot hybrid as biosensing probe. Nanotechnology 2010, 21, (42), 425501-425511), 8개의 항원이 QD655/Ab_{벤조[a]피렌} 검출 탐침자 (인비트로젠)과 접합할 수 있다고 추정되었다.

폴리스티렌 비드 ( PB )/항원 ( Ag ) 경쟁자 합성

연속 2단계 반응, 즉 각 항원의 바이오틴화 반응과 스트렙타비딘-코팅된 PB 표면에 바이오틴화된 분자의 접합 반응을 통해 각 항원 (마이크로시스틴-LR 또는 벤조[a]피렌 유도체)을 폴리스티렌 비드에 결합시켜 PB/Ag 경쟁자를 제조하였다. 다음, 0.30 μmol의 마이크로시스틴-LR (알렉시스)과 벤조[a]피렌 유도체 (c-(10-벤조[a]피레닐)-부티르산, B[a]P-10-C4, 자이델 A 교수(독일 환경 발암물질 생화학 연구소)로부터 입수)를 무수 디메틸설폭시드 (DMSO)/아세토니트릴 (25:75% v/v) 중에 용해시킨 0.45 μmol의 N-히드록시숙신이미드 (NHS)와 0.45 μmol의 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)와 데시케이터에서 24시간 동안 혼합하였다. 이후, 상기 카르복시산의 활성화된 NHS 에스테르를 0.60 μmol EZ-연결 아민-PEG3-바이오틴 (써모 사이언티픽)의 1차 아민기와 21시간 동안 반응시킨 다음, 트리에틸아민 (0.45 μmol)과 3시간 배양하여 잔류 미반응 아민-반응기의 반응성을 제거하였다. 단백질 중합을 최소화하기 위해 상기 시약들의 비율은 아민-PEG3-바이오틴의 몰량을 과량으로 사용하고 DCC의 양을 제한적으로 사용하여 선택하였다. 또한, 0.74 nmol의 바이오틴 결합능에 해당하는 1 mL의 스트렙타비딘-코팅된 폴리스티렌 비드 (Sphero 스트렙타비딘 폴리스티렌 입자 (5.0-5.9 μm), 스페로테크)를 미리 제조한 바이오틴-변형 분자 현탁액 (기능화된 마이크로비드의 바이오틴 결합능 대비 400배 과량의 몰량)과 일정하게 혼합하면서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 합성한 PB 경쟁자로부터 미결합 물질을 0.45 μm 필터튜브 (와트만)를 이용하여 PBS 완충액으로 수차례 원심 세척함으로써 제거하였다. 이후, 최종 착물을 사용하기 전에 4℃의 보존용 완충액으로서 0.02% 아지드화 나트륨/PBS에 재현탁하여 보관하였다.

경쟁적 면역반응의 최적화

경쟁적 면역반응에 영향을 주는 인자들을 최적화하여 감도와 분석시간에 관한 분석 성능을 향상시켰다. 경쟁적 면역학적 인식과 QD 형광신호의 추가 발생을 위한 최적의 실험조건을 파악하기 위해서 QD 검출 탐침자의 시약 농도 (QD525/Ab_{마이크로시스틴-} _LR의 경우 2.5×10^-8 내지 2.0×10^-7 M, QD655/Ab_{벤조[a]피렌}의 경우 5.0×10^-8 내지 4.0×10^-7 M), PB 경쟁자의 시약농도 (2.4×10^-14 내지 1.9×10^-13 M) 및 배양시간 (10-120분)을 최적화하였다.

면역학적 인식: 경쟁 면역분석법

환경 오염물질을 분석하기 위해서 100% 메탄올을 이용한 연속 희석법으로 표준 마이크로시스틴-LR과 벤조[a]피렌을 각각 10^-3- 10² μg/L와 10^-4 - 50 μg/L 범위에서 제조하였다. 각 분석물질을 상온에서 30분간 마이크로시스틴-LR 검출용 (9.5×10^-14 M의 PB/마이크로시스틴-LR와 1.0×10^-7 M의 QD525/Ab_{마이크로시스틴-} _LR) 또는 벤조[a]피렌 검출용 (2.4×10^-14 M의 PB/벤조[a]피렌과 2.0×10^-7 M의 QD655/Ab_벤조[a] _피 _렌) 20 μl의 감지 요소 세트를 이용하여 배양하였다. 경쟁적 면역반응 종료 후, 최종 분석 단계로서, 유세포 분석기를 이용하여 세척 단계를 거치지 않은 각 QD의 형광 측정을 수행하였다.

신호변환: 유세포 분석법

상기 각 분석물질 시료 단독 또는 이들의 혼합물을 22 mW 488 nm 여기 레이저를 장착한 Cell Lab Quanta SC 유세포 분석기 (베크만 쿨터)로 분석하였다. 단일 마이크로비드들을 운반 유체 (sheath fluid: iso-diluent, NPE 시스템즈)를 사용하여 10⁵ - 10⁷입자/ml의 밀도로 현탁시킴으로써, 유세포 분석기의 좁은 구멍 및 그 튜브가 막히지 않도록 하였다. 매 실험진행 전에, 488 nm 레이저 적용을 위한 품질 관리 (QC)를 위해 Flow-check fluorosphere (베크만 쿨터)를 이용하여 조정하였으며, 이를 통하여 장치가 정밀하고 정확하게 작동하도록 하였다. 전기적 부피 (Electronic Volume: EV)의 하한 판별기 (lower level discriminator: LLD)에 의해 설정된 직경 4 μm (EV 채널 = 100)를 초과하는 100,000개의 입자를 계수하여 분석하였다. EV 파라미터에 대한 채널 세팅에 의해서, 설정치 미만의 개체를 배제하고, 미반응 QD/Ab 검출 탐침자, 항원, 이들의 접합체와 불순물에 의해서 초래되는 신호를 제거하였다. 5 μm 보정 비드 (Coulter CC size standard L5, 베크만 쿨터)로 유세포 분석기 EV 채널 축 (㎛³)을 입자 크기 (㎛)로 변환하였다. 시료의 유속을 제어하여 시료 실험 진행 중에 계수율을 일정하게 (600 - 700) 유지하였다. 게인 (gain), PMT 전압 및 판별값을 적당히 설정하여 시료를 배경 노이즈와 구별하는 것이 중요하다. EV와 측면 산란 (SS)의 게인값은 각각 5.23과 3.40이었다. 녹색 (형광 채널 1, F1)과 적색 (형광 채널 3, F3)의 2색 형광 측정을 위한 광전자 증배관 (photomultiplier tube: PMT) 전압을 또한 각각 6.04와 5.98로 설정하였다. 각 항원 (마이크로시스틴-LR과 벤조[a]피렌)의 정량 분석을 위해서, 4개 파라미터 (EV, SS, FL1과 FL3)의 유세포 분석 데이터를 수집하였다.

결과 및 검토

유세포 분석법에서 게이팅 ( gating ) 방법과 데이터 해석

마이크로시스틴-LR과 벤조[a]피렌은 각각 분자량이 불과 995.17 g/mol(C₄₉H₇₄N₁₀O₁₂)과 339.41 g/mol(C₂₄O₂H₁₉)인 상대적으로 작은 분자들이기 때문에 2중 항체를 이용한 샌드위치 면역분석법은 결합 부위의 입체적인 방해 때문에 적용에 어려움이 있다. 따라서, 본 발명에서는 단일의 항체를 이용하여 작은 분자를 인식하도록 경쟁 면역분석법을 구성하였다. 본 발명에서는 2개의 주요 감지 요소 (Ab-코팅된 QD 검출 탐침자와 항원-고정된 PB 경쟁자)를 도입하여 표적 오염물질과 경쟁하도록 하였다. 항체가 코팅된 QD 검출 탐침자의 목적은 (1) 대상 항원을 특이적으로 인식하는 면역학적 결합과, (2) 광학 신호 발생을 제공하는 것이다. 항원-고정된 PB 경쟁자는 또한 2개의 기능, 즉 (1) 고체 담지체 및 QD 검출 탐침자의 한정된 결합 부위에 결합함에 있어서, 대상 분석물질과의 경쟁하는 기능과, (2) 후속 유세포 분석을 위한 크기 판별 기능이 있다.

먼저, 본 발명에서는 유세포 분석법에 기반한 정량분석을 위해서 다른 색상을 갖는 2개의 감지 요소 (QD/Ab 검출 탐침자와 PB/Ag 경쟁자)를 사용하여 특이적 면역반응을 동시에 수행한다. 상기 2개의 감지 요소는 각 표적 화합물에 대해서 경쟁 면역방식으로 반응한다. 표적물질에 따라 여러 색상의 QD로 특이적으로 염색된 마이크로비드들은 유세포 분석법을 이용하여 동시에 특성 분석 및 해석이 이루어지는데, 이때 유세포 분석법은 특이적으로 코딩된 대상 마이크로비드를 선택적으로 판별하고 형광을 측정할 수 있다. 특정 검출기에 기록된 각 QD의 형광 세기는 각 표적 분자에 대한 정성적 및 정량적 정보를 직접 제공한다.

유세포 분석기에 의해서 분석될 주입 시료에 대한 수력학적 집중 (hydrodynamic focusing)이 이루어진 이후에는, 각각의 면역반응 후 코딩된 마이크로비드들이 광선을 통해서 하나씩 통과된다. 광 산란 또는 형광방출은 전기적 부피의 크기 파라미터 (sizing parameter of electronic volume: EV), 측면 산란의 과립도 구별 파라미터 (granularity differentiating parameter of side scatter: SS) 및 형광 파라미터 (fluorescence parameter: FL)와 같은 3개의 파라미터로 측정되며, 따라서 이는 입자 자체의 고유한 특성에 대한 정보를 제공한다. 유세포 분석기로부터 얻어진 데이터에 대한 분석은 마이크로비드들을 다른 비드 형태가 아닌 개체 (미반응 QD/Ab 검출 탐침자, 항원, 이들의 접합체와 불순물)와 구별함으로써 수행되는데, 이는 마이크로비드 평균 직경인 5.04 μm에 해당하는 EV 채널 100 이상의 값을 갖는 EV를 통해서 주로 이루어진다 (도 2a). 관심 집단 (population of interest: POI)을 더욱 선택적으로 정의하기 위한 방법으로서, EV 및 SS 파라미터의 조합은 불균질한 시료에서 QD가 표지된 PB 경쟁자의 특성을 분석하기 위한 단순하고 빠르면서도 효과적인 방법이 될 수 있다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, EV/SS 특성을 이용해서 PB 경쟁자 및 그 QD 검출 탐침자와의 접합체 (높은 EV와 높은 SS)는 PB 경쟁자의 표면에 결합되지 않은 반응물들 (낮은 EV와 낮은 SS)과 명확히 구별된다. 원하는 POI는 EV/SS의 밀도 그래프에서 마이크로비드 조립체를 나타내며, 이는 양성 데이터 세트에 대한 영역 1 (R1)으로서 게이트되지만, 음성 집단 (영역 2, R2)은 전자 게이트 기능에 의해 제거되었다. 이러한 전자적 판별과정은 통상적인 면역분석법에 있어서 필수적이지만 많은 시간이 소요되는 세척 단계를 대체할 수 있다. 일단 R1이 EV/SS 플롯의 여러 세트들 중에서 관심대상이 되는 마이크로비드를 선택적으로 게이트하면, 이와 동시에 2색 형광 강도는 단일의 여기 에너지원으로 측정된다. 그리고, 각 분석물의 정량을 위한 형광 검출 탐침자의 색상들에 따라서 다른 FL 채널들에서 개별적으로 기록된다. 형광 히스토그램 (도 2b의 삽입 그래프)은 상대적 형광 강도에 대한 검출 횟수를 나타내며, 이는 음성 집단 (염색 음성 대조군으로서 PB/Ag 경쟁자 단독), 양성 집단 (PB/Ag 경쟁자와 접합된 QD/Ab 검출 탐침자)의 형광세기로 표시된다. 정량분석을 위해서 마이크로시스틴-LR에 대한 녹색의 PB 경쟁자와 벤조[a]피렌에 대한 적색의 PB 경쟁자의 각 형광세기를 수집하여 평균 형광세기 (mean fluorescence intensity: MFI)로서 표시한다. 그 결과, QD로부터 생성되는 광학신호, 즉 PB 경쟁자와 결합하는 경쟁 비율은 시료 중 마이크로시스틴-LR 또는 벤조[a]피렌 분석물의 농도에 반비례한다는 사실을 알 수 있었다.

경쟁 면역분석의 최적화: 감지 요소의 농도와 반응시간

분석 구성방식과 신호변환 방법이 설정되면 면역분석 최적화의 목표는 감도를 향상시키고 분석시간을 단축하는 것으로, 이들은 시약특성 (2개의 감지 성분인 PB/Ag 경쟁자와 QD/Ab 검출 탐침자에 대한 결합능)과 분석 조건 (감지 요소의 농도와 배양시간)에 의해 주로 좌우된다. 최적의 실험 조건을 결정하기 위해서 분석물질이 존재하는 상태에서 얻어지는 광학 신호 (형광)(B)와 분석물질이 없는 상태에서의 신호 (B_o) 사이의 비율로서 기술되는 감도 지수 (B/B_o)를 도입하였다. 추가 분석을 위해서, 가장 큰 기울기와 함께 최저 감도 지수를 제공하는 최적의 인자를 선택하였다.

분석 감도를 향상시키기 위해 각 표적 분석물질에 대한 최선의 PB 경쟁자와 QD 검출 탐침자 농도를 최적화하기 위해, 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 다양한 조합들에 대해서 연속 2배 희석을 통해 바둑판식 적정실험을 진행하였다. 실제 사용에 있어서 원하는 측정범위에 적합하다고 평가된 감도 지수를 토대로 하여 가장 적합한 QD 검출 탐침자와 PB 경쟁자 농도를 다음과 같이 선택하였다: 마이크로시스틴-LR에 대한 감지 요소 쌍 (QD525/Ab_{마이크로시스틴-} _LR 검출 탐침자 = 100 nM와 PB/마이크로시스틴-LR 경쟁자 = 95 fM)과 벤조[a]피렌에 대한 쌍 (QD655/Ab_{벤조[a]피렌} 검출 탐침자 = 200 nM와 PB/벤조[a]피렌 경쟁자 = 24 fM).

PB/마이크로시스틴-LR 경쟁자 (fM)	QD525/Ab_{마이크로시스틴-} _LR 검출탐침 (nM)
PB/마이크로시스틴-LR 경쟁자 (fM)	200	100	50	25
190	1.09 (4.45)^b	0.98 (5.35)	0.92 (5.41)	0.89 (5.68)
95	0.99 (1.56)	0.82 (0.89)	0.83 (2.55)	0.88 (6.06)
48	0.94 (3.08)	0.92 (1.09)	0.85 (4.13)	0.89 (5.54)
24	0.96 (2.50)	0.84 (0.69)	0.87 (4.47)	0.82 (6.31)

PB/벤조[a]피렌 경쟁자 (fM)	QD655/Ab_{벤조[a]피렌} 검출탐침 (nM)
PB/벤조[a]피렌 경쟁자 (fM)	400	200	100	50
190	0.97 (8.23)	1.01 (7.32)	1.02 (6.86)	0.98 (3.76)
95	0.95 (4.21)	0.94 (8.34)	0.95 (6.32)	0.85 (8.31)
48	0.92 (2.17)	0.89 (4.51)	0.88 (6.82)	0.85 (2.35)
24	0.87 (7.43)	0.82 (4.87)	0.86 (9.30)	0.84 (7.44)

선택된 주입농도는 최적의 감도를 달성하기에 적합한 것으로 간주되며, 이는 이러한 세트가 항원-항체 반응의 평형과 QD 형광 발생 사이의 평형상태를 유지하기 때문이며, 따라서 이를 각 분석물질의 추가 측정에 사용하였다. 전체 분석 시간은 배양 시간에 의해 결정되기 때문에, 경쟁적 결합에 대한 시간의 영향을, 전술한 수치로 시약 농도를 고정하고, 10-120분 범위에 걸쳐 조사하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, MFI를 토대로 최소 감도 지수에 해당하는 30분의 배양 시간을 경쟁 면역분석법에 가장 효과적인 것으로서 선택하였다. 상기 배양시간은 30분 경과 전까지는 QD 검출 탐침자가 분석물질과 PB 경쟁자와 경쟁적 반응을 하기에는 불충분한 것으로 보였지만, 그 후에는 QD 검출 탐침자의 경쟁적 반응에 대한 평형은 PB 경쟁자 쪽으로 이동하여 감도 지수가 약간 상향 이동하는 경향이 나타난다. 평면 분석법과 달리, 이 같이 빠른 결합속도는 현탁 비드 분석법을 기초로 항원-항체 반응은 더 빠른 평형상태에 도달하며, 이는 QD 및 PB 입자의 부피 당 활성 생체분자와 반응하는 표면적이 커지고 확산 거리가 짧아지기 때문이다.

단일 분석물질의 유세포 분석

일반적인 분석 파라미터가 최적화되면, 유세포 분석법과 조합된 경쟁 형광 면역분석법을 사용하여 단일 분석물질의 측정을 수행하기 위해서, 10^-3 내지 10² μg/L 마이크로시스틴-LR과 10^-4 내지 50 μg/L 벤조[a]피렌 범위의 각 분석물질 표준 용액을 측정하였다. QD525/Ab_{마이크로시스틴-} _LR와 QD655/Ab_{벤조[a]피렌} 검출 탐침자를 사용하여 분석물을 경쟁 면역학적으로 염색시킴으로써, 마이크로시스틴-LR에 대해서는 녹색의 PB 경쟁자, 벤조[a]피렌에 대해서는 적색의 PB 경쟁자에 대한 형광 세기 (MFI)를, 게이트된 R1에서 측정하였다. 도 4는 QD 형광세기와 표준 분석물질 농도의 로그 사이의 관계를 보여주는 검량 곡선을 나타내고 있다. 마이크로비드에 결합된 QD로부터 방출된 녹색 (EL1)과 적색 (FL3) 형광의 세기는 각각 단일 분석물질 시료 내 마이크로시스틴-LR과 벤조[a]피렌의 농도에 반비례하였다. 본 발명의 감도와 신뢰도를 확인하기 위해서, 검출한계 (LOD), 정량한계 (LOQ)와 선형한계 (LOL)를 표준 곡선에서 규명하였다. 마이크로시스틴-LR (WHO 제시 음용수 규정 < 1 μg/L)의 단일 분석물질 측정의 경우, LOQ(S/N = 10)로부터 LOL에 이르는 측정범위는 0.36-30 μg/L의 범위 (퍼센트로서 표시한 상대 표준편차 (%RSD)는 1.1-8.5%)에서 얻어졌고; LOD (S/N = 3)는 0.08 μg/L인 것으로 계산되었다. 벤조[a]피렌 (유럽 이사회 제시 음용수 규정 < 10 ng/L)의 단일 분석물질 측정의 경우, 광학신호는 0.097-10 μg/L 범위 (%RSD는 1.3-12.7%)에서 선형관계에 있으며, LOD는 0.044 μg/L였다. 본 발명자들의 이전 연구에서 분광광도계를 이용한 마이크로비드 기반의 형광 측정과 달리 (Yu, H.-W.; Jang, A.; Kim, L. H.; Kim, S.-J.; Kim, I. S., Bead-Based Competitive Fluorescence Immunoassay for Sensitive and Rapid Diagnosis of Cyanotoxin Risk in Drinking Water. Environmental Science & Technology 2011, 45, (18), 7804-7811), 본 발명의 분석법은 상당히 높은 감도 (넓은 측정범위와 기울기)를 나타내는데, 그 이유는 유세포 분석기의 개별 입자 측정과 관련한 높은 분해능 및 감도 (바탕신호와 광산란 및 형광을 구별하는 능력) 때문인 것으로 판단된다.

2개의 분석물질에 대한 동시 유세포 분석

동일 용기 내 마이크로시스틴-LR과 벤조[a]피렌 분석물질이 존재하는 상태에서 QD525/Ab 또는 QD655/Ab 검출 탐침을 경쟁적 면역반응을 통해 각 표적 항원-코팅된 PB 경쟁자에 선택적으로 결합시켰다. 혼합 시료에서 여러 가지 형광신호를 동시에 검출하기 위해서는, 형광염료 간 스펙트럼 중첩이 일어날 가능성을 고려하여 광학 신호를 정확히 판독할 필요가 있다 (Chattopadhyay, P. K.; Price, D. A.; Harper, T. F.; Betts, M. R.; Yu, J.; Gostick, E.; Perfetto, S. P.; Goepfert, P.; Koup, R. A.; De Rosa, S. C.; Bruchez, M. P.; Roederer, M., Quantum dot semiconductor nanocrystals for immunophenotyping by polychromatic flow cytometry. Nature Medicine 2006, 12, (8), 972-977). 이러한 형광 중첩은 스필오버 (spillover) 형광의 크기를 주 검출기에서 측정된 형광의 분율로서 추정함으로써 차감하는 과정, 일명 보상 (compensation)의 과정을 통해 보정된다. 상기 과정은 각 채널에서의 신호가 검출될 형광색소의 실제 신호를 나타낼 때까지 모든 채널에 대해 반복한다. 도 7은 FL1과 FL3 채널에서 측정되는 스필오버를 분석하기 위한 QD525/Ab_{마이크로시스틴-} _LR와 QD655/Ab_{벤조[a]피렌} 검출 탐침자의 발광 스펙트럼을 보여주고 있다. 이들의 발광 스펙트럼은 좁고 대칭적이기 때문에, QD가 생체분자에 의한 개질 여부와 관계없이 최소 보상값으로 다중 검출할 수 있다는 것을 보여준다. 유기 형광염료와 달리, QD 사이의 스펙트럼 중복 현상은 무시할 정도의 수준이므로, 감도 개선뿐만 아니라, 정확한 양성 신호를 측정할 수 있다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 2개의 분석물질을 동시 검출하기 위한 QD 기반의 경쟁 형광 면역 분석은 PB/Ag 경쟁자와 QD/Ab 검출 탐침자라는 서로 다른 감지 요소 세트를 이용하여 달성될 수 있었다. 특정 QD/Ab 검출 탐침자로 코딩된 각각의 마이크로비드는 2개의 분석물질이 존재하는 상태에서 선택적 경쟁반응에 의해 형성된다. 이후의 유세포 분석에 의한 명확한 판별과 형광 신호측정을 통해 정량적인 정보를 제공한다 (도 6 참조). 마이크로시스틴-LR 또는 벤조[a]피렌 분석물질의 표준 검량 곡선은 단일 분석물질 분석과 크게 다르지 않다. 분석물질에 특이적인 마이크로비드로부터 발생한 형광신호는 다른 표적 분석물질의 존재 여부와 관계없이 시료 내 각 항원 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 그러나, 이들 분석의 LOD와 감도는 혼합 면역분석 과정 중에 생성된 형광 신호 방해에 의해 약간 변화될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 따른 경쟁 면역분석법과 조합한 QD 기반의 유세포 분석법에 의하면 다른 여러 분석물질을 동시에 검출할 수 있다는 사실을 알 수 있다.

매트릭스 간섭 효과에 대한 분석 검증

본 발명의 성능을 확인하기 위해서는 잠재적 방해물질이 존재하는 여러 수질 샘플에서의 회수율을 고려하여야 하는데, 이러한 시료 매트릭스 회수율은 여러 유형의 수질 성분 변동성에 의해서 초래된다. 따라서, 이러한 매트릭스 효과의 평가는 수중에 용해된 환경 위험인자에 대해 신뢰성 있는 데이터를 제공하기 위한 중요한 검증 단계이다. 본 실시예에서는, 주변 환경에 있는 5종의 물 시료의 회수율을, 저, 중, 고농도의 내부 분석물질로서 표준 마이크로시스틴-LR과 벤조[a]피렌을 스파이킹 (spiking)함으로써 평가하였는데, 이러한 농도 범위는 본 발명에 따른 방법의 측정범위 내에서 일정 농도 간격으로 선택된 것들이다 (표 3 및 4 참조). 회수율이 90-110%의 범위에 있기 때문에, 본 발명이 수중에 현탁된 성분의 비특이적 결합에 크게 영향을 받지 않고, 따라서 수질 유형에 무관하게 환경 오염물질의 직접 측정에 적용될 수 있음을 알 수 있다.

마이크로시스틴-LR의 농도 (㎍/L)		% 회수^a
마이크로시스틴-LR의 농도 (㎍/L)		병 생수	수돗물	강물^b	호숫물^c	해수^d
음 대조군	0	92.6 (13.7)	100.6 (10.9)	101.9 (12.4)	96.9 (14.7)	99.7 (15.4)
저	1	96.4 (11.3)	94.3 (12.0)	94.9 (13.4)	99.7 (18.7)	104.7 (9.3)
중	15	106.5 (9.3)	104.8 (10.2)	104.4 (10.3)	103.3 (7.6)	102.8 (10.6)
고	30	92.6 (12.2)	97.5 (9.6)	97.0 (12.1)	96.3 (13.0)	94.1 (10.4)

벤조[a]피렌의 농도 (ng/L)		% 회수^a
벤조[a]피렌의 농도 (ng/L)		병 생수	수돗물	강물^b	호숫물^c	해수^d
음 대조군	0	104.0 (9.4)	91.5 (15.2)	100.6 (10.3)	96.4 (18.9)	90.5 (12.0)
저	0.5	94.4 (12.9)	104.8 (8.5)	91.3 (8.1)	109.9 (5.8)	93.8 (11.0)
중	5	103.6 (17.4)	103.3 (8.8)	104.9 (17.8)	102.8 (16.5)	102.2 (8.4)
고	10	95.4 (14.4)	107.2 (8.9)	109.8 (5.3)	104.9 (18.0)	110.3 (4.7)

a. % 회수 = (측정량/기대량)×100, 모든 물 시료는 겨울에 수집되었으며, 0.2 ㎛ 주사기 필터를 사용하여 전처리함으로써 입자 또는 미생물 세포들에 의해서 야기되는 간섭 효과를 배제하였다. 괄호 안의 수치는 3회의 반복 실험에 기초한 %CV를 나타낸다.

b. 강물은 대한민국 광주천 (35°09'N 및 126°50'E)에서 수집하였다.

c. 호숫물은 대한민국 광주시에 위치하는 호수 (35°13'N 및 126°50'E)로부터 수집하였다.

d. 해수는 동해에 위치한 지점 (35°13'N 및 129°14'E)에서 수집하였다.

전술한 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 여러 환경 오염물질을 동시에 검출하기 위해 정립한 분석법은 QD 기반의 경쟁 형광 면역분석법을 유세포 분석 판독법과 효과적으로 병합함으로써 성공적으로 실행되었다. 종래의 분석방법에 비해, 본 발명의 병합된 기술은 감도 증강 (LOD 감소와 측정범위 확장), 분석시간 단축 및 조작 단순화를 달성할 수 있다. 본 발명의 이러한 높은 성능은 3개의 주요 개선점, 즉 현탁 비드 기반의 경쟁적 면역반응, 높은 처리율과 신속한 유세포 동시 분석 다중 판독법, 및 단일의 여기원을 이용한 QD 기반의 광학신호 증폭으로부터 유래된다. 이들 뚜렷한 특징에 의해 본 발명은 음용수 내 다른 환경 위험인자들을 고감도로, 신속 및 용이하게 진단하는 기술로서 매우 효과적이다. 더 나아가, 본 발명의 분석법을 소형 미세유체 유세포 분석법과 결합하면 환경 시료의 실제 현장 평가용으로 각종 독성 화합물을 동시에 빠르게 자동 선별하는 시스템으로도 응용될 수 있다.

Claims

폴리스티렌 비드에 검출 대상이 되는 각각의 항원이 결합된 각각의 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체들을 제조하는 단계;
양자점에 상기 검출 대상이 되는 각각의 항원과 항원-항체 면역반응을 수행할 수 있는 각각의 항체가 결합된 각각의 양자점 검출 탐침자들을 제조하는 단계;
상기 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체들을 분석 대상 시료액에 가해주는 단계;
상기 양자점 검출 탐침자들을 상기 분석 대상 시료액에 가해주는 단계; 및
상기 분석 대상 시료액을 유세포 분석장치의 유액 주입구로 도입하고, 수력학적 집중 구역 (hydrodynamic focusing)으로 이송한 다음, 상기 유세포 분석장치에 구비된 광원으로부터의 광을 상기 분석 대상 시료에 조사함으로써 얻어지는 광학적 신호를 분석하는 단계를 포함하는 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체는 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 비드와 바이오틴화된 검출 항원의 접합 반응에 의해서 형성되는 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 양자점 검출 탐침자들은 상기 검출 대상이 되는 항원에 대한 단일 클론 항체를 상기 양자점 표면에 코팅함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 양자점 검출 탐침자들을 상기 분석 대상 시료액에 가해준 이후에는, 상기 분석 대상 시료액 중의 검출 대상 항원과 상기 양자점 검출 탐침자에 결합된 항체와의 경쟁적인 항원-항체 면역반응 및 상기 폴리스티렌 비드-항원 경쟁 복합체에 결합된 항원과 상기 양자점 검출 탐침자에 결합된 항체와의 항원-항체 면역반응이 평형상태에 이르도록 방치하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 검출 대상이 되는 각각의 항원은 마이크로시스틴-LR 및 벤조[a]피렌인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법.
제1항에 있어서, 상기 양자점은 525nm에서 형광을 방출하는 양자점 및 655nm에서 형광을 방출하는 양자점인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 양자점 검출 탐침자는 상기 525nm에서 형광을 방출하는 양자점에 상기 마이크로시스틴-LR 항원이 부착된 양자점 검출 탐침자 및 상기 655nm에서 형광을 방출하는 양자점에 상기 벤조[a]피렌 항원이 부착된 양자점 검출 탐침자인 것을 특징으로 하는 양자점 기반의 경쟁 면역분석법 및 다중 유세포 분석법을 이용한 시료 중 오염물질의 검출 방법.