KR101316642B1

KR101316642B1 - 메틸 피오포바이드를 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 극복 의약 조성물

Info

Publication number: KR101316642B1
Application number: KR1020120010355A
Authority: KR
Inventors: 김병철; 이창희; 전우광; 최신욱
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2012-02-01
Filing date: 2012-02-01
Publication date: 2013-10-10
Anticipated expiration: 2032-02-01
Also published as: KR20130089030A

Abstract

본 발명은 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide)를 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 극복용 의약 조성물, 헴 옥시데이즈 활성 저해용 조성물 및 그 방법 그리고 세포자멸사 촉진용 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.

Description

메틸 피오포바이드를 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 극복 의약 조성물{A Composition for Overcoming Resistance to Anticancer Drugs comprising Methyl pheophorbide}

본 발명은 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide)를 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 극복 의약 조성물, 헴 옥시데이즈 활성 저해용 조성물 및 그 방법 그리고 세포자멸사 촉진용 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.

최근 30년간, 암 치료를 위한 세포증식억제제로서의 화학 약물의 사용은 일부 충실성 종양 및 조혈성 종양을 위한 일차 치료(first-line treatment)로서 선택된 것 중 하나를 구성한다. 암 치료를 위해 가장 일반적으로 사용된 화학 약물은 다음과 같다: 시스플라틴, 탁솔, 빈카(Vinca) 유래 알칼로이드, 5-플루오로우라실, 시클로포스파미드(Jackman A.L., Kaye S., Workman P. (2004) The combination of cytotoxic and molecularly targeted therapies-can it be done? Drug Discovery Today 1:445-454). 그러나, 임상 실험으로부터의 결과는 환자에서 관찰되는 높은 독성과 함께 치료학적 한계 이익에 의해 증명된 바와 같이 암 치료에서의 이러한 종류의 약물에 대해 낮은 치료학적 인덱스를 나타낸다(Schrader C., et al. M. (2005) Symptoms and signs of an acute myocardial ischemia caused by chemotherapy with paclitaxel (taxol) in a patient with metastatic ovarian carcinoma. Eur J Med Res 10:498-501).

예를 들어, 많은 저자들이 시스플라틴이 폐암의 일차 치료를 구성함에 동의하지만, 생존율의 6주간 증가 및 임상 증상이 거의 개선되지 않은 변변치 않은 효능이 관찰되었다(Grillo R., Oxman A., Julian J. (1993) Chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer. J Clin Oncol 11:1866-1871; Bouquet P.J., Chauvin F., et al (1993) Polychemotherapy in advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis. Lancet 342:19-21).

그러므로, 최적의 치료 이익을 이루기 위한 현재의 전략은 분자성 표적 치료와 함께 세포증식억제 약물을 기초로 한 약학적 조합에 초점을 맞춘다.

현재의 항암 약물 중 일부는 예를 들어, 만성 골수성 백혈병의 발달에서 기본 역할을 차례로 수행하는 Abl 키나제를 표적으로 하는 글리벡(이미티닙)(Giles J.F., Cortes J.E., Kantarjian H.M. (2005) Targeting the Kinase Activity of the BCR-ABL Fusion Protein in Patients with Chronic Myeloid Leukemia. Current Mol Med 5:615-623), 또한 상피 성장 인자(EGF) 수용체에 결합하는 티로신 키나제를 표적으로 하는 이레사(Onn A., Herbst R.S. (2005) Molecular targeted therapy for lung cancer. Lancet 366:1507-1508) and Velcade (Vortezomib) which blocks the protein degradation by targeting the proteasome machinery (Spano J.P., et al. (2005) Proteasome inhibition: a new approach for the treatment of malignancies. Bull Cancer 92:E61-66)와 같은 암 표적 치료로서 분류된다.

통상적인 화학치료의 비-특이 메카니즘이 세포성 유사분열의 폐기를 수렴함을 고려하여, 신규한 암 표적 치료제의 사용이 항종양 효과의 시너지 효과를 생성하는 약학적 조합을 이루기 위한 우수한 전망을 제공한다.

반면에, 화학치료제가 사용되었을 때 약물 저항성 현상이 암 치료에서의 실패의 일차 원인으로서 인식됐다. 종양 환경에서의 차선 약물 농도가 약물 저항성에 영향을 끼침에도 불구하고, 세포성 기원과 같은 다른 인자가 많은 종양에 대한 화학 저항성에서의 특발성 역할을 수행한다. 약물 저항성은 세포내 무독화, 세포성 반응에서의 변화, 스트레스에 대한 인내성 및 아폽토시스 시그널링 경로에서의 결손에 관련된 다중 독립 메커니즘에 따른 다인자성 현상이다(Luqmani A. (2005) Mechanisms of drug resistance in cancer chemotherapy. Med Princ.Pract 14:35-48).

당단백질-P 및 글루타치온(Gluthathion) S-트렌스퍼라제가 암에서의 약물 저항성 현상에 연관된 세포내 무독화를 매개하는 주요 단백질이다(Saeki T., Tsuruo T., Sato W., Nishikawsa K. (2005) Drug resistance in chemotherapy for breast cancer. Cancer Chemother Pharmacol 56:84-89) (Hara T., et al.(2004) Gluthathione S-transferase P1 has protective effects on cell viability against camptothecin.Cancer Letters 203:199-207). 베타-튜불린과 같은 다른 단백질이 파클리탁셀에 대한 종양 저항성에 직접적으로 관련된 수준인 약물 저항성 현상에 관련되어 있음이 보고되었다(Orr G.A., et al. (2003) Mechanisms of Taxol resistance related to microtubules. Oncogene 22:7280-7295). 다른 방법으로, 시스플라틴 저항성이 T-플라스틴(Hisano T., et al. (1996) Increased expression of T-plastin gene in cisplatin-resistant human cancer cells: identification by mRNA differential display. FEBS Letters 397:101-107), the Heat Shock Protein(HSP70) and (HSP90) (Jaattela M. (1999) Escaping cell death: survival proteins in cancer. Exp Cell Res 248:30-43) 및 전사 인자 YB1(Fujita T., et al. (2005) Increased nuclear localization of transcription factor Y-box binding protein accompanied by up-regulation of P-glycoprotein in breast cancer pretreated with paclitaxel. Clin Cancer Res 11:8837-8844)과 같은 상이한 단백질의 과 발현에 의해 영향을 받음이 보고되었다.

게다가, 해당과정(Glycolisis) 및 피루브산 경로가 종양 세포에서 관찰된 화학 저항성 현상에서 특발성 역할을 수행함이 보고되었다(Boros L.G., et al. (2004) Use of metabolic pathway flux information in targeted cancer drug design. Drug Disc. Today 1:435-443).

다른 그룹으로부터의 보고가 아폽토시스를 저해하거나 종양 세포에서 세포 생존율을 증가시켜 세포 종양의 화학 저항성 현상에 기여하는 단백질 세트의 존재를 나타냈다. 실례 중 하나는 세포 주기 촉진, 아폽토시스의 저해에서 중추적인 역할을 수행하는 누클레오포스민(Nucleophosmin) 단백질이며 이는 암에서 좋지 않은 예후 마커로서 간주된다(Ye K. (2005) Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biol Ther 4:918-923). 마찬가지로, CK2 효소는 아폽토시스를 향한 종양 세포의 저항성 및 세포 성장에서 중요한 역할을 수행한다(Tawfic S., Yu S., Wang H., Faust R., Davis A., Ahmed K. (2001) Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histol. Histopathol. 16:573-582). 이전의 발견은 일반 조직에 관한 상피 충실성 종양에서 3- 내지 7-배로의 CK2 활성의 증가를 나타냈다(Tawfic S., Yu S., et al. (2001) Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histol Histopatol. 16:573-582; Faust R.A., Gapany M., et al (1996) Elevated protein kinase CK2 activity in chromatin of head and neck tumors: association with malignant transformation. Cancer Letters 101:31-35). 게다가, CK2 활성은 악성 형질변환에서 중요한 세포성 사건이며 이는 종양 진행 마커를 구성한다(Seldin D.C., Leder P. (1995) Casein Kinase IIa transgene-induced murine lymphoma: relation to theileroiosis in cattle. Science 267:894-897). CK2 인산화는 아폽토시스로부터 종양세포를 보호하기 위한 강한 시그널을 나타내며, 이는 세포 생리학에서 아폽토시스 매개자로서 이 효소를 고려하도록 했다(Ahmed K., Gerber D.A., Cochet C. (2002) Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2. Trends Cell Biol, 12:226-229; Torres J., Rodriguez J., et al (2003)Phosphorylation-regulated cleavage of the tumor suppressor PTEN by caspase-3: implications for the control of protein stability and PTEN-protein interactions. J Biol Chem, 278:30652-60).

분자 생물학과 함께 경쟁적 단백질체 연구는 세포 악성 형질변환 및 종양 화학저항성 둘 다에 관련된 분자 메커니즘을 얼마간 이해할 수 있게 한다. 그러므로, 암 치료 양생법은 세포독성을 상당히 감소시키고 또한 증가하는 화학저항성의 가능성을 감소시키는 효과적인 약물 조합을 이루는데에 주의를 기울인다.

그러므로, 오늘날 암 치료에서 주요한 목적은 유효량 및 이러한 종류의 의약에 의해 나타나는 내재성 독성을 감소시켜 현재의 세포증식억제 약물의 치료학적 인덱스를 증가시키는 것이다. 현재의 다른 전략은 통상적인 세포증식억제 약물에 대한 종양 화학저항성을 우회하는 것이다.

일반적으로 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)은 호기성 생물체 호흡의 부산물로 주로 생성되는데, superoxide anion (O2^―), hydrogen peroxide (H₂O₂), hydroxyl anion (OH) 등을 포함하고 있다.

활성산소종이 세포내 생리활성 및 스트레스 반응에 대한 신호전달 물질로 작용하기 위해서는 타겟 분자를 가역적으로 산화시키고 세포내 농도가 정교하게 조절되는 mild activity를 지녀야 한다.

활성산소종을 세포내 신호전달 물질로서 기능을 지니게 하기 위해서는 이들의 농도를 적절히 조절하고 타겟 단백질의 산화적 변형을 가역적으로 환원시킬 수 있는 항산화 방어 시스템의 역할이 중요하다. 활성산소종 수준을 조절하는 항산화 단백질로 peroxidase, catalase 및 superoxide dismutase가 잘 규명되어 있고 타겟 단백질의 산화적 변형을 복구하는 단백질로는 thioredoxin, glutaredoxin 및 nitrosoglutathione reductase가 대표적이다.

한편 활성산소종은 다양한 방법으로 종양화 과정에 기여하고 있다; ① 유전자 손상 및 유전적 변이 유발 ② 성장인자 및 부착인자들에 의해 유도되는 세포증식 및 세포생존 신호전달의 매개인자로서 기능 ③ 세포 이동성 및 침윤성 촉진 ④ 염증반응 및 신생혈관을 유도하여 종양미세환경 (tumor microenvironment) 형성

종양화 과정 연구 분야의 대다수의 학자들은 활성산소종이 mitogenic signals (EGF, PDGF, Ras, PI3K-Akt)의 중요한 매개인자로 작용한다는 관점을 중심으로 그 중요성을 이해하여 왔다.

그러나 암세포 자신도 산화적 손상 (oxidative damage)으로부터 그들 자신을 보호하고 생존 및 전이능력을 획득하는 것이 매우 중요하다. 즉, 신호전달 물질로서 적절한 활성산소종의 수준을 유지시켜주는 세포내 시스템의 조절 기능이 매우 중요할 수 있다. 이러한 관점은 그 동안 종양화 과정의 negative signal로 여겨져 왔던 항산화 (antioxidant) 시스템이 종양화 과정의 positive signal로서 매우 중요할 수 있다는 새로운 연구방향을 제시하고 있다. 그러나 해당분야의 많은 연구자들이 이러한 관점에서의 연구를 간과하여 현재까지 관련연구가 거의 전무한 실정이다.

암세포의 산화적 스트레스 환경, 즉 활성산소종의 수준을 실질적으로 조율하는 핵심 항산화 시스템이 발굴되어있지 못하다.

또한 활성산소종의 증가에 따른 항산화 시스템 활성화의 유도 기전이 제대로 규명되어 있지 않다.종양환경에서 활성산소종의 조절 기능 외에 암의 진행을 다각적인 방향에서 유도하는 항산화 시스템의 역할 및 작용메커니즘이 밝혀져야 한다. 종양화 과정에서 활성산소종의 역할을 tumor promoter에서 apoptosis inducer로서 전환시킬 수 있는 핵심인자의 발굴 및 전략 시스템 개발을 위한 연구정보가 부족하다.

한편 Heme oxygenase-1(이하, 'HO-1'이라 함) 유전자의 발현은 정상조건에서 매우 낮으나 산화적 스트레스가 유발되는 환경에서 매우 급격히 증가되는 유도형 유전자 (inducible gene)이다. 따라서, 정상세포에서는 발현이 매우 낮은 수준으로 유지되지만 암세포와 같은 산화적 스트레스가 형성된 조건에서는 그 발현이 지속적으로 증가되어 있을 수 있다.

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020090030251호는 '항암 약물로에 대한 무반응성 종양의 치료 및 화학증감을 위한 ＣＫ2 저해제의 용도'에 관한 것으로, 암 치료에 사용되는 표준 화학치료 약물과 함께 카제인 키나제 2(CK2) 펩티드 제해제를 포함하며 함께, 분리되어 또는 순차적으로 투여되는 약학적 조합에 관한 것으로서, 화학치료 약물은 시스플라틴, 탁솔, 빈카 유래 알칼로이드, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에토포사이드, 마이토미신 C, 이마티닙, 이레사 및 멜카데(보르테조밉)을 포함한다. P15 펩티드 및 항암 약물 사이의 시너지 효과는 조합에서 각 세포증식억제 약물의 유효 농도가 각 세포증식억제 약물 단독 사용시보다 10- 내지 100-배 낮아지도록 하며, 기재된 약학적 조합은 항암 치료제에 의해 보고된 것에 비해 더 낮은 독성을 나타내므로 이는 암 치료에서 이의 사용에 대한 결정적인 이점을 나타낸다. 게다가, P15 펩티드로의 예비처리를 통한 이 약학적 조합의 순차적 투여는 항암 치료에 대한 저항성 종양의 화학증감을 이끌어낸다고 기재되어 있으며,

다른 관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020070050918 호는 '암의 치료'에 관한 것으로, 암의 치료를 위한 의약의 제조방법에서, (i) Hsp90의 적어도 하나의 에피토프에 대해서 특이적인 항체 또는 그의 항원 결합성 단편; 및 (ii) 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 헤르셉틴, 도세탁셀 및 시스플라틴으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항암제의 용도가 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 항암제 내성 암 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 헴 옥시데이즈 1 저해용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 캐스페이즈(caspase) 활성 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포자멸사(apoptosis) 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide)을 유효성분으로 포함하는 항암제 내성 암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,상기 항암제는 부설판(busulfan), 카르보퀀(carboquone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜파란(melfaran), 질소머스타드(nitrogen mustard), 티오테파(thiotepa), 우라실머스타드(uracil mustard), 카르무스틴(carmustine; BCUN), 염산니무스틴(nimustine hydrochloride; ACNU), 인산에스트라무틴(estramustine phosphate) 등의 알킬화제; 아자티오프린(asathiorpine), 안시타빈(ancitabine), 카르모퍼(carmofur), 독시플루리딘(doxifluridine), 플루오로우라실(fluorouracil; 5-FU), 머캅토프린(mercaptopurine; 6-MP), 티오이노신(thioinosine), 테가퍼(tegafur), 시타라빈 옥포스페이트(cytarabine ocfosfate), 펜토스타틴(pentostatin) 등의 대사길항제; 닥티노마이신(dactinomycin), 미토마이신C(mitomycin C), 블레오마이신(BLM), 다우노루비신(daunorubicin), 아드리아마이신(독소루비신)(adriamycin(doxorubicin), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin; NCS), 염산이다루비신(idarubicin hydrochloride) 등의 항종양성 항생물질; 에토포시드(etoposide; VP-16), 테니포시드(teniposide), 빈데신(vindesine), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 탁솔(파클리탁셀)(taxol(paclitaxel)), 염산이리노테칸 등의 식물유래항종양성물질; 시스플라틴(sisplatin; CDDP), 카보플라틴(carboplatin;CBDCA), 네다플라틴(nedaplatin; NDP) 등의 백금착체; 프레도니손(predonisone), 프레드니소론(prednisolone),테스토스테론(testosterone), 에스트라무스틴(estramustine), 노레티스테론(norethisterone), 초산고세레린(goserelin acetate), 초산류프로레린(leuprotelin acetate), 구연산도레미펜(toremifene citrate), 염산파드로졸(fadrozole hydrochloride), 타목시펜(tamoxifen) 등의 호르몬제, 미톡산트론(mitoxantrone; MXT) 등의 안트라사이클린계 화합물 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 항암제로서는 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin) 등의 백금착체; 닥티노마이신(dactinomycin), 미토마이신C(mitomycin C); 블레오마이신(bleomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin), 염산이다루비신(idarubicin hydrochloride) 등의 항종양성항생물질; 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 빈데신(vindesine), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 탁솔(taxol), 염산이리노테칸(irinotecan hydrochloride) 등의 식물유래항종양성물질 등이다. 보다 바람직하게는 시스플라틴, 카르보플라틴, 네다플라틴, 아드리아마이신 및 탁솔이며, 특히 바람직하게는 시스플라틴이다.

본 발명에서 사용된 Methyl pheophorbide (MPP)는 Shanghai Xianhui Pharmaceutical Co., Ltd.등으로부터 구입할 수 있다.

본 발명에 따른 MPP 화합물은 뛰어난 항암제 내성 극복작용 및 항암제효과증강작용을 갖는다. 즉, 본 발명의 항암제내성극복 혹은 항암제효과증강 조성물은 항암제와 병용 투여함으로써 내성화된 암에 대해서도 항암제의 항암작용이 발휘된다.

본 발명의 화합물을 항암제내성극복 혹은 항암제효과증강 조성물로서 이용하는 경우, 통상 전신적, 혹은 국소적으로 경구 또는 비경구로 투여된다. 비경구투여로서는 정맥내투여(점적정주(drip infusion)를 포함한다), 동맥내투여, 근육내투여, 피하투여, 복강내투여, 흉강내투여, 방광내투여, 수강(髓腔)내투여, 경피투여, 경점막투여, 직장내투여, 종양내투여 등을 들 수 있다.

본 발명의 항암제내성극복 혹은 항암제효과증강 조성물은 항암제와 동시에 투여하여도 좋고, 또는 항암제의 투여 전 혹은 투여 후에 투여하여도 좋으며, 혹은 항암제의 휴약기간 중에 투여하여도 좋다. 항암제내성극복제 또는 항암제효과증강제와 항암제의 투여경로는 동일하여도 좋고 달라도 좋다.

본 발명의 항암제 내성 극복 의약 조성물은 항암제와 병용하여 투여함으로써, 사람을 포함한 포유동물에서의 폐암(비소세포폐암, 소세포폐암), 대장암(직장암, 결장암), 소장암, 위암, 식도암, 간장암, 췌장암, 악성흑색종, 신장암, 방광암, 자궁암(자궁경암, 자궁체암), 난소암, 유암, 골육종, 악성임파종, 전립성암, 백혈병(급성백혈병, 만성백혈병), 골수종, 신경아세포종, 두경부암, 피부암, 고환종양 등의 암(악성종양)의 치료에 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, '병용 투여'라는 것은 2종류의 약제를 동시에, 연속하여, 또는 시간간격을 두고 투여하는 것을 의미한다. 2종류의 약제는 혼합물로서 투여하여도 좋고, 또는 각각의 제제로서 투여하여도 좋다. 각각의 제제로서 투여하는 경우, 각각의 투여경로는 동일하여도 좋고 달라도 좋다.

MPP 화합물, 또는 염 혹은 그 프로드러그의 투여량은 연령, 체중, 증상, 치료효과, 투여방법, 처리시간 등에 따라서 다르지만, 통상 성인 1인당 0.01mg 내지 1g의 범위에서 1일 1회로부터 수회 경구 혹은 비경구 투여된다.

병용하여 투여하는 항암제의 투여량은 통상의 암의 치료에 사용되는 투여량, 또는 그보다 적은 투여량이라면 된다. 또한 병용하여 투여하는 항암제의 투여경로는 통상의 암의 치료에서 이용되는 투여경로와 동일하여도 좋다.

또한 MPP 화합물, 또는 그 염 혹은 그 프로드러그와, 항암제를 함유하는 의약조성물로서 투여할 수도있다. 조성물 중에서의 MPP 화합물, 또는 그 염 혹은 그 프로드러그와 항암제의 중량비는 1:100 ∼ 100:1의 범위라도 좋지만, 이 범위에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 2종류의 약제를 포함하여 이루어지는 암치료용 의약키트가 제공된다. 본 발명의 암치료용 의약키트 에 있어서, 제 1 약제는 MPP 화합물, 또는 그 염 혹은 그 프로드러그를 함유하는 항암제내성극복제 혹은 항암제효과증강제이며, 제 2 약제는 항암제이다. 이들 2종류의 약제를 병용하여 투여함으로써, 암의 치료, 특히 항암제에 대하여 내성화된 암의 치료에 사용할 수 있다. 항암제 내성극복 의약 조성물은 항암제와 동시에 투여하여도 좋고 또는 항암제의 투여전 혹은 투여후에 투여하여도 좋으며, 경우에 따라서는 항암제의 휴약기간 중에 투여하여도 좋다. 이들 항암제 내성 극복 의약 조성물의 투여경로는 항암제의 투여경로와 동일하여도 좋고 달라도 좋다.

본 발명의 화합물을 경구투여하기 위한 고체조성물로 하는 경우, 정제, 환제, 산제, 과립체 등의 제형이 가능하다. 이와 같은 고체조성물에 있어서는, 하나 또는 그 이상의 활성물질이 적어도 하나의 불활성의 희석제, 분산제 또는 흡착제 등,예를 들어 유당, 만니톨, 포도당, 히드록시프로필셀룰로스, 미정성(微晶性) 셀룰로스, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 메타규산알루민산마그네슘 또는 무수규산분말 등과 혼합된다. 또한, 조성물은 통상의 방법에 따라서 희석제이외의 첨가제를 혼합시켜도 좋다.

정제 또는 환제로 조제하는 경우는, 필요에 따라서 백당, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로스 또는 히드록시메틸셀룰로스 프탈레이트 등의 위용성 혹은 장용성물질의 필름으로 피막하여도 좋으며, 2이상의 층으로 피막하여도 좋다. 또한, 셀라틴 또는 에틸셀룰로스와 같은 물질의 캡슐로 하여도 좋다.

경구투여를 위한 액체조성물로 하는 경우는, 약제적으로 허용되는 유탁제, 용해제, 현탁제, 시럽제 또는 엘릭시르(elixir)제 등의 제형이 가능하다. 이용하는 휘석제로서는 예를 들어 정제수, 에타놀, 식물유 또는 유화제 등이 있다. 또한 이 조성물은 희석제이외에 침윤제, 현탁제, 감미제, 풍미제, 방향제 또는 방부식제 등과 같은 부조제를 혼합시켜도 좋다.

비경구를 위한 주사제로 조제하는 경우는, 무균의 수성 혹은 비수성의 용액제, 가용화제, 현탁제 또는 유화제를 이용한다. 수성의 용액제, 가용화제, 현탁제로서는 예를 들어 주사용수, 주사용 증류수, 생리식염수, 시클로텍스트린 및 그 유도체, 트리에타놀아민, 디에타놀아민, 모노에타놀아민, 트리에틸아민 등의 유기아민류 혹은 무기알칼리용액 등이 있다.

수용성의 용액제로 하는 경우, 예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 혹은 올리브유와 같은 식물유, 에타놀과 같은 알콜류 등을 이용하여도 좋다. 또한 가용하제로서 예를 들어 폴리옥시에틸렌경화피마자유, 슈크로스지방산에스테르 등의 계면활성제(혼합미셀형성), 또는 레시틴 혹은 수첨레시틴(리포좀형성) 등도 이용된다. 또한, 식물유 등의 비수용성의 용해제와, 레시틴, 폴리옥시에틸렌경화피마자유 또는 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜 등으로 이루어진 에멀션제제로 할 수도 있다.

비경구투여를 위한 그 외의 조성물로서는 하나 또는 그 이상의 활성물질을 포함하며, 그 자체 공지의 방법에 의해 처방되는 외용액제, 연고와 같은 도포제, 좌제 또는 펫사리 등으로 하여도 좋다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서,상기 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide)의 유효 농도는 10μM인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide)을 유효성분으로 포함하는 헴 옥시데이즈 1 저해용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 헴 옥시데이즈 1 효소에 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide)을 처리하여 헴 옥시데이즈 1 활성을 저해하는 방법을 제공한다.

또 본 발명은 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide) 및 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는 캐스페이즈(caspase) 활성 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,상기 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide)의 유효 농도는 5∼10μM인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 캐스페이즈(caspase) 효소에 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide) 및 시스플라틴을 처리하여 캐스페이즈(caspase) 활성을 촉진하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide) 및 시스플라틴을 유효성분으로 포함하는 세포자멸사(apoptosis) 촉진용 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 세포에 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide) 및 시스플라틴을 처리하여 세포자멸사(apoptosis)를 촉진하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,상기 방법은 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide)를 5∼10μM을 처리하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

이하 본 발명을 설명한다.

Methyl pheophorbide ( MPP )의 세포 독성 효과

전이성 유방암 세포주 MDA-MB231을 대상으로 MPP의 독성 범위를 분석하였다. 다양한 농도의 MPP를 자외선이 차단된 조건하에서 세포에 24 시간 처리한 후, 세포를 수거하여 MTT assay를 수행하였다. 50 uM 농도 처리에서 세포 독성 효과가 control 비교하여 큰 차이가 없었으며 100 uM에서 10 %의 독성 효과가 나타났다(도면 1). 본 발명에서는 MPP 자체 독성은 적으며 항암제와 복합 처리 시 암세포 사멸을 높일 수 있는 치료 효과를 기대하므로 10 uM MPP를 본 발명에서 사용하였다.

MPP 에 의한 Heme oxygenase ( HO ) 활성 저해

HO은 암세포에서 증가되어 있으며 항암제에 내성을 부여하는 요인으로 작용한다. MPP가 HO의 활성을 저해할 수 있는지를 조사하였다.

우선 정상 인간 유선 세포주와 암세포주를 대상으로 HO-1의 발현 수준을 조사하였다. E-cadherin의 발현은 정상 세포와 암세포를 구분하는 마커로서 사용하였다. HO-1의 발현수준이 전이성 암 세포주인 Hs578T와 MDA-MB231에서 현저히 높았으며 이러한 양상은 E-cadherin의 발현 수준 양상과 반대이다(도면 2A).

또 HO의 활성에 미치는 MPP의 효과를 분석하였다. 자외선이 차단된 조건에서 MPP를 세포주 추출물에 처리한 후, HO의 활성을 동정하였다. Zinc protophorphyrin IX (ZnPP)는 HO의 잘 알려진 저해제로 양성 대조군으로 사용하였다. ZnPP 대비하여 저해효과는 10배 낮았지만 10 uM에서 HO의 활성을 현저히 저하시켰다(도면 2B). 그러나 ZnPP는 자체 세포독성이 강함을 고려할 때 MPP의 유효성은 의미가 있디. 이러한 결과는 phorosensitizer로 사용되던 MPP의 새로운 작용효과를 보여 준다.

MPP 와 Cisplatin 복합 처리에 의한 암세포 사멸 효과

MPP를 자외선이 없는 조건에서 MDA-MB231 세포주에 30분 동안 선 처리하고 cisplatin (50 uM)을 24시간 처리한 후 세포사멸 효과를 분석하였다. 10 uM MPP 또는 cisplatin 그 자체만으로는 세포 사멸 효과가 나타나지 않았다. MPP와 Cisplatin을 복합 처리한 조건에서 세포사멸의 증가가 현저히 확인되었다(도면 3A). 이러한 효과는 propidium Iodide (PI)으로 염색하여 subG1을 분석한 Flow cytometric analysis (FACS) 실험에서도 동일하게 관찰되었다(도면 3B).

MPP 와 Cisplatin 복합 처리에 의한 Caspase 활성 증가 효과

Apoptosis의 마커 인자인 caspase의 활성을 도면 3에서 실험한 동일한 조건으로 분석하였다. MPP와 cisplatin 복합 처리 시, 활성화된 cleaved form의 caspase-3가 MPP의 농도 증가에 따라 현저히 증가하였다(도면 4A). 이러한 cleaved caspase-3의 증가는 caspase의 활성을 동정한 실험에서도 동일하게 확인되었다(도면 4B).

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서는 MPP가 photosensitizer와는 무관한 새로운 효능을 지니고 있음을 보여 준다. 즉 MPP는 특별히 암세포에서 증가되어 있는 HO의 활성을 저해함으로써 항암제에 내성을 보이는 암 세포의 세포사멸 민감도를 현저히 증가시키는 효과가 있다.

도 1은 Methyl pheophorbide (MPP)의 세포 독성 효과를 나타낸 그림.
도 2는 Methyl pheophorbide (MPP)에 의한 HO활성저해 효과를 나타낸 그림.
도 3은 Methyl pheophorbide (MPP)와 시스프라틴 복합처리에 의한 암세포 사멸 효과를 나타낸 그림.
도 4는 Methyl pheophorbide (MPP)와 시스프라틴 복합처리에 의한 Caspase 활성화 효과를 나타낸 그림.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: Caspase Assay

이에 필요한 재료로,

10 mM N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-ρ-nitroanlide (Ac-DEVD-pNA), 100 mM DTT, HEPES Lysis buffer (1% NP-40, 25 mM Hepes, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaF, 10% glycerol, 2 mM Na2VO3, 50 mg/ml aprotinin, 5 mg/ml antipain, 2 mg/ml leupeptin, and 1 mM PMSF) 및 caspase assay buffer(1M HEPES pH7.5, 5mM EDTA)를 사용하였으며,

60 mm cell culture plate에 1x10⁶ cell을 seeding 한 후 MPP를 농도별로 선 처리하고 30분 후 cisplatin 50 uM을 24시간 동안 처리한다. media 제거 후 PBS로 세척해준 후에 HEPES Lysis buffer 300 ul에 세포를 라이시스시켰다. 상기 세포 lysate 75ul를 10mM DEVD 2.1ul, 100mM DTT 10ul, DMSO 2.5ul 및 caspase buffer 100ul에 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 배양하고, 405nm에서 3시간마다 12시간까지 측정하였다.

실시예 2: HO -1 Activity assay

균질화 버퍼(Homogenization buffer)는 [30 mM Tris-HCl, 0.25 M sucrose, 0.15 M NaCl] and [10 ug/ml leupeptin, 10 ug/ml trypsin inhibitor, 2ug/ml aprotinin, 1mM PMSF]의 조성을 가지며,

HO 활성 버퍼는 2 mM MgCl₂100 mM PBS 버퍼로, 증류수 1L에 KH₂PO₄ 8.71g, K₂HPO₄8.71g, MgCl₂ ^.6H₂O 0.407g(Subtract MW. 6H₂O)을 첨가하고, KOH로 pH 7.4로 조정하여 제조하였다.

반응 혼합액은 0.8 mM NADPH, 2 mM glucose-6 phosphate, 0.2 U glucose-6-phosphate dehydrogenase, 20 uM hemin, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), 1 mg의 rat 간 사이토졸로 수행하였다.

실시예 3: 마이크로좀 추출물(세포 또는 충분한 양의 조직)의 제조

세포(~5X10⁶ cells/100 mm 플레이트)를 콜드 PBS (pH 7.4)로 2회 세척하고, 1 ml의 콜드 균질화 버퍼로 스크랩하고, 균질화한 후 10,000 g에서, 15 분 동안 4℃에서 원심분리하였다.

그 상등액을 모아서 초원심분리에 의하여 100,000 g에서 1시간 동안 4 ℃에서 원심분리한 후 그 마이크로좀 펠렛을 2 mM MgCl₂, 10 ug/ml leupeptin, 10 ug/ml 트립신 저해제, 2 ug/ml aprotinin, 및 1 mM PMSF를 포함하는 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4)에서 재부유하였다.

실시예 4: biliverdin reductase 의 공급원으로 rat 간 사이토졸의 제조

마우스 간을 적색 혈액이 완전하게 제거될 때까지 PBS로 수차례 세척하고, 간을 HO 활성 버퍼(1 또는 2 ml)에서 얼음 하에서 균질화한 후, 10,000 g, 4 ℃에서 20분간 원심분리한 후 상등액을 초원심분리 튜브에 옮기고, 100,000 g, 4 ℃에서 1시간 동안 원심분리하고, 그 상등액을 BVR의 공급원으로 사용하였다.

반응은 다음과 같은 과정으로 수행하였다.

마이크로좀 분획(200 ul)을 반응 혼합액(200 ul)에 첨가하고,

그 샘플을 암 조건하에서 1시간 동안 37 ℃ 수조에서 배양하였고(cf. Blank=샘플 마이크로좀을 제외한 모든 물질),

적어도 2분 동안 얼음 상에 그 샘플을 놓고,

500-600 ul 클로로포름을 첨가하여 반응을 정지시키고,

30 초 동안 볼텍싱하고, 상온, 15,000 g에서 20 분간 원심분리하였고,

수층(상부) 및 클로로포름 층(하부층) 사이에 나타나는 갈색 필름을 제거하고,

그 하부층을 464 nm 및 530 nm에서 OD를 측정하기 위하여 모았다(OD 측정을 위하여 rock-made 큐빅을 사용)

bilirubin을 464nm 및 530nm 사이에서 흡광도 차이의 계산에 의하여 결정하였다 (흡광 계수, bilirubin에 대하여 40 mM^-1cm^-1)

실시예 5: PI 염색

유 세포 분석을 위하여, MDA-MB231 세포를 6웰 플레이트에서 성장하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하고, MPP로 미리배양한 후 cisplatin으로 처리하였다. 24시간 후 그 세포를 모아서 PBS (pH 7.4)로 2회 세척하였다. 80% ethanol로 30분간 고정한 후, 그 세포를 2회 세척하고 0.1% Triton X-100 및 5 μg/ml propidium iodide (PI)을 포함하는 PBS (pH 7.4)에 재부유한 후, FACScan cytometer (Program Cell-Quest, BD Biosciences)으로 분석하였다.

Claims

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유방암 세포에 인 비트로에서 5∼10μM 메틸 피오포바이드(Methyl pheophorbide)를 처리하고 50μM 시스플라틴을 처리하여 인 비트로에서 상기 유방암 세포주의 세포자멸사(apoptosis)를 촉진하는 방법.
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