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KR101303699B1 - Ｐｎａ 칩을 이용한 다종 식중독균 검출 방법 - Google Patents

Ｐｎａ 칩을 이용한 다종 식중독균 검출 방법 Download PDF

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KR101303699B1
KR101303699B1 KR1020110071815A KR20110071815A KR101303699B1 KR 101303699 B1 KR101303699 B1 KR 101303699B1 KR 1020110071815 A KR1020110071815 A KR 1020110071815A KR 20110071815 A KR20110071815 A KR 20110071815A KR 101303699 B1 KR101303699 B1 KR 101303699B1
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Abstract

본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acid) 마이크로어레이 칩을 이용한 식중독균 검출 방법, 이에 사용되는 PNA 프로브 및 PNA 마이크로어레이 칩에 관한 것으로서, 이를 사용하면, 우수한 특이도와 민감도로 6종의 식중독균을 단시간 내에 한꺼번에 검출할 수 있으므로 용이하고 체계적인 식중독균 관리를 통한 안전한 농작물 제공이 가능하다.

Description

ＰＮＡ 칩을 이용한 다종 식중독균 검출 방법{Detecting method of several food-poisoning bacteria using PNA chip}
본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브, 이것이 마이크로어레이 기판상에 고정화된 PNA 칩 및 이를 이용한 식중독균 검출 방법에 관한 것이다.
최근 전세계적으로 신선채소의 수요가 증가하면서 급격히 식중독균 오염 사례가 증가하고 있다. 이에, 주요 선진국에서는 농산물 미생물 위해 인자에 대한 안전성을 확보하기 위해 식중독균의 신속 검출 및 오염원 추적 등에 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 비롯한 첨단 분자생물학 기법을 개발 적용 하고있다. 이의 일환으로, 13종의 식중독 관련 세균을 동시에 동정하는 multiplex PCR 방법이 개발 적용되고 있으며, 신속검출 및 정량을 위한 Real time PCR 방법이 적용되고 있고, 동일 식중독균 간의 sub-typing을 위하여 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis), RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) 및 MLVA (Multiple-Locus Variable-number tandem-repeat Assay)를 이용한 방법 등 다양한 분자생물학적인 기법이 이용되고 있다.
그러나 농작물 내 식중독균의 함량이 미미한 경우가 대다수인바, 상기 방법들로는 효과적으로 식중독균을 검출할 수 없었으므로, 보다 감도 높은 검출 방법이 요구되었다.
이에, 본 발명자들이 해결하고자 하는 과제는 우수한 특이도와 민감도로 6종의 식중독균을 한번에, 즉 동시에 검출할 수 있는, PNA(Peptide Nucleic Acid) 마이크로어레이 칩을 이용한 식중독균 검출 방법 및 이에 사용되는 PNA 프로브를 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 양태로 서열번호 1 내지 7 로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된, 식중독균 검출용 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 제공한다.
상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)와 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브는 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)와 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브는 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)와 특이적으로 결합할 수 있고, 그리고 상기 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브는 이 콜라이(E. coli) 0157:H7와 특이적으로 결합할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 DNA의 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합이 펩타이드 결합(peptide bond)으로 대체되어 있으며, DNA와 같은 아데닌, 티민, 구아닌과 시토신을 가지고 있어 염기 특이적으로 DNA나 RNA와 혼성화 반응을 일으킬 수 있고, 펩타이드 결합 형태로 변화된 기본골격(backbone)의 구조적 특성으로 인해 중성을 띄는 합성 물질을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브"는 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들과 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 PNA의 단편을 의미하며 표지(Labelling)를 통해 특정 폴리뉴클레오티드들, 그의 상보적 폴리뉴클레오티드들의 존재 유무를 확인할 수 있다.
상기 PNA 프로브 설계시, 프로브의 A, G, C, T 함량비, 길이, Tm, 및 프로브 결합체(dimer) 형성 방지 등 여러 가지 제약이 따르며, DNA 프로브와는 구별되는 다른 조건이 요구된다.
본 발명에서 제공하는, PNA 프로브는 이러한 요구에 적합하도록 개발된 것으로서, 시료 내 미량으로 포함된 식중독균 검출이 가능할 뿐만 아니라, 단종 식중독균 검출은 물론이고 6종의 식중독균(바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 이 콜라이(E. coli) 0157:H7) 모두를 동시에 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 7의 염기서열로 표시되는 프로브들은 각 프로브의 염기서열에 대하여 1개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 프로브는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 포함할 수 있다. 즉, 염기서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 변형이 가능하다. 또한 PNA는 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 프로브의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프로브 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISAS에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 프로브는 기판상에 효율적으로 고정화하기 위해, 예를 들어 N-말단에 아민 또는 티올과 같은 고정화에 필요한 작용기를 포함할 수 있다.
또한, 다른 양태로 서열번호 1 내지 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 PNA 프로브 군에서 선택된 1 이상의 PNA 프로브를 포함하는, 식중독균 검출용 PNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
상기 PNA 마이크로어레이 칩은 PNA 프로브가 마이크로어레이 기판상에 고정화된 것을 의미한다. 프로브는 이에 제한되지 않지만, 예를 들어 실리카, 반도체, 플라스틱, 금, 은, 자성분자, 나이론(nylon), 폴리디메틸실록산 (poly(dimethylsiloxane), PDMS)의 고분자 화합물, 셀룰로스 또는 니트로셀룰로스에 고정화될 수 있으며, 바람직하게 유리 슬라이드 등의 기판 위에 고정화된다. 기판의 형태에 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 예를 들어 유리 슬라이드와 같이 손으로 잡을 수 있는 박판(薄板) 형태뿐만 아니라, 튜브 형태 또는 액체에 혼합하여 이송할 수 있는 0.1 ㎜ 이하 크기의 비드 형태일 수 있다. 기판의 표면은 알데히드기, 카복실기, 에폭시기, 이소티오시아네이트기, N-하이드록시석신이미딜기, 활성화 에스터기 등의 작용기, 특히 에폭시기로 기능화될 수 있다. 다만, 프로브가 고정된 후에는 배경신호 감소를 위해, 잔여 작용기를 블록킹시키는 처리를 통해 안정화시킬 수 있다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 PNA 프로브 및 이를 마이크로어레이 기판 상에 고정화한 PNA 마이크로어레이 칩을 이용하면, 6종의 식중독균 모두를 한꺼번에 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있음을 확인하였다.
이에, 다른 양태로 본 발명은 시료를 제1항 또는 제2항의 PNA 프로브와 접촉시켜 상기 시료 중 표적 서열과 PNA 프로브를 혼성화하는 단계; 및 상기 혼성화를 통해 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내 식중독균을 검출하는 방법을 제공한다.
하기에서, 상기 방법을 단계별로 설명한다.
상기 시료는 식중독균 포함 여부가 의심되는 임의의 시료일 수 있으며, 바람직하게 식중독균 포함 여부가 의심되는 농작물일 수 있다.
농작물의 경우, 특히 오염된 식중독균의 함량이 미량인 경우가 많다. 따라서, 종래 공지된 바와 같이 시료를 준비하는 경우 식중독균의 민감도 높은(sensitive) 검출이 어렵다. 이에, 본 발명자들은 상기 시료를 하기 단계를 순차적으로 거쳐 준비함으로써, 식중독균의 회수율이 현저히 향상됨을 확인하였고 결과적으로 식중독균 검출의 민감도가 향상되어 시료 내 포함된 식중독균이 10 -100 개 이상이면 6종의 식중독균 모두를 한번에 명확히 검출 가능함을 확인하였다:
식중독균 포함 여부가 의심되는 농작물에서 초음파처리(sonication)를 통해 식중독균을 분리하는 단계, 분리된 식중독균을 증균하는 단계, 및 상기 증균된 식중독균의 표적 유전자를 증폭하는 단계, 증폭된 유전자를 칩과 화학반응 하는 단계 그리고 마지막 결과를 확인하는 단계가 있다. 이러한 단계에서 DNA 칩에서는 여러 개의 프로브를 한꺼번에 증균에 사용하는 데 한계가 있으나 PNA의 고도의 특이성으로 단 한 번의 ITS 부분 증폭만으로 6개의 세균에 특이적인 부분을 증폭하여 화학반응을 할 수 있게 된다. PNA 칩을 이용한 진단 방법에는 2~3개의 PCR 프로브를 이용한 증폭만으로 6개의 세균을 동시에 진단 가능하게 된다.
상기 순서로 순차적으로 시료를 준비함으로써, 본 발명자들은 먼저 증균하고 후차적으로 균 분리를 행하는 경우에 농작물에서 분비되는 일부 물질에 의해 PCR이 억제되는 것을 막을 수 있으므로, 표적 유전자를 효과적으로 증폭시킬 수 있을 것이라고 예상하였으나, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명자들은 증균 시간을 달리하여, 6시간, 12시간, 및 48시간 동안 증균한 결과, 6시간 동안 증균한 후 식중독균을 검출하였을 때 가장 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 이에, 증균 시간은 바람직하게 4-8시간, 더욱 바람직하게 5-7시간, 가장 바람직하게 5.5-6.5시간이다. 4시간 미만으로 증균하는 경우에 충분한 증균이 어렵고, 8시간을 초과하여 증균하는 경우에 특이성이 많이 저해된다. 이는 오염 세균의 증식이 진단하려는 특이 세균의 증식을 저해하여 특이반응이 많이 감소하기 때문이 것으로 생각된다.
상기 증폭을 위해서 당업계 공지된 다양한 PCR 방법이 이용될 수 있으며, 예를 들어 Hot-start PCR, Nested PCR, Multiplex PCR, DOP(degenerate oligonucleotide primer) PCR, Quantitative RT-PCR, In-Situ PCR, Micro PCR, 또는 Lab-on a chip PCR 등이 이용될 수 있으나, 바람직하게 Nested PCR(Nested polymerase chain reaction) 방법을 이용할 수 있다. 본 발명자들은 Nested PCR을 이용해 표적 유전자를 증폭하였을 때, 식중독균의 회수율이 현저히 향상됨을 확인하였고 결과적으로 식중독균 검출의 민감도가 향상됨을 확인하였다. 또한, 더욱 바람직하게 Asymmetric PCR 방법을 이용할 수 있는바, 바람직한 정방향 프라이머: 역방향 프라이머의 양은 1: 40-50, 더욱 바람직하게 1: 50이다.
상기 표적 유전자는 5종의 식중독균, 즉 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)는 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역이고, 이 콜라이(E. coli) 0157:H7)는 eae A 유전자 및 per 유전자이다.
상기 표적 유전자 증폭을 위해 바람직하게 ITS 영역의 증폭을 위해 5종의 식중독균 모두 서열번호 8 및 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍을 이용할 수 있고, 이 콜라이(E. coli) 0157:H7)는 eae A 유전자 증폭을 위해 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍과 per 유전자 증폭을 위해 서열번호 12 및 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍이 사용될 수 있다. 상기 프라이머 쌍은 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법 (1979, Meth, Enzymol.68:90-99), 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4,458,066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 서열번호 8 내지 13의 염기서열로 표시되는 프라이머들은 각 프라이머의 염기서열에 대하여 1개 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기서열도 포함할 수 있다.
그 다음, 시료를 본 발명에 따른 PNA 프로브와 접촉시켜 상기 시료 중 표적 서열과 PNA 프로브를 혼성화한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "혼성화"란 PNA 프로브와 표적 유전자의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자(혼성체)를 형성하는 과정을 말한다.
상기 PNA 프로브는 마이크로어레이 기판상에 고정화된 것, PNA 마이크로어레이 칩을 이용할 수 있다.
마지막으로, 상기 혼성화를 통해 발생하는 신호를 검출한다. 당업계 공지된 다양한 방법을 이용하여 신호 검출이 가능하며, 예를 들어 형광 표지 식중독균을 이용한 경우에 형광 신호 검출 방법을 이용한다.
본 발명에 따른 PNA(Peptide Nucleic Acid) 마이크로어레이 칩을 이용한 식중독균 검출 방법 및 이에 사용되는 PNA 프로브를 사용하면, 우수한 특이도와 민감도로 6종의 식중독균을 단시간 내에 한꺼번에 검출할 수 있으므로 용이하고 체계적인 식중독균 관리를 통한 안전한 농작물 제공이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 PNA 프로브 제작을 위하여 사용된 유전정보를 나타내는 표이다.
도 2는 세균 특이적인 ITS 부분 정보를 찾기 위해 사용된 서열들의 예들이다.
도 3은 최적 프로브를 선별하기 위한 후보 프로브들의 평가 결과를 보여주는 사진 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예에서 제작하여 사용한 PNA 칩에 있어 프로브의 종류와 위치를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 PCR 조건으로 수행한 특정 병원균들의 증폭 결과의 전기 영동 사진 결과이다.
도 6은 증균 과정을 거치지 않는, 농산물에 오염되어 있는 유해세균 회수율을 측정하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 7 및 8은 일반적인 PCR 검출법으로 검출 가능한 최저 농도를 파악하기 위한 실험의 전기영동 사진 결과이다.
도 9는 본 발명에 따른 세균 분리 후 증균 과정을 보여주는 개략도이다.
도 10은 증균 시간에 따른 샘플의 PCR 결과(1~3: 104, 4~6: 102, 7~9: 10)이다.
도 11은 본 발명에 따른 PNA 칩을 이용한, 증균 시간에 따른 샘플의 검출 한도 평가 결과이다.
도 12는 nested PCR를 수행하여 식중독균의 검출 한계를 측정한 전기영동 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.
실시예 1. PNA 프로브 제작
바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 및 이 콜라이(E. coli) 0157:H7를 검출하기 위하여 기존의 열람이 가능한 세균의 총 염기서열 및 ITS 부분을 검토하여 PNA 프로브를 설계하였다. PNA 프로브는 ITS 부분의 세균 특이적인 부분을 우선적으로 선별하였으며 E. coli 0157:H7 등은 특이성을 찾지 못하여 다른 특이 유전자를 프로브로 하였다. 타깃이 된 해당 ITS 부분 및 일 예들을 각각 도 1 및 2에 나타내었다.
구체적으로, 한국 등록특허 제464,261호의 방법과 유사하게 제조하였다. PNA 올리고머를 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체와 기능화된 레진으로부터 고체상 합성법(solid phase synthesis)으로 합성하였다. N-말단에 스페이서로 8-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-3,6-디옥사-옥탄산을 2회 반복 사용하였다. PNA가 레진에 부착된 상태로 다음 반응에 이용하였다. 상기 제조된 레진에 부착된 PNA를 1 M 피페리딘의 DMF(dimethylformamide) 용액으로 20 분간 처리하여 N-말단의 Fmoc 보호기를 제거한 후 DMF로 3회 세척하였다(과정 (a)). 1 당량의 비스 Fmoc 단량체에 1 당량의 HOBt(1-hydroxybenzotriazole), 2 당량의 DIC(diisopropylcarbodiimide) 및 DMF를 가하고 1 시간 동안 흔들어 준 후 DMF로 3회 세척하였다(과정 (b)). 5% 무수 초산(acetic anhydride)과 6% 루티딘(lutidin)이 함유된 DMF를 첨가하고 상온에서 5 분간 흔들어준 후 DMF로 3회 세척하였다(과정 (c)). 상기 (a)~(c) 과정을 2~3회 반복하여 실시하고 최종적으로 과정을 반복하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 아민기가 4개인 경우 2회 반복하고 8개인 경우 3회 반복하였다. PNA가 부착된 레진을 m-크레솔/TFA(trifluoroacetic acid)(1/4 v/v) 용액으로 2 시간 처리하여 PNA를 레진으로부터 떼어내고, 에테르(ether)로 처리하여 석출시킨 후 HPLC로 정제하여 하기 표1과 같이 다중 아민기가 포함된 프로브를 제작하였다.
Figure 112011055870528-pat00001
이들 프로브들을 이용하여 PNA 칩을 제조한 다음, 이들 프로브에 대한 선별 과정을 통해 특이도가 높은 프로브를 선별하였다. 비특이적 반응을 보이는 프로브들은 제외한 결과, 상기 표에서 노란색으로 표시된 프로브들이 선정되었다. 프로브 선별 결과를 도 3에 나타내었다. 2차에 걸친 후보군 프로브들에 대한 선별 과정을 통해 비특이 반응을 나타내지 않고 특이 반응 singal intensity가 가장 높은 프로브를 최적 프로브로 선정하였다. 결과 분석은 PNA 칩 이미지와 프로브 마다의 signal intensity에 대한 background와의 비율(ratio)의 SBR 분석을 통해 positive 프로브를 확인한 후 대상 균주를 확인하는 절차를 거쳤다.
상기 표 1 및 도 3의 평가 실험결과에 나타나는 바와 같이, 여러 평가 실험을 거쳐 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브 (AACTATCTCTCATATATAAATGTA), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)와 특이적으로 결합하는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브 (GAAATACAAATAATCATATCC), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 특이적으로 결합하는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브 (TCACAAGATTAATAACGCG), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)와 특이적으로 결합하는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브 (ACCTCAGATACGCATTGC), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)와 특이적으로 결합하는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브 (GAAGCGTACTTTGCAGTG, 상기 표 1에는 표시되지 않음), 그리고 이 콜라이(E. coli) 0157:H7와 특이적으로 결합하는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브 (TGTCATCAAGATCTGAACTT, eaeA, 상기 표 1에는 표시되지 않음) 및 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브 (GCACCCTATAGCTGAG, per, 상기 표 1에는 표시되지 않음)를 발명하였다.
실시예 2. PNA 칩 제작
1) PNA chip 디자인
선별된 본 발명의 서열번호 1 내지 7의 정제된 PNA 올리고머를 스팟팅 완충액에 50 mM로 희석하여 에폭시기로 기능화된 유리판에 핀 방식으로 스팟팅하고, 일정하게 습도가 유지되는 상온에서 4 시간 동안 정치하였다. 이후 DMF에 가하고 15 분간 초음파 세척하였다. 0.1 M 석시닉언하드라이드를 첨가한 DMF에 가하고 40 ℃에서 2 시간 동안 반응하지 않은 아민기를 제거하였다. 반응 후 반응액을 제거하고 DMF, 3차 증류수 순으로 15 분간 초음파 세척하였다. 이후 0.1 M 에탄올아민이 함유된 100 mM 트리스 완충액(Tris-HCl)을 가하고 고체 표면의 잔여 에폭시기를 불활성화하였다. 이 유리 기판을 3차 증류수로 15 분간 초음파 세척하는 과정을 2회 반복한 후, 끓는 물에서 5 분간 처리하고 3차 증류수를 이용하여 5 분 간 세척하고 건조하였다. 이후 100 ㎕의 혼성화 용액이 함유될 수 있도록 제작된 실리콘 반응기를 유리판 위에 밀착시켰다. 도 4에 PNA 칩에 위치한 프로브의 종류와 위치를 모식적으로 나타내었다.
2) 프라이머 디자인
식중독균 PCR 프라이머는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)는 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역을 검출할 수 있는 프라이머 부위를 사용하였고, 이 콜라이(E. coli) 0157:H7)는 eae A 유전자 및 per 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 부위를 사용하였다. 이러한 프라이머는 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 염기서열을 갖는다.
Target Primer Primer sequence (5'→3') PCR product size (bp)
ITS 16S-1387F GCCTTGTACACWCCGCCC
(서열변호 8)		 500~900
23S-200R ACTTAGATGTTTCAGTTC
(서열번호 9)
eaeA
(only for E. coli O157:H7)		 eaeA-F CAATTTTTCAGGGAATAACATTG
(서열번호 10)		 120
eaeA-R AAAGTTCAGATCTTGATGACATTG
(서열번호 11)
per
(only for E. coli O157:H7)		 per-F CGATGCCAATGTACTCGGAAAAATA
(서열번호 12)		 120
per-R TTCGATAGGCTGGGGAAACTAGGTA
(서열번호 13)
적절한 PCR 조건을 찾기 위해 PCR annealing temperature를 54~64℃ 사이에서 2℃씩 증가시켜 본 결과, 60℃에서 annealing 하는 경우에 가장 효율적인 PCR이 가능함을 확인할 수 있었다. 그 외 PCR 조건을 확립하였는바, 하기 표 3에 나타냈다.
또한, Asymmetric PCR을 통해 PCR 하여 칩 signal을 증폭시킬 때 가장 우수한 효과를 발휘하는 정방향 프라이머 양 : 역방향 프라이머 양을 비교해 본 결과, 그 비가 1: 1, 1: 10, 1: 50 중에서, 1: 50인 경우에 가장 우수한 PCR 결과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112011055870528-pat00002
상기 언급된 실험 조건으로 하기 표 4의 샘플 균주들에 대해 실시한 전기영동 결과를 도 5에 나타내었다.
Lane Strain Lane Strain
M 100 bp ladder
1 7-1 B. cereus 13 V. parahaemolyticus
2 7-2 B. cereus 14 Y. enterocolitica-1 (ATCC 9610)
3 4-1 L. monocytogenes 15 Y. enterocolitica-2 (ATCC 55075)
4 4-2 L. monocytogenes 16 3-1 Salmonella enterica
5 4-3 L. monocytogenes 17 3-2 Salmonella enterica
6 L. monocytogense (LMC ScottA) 18 3-3 Salmonella enterica
7 L. monocytogense (LO 28) 19 E. coli O157:H7
8 6-1 S. aureus 20 2-1 Enterobactersakazakii
9 6-3 S. aureus 21 5-1 Shigellasonnei
10 6-11 S. aureus 22 5-2 Shigellafleneri
11 C. perfringens H3 23 5-3 Shigellafleneri
12 Clostridium perfringens N Negative control
실험예 1. 농산물에 오염되어 있는 세균 회수율
농산물에 오염된 유해세균을 회수할 때, 증균 과정을 거치지 않는 경우의 유해세균 회수율을 도 6의 방법에 따라 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타냈다.
Figure 112011055870528-pat00003
검출 한도(detection limit)를 파악하기 위하여 PCR을 수행하였으며 (이때의 annealing Tm은 50℃이었음), 그 결과를 도 7 및 8에 나타내었다.
도 7 및 8에 나타나는 바와 같이, 일반적인 PCR 방법으로는 적어도 약 10,000 마리의 세균이 있어야만 detection이 가능한 것으로 확인되었다.
실험예 2. 세균 회수율 증가방법 ( 증균 과정)
(1) 세균 분리( sonication ) 후 증균
유해세균이 한두 마리 있을 경우에도 검출가능하기 위하여 증균 과정을 넣었으며, 증균 과정은 여러 가지 방법 중 채소에서 병균을 분리한 상태로 증균시키는 것이 가장 효과가 좋았다.
농산물에 오염되어 있을 세균의 증균 및 분리 과정을 1) '선 증균 후 분리' 및 2) '선 분리 후 증균'의 두 가지 방법으로 나누어 한 결과 (도 9 참조) 선 분리 후 증균의 과정의 결과가 월등히 좋았다. 이는 분리 하기 전에 증균을 하면 식물에서 나오는 이물질이 함께 녹아 나와 PCR 증폭과정에 저해 요소로 작용하는 것으로 추정된다.
(2) 세균 증균 시간
Escherichia coli 0157:H7, Salmonella typhimurium , 및 Yersinia enterocolitica를 대상으로 증균 시간을 달리하여 PCR을 해본 결과, 모든 균들이 6시간 배양하였을 때 가장 민감도가 우수했다. 또 6시간 증균 과정을 거쳐 채소 내 균이 10 개 또는 100개 이상만 포함되면 검출이 가능함을 알 수 있었다.
6시간 증균 후 샘플의 PCR 결과를 도 10에 나타내었으며, 본 발명에 따른 PNA 칩을 이용한 검출 결과를 도 11에 나타내었다.
실험예 3. 세균 회수율 증가방법 ( nested PCR )
검출 감도를 높이기 위하여 nested PCR 방법을 이용하여 표적 유전자를 증폭시킨 결과, 감도가 현저히 향상됨을 확인하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다. 최종적으로 PNA 칩과 hybridization하여 검출 정도를 평가하였다. Nested PCR을 사용한 경우 100 마리의 세균에서도 PNA 칩으로 유해세균의 진단이 가능하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브; 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)와 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브; 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브; 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)와 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브; 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)와 특이적으로 결합 수 있는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 PNA 프로브를 포함하는 식중독균 검출용 PNA 프로브 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 염기서열로 이루어지는 이 콜라이(E. coli) 0157:H7와 특이적으로 결합할 수 있는 것에 특징이 있는 PNA 프로브를 추가로 포함하는, 식중독균 검출용 PNA 프로브 세트.
  3. 제1항 또는 제2항의 식중독균 검출용 PNA 프로브 세트를 포함하는, 식중독균 검출용 PNA 마이크로어레이 칩.
  4. 삭제
  5. 시료를 제1항 또는 제2항의 식중독균 검출용 PNA 프로브 세트와 접촉시켜 상기 시료 중 표적 서열과 식중독균 검출용 PNA 프로브 세트를 혼성화하는 단계; 및
    상기 혼성화를 통해 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함하는,
    시료 내 식중독균을 검출하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식중독균 검출용 PNA 프로브 세트는 마이크로어레이 기판상에 고정화된 것을 특징으로 하는 시료 내 식중독균을 검출하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 시료는 하기 단계를 순차적으로 거쳐 준비되는 것에 특징이 있는 시료 내 식중독균을 검출하는 방법:
    식중독균 포함 여부가 의심되는 농작물에서 초음파처리(sonication)를 통해 식중독균을 분리하는 단계, 분리된 식중독균을 증균하는 단계, 및 상기 증균된 식중독균의 표적 유전자를 증폭하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 증균은 4-8시간 동안 수행되는 것에 특징이 있는 시료 내 식중독균을 검출하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 증폭을 위해 Nested PCR(Nested polymerase chain reaction)을 하는 것에 특징이 있는 시료 내 식중독균을 검출하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 식중독균 중 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)의 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역 증폭을 위해 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍이 사용되는 것에 특징이 있는 시료 내 식중독균을 검출하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 증폭시 사용되는 정방향 프라이머: 역방향 프라이머의 양이 1: 50인 것에 특징이 있는 시료 내 식중독균을 검출하는 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 식중독균 중 이 콜라이(E. coli) 0157:H7 eae A 유전자 증폭을 위해 서열번호 10 및 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍이 사용되는 것에 특징이 있는 시료 내 식중독균을 검출하는 방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 식중독균 중 이 콜라이(E. coli) 0157:H7 per 유전자 증폭을 위해 서열번호 12 및 서열번호 13으로 표시되는 염기서열로 이루어지는 프라이머 쌍이 사용되는 것에 특징이 있는 시료 내 식중독균을 검출하는 방법.
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