KR101299299B1 - 암면역 요법용 세포의 제조방법 - Google Patents

Abstract

NK 세포 및 임파구의 2종류의 세포, 또는, NKT 세포, NK 세포 및 임파구의 3종류의 세포가 증식 및 활성화한 의약 조성물 및 이들의 의약 조성물의 제조방법을 제공한다. 항사람 CD3 모노클로날 항체와 항사람 CD161 모노클로날 항체가 고상화된 배양 용기내에, 말초혈로부터 분리한 말초혈 임파구 혼합물을, 인터로이킨-2를 함유하는 임파구 배양액과 함께 수용하여 배양하는 것에 의해, NK 세포 및 임파구의 2종류의 세포, 또는, NKT 세포, NK 세포 및 임파구의 3종류의 세포를 거의 동시에, 용이하게, 게다가 효율적으로 증식 및 활성화한다.

Description

암면역 요법용 세포의 제조방법{THE METHOD FOR PRODUCTION OF CELL FOR CANCER IMMUNOTHERAPY}

본 발명은 의약 조성물 및 의약 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 상세하게는, 면역 요법용의 의약 조성물, 및 면역 요법용의 의약 조성물의 제조방법에 관련된 것이다.

현재, 암의 치료법은, 수술, 화학요법(항암제 치료), 방사선 요법이 주류로 되고 있지만, 항암제에 의한 치료, 방사선에 의한 치료는 부작용의 문제가 있어, 최근, 부작용이 없는 암의 제 4의 치료법으로서 면역 세포 요법이 주목받고 있다. 현재 실시되고 있는 면역 요법은, 환자의 임파구 혹은 내추럴 킬러(Natural killer : NK) 세포만을 활성화 및 증식하여, 환자에게 점적(点滴) 주사에 의해서 되돌린다는 방법이다.

또한, 최근, 면역계를 구성하는 임파구의 하나로서, 새롭게 내추럴 킬러 T(NKT) 세포가 발견되어, 주목받고 있다. NKT 세포는, 정상인이라도 사람 말초혈 임파구에 0.3~0.5% 정도 밖에 존재하지 않는 세포이며, T세포 수용체(TCR：항CD3 항체와 반응하는 수용체)와 NK 세포 마커(CD161 분자)의 양쪽을 겸비하고, 종속(種屬)에 단지 1종류 밖에 없는 MHC(주요 조직 적합 항원계：개개의 세포의 특징을 제시하는 항원계) 모양 분자인 CD1d에 의해서 암세포로부터 제시되는 암 항원을 인식하여, 암을 공격하여 살상하는 것이 명확하게 되고 있다. 또한, NKT 세포를 활성화 및 증식시키려면, 당지질 α-갈락토실세라미드(α-GalCer)가 불가결하다는 것이 알려져 있다.

또한, 특허문헌 1에는, 특정의 α-갈락토실세라미드가 골수 세포의 증식 촉진 효과를 가지고 있는 점이 발견되어, 특정의 식으로 표시되는 α-갈락토실세라미드의 1종 또는 2종류 이상을 유효 성분으로서 함유하는 골수 세포 증식 촉진제가 개시되어 있다. 즉, 특허문헌 1에는, 단핵구 획분을 배지에서 조제하여, 상기 골수 세포 증식 촉진제와, 조제된 단핵구 획분을 가하여 배양하는 방법이 기재되어 있다.

특허문헌 1 : 일본특허 제 3088461호 명세서

그러나, 특허문헌 1에 기재된 골수 세포 증식 촉진제가 증식하는 골수 세포는 단구이며, NK 세포 및 임파구의 2종류의 세포를 거의 동시에, 혹은, NKT 세포, NK 세포 및 임파구의 3종류의 세포를 거의 동시에, 더구나 용이하게 활성화 및 증식시키는지 여부가 불명했다.

본 발명은, 이상의 점을 감안하여 창안된 것이고, NK 세포 및 임파구의 2종류의 세포를 거의 동시에, 혹은, NKT 세포, NK 세포 및 임파구의 3종류의 세포를 거의 동시에, 더구나 용이하게 활성화 및 증식하는, 암면역 요법용 세포의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 암면역 요법용 세포는, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체와, 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체와, 임파구 배지에 의해서 배양된 임파구 혼합물을 함유한다.

여기에서, 상기 임파구 혼합물은, 적어도 내추럴 킬러(NK) 세포 및 임파구의 2종류의 세포를 함유하는 것인 것이 바람직하다. NK 세포 및 임파구의 2종류의 세포를 거의 동시에 용이하게 활성화 및 증식시키는 것이 가능하기 때문이다.

또한, 보다 바람직하게는, 상기 임파구 혼합물은, 적어도 내추럴 킬러 T(NKT) 세포, 내추럴 킬러(NK) 세포 및 임파구의 3종류의 세포를 함유하는 것이다. NKT 세포, NK 세포 및 임파구의 3종류의 세포를 거의 동시에 용이하게 활성화 및 증식시키는 것이 가능하기 때문이다.

여기에서, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체와, 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체와, 임파구 배지에 의해서 임파구 혼합물을 배양하기 때문에, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체의 조합에 의해, NK 세포 및 임파구의 2종류의 세포를 G-CSF의 비존재하에서 동시에, 혹은, NKT 세포, NK 세포 및 임파구의 3종류의 세포를 G-CSF의 비존재하에서 동시에, 활성화 및 증식할 수 있다.

또한, 본 발명의 암면역 요법용 세포에 있어서, 임파구 혼합물이, 말초혈로부터 분리한 말초혈 임파구의 집합물인 경우, 채혈이 용이하여 환자에게 고통을 주는 경우가 거의 없고, 말초혈로부터 임파구 혼합물을 분리할 때에 번잡한 시간이 걸리지 않으며, 또한, 혈액을 냉장 보존으로 수송할 수 있다.

또한, 본 발명의 암면역 요법용 세포에 있어서, 임파구 배지가, 1000U/ml의 인터로이킨-2를 함유하는 경우, 세포의 활성화 및 증식을 촉진할 수 있다.

또한, 상기의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 암면역 요법용 세포의 제조방법은, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체의 존재하에서, 임파구 배지에, 내추럴 킬러(NK) 세포 및 임파구의 2종류의 세포를 함유하는 임파구 혼합물을 가하여, 상기 2종류의 세포를, 과립구 코로니 자극 인자의 비존재하에서 거의 동시에 공배양하여 활성화 및 증식시킨다.
또한, 본 발명의 암면역 요법용 세포의 제조방법은, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체의 존재하에서, 임파구 배지에, 내추럴 킬러T(NKT) 세포, 내추럴 킬러(NK) 세포 및 임파구의 3종류의 세포를 함유하는 임파구 혼합물을 가하여, 상기 3종류의 세포를 과립구 코로니 자극 인자의 비존재하에서 거의 동시에 공배양하여 활성화 및 증식시킨다.

여기에서, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체의 존재하에서, 임파구 배지에 임파구 혼합물을 가하기 때문에, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체의 조합에 의해, NK 세포 및 임파구의 2종류의 세포를 G-CSF의 비존재하에서 동시에, 혹은, NKT 세포, NK 세포 및 임파구의 3종류의 세포를 G-CSF의 비존재하에서 동시에, 활성화 및 증식할 수 있다.

또한, 본 발명의 암면역 요법용 세포의 제조방법에 있어서, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체의 존재하에서, 임파구 배지에 임파구 혼합물을 가하여 배양한 후, 임파구 혼합물을 포함하는 임파구 배지를, 비고상화 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 비고상화 항사람 CD161 모노클로날 항체의 존재하에서, 다른 임파구 배지에 가하는 경우, 세포에의 과잉의 자극을 줌으로써 생기는 아포토시스(세포사)를 억제할 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명의 실시의 형태에 관하여 설명한다.

우선, 본 발명의 방법에 의해 증식 및 활성화시키는 3종류의 세포 중 특히 NKT 세포(Vα24⁺Vβ11⁺세포)는, 전술한 바와 같이 정상인의 말초혈 중에서도 0.3~0.5%로 극히 미량밖에 존재하지 않고, 강한 항종양 작용, 항알레르기 작용, 자기면역 질환 억제 작용, 장기 이식 후의 거절반응 억제 작용 등을 가지는 것이 알려진 세포이다.

또한, NKT 세포는 세포막 표면에 NK 세포 마커인 CD161 분자와, CD3 분자가 회합한 T세포 수용체를 공유하고 있다. 사람의 NKT 세포는, T세포 수용체가 Vα24⁺Vβ11⁺의 배열을 가지고 있다. 그러므로, 사람의 NKT 세포는 항CD3 항체와 항CD161 항체와 결합하면 활성화하고, 증식할 수 있다. 임파구는, T세포(T임파구)라고도 불리우고 세포막 표면에 T세포 수용체(CD3 분자)를 가지며, 항CD3 항체와 결합하면 활성화하고, 증식할 수 있다. NK 세포는 세포막 표면에 CD161 분자를 발현하고, 항CD161 항체와 결합하면 활성화하고, 증식할 수 있지만, T세포 수용체를 가지고 있지 않기 때문에 항CD3 항체와는 결합하는 경우가 없고, 항CD3 항체에 의해서 활성화 및 증식하는 경우는 없다.

이와 같은 NKT 세포(Vα24⁺Vβ11⁺세포), NK 세포 및 임파구를 본 발명에 있어서 증식 및 활성화하려면, 출발 물질로서 임파구 혼합물을 이용한다.

또한, 임파구 혼합물은, 생체로부터 채취 가능한 임파구의 집합이며, 말초혈임파구, 탯줄혈 임파구, 림프절 임파구, 종양내 침윤 임파구, 암성 복수ㆍ암성 흉수 침윤 임파구 등이 있다. 임파구 혼합물은 생체의 각 부로부터 채혈, 바이옵시(Biopsy)(생체천자), 드레나지(배액법), 수술 등의 방법에 의해 채취할 수 있다. 임파구를 포함하는 세포 혼합물은 목적에 따른 방법에 의해서 처리하고, 비중 1.077의 임파구 분리용 시약에 의해서 임파구 혼합물로서 분리할 수 있다.

이 임파구 혼합물로부터 NKT세포를 단리시켜 사용하는 것도 가능하지만, 수고를 간략화하는 등의 이유로, 임파구 혼합물 상태에서 사용하는 것이 최적이다.

임파구 혼합물 중의 NKT 세포(Vα24⁺Vβ11⁺세포), NK 세포, 임파구만을 단 단리하여 사용할 수도 있지만, 고가의 기기를 필요로 하는 것, 고도의 기술이 필요한 것, 단리에 많은 시간과 경비를 소비할 필요가 있어, 특정의 시설에서밖에 할 수 없다는 이유에서 바람직하지 않다.

또한, 면역 요법용 세포 의약 조성물에, NKT 세포(Vα24⁺Vβ11⁺세포), NK 세포 및 임파구가 활성 및 증식된 임파구 혼합물을 이용하는 경우에는, 이 임파구 혼합물은, 투여되는 환자 자신의 세포인 것이 바람직하다.

또한, 이 임파구 혼합물을 배양하기 위한 배지인 임파구 배양액으로서는, 종래부터 임파구의 세포 배양에 이용되고 있는 RPMI-1640을 기반으로 하여 작성되고 있는 각종의 배양액이 이용 가능하다.

또한, 세포의 초기 배양용 및 2차 배양용의 임파구 배양액에는, 1000U/ml(1000단위/ml)의 인터로이킨-2(IL-2)를 함유시키는 것이 바람직하다. 저농도의 IL-2보다도 1000U/ml의 IL-2를 함유시키는 것에 의해, 세포의 증식율 및 활성도를 향상할 수 있기 때문이다.

또한, IL-2는 세포의 증식 및 활성화에 영향을 주는 것이 알려져 있는 사이트카인(세포로부터 유리되는 면역 물질)이며, 인공적으로도 합성할 수 있기 때문에, 본 발명에 있어서도 사용할 수 있다.

또한, α-갈락토실세라미드를 이용한 실험계에서, 암환자의 임파구를 배양할 때, G-CSF(과립구 코로니 자극 인자)를 함유시키는 것에 의해 NKT 세포의 증식을 개선할 수 있는 것이 보고되어 있지만, 본 발명에 있어서는, 일부러 G-CSF를 사용하지 않더라도, 용이하게 배양할 수 있어, 활성도 및 증식율을 향상하는 것을 기대할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 임파구 혼합물에 항원 제시 세포(암항원을 NKT 세포, NK 세포, 임파구에 전달하는 세포)를 가하여도 되지만, 여기에서는, 항원 제시 세포를 가하지 않는 배양 방법을 사용하는 것이 적절하다. 본 발명은, 항원 제시 세포를 가하지 않아도 세포의 증식 및 활성화에 주는 영향은 적고, 이것에 의해 임파구 배양 방법의 수고를 간략화할 수 있기 때문이다.

한편, 본 발명의 초기 배양 및 2차 배양에서 세포를 증식 및 활성화하는 방법에서 사용하는 배양 용기는, 임파구 배양액 및 임파구 혼합물을 수용 가능한 용기 본체에, 항CD3 항체 및 항CD161 항체가 이중 고상화된 고상화 배양 용기를 사용한다. 더욱이 배양을 계속하는 경우는, 항CD3 항체나 항CD161 항체로 고상화되어 있지 않은 비고상화 배양 용기(CO₂ 투과백) 내에서 배양을 계속하는 것을 특징으로 한다.

또한, 초기 배양 및 2차 배양을 위한 배양 용기 본체로서는, 특별히 한정되는 것이 아니고, 경질 수지제 용기, 연질 수지제 가요성 용기, 유리제 용기 등이 사용 가능하다.

또한, 항CD3 항체 및 항CD161 항체는, 이 용기 본체의 임파구 배양액 및 임파구 혼합물과 접하는 접액 표면의 적어도 일부, 바람직하게는 전부에 고상화되는 것이 좋다.

고상화에 사용되는 항CD3 항체는, NKT 세포, T세포 표면의 T세포 수용체에 회합하여 존재하는 CD3 분자가 특이적으로 반응하는 항체이다.

또한, CD3 분자는, T세포 수용체와 함께 항원 제시 세포의 MHC(주요 조직 적합 항원계：암세포의 표면에 발현하는 항원으로, T세포에 암세포를 인식시켜, 암세포의 배제에 관련되는 면역 반응을 개시시킨다) 분자 및 항원을 인식하여 세포내에 전달하기 위해서 기능하는 분자이며, 항CD3 항체에 의해 NKT 세포, T세포에 자극이 주어지는 것에 의해, 세포의 증식 및 활성화가 야기된다.

또한, 고상화에 사용되는 항CD161 항체는, NKT 세포 표면이나 NK 세포 표면에 존재하는 NKR-P1A(CD161) 분자가 특이적으로 반응하는 항체이다. 이 CD161 항체는 NKT 세포 및 NK 세포의 표면 마커로서 알려져 있지만, NKT 세포 표면의 CD161 분자와의 리간드(배위자 또는 결합 부위)는 아직도 분명하지 않다. 그러나, 항CD161 항체로 NKT 세포, NK 세포를 자극하는 것에 의해, NKT 세포, NK 세포의 활성화에 영향을 준다.

또한, 배양 용기에는, 이들의 항CD3 항체와 항CD161 항체와의 양쪽을 고상화 시킬 필요가 있다. 한쪽만으로는, NKT 세포는 증식 및 활성화할 수 없기 때문이다.

다음에, 고상화의 방법에 관하여 설명한다. 항CD3 항체를 배양 용기에 고상화하려면, 예를 들면, 멸균된 인산 완충액(PBS)을 이용하여 항CD3 항체를 1㎍/ml의 농도로 되도록 조정하고, 이 항체를 배양 용기에 주입하고, 24시간 실온에서 정치 한 후, 적량의 인산 완충액으로 여분의 항체를 세정하는 것에 의해 항CD3 항체를 고상화한다.

그 후, 멸균된 인산 완충액으로 항CD161 항체를 10㎍/ml의 농도로 되도록 조정하고, 이 항체를 배양 용기에 주입하고, 24시간 실온에서 정치한 후, 적량의 인산 완충액으로 여분의 항체를 세정하는 것에 의해 항CD161 항체를 고상화한다. 이와 같은 고상화 방법은 특별히 한정되는 것이 아니고, 적절히 선택하는 것이 가능하다.

다음에, 이와 같이 이중 고상화한 배양 용기를 이용하여 NKT 세포, NK 세포, 임파구를 동시에 증식 및 활성화시키는 방법에 관하여 설명한다.

본 발명에서는 임파구 혼합물을 임파구 배양액과 함께 배양 용기내에 수용하여 배양한다. 여기에서는, 상기와 같이 조제된 임파구 배양액에 임파구 혼합물을 혼합하여 부유(분산)시킨 상태에서, 배양 용기내에 수용하여 37℃의 CO₂ 인큐베이터 중에서 정치하는 것에 의해 행한다.

이 때, 임파구 배양액 중의 임파구 혼합물의 농도를, 1×10⁷~1.5×10⁷(1000~1500만)개/ml로 조정하는 것이 적절하다. 또한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 항체가 고상화된 배양 용기의 접액면의 면적에 대해서 균일 수평으로 되도록 임파구 배양액을 수용하는 것이 적절하다.

그리고, 이 배양 용기를 5% CO₂ 농도, 37℃의 조건하의 인큐베이터 내에서, 5~6일간 정치하는 것에 의해 초기 배양 및 2차 배양을 행한다.

이 배양 과정에서는, 전체 기간을 항CD3 항체 및 항CD161 항체가 고상화된 동일한 배양 용기에 있어서 배양을 행하는 것도 가능하다. 이와 같이 배양 기간 전체에서 세포막 표면의 CD3 분자 및 CD161 분자에 자극을 주고 있어도, NKT 세포, NK 세포, 임파구를 안전하고 확실히 증식 및 활성화할 수 있다.

한편, 배양 기간의 초기 예를 들면 5~6일간, 항CD3 항체 및 항CD161 항체가 고상화된 배양 용기에 있어서 배양을 행한 후, 임파구 혼합물을 포함하는 임파구 배양액을, 항CD3 항체 및 항CD161 항체가 고상화되어 있지 않은 비고상화 배양 용기로 옮겨 배양을 계속하고, NKT 세포, NK 세포 및 임파구를 증식 및 활성화하는 것도 가능하다. 이 비고상화 배양 용기로서는, CO₂ 투과백 이외에도 고상화 배양 용기의 용기 본체와 동일한 것을 사용해도 된다.

이와 같이 하면, 세포에의 과잉의 자극을 방지하여 아포토시스(세포사)를 억제하고, 더욱이 NKT 세포, NK 세포 및 임파구를 동시에 증식 및 활성화할 수 있다. 또한, 초기 배양 및 2차 배양에 의해 증식 및 활성화된, NKT 세포, NK 세포 및 임파구의 전부 또는 일부를 다른 배양 용기에 꺼내어 더욱 증식시킬 때, 그 배양 용기에 항CD3 항체 및 항CD161 항체를 고상화하는 수고를 생략할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 배양 방법은, 항CD3 항체 및 항CD161 항체를 이용하는 것에 의해서, NKT 세포인 Vα24⁺Vβ11⁺세포, NK 세포 및 임파구를 동시에, 또한 용이하게 증식 및 활성화할 수 있다. 더구나, 세포를 증식 및 활성화할 때, 각각의 세포를 단리하는 수고를 생략할 수 있어, 기술적으로 3종류의 세포를 동시에, 또한 용이하게 증식 및 활성화할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용하는 배양 방법은, NKT 세포(Vα24⁺Vβ11⁺세포) 및 NKT 세포의 일부로서 NKT 세포와 동일하게 항종양 작용, 면역 조정 작용을 가지는 Vα24⁺Vβ11^-세포도 높은 증식율로 활성화할 수 있다.

Vα24⁺Vβ11^-세포는, NKT 세포(Vα24⁺Vβ11⁺세포)와 동일하게 막표면에 CD161 분자를 보유하고 있고, NKT 세포와 동일하게 높은 증식율로 활성화할 수 있다. 이것은, 항CD161 항체가 Vα24⁺세포의 CD161 분자에 대한 공유 자극 인자(co-Stimulator)로서 작용했기 때문이라고 생각할 수 있다. 또한, 항CD161 항체가 Vα24⁺Vβ11^-세포를 증식 및 활성화하는 과정은, NKT 세포(Vα24⁺Vβ11⁺세포)를 증식 및 활성화하는 과정과 동일하기 때문이라고 생각된다.

또한, 본 발명에서 사용하는 배양 방법에서는, NKT 세포를 특이적으로 활성화시키는 α-갈락토실세라미드(α-GalCer)를 이용하지 않고, 항CD3 항체와 항CD161 항체를 이용하여 NKT 세포(Vα24⁺Vβ11⁺세포) 및 Vα24⁺Vβ11^-세포(NKT 세포의 일부)를 증식 및 활성화할 수 있다. 그 원인으로서, T세포의 막표면에 존재하는 CD4, CD8 분자가 각각 MHC 클래스 II분자와 MHC 클래스 I분자의 공유 리셉터(coreceptor)로서 존재하는 바와 같이, Vα24⁺NKT세포의 CD161 분자가 세포를 증식 및 활성화로 유도하는 CD1d를 직접 인식할 수 있는 공유 리셉터이거나, 혹은 CD161 분자의 리간드(공유결합부)가 CD1d 그 자체이기 때문이라고 생각할 수 있다.

또한, 배양 기간중에는, NKT 세포가 증식 및 활성화되어 인터페론γ(IFN-γ) 등의 사이토카인이 산생된다.

이상과 같이 하여 배양하는 것에 의해, NKT 세포(Vα24⁺Vβ11⁺세포), NK 세포, 임파구가 동시에 증식 및 활성화된 임파구 혼합물(배양 혼합물)을 얻을 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 임파구 혼합물(배양 혼합물)은, 인산 완충액(PBS)으로 세정 후, NKT 세포 또는 NKT 세포를 함유하는 혼합물로서 여러 가지의 용도에 사용할 수 있다.

또한 면역 요법용 세포 의약의 용도에 사용하는 경우에는, 배양 용기로부터 꺼내진 임파구 혼합물(배양 혼합물)은 250ml의 인산 완충액(PBS)에 의해 2~3회 원심 및 세정되어, 100ml의 생리 식염수에 부유시켜 수액 등의 약액으로 하면 좋다.

또한 이와 같은 약액의, NKT 세포의 농도는, 임파구 혼합물 전량 기준으로 5~40%, NK 세포의 농도는, 임파구 혼합물 전량 기준으로 25~60%, 임파구의 농도는, 임파구 혼합물 전량 기준으로 30~60% 정도로 하는 것이 바람직하다.

그리고, 이 면역 요법용 세포 의약을 환자에게 투여하는 것에 의해, 증식 및 활성화된 NKT 세포(Vα24⁺Vβ11⁺세포) 및 NK 세포, 임파구의 안정된 항종양 작용, 항알레르기 작용, 자기면역 질환 억제 작용, 장기 이식 후의 거절반응 억제 작용에 의해서 뛰어난 치료 효과를 기대할 수 있다.

본 발명에 관련되는 암면역 요법용 세포는, NK 세포 및 임파구의 2종류의 세포, 혹은, NKT 세포, NK 세포 및 임파구의 3종류의 세포가 증식 및 활성화한 것이다.

본 발명에 관련되는 암면역 요법용 세포의 제조방법은, NK 세포 및 임파구의 2종류의 세포를 거의 동시에, 혹은, NKT 세포, NK 세포 및 임파구의 3종류의 세포를 거의 동시에, 더구나 용이하게 활성화 및 증식할 수 있다.

도 1은 실시예 1의 샘플 A~C의 배양 개시시와 배양 개시 후 6일째에 있어서의 상청액 중의 인터페론-γ(IFN-γ)의 농도를 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예에 관하여 설명한다.

(임파구 혼합물)

암환자 15명(폐암 5명, 간장암 4명, 결장암 2명, 위암 1명, 악성 임파종 1명, 유방암 1명, 전립선암 1명, 병기：스테이지(Stage) II~IV)의 말초혈을 채혈하고, 비중 1.007의 임파구 분리용 시약으로 원심분리하는 것에 의해, 각각의 환자마다 따로 따로 임파구 혼합물 샘플을 작성했다.

(임파구 배양액의 조제)

RPMI-1640을 기반으로 한 배양액에, 1000U/ml의 IL-2를 함유시킨 임파구 배양액을 조제했다.

(모노클로날 항체)

항사람 CD3 항체로서 UCTH-1(BD바이오사이언스사제), 항사람 CD161 항체로서 191.B8(임노테크사제)를 이용했다. NKT(Vα24⁺Vβ11⁺) 세포, Vα24⁺Vβ11^-세포의 프로사이트메트리 해석을 위해서 FITC 표지 항 Vα24 항체 C15(임노테크사제), PE표지 항Vβ11 항체 C21(임노아크사제)를 각각 이용했다. T세포(헬퍼/인듀서 T세포)의 해석에는 FITC 표지 항CD4 항체, PE표지 항CD29 항체, NK 세포의 해석에는 PE항CD16 항체, FITC 표지 항CD57 항체(BD바이오사이언스사제)를 이용했다.

(고상화 배양 용기의 제작)

미리, 저부 내표면적이 75㎠와 225㎠의 플라스크에 항CD3 항체 및 항CD161 항체로 고상화 처리를 실시하여 고상화 플라스크를 제작했다.

고상화 처리는, 1㎍/ml로 조정한 항CD3 항체를 플라스크에 주입하여, 24시간 실온에서 정치한 후, 여분의 항체를 인산 완충액으로 씻어 흘리는 것에 의해 행했다. 다음에, 10㎍/ml로 되도록 조정한 항CD161 항체를 플라스크에 주입하고, 또한 24시간 실온에서 정치한 후, 5℃의 냉장고에 보존하여, 사용시에 여분의 항체를 인산 완충액으로 씻어 흘려 사용했다.

(실시예 1)

전술한 15명의 암환자의 임파구 혼합물을 이용하여, 이들의 샘플을 세포수 1×10⁷~1.5×10⁷/ml(1000~1500만개/ml)가 되도록 조정한 후, 1000U/ml의 IL-2를 포함하는 임파구 배양액 50ml에 부유시켜, 75㎠의 플라스크에서 4~5일간 배양했다(초기 배양). 2차 배양은, 4~5일 후에 225㎠의 플라스크에 세포를 옮겨 200ml의 배양액 중에서 1~2일간 배양했다. 초기 배양 및 2차 배양에는 항CD3 항체 UCTH-1, 항CD161 항체 191.B8을 이용하여 고상화한 플라스크를 사용했다. 배양은 전체 기간을 통해서 5% CO₂, 37℃에서의 인큐베이터내에서 행했다.

또한, 폐암 환자(A), 위암 환자(B), 간장암 환자(C)에 관하여, 배양 개시시와 배양 개시 후 6일째에 있어서의 상청액 중의 인터페론-γ(IFN-γ)의 농도를 측정했다. 결과를 도 1에 나타낸다. 도면 중, 샘플 A~C 각각의 왼쪽 그래프(흰 부분)는 배양 개시시의 IFN-γ의 농도를 나타내고, 오른쪽의 그래프(검은 부분)는 배양 개시 후 6일째의 IFN-γ 농도를 나타낸다.

도 1로부터 분명한 바와 같이, IFN-γ 농도가 배양 개시시의 농도에 비해 1800~2400배로 되고, NKT 세포의 증식 및 활성화에 의한 IFN-γ의 산생이 확인되었다.

(실시예 2)

실시예 1과 동일한 조건에서 4~6일간 초기 배양 및 2차 배양을 실시하고, 그 후, 배양 도중의 임파구 혼합물이 함유되어 있는 임파구 배양액을 항CD3 항체 및 항CD161 항체로 고정화되어 있지 않은 175U/ml의 IL-2를 함유하는 1000ml의 RPMI-1640을 기반으로 한 배양액으로 옮겨서, 배양액 합계 1200ml로 배양을 계속하여, 초기 배양으로부터 합계 14일간의 배양을 행했다.

또한, 배양 개시 후 4일, 6일, 14일째의 세포 증식율을, 배양 개시시(0배)와 비교하여 표 1에 나타낸다.

표 1로부터 분명한 바와 같이, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체와, 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체와, 임파구 배양액에 의해서 배양된 임파구 혼합물은, NKT 세포, Vα24⁺Vβ11^-세포, NK 세포 및 임파구의 수가 거의 동시에 활성화 및 증식하고 있는 것을 알 수 있다.

(치료 실시예)

이하, 치료 실시예에 관하여 설명한다.

(암환자)

암환자 15명(폐암 5명, 간장암 4명, 결장암 2명, 위암 1명, 악성 임파종 1명, 유방암 1명, 전립선암 1명, 병기：스테이지(Stage) II~IV)에 관하여, 본 발명의 암면역 요법용 세포(면역 요법용 세포 의약)의 효과를 검토했다.

(면역 요법용 세포 의약의 제조)

암환자로부터 채혈 후, 상기의 방법으로 14일간 배양한 임파구 혼합물을 배양 용기로부터 꺼내어, 250ml의 멸균 인산 완충액(PBS)에 의해 2회 원심 및 세정했다. 그 후, 총 세포수ㆍNK 세포수ㆍ임파구 세포수, 또는 총 세포수ㆍNKT 세포수ㆍNK 세포수ㆍ임파구 세포수를 각각 산정하여, 배양 세포를 100ml의 생리 식염액에 부유시켜 텔모 분리백(텔모사제, 텔프렉스 T-020)에 옮겨 수액용의 약액으로 했다.

수액용 세포 약액 중의 각각의 세포수의 분포를 표 2, 표 3에 나타낸다. 또한, 표 중의 세포수의 단위는, 억개이다.

(면역 요법용 세포 의약의 투여 방법)

치료는, 100ml의 생리 식염액에 부유시킨 NK 세포 및 임파구, 혹은, NKT 세포, NK 세포, 임파구를 정맥에 점적 주사에 의해서 행했다. 점적 주사를 행하는 정맥은 특별히 한정하지 않는다. 점적의 시간은 15~30분이 적절하다.

(치료의 일정)

채혈 후, 2주 간격으로 약 3개월에 걸쳐 6회의 치료를 행했다. 다음회의 배양을 위한 채혈은, 각각 2주간 간격으로 점적 치료 전에 채혈했다.

(치료 효과의 판정)

6회 치료 종료후, 3~4주일 후에 CT, MRI의 촬영, 종양마커치의 측정, NKT 세포수 등의 세포수의 측정, 혈액 및 생화학 일반 검사 등을 행하여 종합적으로 환자 상태를 판정했다.

(치료 효과의 판정 기준)

치료 효과의 판정은 A, B, C, D의 4단계로 하고, 이하의 판정 방법으로 행했다.

A：종양이 소실 또는 25% 이상 축소했다. 종양마커가 내렸다. 재발 또는 전이의 조짐이 없다.

B：종양의 크기 및 전이의 상황도 불변. 종양마커가 하강 혹은 크게 변화 없음. 생활의 질(QOL)이 치료 전보다 개선되었다.

C：종양이 조금씩 증대하고, 종양마커도 조금씩 상승하고 있지만, 완만한 진행이라고 생각된다.

D：이 치료에 관계없이, 종양이 20% 이상 증대하고, 종양마커가 현저하게 상승했다. 생활의 질이 저하했다.

암환자 15명의 치료 성적을 표 4에 나타낸다.

CTㆍMRI의 판정은, 종양의 크기를 나타낸다.

종양마커치의 ↑는 상승을, ↓는 하강을, →는 변화 없음을 나타낸다.

표 4로부터 분명한 바와 같이, 본 발명의 암면역 요법용 세포를 이용하여, 암환자의 치료를 행한 결과, 15명의 암환자 중 13명의 암환자에 관해서, 병상의 개선이 발견되었다.

이와 같이, 본 발명은, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체와, 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체와, 임파구 배지에 의해서 임파구 혼합물을 배양하기 때문에, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체의 조합에 의해 NKT 세포를 활성화 및 증식할 수 있고, 또한, 항사람 CD3 모노클로날 항체에 의해서, 임파구 혼합물 중의 임파구만을 활성화 및 증식할 수 있고, 또한, 항사람 CD161 모노클로날 항체에 의해서, NK 세포를 활성화 및 증식할 수 있으므로, NK 세포 및 임파구의 2종류의 세포를 거의 동시에, 혹은, NKT 세포, NK 세포 및 임파구의 3종류의 세포를 거의 동시에, 더구나 용이하게 활성화 및 증식할 수 있다.

또한, 본 발명의 암면역 요법용 세포는, 강력한 항종양 작용, 항알레르기 작용, 자기면역 질환 억제 작용 및 장기 이식 후의 거절반응 억제 작용을 가지는 NKT 세포(Vα24⁺Vβ11⁺세포)가, NK 세포 및 임파구와 거의 동시에 증식 및 활성화되므로, 임파구 혹은 NK 세포만을 이용한 의약 조성물의 면역 요법에 비해 더욱 효과적이다.

또한, 임파구 혼합물이, 말초혈로부터 분리한 말초혈 임파구의 집합물이므로, 채혈이 용이하고 환자에게 고통을 주는 것이 거의 없고, 말초혈과 임파구 혼합물을 분리할 때에 번잡한 시간이 들지 않고, 더욱이, 혈액을 냉장 보존으로 수송할 수 있다.

또한, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체의 존재하에서, 임파구 배지에 임파구 혼합물을 가하여 배양한 후, 임파구 혼합물을 포함하는 임파구 배지를, 비고상화 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 비고상화 항사람 CD161 모노클로날 항체의 존재하에서, 다른 임파구 배지에 가하므로, 세포에의 과잉인 자극을 줌으로써 생기는 세포사를 억제할 수 있다.

A　　폐암 환자
B　　위암 환자
C　　간장암 환자

Claims (11)

1. 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체의 존재하에서, 임파구 배지에, 내추럴 킬러(NK) 세포와 내추럴 킬러(NK) 세포를 제외한 다른 임파구의 2종류의 세포를 함유하는 임파구 혼합물을 가하여, 상기 2종류의 세포를 과립구 코로니 자극 인자의 비존재하에서 동시에 공배양하여 활성화 및 증식시킨 것을 특징으로 하는 암면역 요법용 세포의 제조방법.
2. 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체의 존재하에서, 임파구 배지에, 내추럴 킬러T(NKT) 세포와 내추럴 킬러(NK) 세포와, 내추럴 킬러T(NKT) 세포 및 내추럴 킬러(NK) 세포를 제외한 다른 임파구의 3종류의 세포를 함유하는 임파구 혼합물을 가하여, 상기 3종류의 세포를 과립구 코로니 자극 인자의 비존재하에서 동시에 공배양하여 활성화 및 증식시킨 것을 특징으로 하는 암면역 요법용 세포의 제조방법.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 임파구 혼합물은, 말초혈로부터 분리한 말초혈 임파구의 집합물인 암면역 요법용 세포의 제조방법.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 임파구 배지가, 1000U/ml의 인터로이킨-2를 함유하는 암면역 요법용 세포의 제조방법.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 고상화된 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 고상화된 항사람 CD161 모노클로날 항체의 존재하에서, 임파구 배지에, 상기 임파구 혼합물을 가하여 배양한 후, 그 임파구 혼합물을 포함한 임파구 배지를, 비고상화 항사람 CD3 모노클로날 항체 및 비고상화 항사람 CD161 모노클로날 항체의 존재하에서, 다른 임파구 배지에 가하는 암면역 요법용 세포의 제조방법.
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