KR101190726B1 - 기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 클로닝하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염기서열을 알고 있는 부위로부터 게놈(genome) 상의 인접한 미지의 영역을 PCR 방법으로 클로닝하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 1) 기지(旣知, known)의 뉴클레오티드 서열 및 이에 인접한 미지의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈 DNA 를 제한효소로 절단하는 단계; 2) 상기 절단된 DNA의 3'-OH 말단을 뉴클레오티드 유사체로 수식하는 단계; 3) 상기 절단된 DNA 단편의 말단 서열에 그 말단 서열과 상보적인 말단을 가지는 링커(linker), 아답타(adapter) 또는 카세트(cassette)를 연결하는 단계; 및 4) 기지의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머 및 카세트 서열에 특이적인 프라이머를 처리하여 미지의 뉴클레오티드 서열을 증폭하는 단계를 포함하는, 기지의 뉴클레오티드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오티드 서열을 클로닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 미지의 뉴클레오티드 서열을 클로닝하는 방법을 위한 유전자 증폭용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 유전자 증폭용 키트에 관한 것이다.

유전자 클로닝, 게놈 워킹, 뉴클레오티드 유사체

Description

기지의 서열에 인접한 미지의 ＤＮＡ 서열을 클로닝하는 방법 {Method for Cloning of Unknown DNA Sequences Adjacent to Known Sequence}

본 발명은 염기서열을 알고 있는 부위로부터 게놈(genome) 상의 인접한 미지의 영역을 PCR 방법으로 클로닝하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 1) 기지(旣知, known)의 뉴클레오티드 서열 및 이에 인접한 미지의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈 DNA 를 제한효소로 절단하는 단계; 2) 상기 절단된 DNA의 3'-OH 말단을 뉴클레오티드 유사체로 수식하는 단계; 3) 상기 절단된 DNA 단편의 말단 서열에 그 말단 서열과 상보적인 말단을 가지는 링커(linker), 아답타(adapter) 또는 카세트(cassette)를 연결하는 단계; 및 4) 기지의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머 및 카세트 서열에 특이적인 프라이머를 처리하여 미지의 뉴클레오티드 서열을 증폭하는 단계를 포함하는, 기지의 뉴클레오티드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오티드 서열을 클로닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 미지의 뉴클레오티드 서열을 클로닝하는 방법을 위한 유전자 증폭용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 유전자 증폭용 키트에 관한 것이다.

게놈 워킹(genome walking) 이란 게놈 상에서 염기서열을 알고 있는 부위로부터 이와 인접한 미지의 영역을 클로닝하는 기술을 말하며, 염색체 워킹(chromosome walking) 이라고도 한다.

지금까지 이러한 게놈 워킹을 위하여 여러 가지 방법이 개발되었다. 가장 전통적인 방법은 특정한 벡터에 게놈 DNA 라이브러리를 구축하고 염기서열을 알고 있는 부위를 탐침(probe)으로 만들어서 원하는 부위를 포함하는 벡터를 선별하는 방법이다. 이 방법은 중합효소 연쇄반응(PCR)이 개발되기 까지는 가장 널리 사용된 방법이나, 라이브러리를 구축해야하고 많은 노동력과 시간이 소요되는 선별과정을 거쳐야하는 단점이 있다.

PCR을 이용하여 원하는 부위를 클로닝하는 방법 중 가장 널리 사용되어온 방법은 inverse PCR로서, 이는 절단된 게놈 DNA를 원형이 되도록 다시 연결한 후 염기서열을 아는 부위를 역방향으로 인식하는 프라이머로 증폭하는 방법이다(Triglia 등, Nucleic Acid Res. 1988, 16, 8186). 이 방법은 클로닝 하려는 부위에 적절한 제한효소 인식부위를 필요로 하는 단점이 있다.

또 다른 방법은 제한효소로 처리한 게놈 DNA를 미스매치(mismatch) 부위를 포함하는 카세트와 연결한 후 PCR하는 vectorette PCR(Riley 등 Nucleic Acid Res. 1990, 18, 2887)이 있으며, 여러 가지 형태의 링커(linker)나 아답타(adapter)를 연결한 후 PCR 하는 방법들이 개발되었다(Isegawa 등, Mol . Cell . Probe. 1992, 6, 467; Siebert 등, Nucleic Acid Res. 1995, 23, 1087; Kilstrup과 Kristialsen, Nucleic Acid Res. 2000, 28, e55 ; Nthangeni 등, J. Microbiol. Methods. 2005, 61, 225).

이러한 방법을 개선하기 위하여 차단된 아답타(blocked adapter)를 사용하거나(Padegimas와 Reichert, Anal. Biochem 1998, 260, 149; Reddy 등 Mol. Biotechnol. 2002, 22, 223) 비오틴화된 프라이머(biotinylated primer)를 사용하거나 (Rosenthal 과 Jones, Nucleic Acid Res. 1990, 18, 3095) 네스티드 프라이머(nested primer)를 이용해서 2차 PCR하는 방법 등이 개발되었다( Rosenthal, Trends. Biotechnol. 1992, 10, 44). 또한, 카세트를 연결하지 않고 무작위적 프라이머를 사용하여 원하는 부위를 클로닝하는 방법도 개발되었다 (Parker 등, Nucleic Acid Res. 1991, 19, 3055; Park 등Nucleic Acid Res. 1991, 19, 7155; Domingue 과 Lopez-Larrea, Nucleic Acid Res. 1994, 22, 3247; Liu와 Whittier, Genomics, 1995, 25, 674; Trueba와 Johnson, Biotechniques, 1996, 21, 20; Tamme 등, Biotechniques, 2000, 28, 895; Karlyshev 등,Biotechniques, 2000, 28, 1078).

이와 같이, 지금까지 게놈 워킹 방법을 개선하기 위하여 많은 연구를 수행하여 상당한 진척을 이루었으나 아직까지 개선해야 할 부분이 많이 남아 있다. PCR을 이용한 게놈 워킹에서 가장 문제가 되는 것은 낮은 증폭 효율과 비 특이적 증폭이다. 즉 원하지 않는 유전자가 함께 증폭되어 원하는 유전자의 증폭을 쉽게 확인할 수 없는 것이다. 이 문제를 개선하기 위하여 2차 PCR을 하거나 비오틴화된 프라이머(biotinylated primer)를 사용하여 원하는 PCR 산물을 정제하거나 PCR 사이클 조 건을 개선하는 등 여러 단계의 복잡한 과정을 거치는 방법이 개발되었지만 아직까지 만족할 만한 수준의 방법은 개발되지 않았다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제를 획기적으로 개선할 수 있는 방법을 개발하였다. 증폭 효율이 낮은 이유는 제한효소 처리된 게놈 DNA와 카세트의 연결이 충분하지 못하기 때문이며, 비특이적인 증폭이 발생하는 이유는 기지영역 특이 프라이머와 카세트 프라이머의 조합에 의해서만 증폭이 일어나지 않고 카세트 프라이머 만으로도 PCR 반응이 일어나기 때문이다. 따라서 효과적으로 원하는 부위를 증폭하기 위해서는 카세트 프라이머 만으로 증폭되는 반응을 저해하여 기지영역 특이 프라이머와 카세트 프라이머의 조합에 의해서만 증폭이 일어나도록 하여야 한다. 본 발명자들은 제한효소 처리된 게놈 유전자를 ddNTP로 처리하고 그에 상보적인 카세트와 연결하여, 게놈 유전자와 카세트의 연결 효율을 증가시킴과 동시에 비특이적인 증폭을 막음으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 1) 기지(旣知, known)의 뉴클레오티드 서열 및 이에 인접한 미지의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈 DNA 를 제한효소로 절단하는 단계; 2) 상기 절단된 DNA의 3'-OH 말단을 뉴클레오티드 유사체로 수식하는 단계; 3) 상기 절단된 DNA 단편의 말단 서열에 그 말단 서열과 상보적인 말단을 가지는 링커(linker), 아답타(adapter) 또는 카세트(cassette)를 연결하는 단계; 및 4) 기지의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머 및 카세트 서열에 특이적인 프라이머를 처리하여 미지의 뉴클레오티드 서열을 증폭하는 단계를 포함하는, 기지의 뉴클레오티드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오티드 서열을 클로닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 미지의 뉴클레오티드 서열을 클로닝하는 방법을 위한 유전자 증폭용 조성물로서, 1) 기지의 뉴클레오티드 서열 및 이에 인접한 미지의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 3'-OH 말단이 뉴클레오티드 유사체로 수식된 DNA 단편, 및 상기 수식된 DNA 단편의 말단 서열과 상보적인 말단을 가지는 링커(linker), 아답타(adpter) 또는 카세트(cassette)를 포함하는 DNA 구조체, 2) 기지의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머, 및 3) 상기 카세트 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 유전자 증폭용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 유전자 증폭용 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 1) 기지(旣知, known)의 뉴클레오티드 서열 및 이에 인접한 미지의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 3'-OH 말단이 뉴클레오티드 유사체로 수식된 DNA 단편, 및 상기 수식된 DNA 단편의 말단 서열과 상보적인 말단을 가지는 링커(linker), 아답타(adpter) 또는 카세트(cassette)를 포함하는 DNA 구조체, 2) 기지의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머, 및 3) 상기 카세트 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 유전자 증폭용 조성물에 관한 것이다.

게놈 DNA의 말단에 카세트를 연결하여 원하는 부위를 클로닝하는 종래의 방법은, 카세트의 5' 말단에 인산기가 없기 때문에 이중가닥으로 구성된 카세트 중 단일가닥만 게놈 DNA에 연결될 수 있으며, 카세트의 단일 가닥만 연결된 게놈 DNA는 도 1의 왼편에 나타낸 바와 같이 카세트 프라이머가 결합할 수 없기 때문에, 이론적으로 볼 때 카세트 프라이머 만으로는 비특이적 증폭이 발생하지 않을 것으로 예상할 수 있다. 즉, 원하는 부위를 증폭하기 위해서는 기지영역 특이 프라이머로부터 첫 번째 반응이 일어나서 카세트 프라이머가 결합할 수 있는 새로운 가닥이 합성되고 이렇게 합성된 새로운 가닥을 주형으로 PCR이 될 경우에만 원하는 유전자 부위가 증폭될 것이다.

그러나, 실제로는 상기와 같은 종래의 방법을 사용할 경우 예상치 않은 비특 이적 증폭이 많이 발생하여 원하는 유전자 부위를 클로닝하기 위해 네스티드 프라이머(nested primer)를 이용하여 2차 PCR까지 수행하여도 원하는 유전자 부위를 확인하기 어려우며, 원하는 유전자 부위를 증폭하기 위해서는 많은 시행착오를 겪어야 한다. 이러한 비특이적 증폭이 발생하는 이유는 도 1의 오른편에 나타낸 바와 같이 카세트의 단일 가닥만 연결된 게놈 DNA가 변성된 후 다시 이중가닥을 형성하고 카세트의 단일 가닥 부위가 DNA 중합효소의 활성에 의하여 이중가닥으로 재생되기 때문이다. 이렇게 재생된 이중가닥 유전자는 양 말단에 이중가닥의 카세트가 연결된 형태이기 때문에 기지영역 특이 프라이머와 무관하게 카세트 프라이머 만으로도 비특이적으로 증폭되는 것이다. 게놈 유전자 내에서 클로닝 하고자 하는 유전자 부위는 전체 게놈의 수천에서 수만분의 일에 불과하기 때문에 비특이적 증폭이 특이적 증폭보다 수천에서 수만배 많이 발생한다. 따라서 특이적 증폭을 아가로스겔 전기영동하여 확인하기 어렵다. 그러므로 성공적인 게놈 워킹 방법을 개발하기 위해서는 비특이적 증폭을 막는 것이 가장 중요한 관건이다.

이에, 본 발명자들은 제한효소 처리된 게놈 유전자의 말단을 변형하여 비특이적 증폭을 최소화할 수 있는 방법 및 유전자 증폭용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, '뉴클레오티드'란 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말하며, '기지의 뉴클레오티드'란 이미 그 염기서열을 알고 있는 뉴클레오티드를 말하는 것으로, 염기서열을 알지 못하여 클로닝의 대상이 되는 '미지의 뉴클레오티드' 와 대비되는 용어이다.

또한, '뉴클레오티드 유사체' 란 뉴클레오티드와 유사한 구조를 가지는 자연 의 또는 인공합성된 유사체를 말한다. 본원 발명에서 뉴클레오티드 유사체는 DNA 단편의 3' 말단에 수식되어 더이상 3'-OH 말단이 채워지지 않도록 하는 물질로서, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 ddATP(dideoxyadenosine triphosphate), ddCTP(dideoxycytosine triphosphate), ddGTP(dideoxyguanosine triphosphate), ddTTP(dideoxythymidine triphosphate), ddUTP(dideoxyuridine triphosphate) 및 ddITP(dideoxyinosine triphosphate)를 포함하는 다이데옥시리보뉴클레오티드(ddNTP, dideoxynucleotide triphosphate)이다. ddNTP 가 DNA 단편의 말단에 연결되면, ddNTP는 3'-OH가 없기 때문에 더 이상 중합반응이 일어나지 않고 중단되게 된다.

도 1에서 설명한 바와 같이 종래의 방법에서는 카세트의 단일 가닥만 연결된 게놈 DNA가 변성(denaturation)/어닐링(annealing) 과정 후 DNA 중합효소의 반응에 의하여 3'-OH 말단이 채워짐으로써 카세트 프라이머가 결합할 수 있는 이중가닥이 형성되기 때문에 비특이적 증폭이 빈번하게 일어난다. 따라서 본원 발명과 같이 게놈 DNA의 3'-OH 말단을 더 이상 중합반응이 일어나지 않도록 ddNTP를 수식하여 변형한다면 비특이적 증폭을 획기적으로 감소시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, '카세트(cassette)'는 DNA 단편에 인위적으로 연결될 수 있도록 짧게 합성된 이중가닥의 올리고뉴클레오티드를 포괄적으로 이르는 용어이다. 카세트의 5' 말단에는 인산기가 없기 때문에 이중가닥으로 구성된 카세트 중 단일가닥만 게놈 DNA에 연결될 수 있다.

이와 유사하게, '링커(linker)'는 시험관에서 합성된 짧은 이중가닥 DNA 로 서, 평활 말단을 가지고 있으나 제한효소 인식부위를 가지고 있으므로 링커를 붙인 후 다시 제한효소를 처리하면 양쪽이 접착 말단을 가지게 된다.

또한, '아답터(adapter)' 는 링커와 같이 짧게 합성된 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 말하며, 링커와는 달리 한쪽 끝은 평활 말단을 가지고 있고 다른쪽 끝은 접착 말단을 가지고 있어서, 제한효소에 의하여 절단된 DNA 단편의 접착말단에 접착하여 평활 말단을 가지는 새로운 DNA 분자를 만들게 된다.

본 발명에서 용어, 'DNA 구조체'란 숙주세포에서 구조 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 핵산 요소를 지닌 발생되거나 합성적으로 된 핵산 구조물을 말하며, 본원 발명에서는 기지의 뉴클레오티드 및 이에 인접한 미지의 뉴클레오티드를 포함하며 3'-OH 말단에 수식된 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 DNA 단편, 및 상기 수식된 DNA 단편의 말단 서열과 연결이 가능한 상보적인 말단을 가지는 링커, 아답타 또는 카세트를 포함하는 재조합된 DNA 단편을 말한다.

본 발명에서 용어, '프라이머'는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 단일가닥 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 dNTP 의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본원 발명의 유전자 증폭용 조성물에는 기지의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머 및 카세트 서열에 특이적인 프라이머이 포함된다.

상기와 같은 유전자 증폭용 조성물을 이용하여, 본 발명자들은 도 2와 같은 비특이적 증폭이 억제된 새로운 게놈 워킹 모델을 세울 수 있었다.

따라서, 또 하나의 양태로서 본 발명은

1) 기지의 뉴클레오티드 서열 및 이에 인접한 미지의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈 DNA 를 제한효소로 절단하는 단계;

2) 상기 절단된 DNA의 3'-OH 말단을 뉴클레오티드 유사체로 수식하는 단계;

3) 상기 절단된 DNA 단편의 말단 서열에 그 말단 서열과 상보적인 말단을 가지는 링커(linker), 아답타(adapter) 또는 카세트(cassette)를 연결하는 단계; 및

4) 기지의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머 및 카세트 서열에 특이적인 프라이머를 처리하여 미지의 뉴클레오티드 서열을 증폭하는 단계를 포함하는, 기지의 뉴클레오티드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오티드 서열을 클로닝하는 방법에 관한 것이다.

상기 단계 1) 은 게놈 DNA 를 제한효소로 절단하여 기지의 뉴클레오티드 및 이에 인접한 미지의 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 단편을 제조하는 단계이다.

본 발명에서 용어, '제한효소'는 DNA 의 특정 염기서열을 인식하여 절단하는 효소로서, 평활말단(blunt end 또는 flush end)을 만드는 제한효소와 접착말단(sticky end 또는 cohesive end)을 만드는 제한효소가 있다. 본원 발명에서는 절단된 DNA 단편과 카세트 간의 연결반응의 효율을 최대화 하기 위하여, DNA 가 접착 말단을 갖도록 절단하는 제한효소를 처리하는 것이 보다 바람직하다.

예를 들어, 제한효소 BamHI, BglⅡ 또는 Sau3A 에 의하여 절단된 게놈 DNA는 5'말단에 GATC 염기가 돌출되어 있다. 또한, HindⅢ 에 의하여 절단된 게놈 DNA는 5'말단에 AGTC 염기를 돌출되어 있고, 이 외에도 제한효소마다 그 인식부위 및 절단에 의해 생기는 접착 말단의 서열이 당업계에 널리 알려져 있으므로, 이러한 정보를 이용하여 원하는 말단 서열을 가지는 DNA 단편을 제조할 수 있다.

상기 단계 2)는 상기 제한효소로 절단된 DNA의 3'-OH 말단을 뉴클레오티드 유사체로 수식하는 단계이다. 본원 발명에서는 게놈 DNA의 3'-OH 말단을 더 이상 중합반응이 일어나지 않도록 ddNTP를 수식함으로써, 비특이적 증폭을 획기적으로 감소시킬 수 있다. 예를 들어서, 제한효소 BamHI이나 BglⅡ에 의하여 절단되어 5'말단에 GATC 염기가 돌출되어 있는 게놈 DNA 단편에, dideoxy GTP(ddGTP)와 함께 DNA 중합효소 크레나우 단편(DNA polymerase Klenow fragment)으로 반응시키면 DNA 단편 이중가닥의 각 3' 말단에 ddGTP가 삽입된다. ddGTP는 DNA 중합에 필요한 3'OH가 없기 때문에 각 3' 말단에서는 더 이상 DNA 중합 반응이 일어나지 않는다. 따라서 카세트 프라이머가 결합할 수 없으며 결과적으로 비특이적 증폭을 최소화 할 수 있다.

상기 단계 3) 은 상기 뉴클레오티드 유사체로 수식된 DNA 에 말단 서열과 상보적인 말단을 가지는 링커, 아답타 또는 카세트를 연결하는 단계이다.

제한효소에 의하여 DNA 단편이 접착말단을 가지도록 절단된 경우 카세트의 접착 말단을 제한효소로 절단된 DNA 단편의 접착 말단과 상보적 서열을 갖도록 설 계 및 접착시켜 DNA양 말단이 카세트로 연결된 새로운 DNA 분자를 만들게 된다. 이와 같이 게놈 DNA 와 상보적인 카세트를 연결함으로써 게놈 유전자와 카세트의 연결 효율을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 게놈 DNA를 제한효소 BamHI, BglⅡ 또는 Sau3A 로 절단하고 ddGTP로 수식하여 이중가닥의 각 5' 말단에 GAT 염기가 돌출된 경우, 카세트는 상기 이중가닥 게놈 DNA 단편의 양 말단에 연결될 수 있도록 카세트의 5' 말단은 ATC 염기가 돌출되고 다른 한 쪽은 평활 말단을 갖도록 제조하여, 카세트가 게놈 DNA 말단에 상보적으로 결합되도록 할 수 있다. 이는, 링커 또는 아답터의 경우에도 마찬가지로 적용될 수 있다.

또한, 게놈 DNA 의 3' 말단에 ddNTP 를 수식함으로써 게놈 DNA 단편과 카세트의 연결 효율이 더욱 증가되는 효과가 있다. 즉, 제한 효소 처리된 유전자 말단에 1 내지 3개의 염기를 DNA 중합효소로 반응하여 부분적으로 채워 넣으면 말단끼리는 서로 상보적이지 못하기 때문에 잘려진 유전자 끼리 다시 연결되어 환형 구조가 되거나 다중 결합하는 것을 막을 수 있으며 마찬가지로 염기를 부분적으로 채워 넣은 유전자 말단과 상보적인 카세트는 카세트끼리 연결될 수 없는 구조이다. 따라서 본 발명에서 제공하는 카세트와 DNA의 연결 방법은 원치 않는 반응을 최소화하고 오로지 잘려진 DNA 단편과 카세트끼리만 1:1로 연결될 수 있기 때문에 연결 반응의 효율을 최대화 할 수 있다.

상기 단계 4)는 기지의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머 및 카세트 서열에 특이적인 프라이머를 처리하여 미지의 뉴클레오티드 서열을 증폭하여 미지의 유전자를 클로닝하는 단계이다.

기지영역 특이 프라이머가 기지영역에 결합하는 경우는 도 2의 왼편과 같이 기지영역 특이 프라이머로부터 카세트 프라이머가 결합할 수 있는 새로운 DNA 가닥이 생성되기 때문에 ddGTP 처리에 영향을 받지 않고 원하는 부위를 증폭할 수 있다. 또한, 복잡한 여러 단계의 중합효소 연쇄반응 없이, 기지영역 특이적 프라이머 및 카세트 특이적 프라이머를 동시에 처리하여 한 번의 중합효소 연쇄반응 만으로원하는 유전자 부위를 바로 증폭할 수 있다.

본 발명에서 뉴클레오티드 서열의 증폭은 중합효소 연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)에 의할 수 있다. 중합효소 연쇄반응은 미량인 DNA 용액에서 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시키는 분자생물학적인 기술로서, 변성(Denaturation), 어닐링(Annealing), 신장(Extension)의 세 단계를 30~40 회(cycle) 정도 거쳐 증폭되는데, 이러한 PCR의 종류로는 다중 PCR(Multiplex-PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 정량적 PCR(Quantitative PCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(RT-PCR), 터치다운 PCR(Touchdown PCR) 등이 있으며, 본원 발명에서는 이에 제한되지 아니하고 적절한 중합효소 연쇄반응을 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 증폭용 조성물을 포함하는 유전자 증폭용 키트에 관한 것이다.

바람직하게 키트의 구성으로는, 기지의 뉴클레오티드 서열 및 이에 인접한 미지의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편의 3'-OH 말단에 뉴클레오티드 유사 체가 수식되고 상기 수식된 DNA 단편의 말단 서열과 상보적인 말단을 가지는 링커(linker), 아답타(adapter) 또는 카세트(cassette)를 포함하는 DNA 구조체, 기지의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머, 및 상기 카세트 서열에 특이적인 프라이머를 포함하며, 추가적으로 게놈 DNA 단편의 증폭을 위하여 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTP), Taq 중합효소와 같은 효소, 멸균수 등을 더욱 포함할 수 있다.

본원 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명에서 제공하는 방법을 게놈 DNA 로부터 특정 부위를 클로닝하는 실험에 적용하기에 앞서 염기서열을 알고 있는 유전자와 플라스미드를 이용하여 그 효과를 검정하였다. 구체적으로, 특이 증폭을 위한 대상유전자로는 효모 URA3 유전자를 사용하기 위해 이를 포함하는 BamHI 으로 잘려진 2.5kb 단편을 사용하였고 비특이 증폭의 정도를 확인하기 위하여 URA3 유전자를 포함하지 않는 BamHI 으로 잘려진 3kb pBluescriptII 플라스미드를 적절한 농도비율로 섞어서 PCR 주형으로 사용하였다. 이에 동일한 조건에서 각각 ddGTP 또는 대조구로서 dGTP 를 이용하여 3' 말단에 하나의 상보적인 염기를 filled-in하였다. 상기 각 단편의 말단 서열과 상보적인 서열을 갖는 카세트를 상기 단편 양 말단에 연결한 후, 카세트 프라이머 및 URA3 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 을 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, dGTP 로 처리한 시료에서는 PCR 주형의 농도비와 무관하게 비특이적인 증폭인 3kb pBluescriptII 가 증폭되었고 URA3 유전 자 특이 증폭(2.2kb)은 일부 농도에서만 나타난 반면, ddGTP 로 처리한 시료에서는 모든 농도비에서 비특이적인 증폭은 전혀 일어나지 않았고 URA3 특이 증폭만이 일어났음을 확인할 수 있었다.

또한, 실제로 본 발명에서 제공하는 방법을 게놈 DNA 로부터 특정 부위를 클로닝하는 실험에 적용하기 위하여, 셀룰라제 활성을 가지는 곰팡이 Penicillium sp. cf4 균주를 동정하여 이로부터 신규한 셀룰라제 유전자를 클로닝하였다. 즉, 기존에 클로닝된 셀룰라제 유전자 서열을 바탕으로 11쌍의 디제너레이트(degenerate) 프라이머를 제작하여 동 균주의 게놈 DNA 를 대상으로 PCR 을 수행하여 0.4 kb 및 0.45 kb 크기의 PCR 산물을 얻었으며, 이를 기지 영역으로 활용하여 본 발명의 방법에 따라 이와 인접한 미지의 서열을 포함하는 전체 셀룰라제 유전자 두 개(PeCBH1 및 PeCBH2)를 클로닝할 수 있었다.

이와 같이, 본 발명에서 제공하는 방법을 사용하면 게놈 유전자와 카세트의 연결 효율을 증가시키고 비특이적 증폭을 억제함으로써, 기존의 게놈 워킹 방법과 달리 복잡한 여러 단계의 중합효소연쇄반응 없이 한번의 PCR만으로 원하는 유전자 부위를 곧 바로 얻을 수 있는 장점을 제공한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 게놈 워킹 방법은 기존 방법이 가지는 비특이적 증폭을 최소화하고 카세트 연결 효율을 최대화 함으로써 추가적인 실험 없이 한번의 PCR 만으로 게놈상에서 원하는 부위를 용이하게 클로닝 할 수 있으므로 게놈 워킹(genome walking) 기술에 있어서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 카세트 제조

본 발명에서 제공하는 방법을 검증 및 확인하기 위하여 먼저 이중가닥의 카세트를 제조하였다. BamHI, BglII 또는 Sau3A로 절단된 후 ddGTP로 한 개의 염기가 채워진 게놈 DNA와 연결될 수 있도록 하기 위하여 서열번호 1(GACGCGTAATACGACTCACTATAGGGA)의 CSF 프라이머와 서열번호 2(ATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGTC)의 CSR 프라이머를 합성하고 100 μM CSF와 100 μM CSR 프라이머를 각각 40㎕를 섞은 후 250 mM Tris.Cl(pH8.0), 100 mM MgCl2 완충용액 10㎕, 증류수 10㎕를 첨가하여 95℃ 항온 수조에서 5분간 가열한 후 수조의 온도가 실온까지 내려오도록 방치하였다. 이러한 방법으로 제작된 카세트는 한쪽은 평활 말단이고 다른 한쪽은 5'에 ATC 세 개의 염기가 돌출된 구조이다.

실시예 2 : 확인용 유전자를 이용한 게놈 워킹 방법 검증

본 발명에서 제공하는 방법을 게놈 DNA로부터 특정 부위를 클로닝하는 실험 에 적용하기에 앞서 염기서열을 알고 있는 유전자와 플라스미드를 이용하여 방법을 검증하였다. 도 3에 나타낸 것과 같이 URA3 유전자를 포함하는 2.5 kb의 BamHI 단편과 BamHI으로 잘려진 3 kb pBluescriptII 플라스미드를 이용하여 ddGTP를 이용한 유전자 말단 변형 효과를 확인하고자 하였다.

비특이적 DNA로 사용될 BamHI으로 잘린 0.5 ㎍의 pBluescriptII 플라스미드와 목적 유전자로 사용될 URA3 BamHI 단편을 10ng, 1ng, 0.1ng, 0.01ng 씩 각각 섞은 후 1㎕의 2mM ddGTP와 10 배 농도의 크레나우 단편(Klenow fragment) 완충액[100mM Tris.Cl(pH7.5), 70mM MgCl2, 1mM DTT] 2㎕를 첨가한 후 증류수를 첨가하여 부피를 20㎕로 조정한 후 5 유닛 크레나우 단편(Klenow fragment)(Takara)를 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 비교를 위하여 동일한 조건에서 ddGTP 대신 dGTP를 첨가한 대조구를 제작하였다. Axygen사(미국)의 PCR 정제 kit을 사용하여 DNA를 정제한 후 40 pmol의 카세트와 DNA Ligation kit(Takara)을 사용하여 연결하였다. 연결 반응은 16℃에서 30분간 반응시켰으며 Axygen사의 PCR 정제 키트를 사용하여 정제한 후 10㎕ 증류수로 용출하였다. 용출된 각각의 시료 1㎕를 주형으로 서열번호 3의 카세트 프라이머 CP(ACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGATC)와 URA3 유전자 특이 프라이머 (GSP, gene specific primer)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 반응 조성은 다음과 같으며 [카세트와 연결된 DNA 1㎕, CP 1pmol, GSP 1pmol, EX taq buffer(Takara) 5㎕, 2.5 mM dNTP 5㎕, 증류수 37㎕, EX taq DNA polymerase(Takara) 1㎕] PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 3분 조건으로 30 사이클 반응하고 72℃ 10분 반응하였다. 반응 후 10㎕ 반응액 을 아가로스겔에서 전기 영동하여 분석하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 dGTP로 처리한 시료(lane 6-9)에서는 비특이적 증폭인 3 kb 크기의 pBluescriptII 유전자가 증폭된 반면 ddGTP로 처리한 시료(lane 2-5)에서는 비특이적 증폭이 발생하지 않았다. 또한 ddGTP로 처리한 시료의 경우 0.01 ng의 목적 유전자(pBluescriptII 사용량의 1/5000)로부터 목적 유전자 특이 증폭에 해당하는 2.2 kb 크기의 밴드를 확인 할 수 있었다(lane4). 따라서 본 발명에서 제공하는 방법은 비특이적 증폭을 최소화하고 특이적 증폭을 최대화함으로써 게놈 워킹에 매우 효과적임을 확인 할 수 있었다.

실시예 3 : 게놈 워킹 방법을 이용한 셀룰라제 유전자 클로닝

본 발명자들은 신규한 셀룰라제 유전자를 클로닝하기 위하여 셀룰라제 활성을 가지는 곰팡이를 선별하였으며 26 S ribosomal RNA 유전자의 서열을 확인하여 동정한 결과 Penicillium 속으로 분류되어 Penicillium sp. cf4 균주로 동정하였다. 동 균주로부터 셀룰라제 유전자를 클로닝하기 위하여 기존에 클로닝된 셀룰라제 유전자서열들을 바탕으로 11쌍의 디제너레이트 (degenerate)프라이머를 제작하였다. 동 균주의 게놈 DNA를 대상으로 PCR을 수행하여 셀룰라제 유전자의 일부분을 포함하는 0.4 kb, 0.45 kb 크기의 두 가지 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 각각의 PCR 산물을 pGEM-T Easy vector(Invitrogen)에 클로닝하여 염기 서열을 분석한 결과 두 가지 모두 exo-glucanase 유전자의 일부분 이었으며 지금까지 보고된 유전자 중에서 동일한 서열은 발견되지 않았다. 따라서 상기한 셀룰라제 유전자는 신규할 가능 성이 높기 때문에 각 유전자의 나머지 부분은 본 발명에서 제공하는 방법으로 게놈 카세트 라이브러리를 제작한 후 게놈 워킹 방법을 사용하여 클로닝 하고자 하였다.

Penicillium sp. cf4 게놈 DNA 2㎍을 1X BamHI 완충액(Takara)과 1X BglII 완충액(Takara) 조건하에서 10 unit의 BamHI과 BglII를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 각각 반응 후 아가로스겔에서 전기영동하여 완전히 절단되었음을 확인하였다. 70℃ 항온 수조에서 20분간 처리하여 제한효소를 불활성화시킨 후에 ddGTP를 0.2 mM이 되도록 첨가하고 8 unit의 klenow fragment(Takara)로 37℃에서 30분간 반응 하였다. Axygen 사의 PCR 정제 kit을 사용하여 DNA를 정제한 후 40pmol의 카세트와 DNA ligation kit(Takara)을 사용하여 연결하였다. 연결 반응은 16℃에서 10시간 반응 하였으며 다시 Axygen 사의 PCR 정제 kit을 사용하여 DNA를 정제한 후 20㎕ 증류수로 용출하여 BamHI 카세트 라이브러리와 BglII 카세트 라이브러리를 각각 제작하였다.

첫 번째 셀룰라제 유전자를 클로닝하기 위하여 도 4 A에서 보는 바와 같이 0.4 kb PCR 산물(기지영역 I)의 염기 서열을 바탕으로 25 염기의 셀룰라제 특이 프라이머(CBH1F, CBH1R)를 양방향으로 제작한 후 각각의 카세트 라이브러리 1㎕를 주형으로 카세트 프라이머 CP (서열번호 3)와 PCR을 수행하였다. 셀룰라제 유전자의 5' 부위를 클로닝하기 위한 반응 조성은 다음과 같으며[게놈 카세트 라이브러리 1㎕, CP 1 pmol, CBH1R 1pmol, EX taq buffer (Takara) 5㎕, 2.5 mM dNTP 5㎕, 증류수 37㎕, EX taq DNA polymerase(Takara) 1㎕] 셀룰라제 유전자의 3' 부위를 클로닝하기 위한 반응은 CBH1R 프라이머 대신 CBH1F 프라이머를 사용한다. PCR 조건 은 95℃ 5분 반응 후 95 ℃ 30초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 3분 조건으로 30 cycle 반응하고 72 ℃에서 10분간 추가 반응하였다. 반응 후 10㎕의 반응액을 아가로스겔에서 전기영동하여 분석한 결과 5' 부위 클로닝 반응에서는 2.6 kb 크기의 단편이 BglII 카세트 라이브러리로부터 증폭되었고 3' 부위 클로닝 반응에서는 3.7 kb 크기의 단편이 BamHI 카세트 라이브러리로부터 증폭되었다 (도 4 C, 레인 2, 3). 각각의 PCR 산물을 pGEM-T Easy vector (Invitrogen)에 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과 클로닝 하고자 하는 부위가 증폭되었음을 확인하였으며 셀룰라제 유전자의 전체서열을 확인 할 수 있었다. 위 방법으로 클로닝된 Penicillium sp. cf4 유래의 셀룰라제 유전자 (PeCBH1)는 인트론이 없는 26개의 분비시그널과 셀룰로스 결합 모듈(cellulose binding module, CBM)을 포함하는 547개의 아미노산으로 구성된 exo-cellobiohydrolase 였으며 Penicillium oxalicum 유래의 exo-cellobiohydrolase와 74.3 % 아미노산 유사성을 나타내었다.

두 번째 셀룰라제 유전자를 클로닝하기 위하여 도 4(B)에서 보는 바와 같이 0.45 kb PCR 산물(기지영역 II)의 염기 서열을 바탕으로 25염기의 셀룰라제 특이 프라이머(CBH2F, CBH2R)를 양방향으로 제작한 후 상기한 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 5' 부위 클로닝 반응에서는 1.5 kb 크기의 단편이 BglII 카세트 라이브러리로부터 증폭되었고 3' 부위 클로닝 반응에서는 4.0 kb 크기의 단편이 BamHI 카세트 라이브러리로부터 증폭되었다 (도 4 C, 레인 4, 5). 각각의 PCR 산물을 pGEM-T Easy vector(Invitrogen)에 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과 클로닝 하고자 하는 부위가 증폭되었음을 확인하였으며 두 번째 셀룰라제 유전자의 전체서 열을 확인할 수 있었다. Penicillium sp. cf4 유래의 두 번째 셀룰라제 유전자 (PeCBH2)는 인트론을 2개 포함하고 있으며 유추된 아미노산 서열은 17개의 분비시그널을 포함하는 452개의 아미노산으로 구성된 exo-cellobiohydrolase 였으며 Penicillium decumbens 유래의 exo-cellobiohydrolase와 78.4 % 아미노산 유사성을 나타내었다.

도 1은 기존의 카세트 연결 PCR 방법을 이용한 게놈워킹방법을 나탄낸 그림이다. 그림중간 표식 "<"은 PCR 산물이 대부분 비특이적(non-specific) 증폭에 의한 DNA임을 의미함.

도 2는 비특이적 증폭 억제 PCR을 통한 개선된 게놈 워킹 방법을 나타낸 그림이다. 그림중간 표식 ">"은 PCR 산물이 대부분 특이적(specific) 증폭에 의한 DNA임을 의미함.

도 3은 확인용 유전자를 이용하여 게놈 워킹 방법을 검증한 결과이다.

왼편의 그림은 카세트가 연결된 확인용 유전자(URA3 및 pBluescript II)를 표시한 그림이고 오른편 그림은 PCR 후 전기영동한 결과를 나타내는 아가로스겔 전기영동 사진이다.

1 레인 : 1 kb DNA ladder

2 레인 : BamHI 으로 잘린 pBluescriptII 0.5 ㎍과 URA3 BamHI단편 10 ng을 ddGTP로 처리하고 40pmol의 카세트와 연결한 후 CP(cassette primer)와 GSP(gene-specific primer)로 PCR한 결과.

3 레인 : BamHI 으로 잘린 pBluescriptII 0.5 ㎍과 URA3 BamHI단편 1 ng을 ddGTP로 처리하고 40pmol의 카세트와 연결한 후 CP와 GSP로 PCR한 결과.

4 레인 : BamHI 으로 잘린 pBluescriptII 0.5 ㎍과 URA3 BamHI단편 0.1 ng을 ddGTP로 처리하고 40pmol의 카세트와 연결한 후 CP와 GSP로 PCR한 결과.

5 레인 : BamHI 으로 잘린 pBluescriptII 0.5 ㎍과 URA3 BamHI단편 0.01 ng 을 ddGTP로 처리하고 40pmol의 카세트와 연결한 후 CP와 GSP로 PCR한 결과.

6 레인 : BamHI 으로 잘린 pBluescriptII 0.5 ㎍과 URA3 BamHI단편 10 ng을 dGTP로 처리하고 40pmol의 카세트와 연결한 후 CP와 GSP로 PCR한 결과.

7 레인 : BamHI 으로 잘린 pBluescriptII 0.5 ㎍과 URA3 BamHI단편 1 ng을 dGTP로 처리하고 40pmol의 카세트와 연결한 후 CP와 GSP로 PCR한 결과.

8 레인 : BamHI 으로 잘린 pBluescriptII 0.5 ㎍과 URA3 BamHI단편 0.1 ng을 dGTP로 처리하고 40pmol의 카세트와 연결한 후 CP와 GSP로 PCR한 결과.

9 레인 : BamHI 으로 잘린 pBluescriptII 0.5 ㎍과 URA3 BamHI단편 0.01 ng을 ddGTP로 처리하고 40pmol의 카세트와 연결한 후 CP와 GSP로 PCR한 결과.

10 레인 : 1 kb DNA ladder

도 4는 게놈 워킹 방법을 이용하여 곰팡이 게놈으로부터 신규한 셀룰라제 유전자를 클로닝하는 그림이다. A와 B 그림은 셀룰라제 유전자의 구조와 셀룰라제 유전자에 결합하는 프라이머의 위치를 나타내는 그림이고 C 그림은 PCR 결과를 나타내는 아가로스겔 전기영동 사진이다.

1 레인 : 1 kb DNA ladder.

2 레인 : CP 프라이머와 CBH1R 프라이머를 이용하여 BglII 카세트 라이브러리를 PCR 결과.

3 레인 : CP 프라이머와 CBH1F 프라이머를 이용하여 BamHI 카세트 라이브러리를 PCR 결과.

4 레인 : CP 프라이머와 CBH2R 프라이머를 이용하여 BglII 카세트 라이브러 리를 PCR 결과.

5 레인 : CP 프라이머와 CBH2F 프라이머를 이용하여 BamHI 카세트 라이브러리를 PCR 결과.

6 레인 : 1 kb DNA ladder.

Claims (5)

1) 하나의 염색체 위에 놓인 기지(旣知, known)의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 PCR로 증폭 가능한 거리인 40 kb 거리 내에 있는 미지의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈 DNA에서 기지 서열부터 미지 서열까지는 유지되고 그 보다 바깥 부분을 제한효소로 절단하는 단계;

2) 상기 절단된 DNA의 3'-OH 말단과 뉴클레오티드 유사체인 ddNTP를 연결하는 단계;

3) 상기 절단된 DNA 단편에 ddNTP가 연결된 후의 말단 서열에 그 말단 서열과 상보적인 말단이 부가된 링커(linker), 아답타(adapter) 또는 DNA 단편의 말단 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 5' 말단에 인산기가 없어서 이중가닥 중 단일가닥만 DNA 단편의 말단에 연결되는 이중가닥의 올리고뉴클레오티드로 구성된 카세트(cassette)를 연결하는 단계; 및

4) 기지의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머 및 카세트 서열에 특이적인 프라이머를 처리하여 미지의 뉴클레오티드 서열을 증폭하는 단계를 포함하는, 기지의 뉴클레오티드 서열로부터 PCR로 증폭 가능한 거리인 40 kb 거리 내에 있는 미지의 뉴클레오티드 서열을 클로닝하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 ddNTP는 ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP, ddUTP 및 ddITP 로 이루어진 군에서 선택되는 ddNTP 인 방법.

1) 하나의 염색체 위에 놓인 기지(旣知, known)의 뉴클레오티드 서열 및 이로부터 PCR로 증폭 가능한 거리인 40 kb 거리 내에 있는 미지의 뉴클레오티드 서열을 포함하며 3'-OH 말단이 뉴클레오티드 유사체인 ddNTP와 연결된 DNA 단편, 및 상기 연결된 DNA 단편의 말단 서열과 상보적인 말단이 부가된 링커(linker), 아답타(adpter) 또는 DNA 단편의 말단 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 5' 말단에 인산기가 없어서 이중가닥 중 단일가닥만 DNA 단편의 말단에 연결되는 이중가닥의 올리고뉴클레오티드로 구성된 카세트(cassette)를 포함하는 DNA 구조체, 2) 기지의 뉴클레오티드 서열에 특이적인 프라이머, 및 3) 상기 카세트 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는, 유전자 증폭용 조성물.

제3항에 있어서, 상기 ddNTP는 ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP, ddUTP 및 ddITP 로 이루어진 군에서 선택되는 ddNTP 인 조성물.

제3항의 조성물을 포함하는 유전자 증폭용 키트.

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