KR101196023B1

KR101196023B1 - 식물에서 글리칸 프로세싱의 최적화

Info

Publication number: KR101196023B1
Application number: KR1020107029774A
Authority: KR
Inventors: 헨드리쿠스 안토니우스 코르넬루스 바커; 디오니시우스 엘리사베트 안토니우스 플로라크; 헨드리크 얀 보쉬; 게라르트 요한 아돌프 로우웬달
Original assignee: 스티칭 디엔스트 랜드보위쿤디그 온데조에크
Priority date: 2002-03-19
Filing date: 2003-03-18
Publication date: 2012-10-30
Anticipated expiration: 2023-03-18
Also published as: US8058508B2; KR101228276B1; JP4532118B2; HK1124364A1; EP1485486A2; KR20040091144A; US20120011600A1; EP1485486B1; JP2014221077A; AU2003219418B2; KR20110079860A; CA2923247A1; EP1959018B1; EP2339004A1; CA2478297A1; JP2012070761A; AR039013A1; US7601891B2; CN100532558C; KR20110004490A

Abstract

본 발명은 유기체 (및 특히 식물)에서 글리칸 프로세싱을 최적화하여 복합체 타입 2-안테나 글리칸을 갖기 때문에 양쪽 팔 (arm)에 갈락토스 잔기를 5 포함하며 크실로스 및 푸코스가 없는 당단백질을 얻는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 얻어진 상기 당단백질 및 이 단백질을 포함하는 숙주계에 관한 것이다.

Description

식물에서 글리칸 프로세싱의 최적화{Optimizing Glycan Processing in Plants}

본 발명은, 2-안테나(bi-antennary) N-글리칸에 제한되지 않으나 이를 포함하는, N-글리칸, 고 만노스 타입 (high mannose type), 혼성 또는 바람직하게는 복합체 타입 N-글리칸을 가지며, N-글리칸의 적어도 하나의 팔 (arm)에 갈락토스 잔기를 포함하고 크실로스 및 푸코스 잔기가 없거나 그 잔기가 감소된 당단백질을 얻을 수 있도록, N-글리칸을 갖는 당단백질을 포함하는 세포 또는 유기체, 특히 식물의 글리칸 프로세싱을 최적화하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 얻어진 상기한 당단백질 및 특히 상기 단백질을 포함하는 식물 숙주계에 관한 것이다.

당단백질의 아스파라긴 잔기에 부착된 특정한 올리고당 구조인 N-연결 글리칸은 그 단백질의 성질 및 나아가 그 유기체의 성질에 상당히 영향을 줄 수 있다. 식물 단백질들은 N-연결 글리칸을 보유할 수 있지만 포유동물과는 아주 반대로, 이들이 관여하는 것으로 알려진 생체 과정은 소수일 뿐이다.

N-연결 글리칸의 생물생성 (biogenesis)은 지질 연결 올리고당 부분 (Glc3Man9GlcNAc2-)의 합성과 함께 시작되며, 지질 연결 올리고당 부분은 소포체 (ER)에서 신생 폴리펩티드쇄로 일괄 전이된다. ER 및 시스 골지체 구획에서 엑소글리코시다제에 의한 일련의 트리밍 반응을 통해 소위 "고 만노스" (Man9GlcNAc2 내지 Man5GlcNAc2) 글리칸이 형성된다. 이어서, 복합체 타입 글리칸의 형성이 GnT1에 의한 제1 GlcNAc의 Man5GlcNAc2 상으로의 전이와 함께 개시되고 추가로 만노시다제 II (ManII)에 의해 트리밍되어 GlcNAcMan3GlcNAc2를 형성한다. 복합체 글리칸 생합성은, 골지체내에서 GnTII에 의한 제2 GlcNAc 잔기의 전이 및 GlcNAcMan3GlcNAc2 상으로 여러 다른 글리코실 트랜스퍼라제의 작용에 의한 그외 단당 잔기의 전이와 함께 당단백질이 분비 경로를 통하여 프로세싱되면서 계속된다.

식물 및 포유동물은 복합체 글리칸 (식물 및 포유동물 중의 당단백질의 당화 경로를 비교한 도 1 참조)의 형성과 관련하여 차이가 있다. 식물에서, 복합체 글리칸은 GlcNAc-1에 연결된 α(1,6)-푸코스 잔기 대신에 GlcNAc-1에 연결된 α(1,3)-푸코스 잔기 및(또는) Man-3에 연결된 β(1,2)-크실로스 잔기의 존재를 특징으로 한다. 상응하는 크실로실(XylT) 및 푸코실(FucT) 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자가 단리되었다 (Strasser et al., "Molecular cloning and functional expression of beta 1,2-xylosyltransferase cDNA from Arabidopsis thaliana", FEBS Lett. 472:105(2000), Leiter et al., "Purification, cDNA cloning, and expression of GDP-L-Fuc:Asn-linked GlcNAc alpha 1,3-fucosyltransferase from mung beans", J. Biol. Chem. 274:21830 (1999)). 식물은 β(1,4)-갈락토실트랜스퍼라제 및 α(2,6)시알릴트랜스퍼라제 둘다 없어서, 결과적으로 식물 글리칸은 포유동물 글리칸에서 종종 발견되는 β(1,4)-갈락토스 및 말단 α(2,6)NeuAc 잔기가 없다.

최종적인 글리칸 구조는 이들 생합성 및 운반에 관여하는 효소의 단순한 존재뿐만 아니라 다양한 효소 반응의 특정한 순서에 의하여 상당한 정도까지 결정된다. 후자는 ER 및 골지체 전체에서 이들 효소의 별개의 고립화 (sequestering) 및 상대적 위치에 의하여 조절되며, 이는 트랜스퍼라제의 결정인자들의 상호작용 및 트랜스퍼라제가 보내지는 서브 골지 구획의 특정한 특성에 의하여 매개된다. 혼성 분자를 사용하는 많은 연구에 의하여 β(1,4)-갈락토실트랜스퍼라제의 막횡단 (transmembrane) 도메인을 비롯한 여러 글리코실트랜스퍼라제의 막횡단 도메인이 그들의 서브-골지체 분류에 있어서 중심적 역할을 함이 밝혀졌다 (Grabenhorst et al., J. Biol. Chem. 274:36107 (1999), Colley, K., Glycobiology 7:1 (1997), Munro, S., Trends Cell Biol. 8:11 (1998), Gleeson, P.A., Histochem. Cell Biol. 109:517 (1998)).

식물 및 포유동물이 비교적 오랜 시간 전에 분기되었을지라도, N-연결 당화는 적어도 부분적으로 보존된 것으로 보인다. 이는, 동일하지는 않으나 유사한 글리칸 구조에 의하여, 그리고 포유동물 GlcNAc TI 유전자가 GlcNAcTI 활성이 결여된 아라비돕시스 (Arabidopsis) 돌연변이체와 상보적이거나 그 반대라는 관찰결과에 의하여 입증된다. 글리칸 구조에서의 차이는 중요한 결과를 가질 수 있다. 예를 들면, 크실로스 및 α(1,3)-푸코스 에피토프는 고도의 면역원성이고 일부 환경에서는 아마도 알레르겐성인 것으로 공지되어 있으며, 이는 식물이 치료 당단백질의 생성에 사용될 때 문제가 될 수 있다. 더욱이, 많은 알레르기 환자의 혈청에 이들 에피토프에 대한 IgE가 포함되어 있으나, 비알레르기 혈액 공여자 중 50 %도 그들의 혈청 중에 코어-크실로스에 특이적인 항체를 포함하는 반면, 25 %가 코어-α 1,3-푸코스에 대한 항체를 가지며 (Bardor et al., 2002, 출판 중, Glycobiology) (Advance Access가 2002년 12월 17일에 출판), 이는 푸코스 및(또는) 크실로스를 함유하는 식물에서 생성된 재조합 단백질로 치료받는 사람들을 위험하게 한다. 또한, 혈청 중의 이러한 탄수화물 유도 IgE는 식물 추출물을 사용하는 시험관내 시험에서 잘못된 양성 반응을 일으킬 수 있는데, 왜냐하면 이들 탄수화물 특이적 IgE은 알레르기 반응에 관련이 없다는 증거가 있기 때문이다. 결과적으로, 식물에서 생성된 당단백질을 사용한 치료 실패는 크실로스 및(또는) 푸코스를 갖는 재조합 당단백질의 가속화된 제거의 결과일 수 있다.

따라서, 식물에서 당화 및 특히 치료용의 당단백질의 당화를 더 잘 조절할 필요가 있다.

정의

본 발명의 이해를 돕기 위하여, 이 명세서에 사용된 많은 용어들을 아래와 같이 정의한다.

용어 "벡터"는 적절한 조절 요소와 결합되면 복제 (replication)될 수 있고 유전자 서열을 세포 안으로 및(또는) 세포들 사이에서 운반할 수 있는, 플라스미드, 파아지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 레트로바이러스, 바이론 또는 유사한 유전적 요소 등의 모든 유전적 요소를 가리킨다. 따라서, 이 용어는 클로닝 및 발현 비히클 및 바이러스 벡터를 포함한다.

용어 "발현 벡터"란, 혼성 효소 (아래에 상술함)를 위한 코딩 서열(들) 등 원하는 코딩 서열 (또는 코딩 서열들) 및 특정 숙주 세포 또는 유기체내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적절한 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 가리킨다. 원핵생물에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 프로모터, 오퍼레이터 (비필수적), 및 리보솜 결합 부위를 종종 다른 서열들과 함께 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 인핸서 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 특정한 발현 벡터 또는 특정 요소가 포함된 발현벡터에 제한되는 것은 아니다.

용어 "트랜스제닉"이 세포와 관련하여 사용되는 경우, 형질도입유전자 (transgene)를 포함하거나 형질도입유전자의 도입에 의하여 게놈이 변경된 세포를 가리킨다. 용어 "트랜스제닉"이 세포, 조직 또는 식물과 관련하여 사용되는 경우, 각각, 형질도입유전자를 포함하는 세포, 그 조직 중 하나 이상의 세포가 형질도입유전자 (본 발명의 혼성 효소를 코딩하는 유전자 등)를 포함하는 조직, 또는 형질도입유전자의 도입에 의하여 게놈이 변경된 식물을 가리킨다. 트랜스제닉 세포, 조직 및 식물은 본 명세서에 기재한 방법에 의하는 등, 인위적 개입의 방식에 의하여 "형질도입유전자"를 이루는 핵산 (통상 DNA)을 표적 세포로 도입하거나 형질도입유전자를 표적 세포의 염색체내로 통합시키는 것을 비롯한 여러 가지 방법에 의하여 생성될 수 있다.

본 명세서에 사용될 때 용어 "형질도입유전자 (transgene)"는 실험적 조작에 의하여 세포의 게놈내로 도입되는 모든 핵산 서열을 가리킨다. 형질도입유전자는 "내인성 DNA 서열" 또는 "이종 DNA 서열" (즉, "외래 DNA")일 수 있다. 용어 "내인성 DNA 서열"이란 그것이 도입되는 세포에서 자연적으로 발견되는 뉴클레오티드 서열로서, 자연발생 서열과 비교할 때 어떠한 변형 (예를 들면, 점 돌연변이, 선택가능한 마커 유전자의 존재, 또는 그외 유사한 변형)을 포함하지 않는 것을 가리킨다. 용어 "이종 DNA 서열"이란, 본래는 라이게이션되지 않거나 또는 본래는 상이한 위치에서 라이게이션되는 핵산 서열로 라이게이션되거나 또는 라이게이션되도록 조작된 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 이종 DNA는 그것이 도입되는 세포에 대해 내인성이 아니고 다른 세포로부터 얻어진 것이다. 이종 DNA는 또한 약간의 변형을 포함하는 내인성 DNA 서열을 포함한다. 필수적인 것은 아니나 일반적으로, 이종 DNA는 그것이 발현되는 세포에 의해 통상 생성되지 않는 RNA 및 단백질을 코딩한다. 이종 DNA의 예는 리포터 유전자, 전사 및 번역 조절 서열, 선택가능한 마커 단백질 (예를 들면, 약물 내성을 부여하는 단백질) 또는 그외 유사한 요소를 포함한다.

용어 "외래 유전자"는 실험적 조작에 의하여 세포의 게놈으로 도입되는 모든 핵산 (예를 들면, 유전자 서열)을 가리키며, 도입된 유전자가 자연발생 유전자와 비교할 때 약간의 변형 (예를 들면, 점 돌연변이, 선택가능한 마커 유전자의 존재, 또는 그외 유사한 변형)을 포함하는 한 그 세포에서 발견되는 유전자 서열을 포함할 수 있다.

용어 "융합 단백질"이란 적어도 한 부분 또는 일부가 제1 단백질로부터 유래하고 다른 부분 또는 일부가 제2 단백질로부터 유래한 단백질을 가리킨다. 용어 "혼성 효소"란 적어도 한 부분 또는 일부가 제1 종으로부터 유래하고 다른 부분 또는 일부가 제2 종으로부터 유래한, 기능적 효소인 융합 단백질을 의미한다. 본 발명의 바람직한 혼성 효소는 적어도 한 부분 또는 일부가 식물로부터 유래하고 다른 부분 또는 일부가 포유동물 (인간 등)로부터 유래한 기능적 글리코실트랜스퍼라제 (또는 그 일부)이다.

핵산 (예를 들면, 벡터)과 관련하여 용어 "세포내로의 도입" 또는 "숙주 세포내로의 도입"은 그 기술을 "형질전환 (transformation)" 또는 "형질감염 (transfection)" 또는 "형질도입 (transduction)"으로 부르는 것을 포함하는 것이다. 세포의 형질전환은 안정적이거나 일시적일 수 있고, 본 발명은 한편으로는 안정적인 발현이 있고 다른 한편으로는 단지 일시적인 발현만 있는 조건하에서 벡터를 도입하는 것을 고려한다. 용어 "일시적인 형질전환" 또는 "일시적으로 형질전환된"이란, 하나 이상의 형질도입유전자를 세포내로 도입하되, 그 숙주 세포의 게놈에 그 형질도입유전자가 통합되지는 않는 것을 의미한다. 일시적인 형질전환은 예를 들어 효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA)에 의하여 검출될 수 있으며, 이 분석은 하나 이상의 형질도입유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩티드의 존재를 검출한다. 이와 다르게는, 일시적 형질전환은 형질도입유전자 (예를 들면, 항체 유전자)에 의하여 코딩되는 단백질의 활성 (예를 들면 항체의 항원 결합)을 검출함으로써 검출할 수 있다. 용어 "일시적인 형질전환체"란, 하나 이상의 형질도입유전자를 일시적으로 합체한 세포를 가리킨다. 반대로, 용어 "안정적인 형질전환" 또는 "안정적으로 형질전환된"이란, 하나 이상의 형질도입유전자를 세포의 게놈내로 도입 및 통합하는 것을 가리킨다. 세포의 안정적인 형질전환은 세포의 게놈 DNA를 하나 이상의 형질도입유전자에 결합할 수 있는 핵산 서열과 서던 블롯 혼성화시킴으로써 검출할 수 있다. 이와 다르게는, 세포의 안정적인 형질전환은 게놈 DNA의 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의하여 형질도입유전자 서열을 증폭시켜서 검출할 수 있도 있다. 용어 "안정적인 형질전환체"란 하나 이상의 형질도입유전자가 게놈 DNA로 안정적으로 통합된 세포를 가리킨다. 따라서, 안정적인 형질전환체의 게놈 DNA가 하나 이상의 형질도입유전자를 포함한 반면, 일시적인 형질전환체의 게놈 DNA는 형질도입유전자를 포함하지 않는다는 점에서 안정적인 형질전환체는 일시적인 형질전환체와 구별된다.

용어 "숙주 세포"란 포유동물 세포 (예를 들면, 인간 B 세포 클론, 차이니스 햄스터 난소 세포, 간 세포) 및 비포유동물 세포 (예를 들면, 곤충 세포, 세균 세포, 식물 세포) 둘 다를 포함한다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이며, 본 발명의 혼성 단백질 (예를 들면, TmGnTII-GalT)을 발현하는 벡터를 도입하면 상기 포유동물 세포에서 푸코실화를 억제한다 (또는 적어도 감소시킨다).

용어 "관심있는 뉴클레오티드 서열"이란 당분야의 숙련자에 의하여 어떠한 이유 (예를 들면, 개선된 특질 부여, 치료 단백질의 생산을 위한 사용)로 그 조작이 필요한 것으로 생각될 수 있는 모든 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 그러한 뉴클레오티드 서열은 구조 유전자 (예를 들면, 리포터 유전자, 선별 마커 유전자, 발암유전자, 항체 유전자, 약물 내성 유전자, 성장인자 및 그외 유사한 유전자)의 코딩 서열 및 mRNA 또는 단백질 생성물을 코딩하지 않는 비코딩 조절 서열 (예를 들면, 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 종결 서열, 인핸서 서열, 및 그외 유사한 서열)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 하나 이상의 혼성 효소와 함께 관심있는 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩되는 이종 단백질을 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다.

"단리된 핵산 서열"에서와 같이 핵산과 관련하여 사용되는 용어 "단리된"이란 핵산의 천연 원천에서 보통 결합되어 있는 하나 이상의 다른 성분으로부터 분리 (예를 들면, 핵산을 포함하는 세포부터 분리, 또는 하나 이상의 오염물 핵산으로부터 분리, 또는 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 지질로부터 분리)되고 동정된 핵산 서열을 가리킨다. 단리된 핵산은 그것이 본래 발견되는 형태와는 다른 형태나 설정으로 존재하는 핵산이다. 반대로, 비단리된 핵산은 본래 그들이 존재하는 상태로 발견되는 DNA 및 RNA 등의 핵산이다. 예를 들면, 주어진 DNA 서열 (예를 들면, 유전자)은 이웃한 유전자에 근접하여 숙주 세포 염색체 상에서 발견되며, 특정 단백질을 코딩하는 특정 mRNA 서열 등의 RNA 서열은 세포내에서 많은 단백질을 코딩하는 많은 다른 mRNA와 혼합물로서 발견된다. 그러나, 서열 1을 포함하는 단리된 핵산 서열은 예를 들면, 그 핵산 서열이 천연 세포의 것과는 상이한 염색체 또는 염색체외 위치에 있을 때 서열 1을 보통 포함하는 세포내의 핵산 서열을 포함하거나 그렇지 않고 본래 발견되는 것과 다른 핵산 서열로 플랭킹된다. 단리된 핵산 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 단리된 핵산 서열이 단백질을 발현하는 데에 사용되려면, 그 핵산 서열은 최소한 적어도 일부의 센스 또는 코딩 가닥을 포함할 수 있다 (즉, 핵산 서열은 단일 가닥일 수 있음). 이와 다르게는, 센스 및 안티-센스 가닥 양자를 포함할 수 있다 (즉, 그 핵산 서열은 이중 가닥일 수 있음).

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "정제된"이란, 핵산 또는 아미노산 서열인 분자가 이들의 천연 환경으로부터 제거되거나 단리 또는 분리됨을 의미한다. 따라서, "단리된 핵산 서열"은 정제된 핵산 서열이다. "실질적으로 정제된" 분자란, 이들이 자연적으로 결합한 다른 성분들로부터 60 % 이상 유리된, 바람직하게는 75 % 이상 유리된, 더 바람직하게는 90 % 유리된 것이다. 본 발명은 정제된 혼성 효소 (실질적으로 정제된 것을 포함) 및 비정제된 혼성 효소 (상세히 후술함)에 관한 것이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "상보적" 또는 "상보성"이란 염기쌍 형성 규칙에 의하여 관련된 뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용된다. 예를 들면, 서열 5'-AGT-3'은 서열 5'-ACT-3'과 상보적이다. 상보성은 "부분적" 또는 "전면적"일 수 있다. "부분적" 상보성이란 하나 이상의 핵산 염기가 염기쌍 형성 규칙에 따라 매치되지 않는 경우이다. 핵산간의 "전면적" 또는 "완전한" 상보성은 각각의 모든 핵산 염기가 염기쌍 형성 규칙하에서 다른 염기와 매치되는 경우이다. 핵산 가닥 간의 상보성의 정도는 핵산 가닥 간의 혼성화 효율성 및 강도에 상당한 영향을 준다.

본 명세서에 사용된 핵산 서열의 "상보체"란 그 핵산 서열의 핵산에 대하여 전면적 상보성을 보이는 핵산을 가지는 뉴클레오티드 서열을 가리킨다. 예를 들면, 본 발명은 서열 1, 3, 5, 9, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 37, 38, 40, 41 및 43의 상보체에 관한 것이다.

핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "상동성 (homology)"이란 상보성의 정도를 가리킨다. 부분적 상동성 (즉, 부분적 동일성) 또는 완전한 상동성 (즉, 완전한 동일성)이 있을 수 있다. 부분적으로 상보적인 서열은 완전하게 상보적인 서열이 표적 핵산에 혼성화되는 것을 적어도 부분적으로 방해하는 것이며, 기능적 용어인 "실질적으로 상동성인"를 사용할 때 언급된다. 완전하게 상보적인 서열의 표적 서열로의 혼성화를 방해하는 것은 저엄격도 (low stringency) 조건하에서 혼성화 분석 (서던 또는 노던 블롯, 용액 혼성화 및 기타)을 통해 검사할 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열 또는 프로브 (즉, 관심있는 다른 올리고뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드)는 저엄격도 조건하에서 완전하게 상동성인 서열이 표적에 결합하는 것 (즉, 혼성화)을 경쟁하고 방해할 것이다. 이는 저엄격도 조건이 비특이적 결합이 허용되는 것임을 말하려는 것은 아니다. 저엄격도 조건은 두 서열 상호간의 결합이 특이적 (즉, 선택적) 상호작용일 것을 요구하기 때문이다. 비특이적 결합의 부재는 부분적인 정도의 상보성조차 결여한 (예를 들면, 약 30 % 미만의 동일성) 제2 표적을 사용함으로써 시험할 수 있다. 비특이적 결합이 없는 상태에서는 프로브는 제2 비상보적 표적에 혼성화되지 않을 것이다.

cDNA 또는 게놈 클론 등의 이중 가닥 핵산 서열과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "실질적으로 상동성인"이란, 후술한 바와 같은 저엄격도 조건하에서 이중 가닥 핵산 서열의 한쪽 또는 양쪽 가닥에 혼성화될 수 있는 모든 프로브를 가리킨다.

단일가닥 핵산 서열과 관련하여 사용될 때 용어 "실질적으로 상동성인"이란 후술한 바와 같은 저엄격도 조건하에서 단일가닥 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 모든 프로브를 가리킨다.

본 명세서에 사용된 용어 "혼성화"란 "핵산 가닥이 염기쌍 형성을 통해 상보적 가닥과 결합하는 과정"을 포함한다 (Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York, NY). 혼성화 및 혼성화 강도 (즉, 핵산간의 결합 강도)는 핵산 간의 상보성 정도, 관련된 조건의 엄격도, 형성된 혼성체의 T_m 및 핵산 내의 G:C 비율 등의 요인에 의하여 영향을 받는다.

본 명세서에 사용될 때 용어 "T_m"이란 융점과 관련하여 사용된다. 융점은 이중가닥 핵산 분자 집단이 반쯤 단일가닥으로 해리되는 온도이다. 핵산의 T_m을 계산하기 위한 방정식은 당분야에 잘 알려져 있다. 표준적인 참고문헌에 지적된 바와 같이, T_m 값의 단순한 측정은 핵산이 1 M NaCl인 수용액 중에 있을 때 방정식: T_m = 81.5 + 0.41 (%G + C)에 의하여 계산할 수 있다 (참조: Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in: Nucleic Acid Hybridization (1985)). 다른 참고문헌은 T_m의 계산에 있어서 구조적 및 서열 특성을 고려하는 더 복잡한 계산을 포함한다.

핵산 혼성화와 관련하여 사용될 때 저엄격도 조건은, 약 100 내지 약 1000 뉴클레오티드 길이의 DNA 프로브가 사용되는 경우 5X SSPE (염수, 인산나트륨, EDTA) (43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄·H₂O 및 1.85 g/l EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산), NaOH로 pH를 7.4로 조정), 0.1 % SDS (나트륨 도데실 술페이트), 5X 덴하르츠 (Denhardt's) 시약 (50X 덴하르츠는 500 ml당, 5 g 피콜 (타입 400, 파마시아 제품), 5 g BSA (소 혈청 알부민) (분획 V, 시그마 제품) 포함) 및 100 ㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA로 이루어진 용액 중에서 68 ℃에서의 결합 또는 혼성화한 후, 실온에서 0.2X 내지 2.0X SSPE 및 0.1 % SDS을 포함하는 용액 중에서 세척하는 것과 동등한 조건을 포함한다.

핵산 혼성화와 관련하여 사용되는 경우 고엄격도 조건은 약 100 내지 약 1000 뉴클레오티드 길이의 DNA 프로브가 사용되는 경우 5X SSPE, 1 % SDS, 5X 덴하르츠 시약 및 100 ㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA로 이루어진 용액 중에서 68 ℃에서 결합 또는 혼성화한 후 0.1X SSPE 및 0.1 % SDS를 포함하는 용액 중에서 68 ℃에서 세척하는 것과 동등한 조건을 포함한다.

용어 "동등한 (equivalent)"는 그것이 관심있는 혼성화 조건과 관련될 때 혼성화 조건과 관련하여 언급된 경우 혼성화 조건 및 관심있는 혼성화 조건이 퍼센트 (%) 상동성의 동일한 범위를 가지는 핵산 서열의 혼성화를 가져오는 것을 의미한다. 예를 들면, 관심있는 혼성화 조건은 제1 핵산 서열과 제1 핵산 서열에 대해 50 % 내지 70 %의 상동성을 가지는 다른 핵산 서열과의 혼성화를 가져온다면, 다른 혼성화 조건이 제1 핵산 서열에 대해 50 % 내지 70 %의 상동성을 가지는 다른 핵산 서열과 제1 핵산 서열의 혼성화를 가져온다면, 관심있는 혼성화 조건에 동등하다고 말한다.

핵산 혼성화와 관련하여 사용될 때 저엄격도 또는 고엄격도 조건을 포함하여 수많은 동등한 조건이 사용될 수 있으며, 프로브의 길이 및 성질 (DNA, RNA, 염기 조성) 및 표적의 성질 (DNA, RNA, 염기 조성, 용액 중에 존재하거나 또는 고정됨) 및 염 및 기타 성분의 농도 (예를 들면, 포름아미드, 덱스트란 술페이트, 폴리에틸렌 글리콜의 존부) 등의 요인들이 고려되며, 혼성화 용액을 달리하여 상기 열거한 조건과 상이하지만 동등한 저엄격도 또는 고엄격도 혼성화 조건을 생성할 수 있다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 "프로모터", "프로모터 요소" 또는 "프로모터 서열"은 관심있는 뉴클레오티드 서열에 라이게이션되었을 때 관심있는 핵산 서열의 mRNA로의 전사를 조절할 수 있는 DNA 서열을 가리킨다. 프로모터가 mRNA로의 전사를 조절하는 관심있는 뉴클레오티드 서열의 5'에 프로모터가 위치하는 것이 필수적인 것은 아니나 통상적이며, RNA 중합효소 및 전사 개시를 위한 그외 전사 인자에 의한 특이적 결합을 위한 부위를 제공한다.

프로모터는 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다. 프로모터에 적용될 때 용어 "조직 특이적"란 다른 타입의 조직 (예를 들면 뿌리)에서는 관심있는 동일한 뉴클레오티드 서열의 발현이 상대적으로 없는 상태에서 특정 타입의 조직 (예를 들면, 화판)에서는 관심있는 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 가리킨다. 프로모터의 조직 특이성은, 예를 들어 리포터 유전자를 프로모터 서열에 작동가능하게 연결하여 리포터 구조물을 생성하고 이 리포터 구조물을 식물의 게놈 내로 도입하여 리포터 구조물이 생성되는 트랜스제닉 식물의 모든 조직내로 통합되고 그 트랜스제닉 식물의 상이한 조직들 내에서 리포터 유전자의 발현을 검출 (예를 들면, mRNA, 단백질 또는 리포터 유전자에 의해 코딩된 단백질의 활성을 검출)함으로써 평가할 수 있다. 하나 이상의 조직에서 리포터 유전자의 발현 수준이 나머지 조직에서의 리포터 유전자의 발현 수준에 비하여 더 높게 검출됨은 더 큰 발현 수준이 검출된 조직에 대해 프로모터가 특이적임을 보여준다. 프로모터에 적용될 때 "세포 타입 특이적"이란 용어는 동일한 조직내의 다른 타입의 세포에서는 관심있는 동일한 뉴클레오티드 서열의 발현이 상대적으로 없는 상태에서 특정 타입의 세포에서 관심있는 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 가리킨다. 또한, 프로모터에 적용될 때 용어 "세포 타입 특이적"이란, 단일 조직 내의 한 영역에서 관심있는 뉴클레오티드 서열의 선택적 발현을 촉진할 수 있는 프로모터를 의미한다. 프로모터의 세포 타입 특이성은 당분야에 잘 알려진 방법, 예를 들면, 면역조직화학적 염색법을 사용하여 평가할 수 있다. 간략하게 설명하면, 조직 절편을 파라핀에 고정시키고, 프로모터에 의해 발현이 조절되는 관심있는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 생성물에 대해 특이적인 1차 항체와 파라핀 절편을 반응시킨다. 1차 항체에 특이적인 표지된 (예를 들면, 퍼옥시다제 결합된) 2차 항체를 잘라낸 조직에 결합하게 하고 특이적 결합을 현미경에 의하여 검출한다 (예를 들면, 아비딘/바이오틴을 사용).

프로모터는 항시적 (constitutive)이거나 조절가능할 수 있다. 프로모터와 관련하여 사용될 때 용어 "항시적 (constitutive)"이란 프로모터가 자극 (예를 들면, 열 충격, 화학물질, 광, 또는 유사한 자극들)이 없이도 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 유도할 수 있음을 의미한다. 통상적으로, 항시적 프로모터는 실질적으로 어느 세포 및 어느 조직에서든 형질도입유전자의 발현을 유도할 수 있다. 반대로, "조절가능한 (regulatable)" 프로모터는 자극 (예를 들면, 열 충격, 화학물질, 광, 또는 유사한 자극들)이 있는 상태에서 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를, 자극이 없는 상태에서 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준과는 다른 수준으로 유도할 수 있는 것이다.

세균을 이용한 "감염시키다" 및 "감염"란 용어는, 표적 생물 샘플 (예를 들면, 세포, 조직, 식물 부분)과 세균을 함께 인큐베이션하여 세균내에 들어있는 핵산 서열이 표적 생물 샘플의 하나 이상의 세포 내로 도입되게 하는 것을 가리킨다.

용어 "아그로박테리움 (Agrobacterium)"이란 근두암종병(crown gall)을 유발하는 토양성의 그램음성 막대모양 식물병리적 세균이다. 용어 "아그로박테리움"에는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) (감염된 식물에서 근두암종병을 통상적으로 유발) 및 아그로박테리움 리조겐스 (Agrobacterium rhizogens) (감염된 숙주 식물에서 털뿌리병 (hairy root disease)을 유발) 균주를 포함하나 이들로 제한되는 것은 아니다. 식물 세포를 아그로박테리움으로 감염시키면 일반적으로, 감염된 세포에 의한 오핀 (예를 들면, 노팔린, 아그로핀, 옥토핀)의 생성을 초래한다. 따라서, 노팔린의 생성을 유발하는 아그로박테리움 균주 (예를 들면, 균주 LBA4301, C58, A208)는 "노팔린-타입" 아그로박테리아로 불리며, 옥토핀의 생성을 유발하는 아그로박테리움 균주 (예를 들면, 균주 LBA4404, Ach5, B6)는 "옥토핀-타입" 아그로박테리아로 불리며, 아그로핀의 생성을 유발하는 아그로박테리움 균주 (예를 들면, 균주 EHA105, EHA101, A281)는 "아그로핀-타입" 아그로박테리아로 불린다.

용어 "충격하다", "충격 (bombardment)" 및 "유전자총 충격 (biolistic bombardment)"이란 표적 생물 샘플 (예를 들면, 조직, 세포, 식물 부분- 잎, 또는 완전한 식물 등)을 향하여 입자를 가속화시켜서 표적 생물 샘플의 세포의 세포막을 손상시키고(거나) 입자를 표적 생물 샘플내로 진입시키는 과정을 가리킨다. 유전자총 충격법은 당분야에 공지되어 있으며 (예를 들면, 미국 특허 제5,584,807호 및 제5,141,131호, 두 특허의 내용은 언급함으로써 본 명세서에 도입됨), 시판된다 (예를 들면, 헬륨 기체-유도 미세발사기 가속기 (PDS-1000/He)(BioRad).

용어 "미세손상 (microwounding)"이 식물 조직과 관련하여 언급될 때는 그 조직에 미시적 손상을 내는 것을 가리킨다. 미세손상은 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 입자 충격에 의하여 달성될 수 있다. 본 발명은 구체적으로는, 미세손상을 사용하는 핵산 도입 계획을 고려한다.

본 명세서에서 사용될 때 용어 "유기체"란 모든 유기체 및 특히 n-연결 글리칸이 있는 당단백질을 포함하는 유기체를 가리킨다.

본 명세서에서 사용될 때 용어 "식물"이란 식물의 발생의 어느 단계에서나 존재하는 구조로 상당히 분화된 다수의 식물세포를 가리킨다. 그러한 구조는 열매, 슈트 (shoot), 뿌리, 잎, 씨, 꽃잎, 또는 유사한 구조를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 "식물 조직"에는 뿌리, 슈트, 잎, 화분, 씨, 종양 조직 및 여러 가지 타입의 배양 세포 (예를 들면, 단일 세포, 원형질체, 유합조직 (callus), 프로토코옴 유사체 및 그외 타입의 세포)를 포함하나 이에 제한되지 않은 분화 및 비분화 식물조직이 포함된다. 식물 조직은 식물내(in planta) 또는, 기관 배양, 조직 배양, 또는 세포 배양 중일 수 있다. 유사하게, "식물 세포"도 배양 중인 세포이거나 식물의 일부일 수 있다.

글리코실트랜스퍼라제는 당단백질 상의 올리고당을 포함하여, 세포 올리고당의 구조를 결정하는 프로세싱 반응을 촉매하는 효소이다. 본 명세서에서 사용될 때 "글리코실트랜스퍼라제"는, 만노시다제가 글리칸을 트리밍하는 것이고 단당을 운반하는 것이 아님에도 만노시다제를 포함하는 뜻이다. 글리코실트랜스퍼라제는 타입 II 막 배향의 특징을 공유한다. 각 글리코실트랜스퍼라제는 아미노 말단 세포질 꼬리부(tail) (임의로 "X"로 표지된 일련의 아미노산으로 이루어진 것으로서 예시용으로 아래에 보임-그 영역의 실제 크기를 제시할 의도는 없음), 막에 걸쳐있는 신호 앵커 도메인 (소수성을 나타내는 "H"로 표지한 일련의 아미노산으로 이루어진 것으로 아래에 나타냄 - 도메인의 실제 크기를 제시할 의도는 없으며, 도메인이 소수성 아미노산으로만 이루어진 것을 제시할 의도도 없음), 그 뒤의 내강 줄기부(luminal stem)(임의로 "S"로 표지된 일련의 아미노산으로 이루어진 것으로 아래에 나타냄 - 그 영역의 실제 크기를 제시할 의도는 없음) 또는 자루 (stalk) 영역, 및 카르복시 말단 촉매 도메인 (임의로 "C"로 표지된 일련의 아미노산으로 아래에 나타냄 - 그 도메인의 실제 크기를 제시할 의도는 없음)로 이루어진다:

NH₂-XXXXXXHHHHHHHHSSSSSSSSCCCCCCCC.

종합적으로, 세포질 꼬리부-막횡단-줄기부 영역 또는 "CTS"(분명하게 나타내기 위하여 상기 도식에 밑줄 그음) (또는 그 일부)는 본 발명에 의하여 고려되는 구체예에서 사용될 수 있되, 촉매 도메인은 다른 분자의 상응하는 촉매 도메인 (또는 그러한 영역/도메인의 일부)로 교환 또는 스와핑된다.

예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 혼성 효소를 코딩하는 핵산 (뿐만 아니라, 그러한 핵산을 포함하는 벡터, 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 혼성 효소 그 자체)에 관한 것이며, 이 혼성 효소는 제1 글리코실트랜스퍼라제 (예를 들면, 식물 글리코실트랜스퍼라제)의 CTS 영역의 적어도 일부 (예를 들면, 세포질 꼬리부 ("C"), 막횡단 영역 ("T"), 세포질 꼬리부와 막횡단 도메인 ("CT"), 막횡단 도메인과 줄기부 ("TS"), 또는 완전한 CTS 영역) 및 제2 글리코실트랜스퍼라제 (예를 들면, 포유동물 글리코실트랜스퍼라제)의 촉매 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 구체예를 창조하기 위하여, 완전한 CTS 영역 (또는 그의 일부)의 코딩 서열을 포유동물 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산으로부터 결실시키고 식물 글리코실트랜스퍼라제의 완전한 CTS 영역 (또는 그 일부)을 위한 코딩 서열로 대체한다. 다른 한편으로는, 이런 구체예를 창조하기 위해 상이한 접근 방법을 취할 수 있는데, 예를 들면, 완전한 촉매 도메인 (또는 그 일부)를 위한 코딩 서열을 식물 글리코실트랜스퍼라제를 위한 코딩 서열로부터 결실시키고 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 완전한 촉매 도메인 (또는 그 일부)을 위한 코딩 서열로 대체할 수 있다. 이러한 경우에, 생성되는 혼성 효소는 야생형 식물 효소의 정상적인 방식으로, 식물 글리코실트랜스퍼라제의 아미노 말단 세포질 꼬리부가 식물 글리코실트랜스퍼라제 막횡단 도메인에 연결되고 이것이 다시 식물 글리코실트랜스퍼라제의 줄기부에 연결되나, 이 줄기부는 포유동물 글리코실트랜스퍼라제 (또는 그 일부)의 촉매 도메인에 연결될 것이다.

본 발명은 위에서 요약한 두 가지 방법에만 제한되는 것은 아니다. 접근 방법에 다른 변화들도 고려된다. 예를 들면, 혼성 효소, 식물 글리코실트랜스퍼라제의 막횡단 영역의 적어도 일부 및 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 영역의 적어도 일부를 포함하는 상기 혼성 효소를 코딩하는 핵산을 창조하기 위해서는, CTS 영역을 위한 전체 코딩 서열보다는 적게 (예를 들면, 식물 글리코실트랜스퍼라제의 막횡단 영역만, 또는 완전한 세포질 꼬리부와 막횡단 도메인의 전부 또는 일부, 또는 완전한 세포질 꼬리부와 막횡단 도메인 전부와 줄기 영역 일부) 사용할 수 있다. 전체 세포질 꼬리부의 포유동물 코딩 서열과 막횡단 도메인 (또는 그 일부)의 코딩 서열을 결실시킨 후, 식물 글리코실트랜스퍼라제의 세포질 꼬리부 및 막횡단 도메인 (또는 그 일부)의 상응하는 코딩 서열로 대체할 수 있다. 이런 경우에, 생성된 혼성 효소는 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 줄기 영역이 식물 글리코실트랜스퍼라제 막횡단 도메인 (또는 그 일부)에 연결되고 이것이 다시 식물 글리코실트랜스퍼라제의 아미노 말단 세포질 꼬리부에 연결되고 줄기 영역이 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 도메인에 연결된 것이다 (즉, 4개 영역/도메인 중 2개는 식물에서 기원한 것이고, 2개는 포유동물에서 기원한 것임).

다른 구체예에서, 본 발명은 식물 글리코실트랜스퍼라제의 아미노 말단 세포질 꼬리부의 적어도 일부 및 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 영역의 적어도 일부를 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산 (및 벡터, 벡터를 포함하는 숙주 세포, 식물 - 또는 식물 부분 - 숙주 세포를 포함)에 관한 것이다. 이 구체예에서는, 핵산에 의하여 코딩되는 혼성 효소가 다른 식물 서열 (예를 들면, 막횡단 도메인 또는 그 일부, 줄기 영역 또는 그 일부)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어 이러한 구체예를 창조하기 위하여, 전체 세포질 꼬리부 (또는 그 일부)의 코딩 서열을 포유동물 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산으로부터 결실시키고 식물 글리코실트랜스퍼라제의 전체 세포질 도메인 (또는 그 일부)의 코딩 서열로 대체할 수 있다. 이 경우, 생성되는 혼성 효소는, 식물 글리코실트랜스퍼라제의 아미노 말단 세포질 꼬리부 (또는 그 일부)가 포유동물 글리코실트랜스퍼라제 막횡단 도메인에 연결되고 이것이 다시 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 줄기 영역에 연결되며 줄기 영역이 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 도메인에 연결되는 것이다. 다른 한편으로는 이 구체예를 창조하기 위해 다른 접근 방법을 취할 수 있는데, 예를 들면, 전체 촉매 도메인 (또는 그 일부)의 코딩 서열을 식물 글리코실트랜스퍼라제의 코딩 서열로부터 결실시키고 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 전체 촉매 도메인 (또는 그 일부)의 코딩 서열로 대체할 수 있다. 이 경우, 생성되는 혼성 효소는 식물 글리코실트랜스퍼라제의 아미노 말단 세포질 꼬리부가 식물 글리코실트랜스퍼라제 막횡단 도메인에 연결되고 이것이 식물 글리코실트랜스퍼라제의 줄기 영역에 야생형 식물 효소의 정상적 방식으로 연결되나 줄기 영역은 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 도메인 (또는 그 일부)에 연결될 것이다.

위 논의에서, "또는 그 일부"란 어구의 사용은 특정한 경우에 전체 영역/도메인보다 덜 사용될 수 있음 (예를 들면 단편 (fragment)이 사용될 수 있음)을 명백히 표현하기 위해 사용되었다. 예를 들면, 글리코실트랜스퍼라제의 세포질 꼬리부는 특정한 트랜스퍼라제에 따라서 길이가 대략 5 내지 50 아미노산, 더 전형적으로는 15 내지 30 아미노산이다. 세포질 꼬리부 영역의 "일부"란 4개 이상의 아미노산으로 본 명세서에서 정의되며, 그 영역/도메인의 전체 길이보다 1개 아미노산이 적은 정도까지의 크기일 수 있다. 그 일부는 전체 길이 영역/도메인과 유사한 방식으로 기능할 것이 요구되나, 동일한 정도로 기능할 필요는 없다. 예를 들면, 전체 길이 세포질 꼬리부가 골지 체류 영역 또는 ER 체류 신호로 기능하는 경우에는, 상기 지정된 구체예에서 사용된 부분이 전체 길이 영역만큼 효과적으로는 아닐지라도, 골지 또는 ER 체류 영역으로서 기능할 것이 요구된다.

이와 유사하게, 막횡단 도메인은 전형적으로 길이가 15 내지 25 아미노산이며, 주로 소수성 아미노산으로 이루어진다. 막횡단 도메인의 "일부"란 10개 이상의 아미노산으로서 본 명세서에서 정의되며, (특정 타입의 트랜스퍼라제의 경우) 그 영역/도메인의 전체 길이보다 1 개 아미노산이 적은 정도까지의 크기일 수 있다. 그 일부는 전체 길이 영역/도메인과 유사한 방식으로 기능할 것이 요구되나, 동일한 정도로 기능할 필요는 없다. 예를 들면, 전체 길이 막횡단 도메인이 1차적 골지 체류 영역 또는 ER 체류 신호로 기능하는 경우에는, 상기 지정된 구체예에서 사용된 영역이 전체 길이 영역만큼 효과적으로는 아닐지라도, 골지 또는 ER 체류 영역으로서 기능할 것이 요구된다. 본 발명은 구체적으로는, 야생형 막횡단 도메인 또는 그 일부의 변이체를 창조하기 위하여 보존적 치환을 고려한다. 예를 들면, 본 발명은 야생형 서열의 하나 이상의 소수성 아미노산 (위 도식에서 "H"로 나타냄)을 하나 이상의 다른 아미노산, 바람직하게는 역시 소수성 아미노산으로 대체하는 것에 관한 것이다.

촉매 도메인의 일부는 그 도메인의 전체 길이보다 1개 아미노산이 적은 정도의 크기일 수 있다. 촉매 도메인이 β 1,4-갈락토실트랜스퍼라제로부터 유래한 경우, 이 일부는 최소한, 올리고당 억셉터 결합 부위를 부여하는 구조에 관여하는 것으로 생각되는 잔기 345-365를 포함하는 것이 바람직하다 (그 일부가 최소한 이 영역 및 적절한 구조를 허용하도록 어느 한 쪽에 5 내지 10 아미노산을 포함하는 것이 바람직함).

또한, 본 발명은 합성 CTS 영역 및 그 일부를 포함한다. CTS 영역의 "일부"는 적어도 하나의 완전한 도메인 (예를 들면, 완전한 막횡단 도메인)을 포함해야 하나 (하나 이상의 완전한 도메인을 포함할 수 있음) 완전한 CTS 영역보다 덜 포함한다.

중요하게는, "CTS 영역" 또는 "막횡단 영역"이란 용어를 사용함으로써 단지 야생형 서열만을 포괄하려는 것은 아니다. 실제로는, 본 발명은 천연 글리코실트랜스퍼라제 및 당화에 관여하는 효소에 제한되는 것은 아니며, 동일하거나 유사한 기능을 보이는 합성 효소의 사용도 포함한다. 한 구체예에서, 야생형 도메인은 변화된다 (예를 들면, 결실, 삽입, 대체 및 기타에 의하여).

마지막으로, 특정 혼성체 (예를 들면, "TmXyl-)를 언급할 때 "Tm"이란 지표를 사용함은, (야생형 서열에 변화를 주거나 주지 않은) 완전한 막횡단/CTS 도메인 및 (야생형 서열에 변화를 주거나 주지 않은) 일부가 포괄되도록 하려는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 혼성 효소 (또는 "융합 단백질")을 코딩하는 핵산 (DNA든 또는 RNA든), 이러한 핵산을 포함하는 벡터, 이러한 벡터를 포함하고 혼성 효소를 발현하는 숙주 세포 (식물 조직 및 전체 식물 중의 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않음), 및 단리된 혼성 효소 그 자체에 관한 것이다. 한 구체예에서, 상기 혼성 효소 (또는 "융합 단백질")의 발현은, 크실로스, 푸코스, 루이스^A/B/X 또는 그외에 원하는 글리코형태 축적을 방해하는 당 구조물 등 당 부분의 감소와 같은 (그러나 이에 제한되지는 않음) 당화의 변화를 가져온다. 한 구체예에서, 본 발명은 글리코실트랜스퍼라제 (식물 글리코실트랜스퍼라제를 포함하나 이에 제한되지 않음)의 CTS 영역 (또는 그 일부) 및 비식물 글리코실트랜스퍼라제 (예를 들면, 포유동물, 어류, 양서류, 진균류)의 촉매 영역 (또는 그 일부)을 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. CTS 영역 (또는 그 일부)은 발현시에 상기 촉매 영역 (또는 그 일부)에 작동가능한 조합으로 (직접 또는 간접적으로) 연결되는 것이 바람직하다. 이 연결은 바람직하게는 공유결합이며, 그 조합은 촉매 영역이 촉매 기능을 (상기 촉매 기능이 야생형 효소에 비하여 감소된다고 할지라도) 보인다는 점에서 작동가능하다. 연결은 개입되는 아미노산 또는 다른 영역/도메인이 없다는 의미에서 직접적일 수 있다. 다른 한편으로는, 개입되는 아미노산 (또는 다른 화학적 기) 및(또는) 다른 영역/도메인이 그들 사이에 있다는 점에서 간접적일 수 있다. 물론, 상기한 혼성 효소(들)를 코딩하는 핵산을 만드는 데 사용되는 핵산은 실제 서열 (예를 들면, 게놈 DNA, cDNA 및 기타)로부터 효소적으로 얻을 수 있거나 이와 다르게는 가이드로서 참조 서열 (예를 들면, 전자 또는 하드카피 서열)을 사용하여 합성하여 만들 수 있다.

특정한 구체예에서, 본 발명은 식물 글리코실트랜스퍼라제의 막횡단 영역 (예를 들면, CTS 영역의 적어도 막횡단 영역 및 임의로는 그 이상) 및 비식물 (포유동물 등) 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 영역 (또는 그 일부)을 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 또한, 이들 영역은 발현시에 작동가능한 조합으로 (직접 또는 간접적으로) 연결되는 것이 바람직하다. 그러나 다른 구체예에서, 본 발명은 식물 글리코실트랜스퍼라제의 막횡단 도메인 (또는 그 일부) 및 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 영역 (또는 그 일부)를 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 또한, 이들 영역은 발현시에 작동가능한 조합으로 (직접 또는 간접적으로) 연결되는 것이 바람직하다.

본 발명은 특정의 트랜스퍼라제에 제한하려는 것이 아니다. 한 구체예에서, 식물 글리코실트랜스퍼라제는 크실로실트랜스퍼라제이다. 다른 구체예에서는, 식물 글리코실트랜스퍼라제는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제이다. 다른 구체예에서는, 식물 글리코실트랜스퍼라제는 푸코실트랜스퍼라제이다. 바람직한 구체예에서, 포유동물 글리코실트랜스퍼라제는 인간 갈락토실트랜스퍼라제 (예를 들면, 막횡단 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 결실되고 대체된 서열 1에 의하여 코딩되는 인간 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제)이다.

본 발명은 식물 유래 글리코실트랜스퍼라제 CTS-도메인 및 인간 글리코실트랜스퍼라제 촉매 도메인 또한 그 반대의 사용 및 글리코실트랜스퍼라제의 임의의 CTS 도메인을 적어도 하나의 다른 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 단편과 함께 사용하는 것에 제한되는 것은 아니다. 실제로, 한 구체예에서 본 발명은 넓게는, 제1 글리코실트랜스퍼라제의 막횡단 영역 및 제2 글리코실트랜스퍼라제의 촉매영역을 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 상기 제1 및 제2 글리코실트랜스퍼라제는 상이한 종으로부터 유래하는 것이 바람직하다(상이한 종 또는 심지어 상이한 문 (phylum)으로부터 유래할 수 있다). 한 구체예에서, 상기 제1 글리코실트랜스퍼라제는 식물 글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 다른 구체예에서는 상기 식물 글리코실트랜스퍼라제가 크실로실트랜스퍼라제이다. 또다른 구체예에서 상기 식물 글리코실트랜스퍼라제는 푸코실트랜스퍼라제이다. 바람직한 구체예에서 상기 제2 글리코실트랜스퍼라제는 포유동물 글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서는 상기 포유동물 글리코실트랜스퍼라제가 인간 갈락토실트랜스퍼라제이다.

본 발명은 제1 및 제2 글리코실트랜스퍼라제가 각기 식물과 비식물의 것인 경우로 제한되는 것은 아니다. 한 구체예에서, 상기 제1 글리코실트랜스퍼라제는 제1 포유동물 글리코실트랜스퍼라제를 포함하며, 상기 제2 글리코실트랜스퍼라제는 제2 포유동물 글리코실트랜스퍼라제를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 제1 포유동물 글리코실트랜스퍼라제는 비인간 글리코실트랜스퍼라제이고, 상기 제2 포유동물 글리코실트랜스퍼라제는 인간 글리코실트랜스퍼라제이다.

본 발명은 벡터의 타입에 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 본 발명은 상기한 혼성 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 숙주 세포의 타입에 제한되지 않는다. 다양한 원핵 및 진핵 숙주 세포가 단백질 발현용으로 시판되고 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 상기한 혼성 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 (다른 혼성 효소 또는 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 다른 핵산 또는 다른 벡터와 함께 또는 없이) 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 숙주 세포는 식물 세포이다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 이러한 숙주 세포를 포함하는 식물에 관한 것이다.

본 발명은 본 발명의 혼성 효소를 발현시키기 위해 숙주 세포를 제조하는 방법에 의하여 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 본 발명은 (a) i) 숙주 세포 (예컨대, 배양 중인 것이든, 식물 조직의 일부로서든, 또는 온전한 성장중인 식물의 일부로서든 식물 세포) 및 ii) 식물 글리코실트랜스퍼라제의 CTS 영역의 적어도 일부 (예를 들면, 막횡단 도메인) 및 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 영역의 적어도 일부를 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공하고, (b) 상기 혼성 효소가 발현되게 하는 조건하에서 상기 식물 세포 내로 상기 발현 벡터를 도입하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정한 트랜스퍼라제로 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 상기한 방법에 사용되는 식물 글리코실트랜스퍼라제는 크실로실트랜스퍼라제이다. 다른 구체예에서 식물 글리코실트랜스퍼라제는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제이다. 다른 구체예에서는, 식물 글리코실트랜스퍼라제가 푸코실트랜스퍼라제이다. 바람직한 구체예에서는, 상기한 방법에 사용된 포유동물 글리코실트랜스퍼라제는 인간 갈락토실트랜스퍼라제 (예컨대, 막횡단 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 결실되고 대체된 서열 1에 의하여 코딩되는 인간 β 1,4-갈락토실트랜스퍼라제)이다 (또는 단순히, 촉매 도메인을 코딩하는 서열 1의 뉴클레오티드 또는 그 일부를 취하여 식물 글리코실트랜스퍼라제의 CTS 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 또는 그 일부에 연결시킨 경우).

본 발명은 상기한 혼성 효소를 사용하여 이종 단백질의 당화를 조절하는 특정한 계획에 제한되지 않는다. 한 구체예에서, 본 발명은 (a) i) 숙주 세포 (예컨대, 식물 세포), ii) 제1 (예컨대, 식물) 글리코실트랜스퍼라제의 CTS 영역의 적어도 일부 (예를 들면, 적어도 막횡단 도메인) 및 제2 (예컨대, 포유동물) 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 영역의 적어도 일부를 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터 및 iii) 이종 당단백질을 코딩하는 핵산 (또는 그 일부)을 포함하는 제2 발현 벡터를 제공하고, (b) 상기 혼성 효소 및 이종 단백질이 발현되게 하는 조건하에서 상기 식물 세포 내로 상기 제1 및 제2 발현 벡터를 도입하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이와 다르게는, 혼성 효소 (또는 혼성 효소들) 및 이종 당단백질 둘다를 코딩하는 핵산을 포함하는 단일 벡터를 사용할 수도 있다. 사용된 방법이 무엇인가를 불문하고, 한 구체예에서, 본 발명은 이종 단백질을 단리하는 추가의 단계 (c)뿐만 아니라 조성물인 단리된 단백질 자체에 관한 것이다.

다른 한편으로 본 발명은 또한, 상이한 벡터를 상이한 식물 세포 (이들이 배양중이든, 식물 조직의 일부이든, 완전한 성장중인 식물의 일부이든) 내로 도입하는 것에 관한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명은 (a) i) 식물 글리코실트랜스퍼라제의 CTS 영역의 적어도 일부 (예를 들면, N-말단의 처음 대략 40 내지 60 아미노산) 및 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 영역의 적어도 일부를 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 (또는 둘 이상의 혼성 효소들을 코딩하는) 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터를 포함하는 제1 식물 및 ii) 이종 당단백질을 코딩하는 핵산 (또는 그 일부)을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 제2 식물을 제공하고, (b) 상기 제1 식물과 제2 식물을 교배하여 상기 혼성 효소 및 이종 단백질을 발현하는 자손을 생산하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 물론, 그러한 자손은 단리하고 증식시켜서 단백질 각각 또는 전부의 존재에 대하여 분석할 수 있다. 실제로, 이종 단백질이 치료용으로 (예를 들어, 인간 또는 동물에 경구, 정맥내, 경피 또는 일부 그외 투여 경로로 투여) 사용되어 (전형적으로는 식물 세포 물질이 실질적으로 없도록 우선 정제됨) 질병을 치료 또는 예방할 수 있다.

본 발명은 특정한 이종 단백질에 제한되는 것은 아니다. 한 구체예에서, 숙주 세포 (또는 유기체)에 내인성이 아닌 임의의 펩티드 또는 단백질이 고려된다. 한 구체예에서, 이종 단백질은 항체 또는 항체 단편이다. 특히 바람직한 구체예에서는 항체가 식물에서 고수율로 발현되는 인간 항체 또는 "인간화" 항체이다. "인간화" 항체는 비인간 항체의 과가변 영역 (소위 CDR)을 취하여 인간 골격(framework)으로 이식함으로써 비인간 항체 (예를 들면, 설치류 항체)로부터 전형적으로 제조된다. 전체 공정은 합성 (서열이 공지된 경우)일 수 있며, 골격은 공통적인 인간 골격의 데이타베이스로부터 선택할 수 있다. 수 차례, 골격 서열이 변형되거나 CDR이 변형되지 않으면 공정에서 친화도 손실이 있다. 사실상, 친화도 증가는 CDR이 체계적으로 돌연변이 (예를 들면, 램덤화 과정)되고 시험될 때 드러날 수 있다.

본 발명은 이종 단백질과 관련하여 특히 유용하지만, 한 구체예에서, 본 발명의 혼성 효소는, 내인성 단백질, 즉, 숙주 세포 또는 유기체에 의하여 정상적으로 발현되는 단백질의 당화를 변화시키는 데에 사용된다.

본 발명은 특히 식물 그 자체에 관한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명은 식물 글리코실트랜스퍼라제의 CTS 영역의 적어도 일부 (예를 들면, 세포질 꼬리부와 함께 막횡단 도메인의 적어도 일부) 및 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 영역의 적어도 일부를 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터 및 이종 당단백질 (또는 그 일부)을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 식물에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 혼성 효소 (또는 혼성 효소들)와 함께 발현되기 때문에, 이종 단백질은 혼성 효소 (또는 효소들)가 없는 상태에서 식물에서 발현될 때와 비교할 때 감소된(10 내지 99 %) α 1,3-푸코실화(또는 전혀 푸코실화가 안됨)를 나타낸다. 바람직한 구체예에서는 본 발명의 혼성 효소 (또는 혼성 효소들)와 함께 발현되기 때문에, 이종 단백질은 혼성 효소 (또는 효소들)가 없는 상태에서 식물에서 발현될 때와 비교할 때 감소된(10 내지 99 %) 크실로실화 (또는 전혀 크실로스가 없음)를 나타낸다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 혼성 효소 (또는 혼성 효소들)와 함께 발현되기 때문에, 이종 단백질은 혼성 효소 (또는 효소들)가 없는 상태에서 식물에서 발현될 때와 비교할 때, 푸코스 및 크실로스 모두가 감소되는 것으로 나타난다.

감소된 푸코스 및(또는) 크실로스가 얻어지는 특정한 이론에 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 식물에서 서브 골지(sub-Gogi) 분류(sorting) 메카니즘에 대해 알려진 것은 거의 없다. 포유동물 특이적 β(1,4)-갈락토실트랜스퍼라제 (GalT)는 식물에서 정상적으로는 발견되지 않는 글리칸 구조를 생성하기 때문에 이런 현상을 연구하기 위한 훌륭한 제1 마커로서 사용된 바 있다 (하기 실시예 참조). 갈락토실트랜스퍼라제를 발현하는 식물의 글리칸 구조를, CTS 도메인이 식물 크실로실트랜스퍼라제의 CTS 도메인 (또는 그 일부)로 교체된 키메릭 갈락토실트랜스퍼라제를 발현하는 식물의 글리칸 구조와 비교하였다. 관찰된 글리칸 구조에서의 변화는 갈락토실트랜스퍼라제가 포유동물에서와 같이 식물 골지의 특정한 서브-구획에 한정됨을 보여준다. 본 발명이 어떠한 특정 메카니즘에 제한되지 않지만, 식물 및 포유동물의 분류 메카니즘은 식물에서 알려지지 않은 글리코실트랜스퍼라제가 골지의 특정한 유사 위치로 보내지는 정도까지는 보존된 것으로 보인다. 이 위치는 내인성 크실로실-, 푸코실- 및 GlcNAcTII (GnTII) 트랜스퍼라제가 위치하는 곳보다는 골지에서 뒷쪽이다.

크실로스 및 푸코스를 상당히 적게 포함하는, GalT의 재위치화된 변이체를 발현하는 이들 식물의 N-글리칸도 생물공학적으로 관련된다는 발견. 인간 등 포유동물에서의 치료용인 당단백질의 경우, 본 발명의 특정 구체예의 접근 방법은, 크실로스 및 푸코스가 본질적으로 없고 적어도 2-안테나 N-글리칸 (그러나 2-안테나에 제한되지 않으며, 3-안테나 및 이와 유사한 것도 포함) 및 N-글리칸의 팔 (arm)의 적어도 한쪽에서 (하나 이상의) 갈락토스 잔기를 포함하는 당단백질이 얻어질 수 있도록 식물에서 당단백질의 N-연결 당화를 조절하는 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 2-안테나 N-글리칸에 제한되는 것이 아니라 이분된 2-안테나 N-글리칸, 3-안테나 N-글리칸 및 이와 유사한 것도 포함한다. 또한, 본 발명은 복합체 타입 N-글리칸에 제한되지 않으나, 혼성 타입 N-글리칸 및 그외 타입 N-글리칸도 포함한다. 본 발명은 이러한 생성되는 당단백질에 관한 것이다. 또한 본 발명의 방법 및 조성물은 크실로스, 푸코스, 루이스^A/B/X 타입 N-글리칸 변형 (β1-3-GalT, α1-4-FucT, 기타) 또는 그외 당 이외에 원하는 글리코형태 축적을 방해하는 식물 및 비식물계에 대해 적용할 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명은 골지체에서 글리칸 생합성에 관여하는 효소의 위치화를 조정함으로써 식물의 N-연결 당화를 조절하는 것에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명의 구체예들은 (a) 당단백질의 글리칸의 중심부에서 크실로스 및 푸코스의 첨가를 방지 (또는 억제)하고 (b) 하나 또는 바람직하게는 두 개의 갈락토스 잔기를 한쪽 팔에 첨가하는 것을 포함하는, 2-안테나 글리칸을 갖지며 그 팔의 적어도 한쪽에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 포함하며 크실로스 및 푸코스가 없는 (또는 감소된) 당단백질을 식물 숙주계에서 생산하는 방법에 관한 것이다.

단백질, 특히 식물 크실로실트랜스퍼라제와 같은 효소의 CTS 영역 (또는 그 일부) 및 식물에서 정상적으로는 발견되지 않는 갈락토실트랜스퍼라제의 촉매 영역 (또는 그 일부) 또는 막횡단 부분이 제거되고 소포체 체류 신호가 삽입된 변형된 갈락토실트랜스퍼라제를 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산을 상기 식물 숙주계로 도입함으로써, 크실로스 및 푸코스를 상기 이종 당단백질에 첨가하는 것이감소되거나 심지어 방지할 수 있는데, 여기서 상기 단백질 또는 효소는 상기 갈락토실트랜스퍼라제보다 먼저 상기 식물 숙주계에서 식물 세포의 골지체에서 작용한다. 갈락토실트랜스퍼라제는 포유동물 갈락토실트랜스퍼라제, 특히 인간 갈락토실트랜스퍼라제인 것이 바람직하다. 가장 구체적인 구체예에서, 상기 갈락토실트랜스퍼라제는 인간 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제 (GalT)이다. 바람직한 구체예에서, 상기 크실로실트랜스퍼라제는 β1,2-크실로실트랜스퍼라제이다. 포유동물 글리코실트랜스퍼라제의 CTS 영역 또는 CTS 단편을, 갈락토실트랜스퍼라제보다 먼저 골지체에서 작용하는, XylT, FucT, GnTI, GnTII, GnTIII, GnTIV, GnTV, GnTVI, ManI, ManII 및 ManIII의 그러한 형태를 포함하나 이에 제한되지 않는 일군의 효소 중 하나로 교체하면, 원치않는 크실로스 및 푸코스 잔기를 포함하는 글리칸의 양을 강력히 감소시킨다 (도 2 참조). 또한, 갈락토실화는 향상되고, 글리칸의 다양성이 감소한다. 어떠한 특정한 메카니즘에 제한되는 것은 아니나, 크실로스 및 푸코스를 모두 보유하지 않는 갈락토실화 글리칸의 증가는 GalGNMan5, GNMan5 또는 GalGNMan4의 축적에 주로 기인한 것으로 생각된다. 또한, 갈락토실화는 하나의 글리칸 팔에서만 나타난다. 만노시다제 II (ManII)에 의하여 상기 글리코형태가 GalGNMan3으로 트리밍되는 것을 골지에서 먼저 일어난 갈락토실화에 의해 억제되는 것으로 보인다. 또한 제2 GlcNAc가 GlcNAcTII (GnTII)에 의하여 첨가되는 것도 억제된다.

따라서, 한 구체예에서, 양쪽 팔이 갈락토실화되고 크실로스 및 푸코스가 본질적으로 없는 원하는 당단백질을 얻기 위한 추가의 단계가 고려된다. 따라서, 한 구체예에서, 상기한 바와 같은 본 발명의 방법은 추가로, 상기 당단백질의 팔에 갈락토스 잔기를 첨가하는 것을 포함한다 (도 3 참조). 본 발명의 한 구체예에서는, (a) GnTI의 CTS 영역 (또는 단편, 예컨대, 막횡단 도메인을 포함하는 것) 및 GnTII의 활성 도메인 (또는 그 일부)을 포함하는 제1 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열, (b) GnTI의 CTS 영역 (또는 단편, 예컨대, 막횡단 도메인을 포함하는 것) 및 ManII의 활성 도메인을 포함하는 제2 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열, 및 (c) XylT의 CTS 영역 (또는 단편, 예컨대, 막횡단 도메인을 포함하는 것) 및 인간 갈락토실트랜스퍼라제 (TmXyl-GalT)의 활성 도메인 (또는 그 일부)을 포함하는 제3 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열을 상기 식물 숙주계에 도입함으로써 갈락토스 잔기가 양쪽 팔에 첨가된다. 본 발명의 다른 구체예에서는, (a) ManI의 CTS 영역 (또는 단편, 예컨대, 막횡단 도메인을 포함하는 것) 및 GnTI의 활성 도메인 (또는 그 일부)을 포함하는 제1 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열, (b) ManI의 CTS 영역 (또는 단편, 예컨대, 막횡단 도메인을 포함하는 것) 및 GnTII의 활성 도메인 (또는 그 일부)을 포함하는 제2 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열, (c) ManI의 CTS 영역 (또는 단편, 예컨대, 막횡단 도메인을 포함하는 것) 및 ManII의 활성 도메인 (또는 그 일부)을 포함하는 제3 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열, 및 (d) XylT의 CTS 영역 (또는 단편, 예컨대, 막횡단 도메인을 포함하는 것) 및 인간 갈락토실트랜스퍼라제 (TmXyl-GalT)의 활성 도메인 (또는 그 일부)을 포함하는 제4 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열을 상기 식물 숙주계에 도입함으로써 갈락토스 잔기가 양쪽 팔에 첨가된다.

본 발명은 단일 세포, 식물 조직 또는 식물에 사용된 그러한 혼성 효소의 수나 혼성 효소의 특정한 조합에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 TmXyl-GalT + TmGnTI-GnTII + TmGnTI-ManII를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 한 구체예에서는, (a) 단백질, 특히 효소 (N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I (GnTI)을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 CTS 영역 (또는 그 단편) (여기서, 상기 효소는 만노시다제 II 또는 그 막횡단 부분이 결실되고 소포체 체류 신호가 삽입된 변형된 만노시다제 II보다 먼저 상기 식물 숙주계의 식물 세포의 골지체에서 작용하는 것임) 및 만노시다제 II (ManII)의 촉매 영역 (또는 그 일부)을 포함하는 제1 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열, 및 (b) N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I (GnTI)을 포함하나 이에 제한되지 않는 효소의 CTS 영역 (또는 그 단편, 예컨대, 막횡단 영역을 포함하는 것) (여기서, 상기 효소는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II 또는 그 막횡단 부분이 결실되고 소포체 체류 신호가 삽입된 변형된 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II보다 먼저 상기 식물 숙주계의 식물 세포의 골지체에서 작용하는 것임) 및 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II (GnTII)의 촉매 영역 (또는 그 일부)을 포함하는 제2 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열을 상기 식물 숙주계로 도입함으로써 갈락토스 잔기를 상기 팔에 첨가할 수 있다. N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 또는 만노시다제 II 또는 상기 막횡단 단편을 코딩하는 서열은 식물 또는 진핵생물 비식물 유기체 (예를 들면, 포유동물)에서 기원할 수 있다.

또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 TmXyl-GalT + TmManI-GnTI + TmManI-ManII + TmManI-GnTII를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 다른 구체예에서는, (a) 단백질, 특히 효소 (만노시다제 I (ManI)을 포함하나 이에 제한되지 않음)의 CTS 영역 (또는 그 단편, 예컨대, 막횡단 도메인을 포함하는 것) (상기 효소는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I (GnTI) 또는 그 막횡단 부분이 결실되고 소포체 체류 신호가 삽입된 변형된 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I (GnTI)보다 먼저 상기 식물 숙주계의 식물 세포의 골지체에서 작용하는 것임) 및 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I (GnTI)의 촉매 영역 (또는 그 일부)을 포함하는 제1 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열, 및 (b) 만노시다제 I (ManI)을 포함하나 이에 제한되지 않는 효소의 CTS 영역 (또는 그 단편, 예컨대, 막횡단 영역을 포함하는 것) (상기 효소는, 만노시다제 II (ManII) 또는 그 막횡단 부분이 결실되고 소포체 체류 신호가 삽입된 변형된 만노시다제 II (ManII)보다 먼저 상기 식물 숙주계의 식물 세포의 골지체에서 작용하는 것임) 및 만노시다제 II (ManII)의 촉매 영역 (또는 그 일부)을 포함하는 제2 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열, 및 (c) 만노시다제 I (ManI)을 포함하나 이에 제한되지 않는 효소의 CTS 영역 (또는 그 단편, 예컨대, 막횡단 도메인을 포함하는 것) (상기 효소는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II (GnTII) 또는 그 막횡단 부분이 결실되고 소포체 체류 신호가 삽입된 변형된 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II (GnTII)보다 먼저 상기 식물 숙주계의 식물 세포의 골지체에서 작용함) 및 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II (GnTII)의 촉매 영역 (또는 그 일부)을 포함하는 제1 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열을 상기 식물 숙주계로 도입함으로써 갈락토스 잔기를 상기 팔에 첨가할 수 있다. N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 또는 만노시다제 또는 상기 막횡단 단편을 코딩하는 서열은 식물 또는 진핵생물 비식물 유기체 (예를 들면, 포유동물)에서 기원할 수 있다.

또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 TmXyl-GalT + ManIII를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 만노시다제 III (ManIII, 야생형 유전자 서열이나 그에 제한되지는 않음: 또한 소포체 체류 신호가 있는 ManIII, 초기 (early) (시스-) 골지체 글리코실트랜스퍼라제 (GnTI, ManI, GnTIII)의 막횡단 단편이 있는 ManIII)를 코딩하는 핵산 서열을 상기 식물 숙주계로 도입함으로써 갈락토스 잔기를 상기 팔에 첨가할 수 있다. 만노시다제 III를 코딩하는 서열은 바람직하게는 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 또는 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (이에 제한되지는 않음) 중의 곤충, 인간 또는 다른 유기체에서 기원할 수 있다.

또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 TmXyl-GalT + ManIII + TmGnTI-GnTII을 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 TmXyl-GalT + ManIII + TmManI-GnTI + TmManI-GnTII을 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 방법은, 한 구체예에서는, 포유동물 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 GnTIII, 특히 인간 GnTIII, 또는 포유동물 GnTIII의 촉매 부분과 진핵세포의 골지체의 초기 구획 또는 ER에 존재하는 단백질의 막횡단 부분을 포함하는 혼성 단백질을 상기 식물 숙주계 내로 도입하는 것을 임의로 포함할 수 있다. 예를 들면, 한 구체예에서, 혼성 효소 TmXyl-GnTIII이 (그러한 혼성 효소를 코딩하는 핵산, 그 핵산을 포함하는 벡터, 그 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 그 숙주 세포를 포함하는 식물 (또는 식물 부분)과 함께) 고려된다. 또다른 구체예에서는, 혼성 효소 TmFuc-GnTIII가 (그러한 혼성 효소를 코딩하는 핵산, 이 핵산을 포함하는 벡터, 이 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 이런 세포를 포함하는 식물 또는 식물 부분과 함께) 고려된다. 본 발명은 구체적으로는, (추가의 혼성 효소 또는 다른 글리코실트랜스퍼라제와 함께 또는 없이) 그러한 혼성 효소를 발현하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 상기 혼성 및 변형 효소, 그 혼성 효소를 코딩하는 핵산, 그 핵산을 포함하는 벡터, 및 이 혼성 효소를 얻은 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 바람직하게는 복합체 타입 2-안테나 글리칸을 가지며 적어도 한쪽 팔에 하나 이상의 갈락토스를 포함하고 크실로스 및 푸코스가 없는 이종 당단백질을 포함하는 식물 숙주계에 관한 것이다. "이종 당단백질"이란 식물 숙주계 이외의 종으로부터 기원한 당단백질이다. 이 당단백질은 항체, 호르몬, 성장인자 및 성장인자 수용체 및 항원을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

사실상, 본 발명은 항체 또는 항체 단편 (단일쇄 항체, Fab 단편, Fab₂ 단편, Fv 단편 및 이와 유사한 것) 등의 이종 당단백질의 당화를 조절하는 데에 특히 유용하다. 항체의 당화를 조절하기 위하여, 본 발명의 혼성 효소를 코딩하는 유전자 제작물 (예를 들면, TmXyl-GalT 유전자 제작물)을 항체 (예를 들면, 모노클론 항체) 또는 항체 단편을 발현하는 트랜스제닉 식물에 도입할 수 있다. 다른 한편으로는, 항체 (또는 항체 단편)을 코딩하는 유전자(들)은 TmXyl-GalT 유전자 제작물을 발현하는 식물의 재형질전환에 의하여 도입될 수 있다. 또다른 구체예에서, TmXyl-GalT 발현 카세트를 갖는 바이너리 벡터는, 단일 T-DNA 상에 모노클론 항체의 경쇄 및 중쇄 서열을 둘다 포함하는 발현 카세트를 갖는 식물 바이너리 벡터와 함께 또는 독립적 T-DNA 상에 경쇄 및 중쇄 서열 양자의 발현 카세트를 따로따로 가지나 둘다 모노클론 항체를 코딩하는 바이너리 벡터와 함께 공형질전환시킬 수 있다. 본 발명은 구체적으로는, 한 구체예에서, 본 발명의 혼성 글리코실트랜스퍼라제(들)를 발현하는 식물과 항체를 발현하는 식물을 교배하는 것에 관한 것이다.

"숙주계"는 N-글리칸이 있는 당단백질을 포함하는 임의의 유기체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

"식물 숙주계"는 식물 세포, 식물 기관 및(또는) 식물 조직을 포함하나 제한되지 않는 식물 또는 그 일부를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 식물은 배(胚)가 하나의 떡잎 또는 자옆을 가지는 개화식물인 외떡잎식물 (monocot)일 수 있으며, 백합, 잔디, 옥수수 (Zea mays), 벼, 귀리, 밀 및 보리를 포함하는 곡물, 난초, 붓꽃 (irises), 양파 및 야자수를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이와 다르게, 식물은 쌍떡잎식물일 수 있으며, 이는 담배 (Nicotiana), 토마토, 감자, 콩과식물 (예를 들면, 자주개자리(alfalfa) 및 대두), 장미, 데이즈 (daises), 선인장, 제비꽃 (violet) 및 개구리밥무리 (duckweed)를 포함하나 이에 제한되는 않는다. 식물은 또한 이끼일 수 있으며, 이는 피스코미트렐라 파텐스 (Physcomitrella patens)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 또한 상기 식물 숙주계를 얻는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 (a) 식물에서 정상적으로는 발견되지 않는 갈락토실트랜스퍼라제의 촉매 영역 (또는 그 일부) 및 단백질의 CTS 영역 (또는 그 단편, 예컨대, 막횡단 도메인을 포함하는 것) (이 단백질은 상기 갈락토실트랜스퍼라제 또는 그 막횡단 부분이 결실되고 소포체 체류 신로로 교체된 변형된 갈락토실트랜스퍼라제보다 먼저 상기 식물 숙주계의 식물 세포의 골지에서 작용함)을 포함하는 혼성 효소, (b) 단백질, 특히 효소 (N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I (GnTI)을 포함하나 이에 제한되지는 않음)(이 효소는 만노시다제 II 또는 그 막횡단 부분이 결실되고 소포체 체류 신호로 교체된 변형된 만노시다제 II보다 먼저 상기 식물 숙주계의 식물 세포의 골지에서 작용함)의 CTS 영역 (또는 그 부분, 예컨대, 막횡단 도메인) 및 만노시다제 II (ManII)의 촉매 영역 (또는 그 일부)을 포함하는 혼성 효소, 및 (c) N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I (GnTI)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 글리코실트랜스퍼라제의 (N-말단의 처음 40-60개 아미노산과 같은) 효소의 적어도 막횡단 영역 (상기 효소는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II (GnTII) 또는 그 막횡단 부분이 결실되고 소포체 체류 신호가 삽입된 변형된 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II (GnTII)보다 먼저 상기 식물 숙주계의 식물 세포의 골지체에서 작용함) 및 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II (GnTII)의 촉매 영역을 포함하는 혼성 효소를 포함하는 식물과 이종 당단백질을 발현하는 식물을 교배하고, 이 교배로부터 자손을 수확하고 상기 이종 당단백질을 발현하는 원하는 자손을 선별하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한, 식물 숙주계를 구성할 상기 식물 또는 그 일부에 관한 것이다. 상기 숙주 세포계는 포유동물 GnTIII의 촉매 부분 및 진핵세포의 골지체의 초기 구획 또는 ER에 존재하는 단백질의 막횡단 부분을 포함하는 혼성효소 또는 포유동물 GnTIII 효소를 더 포함할 수 있다.

추가로, 본 발명은 원하는 당단백질 또는 그 기능적 단편을 생산하는 식물 숙주계를 사용하는 것을 제공한다. 본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 식물을 그 식물이 수확가능한 단계에 도달할 때, 예컨대 충분한 생물질량이 성장하여 수익성있는 수확이 가능해졌을 때까지 재배한 후 상기 식물을 당분야에 공지된 확립된 기술을 써서 재배하고 상기 식물을 당분야에 공지된 확립된 기술을 써서 분획화하여 분획화된 식물 물질을 얻고 상기 분획화된 식물 물질로부터 적어도 부분적으로 상기 당단백질을 단리하는 것을 포함하는, 원하는 당단백질 또는 그의 기능적 단편을 얻는 방법을 제공한다.

이와 다르게는, 상기 이종 당단백질을 포함하는 상기 식물 숙주 세포계는 (a) 식물에서 정상적으로는 발견되지 않는 갈락토실트랜스퍼라제의 촉매 영역 및 단백질의 (CTS의) 적어도 막횡단 영역 (또는 그 이상) (이 단백질은 상기 갈락토실트랜스퍼라제 또는 이의 막횡단 부분이 결실되고 소포체 체류 신호가 삽입된 변형된 갈락토실트랜스퍼라제보다 먼저 상기 식물 숙주계의 식물 세포의 골지체에서 작용하는 것임)을 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열, (b) 단백질, 특히 효소 (N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I (GnTI)를 포함하나 이에 제한되지는 않음)의 (CTS의) 적어도 막횡단 영역 (또는 필요하다면 그 이상) (상기 효소는 만노시다제 II 또는 이의 막횡단 부분이 결실되고 소포체 체류 신호가 삽입된 변형된 만노시다제 II보다 먼저 상기 식물 숙주계의 식물 세포의 골지체에서 작용하는 것임) 및 만노시다제 II (ManII)의 촉매 영역을 포함하는 제1 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열, 및 (c) N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I (GnTI)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 효소의 (CTS의) 적어도 막횡단 영역 (필요하다면 그 이상) (상기 효소는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II (GnTII) 또는 이의 막횡단 부분이 결실되고 소포체 체류 신호가 삽입된 변형된 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II (GnTII)보다 먼저 상기 식물 숙주계의 식물 세포의 골지체에서 작용하는 것임) 및 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 II (GnTII)의 촉매 영역을 포함하는 제2 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열을 식물의 숙주 세포계 또는 그 일부로 도입하고 상기 이종 당단백질 (또는 그 일부)를 발현하는 식물 또는 그 일부를 단리함으로써 얻을 수도 있다. 한 구체예에서는, 이들 핵산 서열을 모두 포함하는 하나의 벡터를 상기 식물 숙주계에 도입한다. 또다른 구체예에서는, 각 핵산 서열이 별개의 벡터에 삽입되고, 이들 벡터가 상기 식물 숙주계에 도입된다. 또다른 구체예에서는, 둘 이상의 핵산 서열의 조합이 별개의 벡터에 삽입되고 이 벡터가 재형질전환 또는 공형질전환에 의하여 또는 교배에 의하여 상기 식물 숙주계내로 결합된다.

본 발명은 또한, 항체, 호르몬, 백신 항원, 효소 또는 이와 유사한 것으로 환자의 치료 등을 위한 조성물, 특히 제약 조성물의 제조를 위한, 본 발명에 따른 식물-유래 당단백질 또는 이의 기능적 단편의 용도를 제공한다. 당단백질 또는 그 기능적 단편을 포함하는 이러한 제약 조성물도 본 발명에서 제공된다.

마지막으로, 상기한 접근 방법은 (포유동물 GalT만으로 단순히 형질전환된 식물 또는 야생형 식물과 비교할 때) 본 발명의 혼성 효소 하나 이상을 발현하는 식물에서 글리칸의 전체적 다양성을 감소시키는 데에 유용할 수 있다고 생각된다.

도 1은 식물 및 포유동물에서 당단백질의 당화 경로를 비교한다.
도 2는 갈락토실트랜스퍼라제의 CTS 단편을 크실로실트랜스퍼라제로 교체한 영향을 보여준다.
도 3은 만노시다제 II 및 GlcNAcTII를 재위치화한 것의 추가적 영향을 보여준다.
도 4 위쪽 패널은 면역원성 크실로스 및 푸코스가 없는 갈락토실화 글리칸을 효율적으로 생성하는 글리칸 변형 효소를 코딩하는 유전자를 운반하는 T-DNA 제작물 (construct)을 보여주며, 아래쪽 패널은 항체 경쇄 및 중쇄 유전자를 운반하는 T-DNA 제작물을 보여준다.
도 5는 인간 갈락토실트랜스퍼라제 (인간 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제-GalT)의 핵산 서열 (서열 1)을 보여준다.
도 6은 도 5의 핵산 서열과 이에 상응하는 아미노산 서열 (서열 2)를 함께 보여준다.
도 7은 인간 갈락토실트랜스퍼라제의 야생형 아미노산 서열 (서열 2)에서 유래된 예시적 돌연변이 서열 (서열 59)를 보여주며, 여기서 세포질 꼬리부에서 세린이 결실되고 G-I-Y 모티프가 반복된다. 물론 그러한 변화는 본 발명의 범위 내에서 가능한 많은 변화의 예에 지나지 않는다. 예를 들면, 한 구체예에서, 본 발명은 결실 (하나 또는 그 이상)만이 사용되고 (예를 들면, 세포질 꼬리부 또는 줄기부에서 결실) 삽입이나 반복부가 없는 돌연변이 서열에 관한 것이다. 이와 유사하게, 한 구체예에서, 본 발명은 단지 (하나 이상의) 삽입 또는 반복부 (예를 들면, 막횡단 도메인에서)가 사용되고 결실은 없는 돌연변이 서열에 관한 것이다.
도 8은 인간 갈락토실트랜스퍼라제 (인간 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제-GalT)를 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열 (서열 3)을 보여준다. 대문자는 β 1,2-크실로실트랜스퍼라제에 대한 아라비돕시스 탈리아나 mRNA의 뉴클레오티드 (데이타베이스 엔트리: EMBL:ATH277603, 사용된 TmXyl-단편은 이 데이타베이스 서열의 뉴클레오티드 135-297을 포함함)이다.
도 9는 도 8의 핵산 서열을 이에 상응하는 아미노산 서열 (서열 4)과 함께 보여준다.
도 10은 도 8에 도시된 핵산에 의하여 코딩되는 혼성 효소의 아미노산 서열 (서열 4)를 보여준다.
도 11은 인간 글리코실트랜스퍼라제 GnTIII의 핵산 서열 (서열 5)을 (myc-태그를 코딩하는 추가의 서열과 함께) 보여준다 (1차 기탁번호 Q09327 GNT3 HUMAN).
도 12는 도 11의 핵산 서열을 이에 상응하는 아미노산 서열 (서열 6)과 함께 보여준다.
도 13은 인간 GnTIII의 아미노산 서열 (서열 6)을 (myc 에피토프 태그의 추가의 아미노산 서열, 서열 7과 함께) 보여준다.
도 14는 식물 크실로실트랜스퍼라제 (TmXyl-)의 막횡단 도메인 및 인간 GnTIII (TmXyl-GnTIII)의 촉매 도메인 (다른 영역과 함께) (myc-태그를 코딩하는 추가의 서열과 함께)을 포함하는 본 발명에 따른 혼성 효소의 한 구체예를 코딩하는 핵산 서열 (서열 9)을 보여준다.
도 15는 도 14의 핵산 서열을 이에 상응하는 아미노산 서열 (서열 10)과 함께 보여준다.
도 16은 도 14의 핵산에 의하여 코딩되는 혼성 효소의 아미노산 서열 (서열 10)을 (myc 에피토프 태그의 추가 서열 서열 7과 함께) 보여준다.
도 17은 혼성 효소 TmXyl-GalT + TmGnTI-GnTII + TmGnTI-ManII를 코딩하는 카세트의 완전한 핵산 서열 (서열 27)을 보여준다.
도 18은 혼성 효소 TmGnTI-ManII를 코딩하는 카세트의 완전한 핵산 서열 (서열 28)을 보여준다 (RbcS1 프로모터 서열 서열 39도 함께 도시함).
도 19는 혼성 효소 TmGnTI-ManII를 코딩하는 핵산 서열 (서열 29)을 보여준다.
도 20은 혼성 효소 TmGnTI-GnTII을 코딩하는 핵산 서열 (서열 30)을 보여준다.
도 21은 사용된 막횡단 단편 (TmGntI로 명명됨)이 서열 32에 기재한 핵산 서열을 갖는 혼성 효소 TmGnTI-GnTII을 코딩하는 핵산 서열 (서열 31)을 보여준다.
도 22a는 막횡단 도메인 단편 (TmGnTI)의 한 구체예를 코딩하는 핵산 서열 (서열 32)을 보여준다. 도 22b는 막횡단 도메인 단편 (TmManI)의 또다른 구체예를 코딩하는 핵산 서열 (서열 33)을 보여준다.
도 23은 본 발명의 3중 카세트 구체예의 완전한 핵산 서열 (서열 34)을 보여준다.
도 24는 혼성 유전자 발현 카세트 (TmManI-GnTI)의 핵산 서열 (서열 35)을 보여준다.
도 25는 히스톤 3.1 프로모터의 핵산 서열 (서열 36)을 보여준다.
도 26은 혼성 유전자 융합체 (TmManI-TmGnTI)의 핵산 서열 (서열 37)을 보여준다.
도 27은 혼성 유전자 융합체 TmManI-ManII의 핵산 서열 (서열 38)을 보여준다 (RbcS1 프로모터 서열 서열 39를 함께 도시함).
도 28은 RbcS1 프로모터의 핵산 서열 (서열 39)을 보여준다.
도 29는 혼성 유전자 TmManI-ManII의 핵산 서열 (서열 40)을 보여주며, 막횡단 단편을 코딩하는 핵산 서열 (서열 33)이 도시된다.
도 30은 혼성 유전자 TmManI-GnTII의 핵산 서열 (서열 41)을 보여준다.
도 31은 Lhca 프로모터의 핵산 서열 (서열 42)을 보여준다.
도 32는 혼성 유전자 TmManI-GnTII의 핵산 서열 (서열 43)을 보여주며, 막횡단 단편을 코딩하는 핵산 서열 (서열 33)이 도시된다.
도 33은 사용된 터미네이터 서열 (아래 참조)의 핵산 서열 (서열 44)을 보여준다.
도 34는 대조구 식물과 비교하여 본 발명의 식물의 전체 단백질 당화를 검사한 웨스턴 블롯이다.
도 35는 본 발명의 한 구체예에 따라 만들어진, 교배된 식물의 F1 자손에 대한 RCA를 사용한 렉틴 블롯이다.
도 36은 웨스턴 블롯이다. 패널 A는 항-IgG 항체를 사용하여 분석되었다. 패널 B는 항-HRP 항체를 사용하여 분석되었다. 패널 C는 특이적 항-Xyl 항체 분획을 사용하여 분석되었다. 패널 D는 특이적 항-푸코스 항체 분획을 사용하여 분석되었다. 패널 E는 렉틴 RCA를 사용하여 분석되었다.
도 37은 곤충 만노시다제 III 유전자의 아미노말단 CTS 영역이 마우스 신호 펩티드에 의하여 대체되고 카르복시말단 소포체 체류 신호 (KDEL)가 첨가된 혼성 유전자의 핵산 서열 (서열 49)을 보여준다.
도 38은 도 37의 핵산 서열에 상응하는 아미노산 서열 (서열 50)을 보여준다.
도 39는 인간 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제 (GalT) 유전자의 아미노말단 CTS 영역이 마우스 신호 펩티드에 의하여 대체되고 카르복시말단 소포체 체류 신호 (KDEL)가 첨가된 혼성 유전자의 핵산 서열 (서열 51)을 보여준다.
도 40은 도 39의 핵산 서열에 상응하는 아미노산 서열 (서열 52)을 보여준다.
도 41은 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) GnTI 유전자의 아미노말단 CTS 영역이 마우스 신호 펩티드로 대체되고 카르복시말단 소포체 체류 신호 (KDEL)가 첨가된 혼성 유전자의 핵산 서열 (서열 53)을 보여준다.
도 42는 도 41의 핵산 서열에 상응하는 아미노산 서열 (서열 54)을 보여준다.
도 43은 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) GnTII 유전자의 아미노말단 CTS 영역이 마우스 신호 펩티드로 대체되고 카르복시말단 소포체 체류 신호 (KDEL)가 첨가된 혼성 유전자의 핵산 서열 (서열 55)을 보여준다.
도 44는 도 43의 핵산 서열에 상응하는 아미노산 서열 (서열 56)을 보여준다.
도 45는 인간 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 (GalT) 유전자의 아미노말단 CTS 영역이 GnTI의 인간 유전자의 CTS 영역에 의하여 대체된 혼성 유전자의 핵산 서열 (서열 57)을 보여준다.
도 46는 도 45의 핵산 서열에 상응하는 아미노산 서열 (서열 58)을 보여준다.
도 47은 효소가 골지로 위치되어지는 방식의 계략도이다.
도 48은 트랜스퍼라제의 영역들의 스와핑이 재위치화를 일으키는 방식의 무제한적 추론적 개략도이다.
<발명의 상세한 설명>
혼성 효소
만노시다제, GlcNAcT, 갈락토실트랜스퍼라제 등의 다양한 당화 효소를 코딩하는 핵산 서열들은 발현 라이브러리의 스크리닝 또는 중합효소 연쇄반응 (PCR) 등의 당분야에 공지된 여러 재조합 DNA 방법을 사용하여 구조적 특징을 공유하는 클로닝된 DNA 단편을 검출함으로써 얻을 수 있다. 문헌 (Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York)을 참조한다. 리가제 연쇄반응 (LCR), 라이게이션된 활성화된 전사 (LAT) 및 핵산 서열에 의거한 증폭 (NASBA) 또는 롱레인지 (long range) PCR 등의 그외 핵산 증폭 방법이 사용될 수 있다.
DNA 단편이 일단 생성되면, 원하는 유전자를 포함하는 특정 DNA 단편의 동정은 여러 가지 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 유전자의 일부 또는 그의 특이적 RNA, 또는 이의 단편의 양을 얻어 정제하고 표지할 수 있다면, 생성된 DNA 단편은 표지된 프로브에 핵산 혼성화에 의하여 스크리닝될 수 있다 (Benton and Davis, Science 196: 180 (1977); Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961 (1975)). 이와 다르게는, 유전자의 존재를 그의 발현된 생성물의 물리적, 화학적 또는 면역학적 성질에 기초한 분석에 의하여 검출할 수 있다. 예를 들면, 동일한 또는 유사한 전기영동 이동도, 등전 집속 거동, 단백질분해 소화 지도, 또는 관심있는 단백질에 대해 공지된 항원적 성질을 갖는 단백질을 생산하는, cDNA 클론, 또는 적절한 mRNA를 혼성 선별하는 DNA 클론이 선택될 수 있다.
제1 효소의 막횡단 부분 및 제2 효소의 촉매 부분을 포함하는 혼성 효소를 코딩하는 핵산 서열을 다음과 같이 얻을 수 있다. 촉매 부위를 포괄하는, 제2 효소의 C-말단 부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열을 남기고 막횡단 부분을 코딩하는 서열은 제2 효소로부터 제거된다. 제1 효소의 막횡단 부분을 코딩하는 서열은 PCR을 통해 단리 또는 얻어지며, 제2 효소의 C 말단 부분을 포함하는 서열을 코딩하는 서열에 라이게이션된다.
변형된 효소
단백질, 특히 ER에 머무르는 갈락토실트랜스퍼라제, 만노시다제 및 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제 등의 효소를 코딩하는 핵산 서열은 그 막횡단 단편을 코딩하는 서열을 제거하고, 그 대신에 메티오닌 (번역개시) 코돈으로 치환하고 갈락토실트랜스퍼라제의 최후의 코돈과 정지 코돈 사이에 KDEL (아미노산 잔기 서열: 리신-아스파르트산-글루탐산-루이신)을 코딩하는 서열 등 ER 체류 신호를 코딩하는 핵산 서열을 삽입함으로써 얻을 수 있다 (Rothman Cell 50:521 (1987)).
도메인 및 그 일부의 사용
상기한 바와 같이, 어구 "적어도 일부" 또는 "단편"이란 천연 또는 본래의 기능을 보유하기 위해 단백질 또는 펩티드에 필요한 최소한의 아미노산 서열을 가리킨다. 예를 들면, 효소의 기능은 그의 효소 또는 촉매 역할, 골지체에서 단백질을 고정하는 능력, 또는 신호 펩티드로서의 기능을 가리킨다. 따라서 어구 "막횡단 도메인의 적어도 일부" 또는 "막횡단 도메인의 단편"은 각기 본래의 막횡단 기능성의 적어도 일부를 여전히 보유하는 (예를 들면, 기능이 감소되기는 하지만 분명히 나타날 수 있음), 큰 막횡단 도메인의 최소한의 아미노산 세그먼트를 가리킨다. 본 명세서에서 설명한 바와 같이, 당분야의 전문가라면, 단백질 또는 펩티드가 본래의 단백질 또는 펩티드의 기능성의 적어도 일부를 보유하는 데 필요한 최소한의 아미노산 세그먼트를 알 것이다.
글리코실트랜스퍼라제 효소는 이들이 운반하는 당의 타입에 기초하여 패밀리로 (예를 들면, 갈락토실트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제 등) 그룹화되는 것이 전형적이다. 아미노산 서열 유사성 및 반응의 입체화학적 경로에 기초하여, 글리코실트랜스퍼라제는 적어도 27개 및 아마도 많게는 47개의 상이한 패밀리로 분류될 수 있다 (Campbell et al., Biochem. J. 326: 929-939 (1997), Biochem. J. 329: 719 (1998)). 오늘날까지 클로닝된 글리코실트랜스퍼라제의 대부분은 타입 II 막횡단 단백질 (즉, 세포질에 NH₂ 말단이 있고 골지체의 루멘에 COOH 말단이 있는 단일 막횡단 도메인)이다. 이들이 어떻게 분류되는가와 관계없이, 모든 글리코실트랜스퍼라제는 어느 정도 공통된 구조적 특징을 공유한다: 짧은 NH₂-말단 세포질 꼬리부, 16 - 20 개의 아미노산 신호- 고정 (anchor) 또는 막횡단 도메인, 및 연장된 줄기 영역 다음에 큰 COOH 말단 촉매 도메인이 뒤이음. 세포질 꼬리부는 몇몇 타입의 글리코실트랜스퍼라제의 골지로의 특이적 위치화에 관여하는 것으로 보인다 (Milland et al., J. Biol. Chem. 277: 10374-10378). 신호 고정 도메인은 골지체의 루멘 내에 글리코실트랜스퍼라제의 촉매 도메인을 배향시키는 막-걸침 (membrane-spanning) 영역으로서 및 절단되지 않는 신호 펩티드로서 작용할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서는, 니코티아나 벤타미아나 (Nicotiana benthamiana, 담배) 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 I의 N-말단 77 아미노산에 의하여 정의되는 부분은 식물 골지체로 표적화하고 리포터 단백질을 보유하는 데 충분한 것으로 밝혀졌기 때문에, 이 부분이 혼성 효소에서의 사용을 위해 고려된다 (Essl et al., FEBS Lett 453: 169-173 (1999)). 추정적 세포질, 막횡단 및 줄기 도메인 사이의 다양한 융합 단백질의 담배에서의 세포내 (subcellur) 위치화는, 세포질-막횡단 도메인만으로도 어떤 내강 (luminal) 서열의 도움 없이도, β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 골지 체류를 유지하는 데 충분하다는 것을 밝혀주었다 (Dirnberger et al., Plant Mol. Biol. 50: 273-281 (2002)). 따라서, 상기한 바와 같이, 본 발명의 특정한 구체예는 CTS 영역의 줄기 영역을 사용하지 않고 세포질-막횡단 도메인 (또는 그 일부)만을 포함하는 CTS 영역 일부를 사용한다. 그러나, 몇몇 타입의 글리코실트랜스퍼라제가 골지 체류를 위해 이들의 막횡단 도메인에 주로 의존하는 반면, 다른 타입들은 이들의 막횡단 영역 및 이 영역의 한쪽 또는 양쪽을 플랭킹하는 서열을 필요로 한다 (Colley, Glycobiology 7: 1-13 (1997)). 예를 들면, 아미노산 1 내지 32를 포괄하는 N-말단 펩티드는 골지로 β1,6-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제를 위치시키는 데 충분한 최소한의 표적화 신호인 것으로 보인다. 이 펩티드는 이 효소의 세포질 및 막횡단 도메인을 이룬다 (Zerfaoui et al., Glycobiology 12: 15-24).
많은 정보가 특정한 글리코실트랜스퍼라제를 위한 도메인의 아미노산 서열에 대해 사용할 수 있다. 예를 들면, 젠뱅크 기탁번호 제AAM17731호에서 제공된 포유동물 갈락토실트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 각각 잔기 19 내지 147 및 잔기 148 내지 397에 걸친 "줄기" 및 "촉매" 도메인을 가지며 (미국 특허 제6,416,988호, 언급됨으로써 여기에 도입됨), 본 발명은 특정한 구체예에서, 특히 혼성 효소에 사용하기 위한 그러한 부분들에 관한 것이다. 젠뱅크 기탁번호 제AAC91156호에 제공된 래트 간 시알릴트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 9-아미노산 NH₂-말단 세포질 꼬리부, 17-아미노산 신호-고정 도메인, 및 노출된 줄기 영역을 포함하는 내강 도메인, 그 다음에 41 kDa 촉매 도메인을 가진다 (Hudgin et al., Can. J. Biochem. 49: 829-837 (1971); 미국 특허 제5,032, 519호 및 제5,776,772호, 언급됨으로써 여기에 도입됨). 공지된 인간 및 마우스 β 1,3-갈락토실트랜스퍼라제는 8개의 보존된 영역을 갖는 촉매 도메인이 있다 (Kolbinger et al., J. Biol. Chem. 273: 433-440 (1998); Hennet et al., J. Biol. Chem. 273: 58-65 (1998); 미국 특허 제5,955,282호, 언급됨으로써 여기에 도입됨). 예를 들면, 젠뱅크 기탁번호 제NM020026호에 제공된 마우스 UDP-갈락토스: β-N-아세틸글루코사민 β1,3-갈락토실트랜스퍼라제-I의 아미노산 서열은 다음의 촉매 영역을 갖는다: 잔기 78-83의 영역 1, 잔기 93-102의 영역 2, 잔기 116- 119의 영역 3, 잔기 147-158의 영역 4, 잔기 172-183의 영역 5, 잔기 203- 206의 영역 6, 아미노산 잔기 236-246의 영역 7, 및 잔기 264-275의 영역 8 (Hennet et al., 앞의 문헌). 이들 모두는 본 발명의 특정한 구체예에서 상기한 혼성 효소(들)과 관련하여 유용한 일부로서 고려된다.
글리코실트랜스퍼라제의 공지된 cDNA 클론들 간의 초기 비교는 효소들 간에 서열 상동성이 거의 없음을 입증했으나 (Paulson et al., J. Biol. Chem. 264: 17615-618 (1989)) 다양한 특이성의 글리코실트랜스퍼라제에서 보존된 도메인 구조의 추론을 가능케 하는 더 최근의 진전이 이루어졌다 (Kapitonov et al., Glycobiology 9: 961-978 (1999)). 예를 들면, 많은 글리코실트랜스퍼라제의 핵산 및 아미노산 서열은 호모 사피엔스 (Homo sapiens, 인간), 카에노르합디티스 엘레강스 (Caenorhabditis elegans, 토양 선충류), 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana, 탈레 크레스, 겨자) 및 오리자 새티바 (Oryza sativa, 벼) 등의 다양한 유기체에 데해 얻어진 완전한 게놈 서열에 의하여 제공되는 서열 데이타를 사용하여 동정되었다.
광범위한 연구 결과로서, 글리코실트랜스퍼라제의 다양한 패밀리의 상동성 결합 부위에 대해 공통적인 아미노산 서열이 추론되었다. 예를 들면, 시알릴트랜스퍼라제는 도너 기질인 CMP-시알산의 인식에 참여하는 것으로 보이는 시알릴 모티프를 갖는다 (Paulson et al., J. Biol. Chem., 264: 17615-17618 (1989); Datta et al., J. Biol. Chem., 270: 1497-1500 (1995); Katsutoshi, Trends Glycosci. Glycotech. 8: 195-215 (1996)). Gal α1-3 갈락토실트랜스퍼라제에서 헥사펩티드 RDKKND 및 GlcNAc β1-4 갈락토실트랜스퍼라제에서 RDKKNE는 UDP-Gal을 위한 결합 부위로서 제안되었다 (Joziasse et al., J. Biol. Chem., 260: 4941-4951 (1985), J. Biol. Chem., 264: 14290-14297 (1989); Joziasse, Glycobiology, 2: 271-277 (1992)).
α-1,3-만노실트랜스퍼라제, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제, α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제, 글루쿠로닐트랜스퍼라제, 푸코실트랜스퍼라제, 글리코게닌 및 기타를 포함하는 많은 상이한 진핵생물 트랜스퍼라제에게서, 소수성 영역에 의하여 종종 둘러싸인, 두 개의 아스파르트산 잔기 (DXD)에 의하여 형성된 작은 고도로 보존된 모티프가 동정되었다 (Wiggins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95: 7945-7950 (1998)). 돌연변이 연구는 이 모티프가 효소 활성에 필요하다는 것을 지시한다 (Busch et al., J. Biol. Chem. 273: 19566-19572 (1998); Wang et al., J. Biol. Chem. 277: 18568-18573 (2002)). 다중적 펩티드 배열을 통해, β 3-갈락토실트랜스퍼라제 패밀리에 속하는 모든 것들 전체에서 보존된 추정적 촉매 도메인에 상응하는 여러 모티프, 즉, 타입 II 막횡단 도메인, 보존된 DxD 모티프, N-글리코실화 부위 및 5 개의 보존된 시스테인이 밝혀졌다 (Gromova et al., Mol. Carcinog. 32: 61-72 (2001)).
BLAST 검색 및 다중적 배열 (multiple alignment)을 사용하여, E-X₇-E 모티프는 글리코실트랜스퍼라제를 보유하는 4개 패밀리에 속하는 것들 사이에 고도로 보존된 것을 밝혀졌다 (Cid et al., J. Biol. Cherra. 275: 33614-33621 (2000)). 0-연결 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 (GlcNAc)는 특이적 세린 또는 트레오닌 가수분해에 단일한 β-N-아세틸글루코사민 부분을 첨가한다. BLAST 분석, 컨센서스 2차 구조 예상 및 폴드 인식 연구는 제2 로스만 (Rossman) 도메인에서 보존된 모티프 UDP-GlcNAc 도너-결합 부위를 가리킨다는 것을 지시한다 (Wrabl et al., J. Mol. Biol. 314: 365-374 (2001)). 오늘날까지 동정된 β1,3-글리코실트랜스퍼라제 효소는 여러 보존된 영역 및 보존된 시스테인 잔기를 공유하며, 이들 모두는 추정적 촉매 도메인에 위치한다. 쥐의 β3GatT-I 유전자 (기탁번호 제AF029790호)의 위치지정 돌연변이에 따르면, 보존된 잔기 W101 및 W162가 UDP-갈락토스 도너의 결합에 관여하고 잔기 W315는 N-아세틸글루코사민-β-p-니트로페놀 수용체의 결합체 관여하고, E264를 포함하는 도메인은 두 기질의 결합에 참여하는 것으로 보인다 (Malissard et al., Eur. J. Biochem. 269: 233-239 (2002)).
식물 숙주계에서 관심있는 단백질의 발현
혼성 또는 변형된 효소 또는 이종 당단백질과 같은 다른 이종 단백질을 코딩하는 핵산은 본 발명의 특정한 구체예에 따라서, 적절한 발현 벡터, 예를 들면, 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우에는 복제 및 번역에 필요한 요소 뿐만 아니라 선택가능한 마커를 포함하는 벡터 내로 삽입할 수 있다. 이들은 프로모터 영역, 신호 서열, 5' 비번역된 서열, 개시 코돈 (구조 유전자가 개시 코돈을 수반하는지에 따라서), 및 전사 및 번역 종결 서열을 포함하나 이에 제한되는 않는다. 그러한 벡터를 얻는 방법은 당분야에 공지되어 있다 (참고로 WO 01/29242 참조).
식물에서 발현에 적합한 프로모터 서열은 당분야, 예를 들면 WO 91/198696에 기재되어 있다. 이들은 노팔린 신테타제 및 옥타핀 신테타제 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 및 35S 프로모터, 및 현삼 (figwort) 모자이크 바이러스 (FMV) 35 프로모터 (미국 특허 제5,352,605호 및 제6,051,753호, 둘 모두 언급함으로써 여기에 도입됨) 등의 비항시적 프로모터 또는 항시적 프로모터를 포함한다. 사용된 프로모터는 또한, 예를 들어 배젖 (endosperm), 호분층 (aleurone layer), 배(胚), 과피 (pericarp), 줄기, 잎, 괴경 (tuber), 뿌리 및 이와 유사한 것으로 표적화된 조직 특이적 프로모터일 수도 있다.
신호 서열은 적절한 경우 단백질의 프로세싱 및 전좌 (translocation)를 가능하게 한다. 신호는 식물로부터 유래할 수 있거나 비식물 신호 서열일 수 있다. 신호 펩티드는 신생 폴리펩티드를 소포체로 향하게 하며, 소포체에서 폴리펩티드는 그 뒤, 번역후 변형을 겪는다. 신호 펩티드는 당분야의 숙련자에게는 통상적으로 밝혀져 있을 수 있다. 이들은 전형적으로 3부 구조를 가지는데, N말단 종지부에 양으로 대전된 아미노산, 그 다음에 소수성 영역, 그 뒤에 감소된 소수성 영역 내에 절단 부위를 갖는다.
전사 종결은 통상, 전사 개시 조절 영역의 반대쪽 종지부에서 일어난다. 이는 전사 개시 영역과 결합하거나 상이한 유전자로부터 유래한 것일 수 있고 발현을 향상시키도록 선택될 수 있다. 아그로박테리움 Ti 플라스미드로부터 유래한 NOS 터미네이터 및 벼 α-아밀라제 터미네이터이다. 폴리아데닐화 꼬리부도 첨가될 수 있다. 예로는 아그로박테리움 옥토핀 신테타제 신호 (Gielen et al., EMBO J. 3: 835-846 (1984)) 또는 동일한 종의 노팔린 신타제 [Depicker et al., Mol. Appl. Genet. 1: 561-573 (1982))가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
인핸서는 이종 단백질의 전사를 증가 및(또는) 최대화시키기 위해서 포함될 수 있다. 이들은 펩티드 방출 신호 서열, 코돈 사용, 인트론, 폴리아데닐화, 및 전사 종결 부위를 포함하나 이에 제한되는 않는다 (WO 01/29242 참조).
마커는 바람직하게는 원핵생물 선택 마커를 포함한다. 이러한 마커는 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신 및 스펙티노마이신 등의 항생제에 대한 내성을 포함한다. 구체적인 예로는 스트렙토마이신 내성을 코딩하는 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제 (spt) 유전자, 카나마이신 또는 제네티신 내성을 코딩하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (nptII) 유전자, 히그로마이신에 대한 내성을 코딩하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt) 유전자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
제작된 벡터는 당분야에 공지된 방법을 사용하여 식물 숙주계 내로 도입될 수 있다 (WO 01/29242 및 WO 01/31045에서 검토). 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스 벡터에 상동성이 있는 영역, A. 투메파시엔스로부터 유래한 T-DNA 가장자리 영역을 포함하는 중간적 식물 형질전환 플라스미드로 변형될 수 있다. 이와 다르게는, 본 발명의 방법에 사용된 벡터는 아그로박테리움 벡터일 수 있다. 벡터를 도입하는 방법은 미세주입, 작은 비드 또는 입자의 매트릭스 내 또는 그 표면 상에 핵산을 가지는 작은 입자에 의한 신속 유전자총 투과 (velocity ballistic penetration) 및 전기천공을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 식물 세포, 조직 또는 기관 내로 도입될 수 있다. 특정한 구체예에서는, 이종 유전자의 존재가 일단 확인되면, 식물은 당분야에 공지된 방법을 사용하여 재생할 수 있다. 원하는 단백질의 존재는 당분야에 공지된 방법, 바람직하게는 생체 활성 부위가 검출가능한 신호를 생성하는 방식으로 검출되는 스크리닝 분석을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 이 신호는 직접 또는 간접적으로 생성될 수 있다. 그러한 분석의 예는 ELISA 또는 방사성면역분석법을 포함한다.
일시적인 발현
본 발명은 구체적으로는, 상기한 혼성 효소의 안정적 및 일시적 발현 양자에 관한 것이다. 광범위하게 다양한 고등식물 종을 발현 카세트의 일시적 발현을 위해 형질전환시키는 기술은 잘 알려져 있다 (예를 들면, Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1988) 참조). 상이한 계의 변수에는 전이되는 핵산 타입 (DNA, RNA, 플라스미드, 바이러스), 형질전환되는 조직의 타입, 형질도입유전자를 도입하는 수단, 및 형질전환의 조건이 포함된다. 예를 들면, 핵산 제작물은 전기천공, PEG 천공, 입자 충격, 규소 섬유 운반 (silicon fiber delivery), 식물 세포 원형질체 또는 배형성 유합조직 (embryogenic callus) 또는 그외 식물 조직의 미세주입, 또는 아그로박테리움-매개 형질전환에 이르는 기술을 사용하여 식물 세포내로 직접 도입될 수 있다 (Hiei et al., Plant J. 6: 271-282 (1994)). 형질전환 효율성이 다양하기 때문에, 내부 표준 (예를 들면, 35S-Luc)을 종종 사용하여 형질전환 효율성을 표준화한다.
일시적 분석을 위한 발현 제작물에는 플라스미드 및 바이러스 벡터가 포함된다. 벡터로 사용될 수 있는 다양한 식물 바이러스는 당분야에 공지되어 있으며, 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV), 게미니바이러스 (geminivirus), 브롬 모자이크 바이러스 (brome mosaic virus), 및 담배 모자이크 바이러스를 포함한다.
일시적 발현에 적합한 식물 조직은 온전한 것이든 원형질체 (세포벽이 제거됨)로서든 배양된 세포, 배양된 조직, 배양된 식물, 및 잎과 같은 식물 조직을 포함한다.
일부 일시적 발현 방법은 전기천공 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 의하여 매개되는 식물 세포 원형질체내로의 유전자 전이를 이용한다. 이 방법은 식물 원형질체의 제조 및 배양을 필요로 하며, 핵산이 원형질체의 내부로 전이되는 원형질체의 구멍을 만드는 것을 포함한다.
전형적인 전기천공법은 문헌 (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824 (1985))에 기재되어 있다. DNA 제작물을 폴리에틸렌 글리콜 침전을 통하여 도입하는 방법은 문헌 (Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984))에 기재되어 있다. 담배 원형질체의 PEG-매개 형질전환은 단리, 정제 및 원형질체의 형질전환 단계를 포함하는데, 문헌 (Lyck et al., (1997) Planta 202: 117-125) 및 (Scharf et al., (1998) Mol Cell Biol 18 : 2240-2251), 및 (Kirschner et al., (2000) The Plant J 24 (3): 397-411)에 기재되어 있다. 이들 방법은 예를 들면, 외부 자극에 의하여 활성화되는 프로모터에서 시스-작용 요소를 밝히는 데에 사용된 바 있고 (Abel and Theologis (1994) Plant J 5 : 421-427; Hattori et al., (1992) Genes Dev 6: 609- 618 ; Sablowski et al., (1994) EMBO J 13 : 128-137; and Solano et al., (1995) EMBO J 14 : 1773- 1784), 뿐만 아니라 다른 유전자 발현 연구에도 사용된 바 있다 (미국 특허 제6,376,747호, 언급됨으로써 여기에 도입됨).
탄도 (ballistic) 형질전환법은 문헌 (Klein et al., (1987) Nature 327: 70-73)에 기재되어 있다. 유전자총 (biolistic) 일시적 형질전환은 현탁 세포 또는 식물 기관과 함께 사용된다. 예를 들면, 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum) 잎에서 사용되기 위해 개발되었다 (Godon et al (1993) Biochimie 75 (7): 591-595). 또한, 식물 프로모터를 연구 (Baum et al., (1997) Plant J 12: 463-469; Stromvik et al., (1999) Plant Mol Biol 41 (2): 217-31, Tuerck and Fromm (1994) Plant Cell 6 : 1655-1663; 및 미국 특허 제5,847,102호, 언급함으로써 여기에 도입됨), 및 전사 인자의 특징분석 (Goffet al., (1990) EMBO J 9 : 2517-2522 ; Gubler et al., (1999) Plant J 17: 1- 9 ; 및 Sainz et al., (1997) Plant Cell 9: 611-625)에 사용되었다.
다른 방법은, 여러 세포 구획내에서 GFP 발현이 관찰되었된, 양파 표피 껍질을 이용한 경우처럼, 그 위치에서 유전자의 일시적 발현의 가시화를 가능케 한다(Scott et al., (1999) Biotechniques 26 (6): 1128-1132).
핵산은 또한 직접 주입에 의하여 식물에 도입될 수도 있다. 일시적 유전자 발현은 화분으로의 직접적인 DNA 전이에 의하는 등 (예를 들면, Zhou etal., (1983) Methods in Enzymology, 101: 433; D. Hess (1987) Intern Rev. Cytol., 107: 367 ; Luo et al., (1988) PlantMol. Biol. Reporter, 6: 165 참조) 식물의 재생산 기관 내로 DNA를 주입하여 얻을 수 있다 (예를 들면, Pena et al., (1987) Nature, 325.: 274 참조). DNA는 또한 미성숙 배(胚)의 세포내로 직접 주입할 수도 있다 (예를 들면, Neuhaus et al., (1987) Theor. Appl. Genet : 75: 30; 및 Benbrook et al., (1986) in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass. , pp. 27-54 참조).
아그로박테리움-매개 형질전환은 쌍떡잎식물 및 외떡잎식물 양자에 적용가능하다. 쌀 및 옥수수 등의 벼과 식물의 아그로박테리움-매개 형질전환을 위한 최적화된 방법 및 벡터가 기재되어 있다 (예를 들면, Heath et al., (1997) Mol. Plant-Microbe Interact. 10: 221-227 ; Hiei et al., (1994) Plant J. 6: 271-282 및 Ishida et al., (1996) Nat. Biotech. 14: 745-750 참조). 옥수수 형질전환의 효율성은 감염된 조직의 타입 및 단계, 아그로박테리움의 농도, 조직 배양 배지, Ti 벡터 및 옥수수 유전자형을 비롯한 다양한 요인에 의하여 영향을 받는다.
또다른 유용한 기본적 형질전환 프로토콜은 입자 충격에 의하여 손상시킨 후 DNA 운반을 위한 아그로박테리움의 사용을 병용하는 것을 포함한다 (예를 들면, Bidney et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18: 301-313 참조). 완전한 분열조직 형질전환 및 분할된 분열조직 형질전환 방법 모두가 공지되어 있다 (미국 특허 제6,300,545호, 언급함으로써 여기에 도입됨).
아그로박테리아를 사용하는 추가의 방법은 아그로감염 및 아그로침윤을 포함한다. 바이러스 게놈을 T-DNA 내로 삽입함으로써 아그로박테리움을 식물의 바이러스 감염을 매개하는 데에 사용할 수 있다 (예를 들면, 미국 특허 제6,300,545호, 언급함으로써 여기에 도입됨). T-DNA를 식물 세포로 전이한 후, T-DNA로부터 바이러스 게놈의 절제 (동원 (mobilization))가 성공적인 바이러스 감염을 위해 필요하다. 바이러스를 식물내로 도입하는 이러한 아그로박테리움-매개 방법은 아그로감염으로 공지되어 있다 (예를 들면, Grimsley, "Agroinfection" pp. 325-342, in Methods in Molecular Biology, vol 44: Agrobacterium Protocols, ed. Gartland and Davey, Humana Press, Inc., Totowa, N. J. ; 및 Grimsley (1990) Physiol. Plant. 79: 147-153 참조).
외래 유전자를 식물에서 발현시키기 위한 식물 바이러스 유전자 벡터의 개발하면 단시간내에 높은 수준의 유전자 발현을 제공한다. 적절한 바이러스 레플리콘은 이중가닥 DNA 게놈 또는 복제 중간체를 가지는 바이러스로부터의 이중가닥 DNA를 포함한다. 절제된 바이러스 DNA는 레플리콘 또는 복제 중간체로서 독립적으로 또는 트랜스로 공급된 인자들과 함께 작용할 수 있다. 바이러스 DNA는 감염성 바이러스 입자를 코딩하거나 코딩하지 않을 수 있으며, 또한, 삽입, 결실, 치환, 재배열 또는 그외 변형을 포함할 수 있다. 바이러스 DNA는 임의의 비바이러스 DNA 또는 상이한 바이러스로부터의 DNA인 이종 DNA를 포함할 수 있다. 예컨대, 이종 DNA는 관심있는 단백질 또는 RNA를 위한 발현 카세트를 포함할 수 있다.
아그로박테리움 균주 A281 및 A348의 vir 유전자를 보유하는 슈퍼 바이너리 벡터는 외떡잎식물의 고효율 형질전환에 유용하다. 그러나, 고효율 벡터를 사용하지 않고도 종양이 형성되지는 않으나 아그로감염에 의하여 도입된 바이러스에 의하여 전신 감염을 초래하는 효율도로 T-DNA가 옥수수로 전이됨이 증명되었다 (Grimsley et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 217: 309-316). 이는 절제된 바이러스 게놈이 독립적인 레플리콘으로 작용하므로 바이러스 게놈을 포함하는 T-DNA가 바이러스 조작에 필요하지 않기 때문이다.
또다른 아그로박테리아-매개 일시적 발현 분석은 완전한 식물체 (in planta)인 담뱃잎의 아그로박테리움-매개 형질전환에 기초한다 (Yang et al., (2000) The Plant J 22 (6): 543-551). 이 방법은 담뱃잎 내로 플라스미드 제작물을 보유한 아그로박테리아의 침윤을 이용하여, 아그로침윤으로 명명되고, 2-3일 정도의 단기간 내에 프로모터 및 전사 인자의 생체내 발현을 분석하는 데에 사용된 바 있다. 또한, 이 방법은 그 위치에서 (in situ) 프로모터 활성에 대한 병원체 감염 및 환경적 스트레스 등의 외부 자극의 영향을 검사할 수 있다.
<실시예 1>
β 1,2-크실로실트랜스퍼라제를 코딩하는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) cDNA를 앞서 설명한 PCR 기초 시블링 선별 과정 (Bakker et al., BBRC 261:829 (1999))에 의하여 cDNA 라이브러리로부터 단리하였다. 크실로실트랜스퍼라제는 형질감염된 CHO 세포를 토끼-항-양고추냉이-퍼옥시다제 항혈청으로부터 정제된 크실로스 특이적 항체를 써서 면역염색함으로써 확인하였다. 크실로실트랜스퍼라제의 N-말단 부분을 포함하는 DNA 단편을 다음 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.
XylTpvuF : ATACTCGAGTTAACAATGAGTAAACGGAATC (서열 45) 및
XylTpvuR : TTCTCGATCGCCGATTGGTTATTC (서열 46)
XhoI 및 Hpal 제한 부위는 개시 코돈의 앞에 도입되며, PvuI은 반대 말단에 도입되었다. 인간 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제 (acc.no x55415, Aoki 1992)의 C 말단 단편을 프라이머 GalTpvuF : GCCGCCGCGATCGGGCAGTCCTCC (서열 47) 및 GalTrev : AACGGATCCACGCTAGCTCGGTGTCCCGAT (서열 48)을 사용하여 증폭시킴으로써 PvuI 및 BamHI 부위를 도입했다. XhoI/PvuI 및 PvuI/BamHI로 소화된 PCR 단편을 XhoI/BamHI 소화된 pBluescriptSK+에 라이게이션시키고 서열분석하였다. 생성된 오픈 리딩 프레임은 A. 탈리나 β1,2-크실로실트랜스퍼라제의 처음 54개 아미노산이 인간 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 아미노산 69 내지 398과 융합된 융합 단백질을 코딩하며 TmXyl-GalT로 명명한다. 이 단편을 HpaI/BamHI를 사용하여 CaMV35S 프로모터와 Nos 터미네이터 사이에서 식물의 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이 클론을 본래의 인간 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제에 대해 기재한 바와 같이 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum, samsun NN)내로 도입하였다 (Bakker et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98: 2899 (2001)).
트랜스제닉 식물의 단백질 추출물 및 웨스턴 블롯을 기재된 바와 같이 제조하였다 (Bakker et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98: 2899 (2001)). 렉틴 RCA와의 반응에 기초하여, TmXylGalT를 발현하는 트랜스제닉 식물을 MALDI-TOF (Elbers et al., Plant Physiology 126: 1314 (2001))에 의한 추가 글리칸 분석을 위하여 선별하였고, 본래의 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 발현하는 식물로부터 단리한 글리칸 및 야생형 식물로부터의 글리칸을 비교하였다.
MALDI-TOF 스펙트럼의 상대적 피크 면적이 표 1에 제공된다. 표 1은 대조구 담배 ("담배"), 인간 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제 ("GalT")를 발현하는 트랜스제닉 담배 및 CTS 영역이 β-1,2-크실로실트랜스퍼라제의 것으로 대체된 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 트랜스제닉 담배 ("TmXyl-GalT")의 내인성 당단백질의 N-글리칸 질량 스펙트럼 (MALDI-TOF) 분석 결과의 비교이다.
<표 1>

이들 데이타는
1. TmXylGalT 식물에서, 글리칸의 크실로실화 및 푸코실화가 급격히 감소함 (야생형 식물에서의 14 %와 비교할 때 글리칸의 82 %가 크실로스 및 푸코스를 보유하지 않음)과
2. 갈락토실화가 GalT 식물에서 9 %로부터 TmXylGalT 식물에서 32 %로 증가하였음을 보여준다.
<실시예 2>
상기 TmXyl-GalT 유전자 (TmXyl-GalT-12 식물)을 발현하는 트랜스제닉 식물을 바이오틴-표지된 RCA (Vector Laboratories, 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)을 사용하는 렉틴 블롯팅에 기초하여 선택하였다. MGR48 트랜스제닉 (대조구) 식물, 비변형된 인간 β1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 발현하는 선택된 트랜스제닉 식물, 및 TmXyl-GalT-12 식물의 단백질 추출물을 항-HRP (양고추냉이 퍼옥시다제) 폴리클론 항체 (높은 항-크실로스 및 항-푸코스 반응성에 대해 알려짐)를 사용하여 크실로스 및 푸코스의 존재에 대하여 비교한 결과는 크실로스 및 푸코스의 감소를 명백히 보여주었다 (도 34: "항-HRP"). 항-HRP의 항-크실로스 분획 및 항-푸코스 분획 (이들은 각기 적절한 리간드에 대한 친화성 크로마토그래피에 의해 제조될 수 있음)을 사용하는 웨스턴 블롯팅은 특히 크실로스가 대조구 식물과 비교할 때 감소됨을 보여주었다 (도 34: "항-Fuc" 및 "항-Xyl").
<실시예 3>
단일 T-DNA 통합 결과 (MGR48-31)로부터 얻은 모노클론 항체 MGR48를 발현하는 트랜스제닉 식물과 TmXyl-GalT-12 식물을 교배하였고, 카나마이신 내성 마커 및 항체 생성 (MGR48-31-4)에 대하여 분리하지 않는 자손 식물을 선별하였다. MGR48-31-4의 화분을 무기력화된 TmXyl-GalT-12 식물의 수분에 사용하였다. 그 반대로, TmXyl-GalT-12 식물의 화분은 무기력화된 MGR48-31-4 식물의 수정에 사용하였다. 많은 F1 식물을 웨스턴 블롯팅을 통하여 MGR48의 존재에 대하여 분석하고, RCA를 사용하는 렉틴 블롯팅에 의하여 내인성 당단백질의 갈락토실화에 대해 분석하였다 (도 35). MGR48을 발현하고 내인성 당단백질의 갈락토실화를 보이는 식물을 추가의 분석을 위하여 선별하였다. 이 식물을 XGM8로서 동정하였다.
TmXyl-GalT-12 (♀) x MGR48-31-4 (♂)로부터의 씨를 파종하고, 상기한 바와 같은 표준 기술을 사용하여, Fl 자손 식물 (XGM)을 항체 생성에 대해 웨스턴 블롯팅으로 분석하였고 바이오티닐화 RCA120 (Vector Labs., 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)을 사용하여 렉틴 블롯팅에 의해 갈락토실화에 대해 분석하였다. 기대된 모든 식물이 모노클론 항체 MGR48을 발현했으며, 또한 대부분은 RCA120을 사용하는 렉틴 블롯팅으로부터 묘사된 바와 같이 갈락토실화 글리칸을 가졌다. 항체 MGR48을 발현하고 갈락토실화 N-글리칸을 갖는 단일 식물을 추가의 분석을 위해 선별하였다 (XGM8) (TmXyl-GalT-12 X MGR48-31-4 자손 식물 8). 모노클론 재조합 MGR48 항체를 이 식물로부터 상기한 바와 같이 정제하고 MALDI-TOF에 의하여 N-글리칸 분석하였다.
간략하게 설명하면, XGM8 식물을 최적 조건하에서 항체 생성을 위해 온실에서 재배했다 (Elbers et al., Plant Physiology 126 : 1314 (2001)). 트랜스제닉 XGM8 식물의 잎의 단백질 추출물을 제조하고 기재된 바와 같은 단백질 G 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다 (Bakker et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98: 2899 (2001)). 정제된 모노클론 항체의 N-글리칸의 MALDI-TOF를 기재된 바와 같았다 (Elbers et al., 2001, 앞의 문헌). 글리칸 상의 갈락토스의 존재는 기재된 바와 같이 소 고환 β-갈락토시다제를 사용하여 효소 서열분석에 의하여 확립하였다 (Bakker et al., 2001, 앞의 문헌, 표 2). 표 2 (아래)는 TmXyl-GalT-12 식물과 rec-mAb (MGR48)을 생성하는 식물과의 F1 잡종의 내인성 당단백질 ("Xyl-GalT 내인성")의 N-글리칸 및 상기 F1 잡종으로부터 단백질 G 크로마토그래피에 의하여 정제된 rec-mAB의 N-글리칸의 질량 스펙트럼 (MALDI-TOF) 분석 결과의 비교이다.
<표 2>

이들 데이타는 다음을 보여준다.
1. F1 잡종에서, 글리칸의 크실로실화 및 푸코실화가 급격하게 감소된다. 내인성 당단백질의 글리칸 43 %가 크실로스 및 푸코스가 없으며 이는 야생형 담배 식물에서 14 %뿐인 것과 비교된다.
2. 이 F1 잡종의 정제된 mAb의 글리칸은 감소된 크실로스 및 푸코스를 갖는다. 47 %로서, 야생형 담배의 경우 14 %와 비교됨. 도 36 패널 B-D 참조한다.
3. F1 잡종의 내인성 당단백질의 갈락토실화는 GalT 식물의 9 %에서 F1 TmXyl-GalT X MGR48 식물에서 37 %로 증가하였다. 도 35를 참조한다.
4. 상기 F1 (도 36, 패널 A)으로부터의 정제된 rec-mAb는 증가된 갈락토실화를 나타냈는데, 즉, 46 %가 갈락토스를 갖는다. 도 36, 패널 E 참조한다.
그러나, 관찰된 양 (MALDI-TOF)이 생체내에서 상기 글리코형태의 몰 비율을 반드시 반영하지는 않는다는 점을 유의해야 한다. MALDI-TOF에 기초한 정량은 연구중인 특정한 글리코형태에 기초하여 과소 또는 과다평가될 수 있다. 또한, Gal과 Man 간의 분자량 차이가 없기 때문에, 갈락토시다제 처리 전후에 특정한 분자의 상대적 높이에서 명백한 차이가 없다면, 일부 피크는 명백하게 주석을 달 수가 없다.
<실시예 4>
크실로스, 푸코스 및 갈락토스 함량의 더 직접적 비교는 하이브리도마, 트랜스제닉 담배 및 TmXyl-GalT 트랜스제닉 담배로부터 MGR48 IgG 항체를 검사함으로써 수행하였다. 상술한 바와 같이, TmXyl-GalT-12 식물을 MGR48 IgG를 발현하는 담배 식물 (MGR48 담배)와 교배하여 MGR48 TmXyl-GalT를 가지는 F1 잡종을 얻었다. F1 식물을 MGR48 IgG의 추출 및 정제를 위하여 선별하였다. 상기 식물 (담배 및 TmXyl-GalT)로부터의 항체를 단백질 G 크로마토그래피를 사용하여 단리 및 정제하였다 (Elbers et al., 2001. Plant Plzysiology 126: 1314-1322). 하이브리도마 MGR48 및 식물유래 recMGR48 각 300 나노그램을 미리 만든 12 % SDS-PAGE 겔 (Biorad) 상에 로딩하고 러닝시켰다. 각 레인의 함량은 다음과 같았다: 레인 1, 하이브리도마로부터의 MGR48; 레인 2, 정상적 트랜스제닉 담배 식물로부터의 정제된 recMGR48; 및 레인 3, TmXyl-GalT 트랜스제닉 식물로부터의 정제된 recMGR48. SDS-PAGE 이후에, 단백질을 CAPS 완충액을 사용하여 니트로셀룰로오스로 옮겼다. 블롯을 A, 항-마우스 IgG; B, 폴리클론 토끼 항-HRP (항-크실로스/ (α 1,3- 푸코스); C, 항-크실로스; D, 항-(α 1,3-) 푸코스 항체; 및 E, 바이오티닐화 RCA과 함께 인큐베이션시켰다. HRP-표지된 양 항-마우스 (패널 A) 또는 염소-항-토끼 (패널 B-D) 항체 및 HRP-표지된 스트렙타비딘 (E)와 함께 인큐베이션한 후, 루미 이미저 (Lumi Imager) 상의 루미라이트 (LumiLight)를 써서 검출하였다.
패널 A는 MGR48 IgG의 대략 유사한 양을 모든 레인 (1-3)에 로딩하였음을 보여준다. L은 MGR48 IgG의 경쇄를, H는 중쇄를 가리킨다. 패널 B는 레인 2 (담배)에서 MGR48 항체의 중쇄가 예상한 바와 같이 항-HRP와 강력하게 반응한 반면, 하이브리도마 유래 MGR48 (레인 1)의 중쇄는 (예상한 바와 같이) 그렇지 않음을 보여준다. 하이브리도마 유래된 항체는 크실로스 및 α1,3-푸코스 잔기를 보유하지 않는다. 주목할만한 것은, TmXyl-GalT 담배 식물로터의 MGR48 항체는 반응하지 않는다는 점인데, 이는 이 식물로부터의 항체의 중쇄가 N-글리칸 상에 크실로스 및 푸코스 잔기의 양을 상당히 감소시켰음 (아마도 90 % 이상)을 의미한다. 이는 패널 C (항-크실로스) 및 D (항-푸코스)에서 묘사된 실험에 의하여 확인된다. 패널 E는 하이브리도마의 MGR48 항체 (레인 1)의 중쇄는 갈락토실화 N-글리칸을 갖는 반면 담배 유래 MGR48 (레인 2) 갖지 않음을 보여주며, 이는 예상한 바와 같다. TmXyl-GalT 식물로부터의 MGR48 (레인 3)의 중쇄도 혼성 효소를 발현하는 제작물의 존재로 인하여 갈락토실화 N-글리칸을 갖는다.
이들 데이타는 이미 나타낸 바와 같은, 유사한 식물 (담배 및 TmXyl-GalT-12 식물)로부터의 전체 단백질 추출물을 사용하여 유사한 실험으로부터 얻은 데이타와 일치하며, TmXyl-GalT 유전자의 발현으로부터 담배에 도입된 신규 특질은 자손 및 재조합 모노클론 항체로 안정적으로 전달될 수 있음을 입증한다.
<실시예 5>
상기한 F1 잡종의 추가의 특징 분석을 β-갈락토시다제로 처리하여 수행하였다. 표 3은 β-갈락토시다제로 글리칸을 처리하기 전후에 TmXyl-GalT와 MGR48 식물과의 F1 잡종으로부터 단백질 G 크로마토그래피에 의하여 정제된 rec-mAb의 N-글리칸의 질량 스펙트럼 (MALDI-TOF) 분석을 비교한 것이다.
<표 3>

이들 데이타는 다음을 보여준다:
1. F1 잡종으로부터의 Rec-mAb는 갈락토스를 포함하는데, 이는 β-갈락토시다제 처리 후의 특정 (갈락토스-함유) 글리코형태의 관찰된 감소 및 갈락토스 없는 글리코형태의 증가로부터 추론할 수 있다. m/z 1622가 6에서 1 %로 감소된 것으로 관찰되고 동시에 m/z 1460이 10에서 14 %로 증가한 것을 유의해야 하는데, 이는 GalGNM5로부터 갈락토스를 제거하여 GNM5를 발생시킨 결과이다. m/z 1768 (3에서 1 %로 감소) 및 상응하는 m/z 1606 피크 (4에서 6 %로 증가)의 경우에도 같다. 또한 도 36 패널 E를 참조한다.
2. 유사하게, 갈락토스 함유 글리칸에 기인하는 것으로 보이는 많은 피크들, 특히 갈락토스 존재를 입증하는 m/z 1501, 1647, 1663는 갈락토시다제로 처리했을 때 사라진다.
<실시예 6>
또다른 구체예에서, 곤충 만노시다제 III 유전자 (기탁번호: AF005034, 만노시다제 II 유전자로 잘못된 주석이 붙어있음)의 아미노말단 CTS 영역을 소포체로의 진입 (import)을 위한 마우스 신호 펩티드 코딩 서열에 의하여 대체한다. 이 신호 펩티드 서열은 IgG 서열의 아미노말단에 정상적으로 존재하는 완전히 활성인 신호 펩티드를 코딩하며, 식물 및 다른 유기체에서도 종래에 성공적으로 사용된 바 있었다. 더욱이, 소위 소포체 체류 서열 (KDEL)을 코딩하는 합성 서열을 ER 체류를 위하여 촉매 단편을 코딩하는 유전자 부분의 카르복시말단에 첨가한다. 따라서 이 유전자 서열에 의하여 코딩되는 혼성 만노시다제 III 단백질은 소포체에서 우선적으로 축적될 것이다.
<실시예 7>
또다른 구체예에서, 인간 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 (GalT) 유전자 (기탁번호: A52551)의 아미노말단 CTS 영역을 소포체로의 진입을 위한 마우스 신호 펩티드 코딩 서열에 의하여 대체한다 (도 39 참조). 이 신호 펩티드 서열은 IgG 서열의 아미노말단에 정상적으로 존재하는 완전히 활성인 신호 펩티드를 코딩하며, 식물 및 다른 유기체에서도 종래에 성공적으로 사용된 바 있었다. 더욱이, 소위 소포체 체류 서열 (KDEL)을 코딩하는 합성 서열을 ER 체류를 위하여 촉매 단편을 코딩하는 유전자 부분의 카르복시말단에 첨가한다. 따라서 이 유전자 서열에 의하여 코딩되는 혼성 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 단백질은 소포체에서 우선적으로 축적될 것이다.
<실시예 8>
또다른 구체예에서, 아라비돕시스 탈리아나 GnTI (기탁번호: AJ243198)의 아미노말단 CTS 영역을 소포체로의 진입을 위한 마우스 신호 펩티드 코딩 서열에 의하여 대체한다 (도 41 참조). 이 신호 펩티드 서열은 IgG 서열의 아미노말단에 정상적으로 존재하는 완전히 활성인 신호 펩티드를 코딩하며, 식물 및 다른 유기체에서도 종래에 성공적으로 사용된 바 있었다. 더욱이, 소위 소포체 체류 서열 (KDEL)을 코딩하는 합성 서열을 ER 체류를 위하여 촉매 단편을 코딩하는 유전자 부분의 카르복시말단에 첨가한다. 따라서 이 유전자 서열에 의하여 코딩되는 혼성 GnTI 단백질은 소포체에서 우선적으로 축적될 것이다.
<실시예 9>
또다른 구체예에서, 아라비돕시스 탈리아나 GnTII (기탁번호: AJ249274)의 아미노말단 CTS 영역을 소포체로의 진입을 위한 마우스 신호 펩티드 코딩 서열에 의하여 대체한다 (도 43 참조). 이 신호 펩티드 서열은 IgG 서열의 아미노말단에 정상적으로 존재하는 완전히 활성인 신호 펩티드를 코딩하며, 식물 및 다른 유기체에서도 종래에 성공적으로 사용된 바 있었다. 더욱이, 소위 소포체 체류 서열 (KDEL)을 코딩하는 합성 서열을 ER 체류를 위하여 촉매 단편을 코딩하는 유전자 부분의 카르복시말단에 첨가한다. 따라서 이 유전자 서열에 의하여 코딩되는 혼성 GnTII 단백질은 소포체에서 우선적으로 축적될 것이다.
<실시예 10>
또다른 구체예에서, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 (GalT) 유전자의 인간 유전자의 아미노말단 CTS 영역을 GnTI의 인간 유전자의 CTS 영역에 의하여 대체하였다 (TmhuGnTI-GalT) (도 45 참조).
본 발명은 어떠한 특정 메카니즘에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 본 발명의 다양한 구체예를 성공적으로 사용하기 위하여 메카니즘을 이해할 필요도 없다. 그럼에도 불구하고, 골지 효소의 순차적 분배 (도 47)가 있음과, 식물 글리코실트랜스퍼라제의 막횡단 도메인의 스와핑은 재위치화를 유발한다고 생각된다 (도 48).
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정한 방법, 프로토콜, 세포주, 벡터 및 시약은 달라질 수 있기 때문에 이들에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 용어는 단지 특정한 구체예를 설명하기 위한 목적으로 사용된 것일뿐 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에 사용된, 단수형은 명백히 달리 언급이 없는한 복수를 지칭하는 것을 포함한다. 달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자에게 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 기재하고 청구한 발명은 본 명세서에 개시된 특정한 구체예로 그 범위가 제한되는 것은 아니다. 이들 구체예는 본 발명의 여러 측면을 예시하기 위한 것이다. 모든 동등한 구체예가 본 발명의 범위에 포함된다. 실제로, 본 명세서에 나타내고 설명한 것이외에도 본 발명의 다양한 변형이 상기한 설명으로부터 당분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 그러한 변형은 첨부한 청구의 범위에 포함된다.
다양한 참고문헌이 본 명세서에 인용되었으며, 이들의 공개내용은 그 전체로 언급에 의하여 도입된다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열 10의 아미노산 서열을 갖는 혼성 글리코실트랜스퍼라제.
삭제
삭제
제1항의 혼성 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산.
제4항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 서열 9인 핵산.
제4항 또는 제5항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
제6항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제7항에 있어서, 박테리아 세포 또는 식물 세포인 숙주 세포.
제4항 또는 제5항의 핵산을 포함하는 식물 숙주계.
제9항에 있어서, 식물 또는 그의 일부인 식물 숙주계.
제9항에 있어서, 이종 글리코폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 식물 숙주계.
제11항에 있어서, 이종 글리코폴리펩티드가 항체 또는 그의 단편인 식물 숙주계.
제6항의 발현 벡터인 제1 발현 벡터를 식물 숙주계 내로 도입시키고,
상기 발현 벡터에 의해 코딩되는 혼성 글리코실트랜스퍼라제가 발현되도록 하는 조건 하에서 식물 세포를 배양하는 것
을 포함하는, 식물 숙주계에서 혼성 효소 및 임의적으로 다른 이종 글리코폴리펩티드를 생산하는 방법.
제13항에 있어서, 다른 이종 글리코폴리펩티드를 코딩하는 제2 발현 벡터를 식물 숙주계 내로 도입시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 다른 이종 글리코폴리펩티드가 항체 또는 그의 단편인 방법.
제14항에 있어서, 생산된 상기 다른 이종 글리코폴리펩티드를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
각각 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 (i) 각각 제1항의 혼성 글리코실트랜스퍼라제를 코딩하는 하나 이상의 핵산, 및 (ii) 다른 이종 글리코폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 식물 숙주계 내로 도입시키고,
상기 혼성 글리코실트랜스퍼라제 및 상기 다른 이종 글리코폴리펩티드를 발현하는 식물 또는 그의 일부를 수집하는 것
을 포함하는, 식물 숙주계에서 혼성 효소 및 다른 이종 글리코폴리펩티드를 생산하는 방법.
제17항에 있어서, (i)에 기재된 하나 이상의 핵산이 뉴클레오티드 서열 9를 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 다른 이종 글리코폴리펩티드를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
a) i) 제6항의 제1 발현 벡터를 포함하는 제1 식물, 및 ii) 다른 이종 글리코폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 제2 식물을 제공하고,
b) 제1 식물 및 제2 식물을 교배하여, 혼성 효소 및 상기 다른 이종 글리코폴리펩티드를 모두 발현하는 자손을 생산하는 것
을 포함하는, 식물에서 혼성 효소 및 다른 이종 글리코폴리펩티드를 생산하는 방법.
제15항에 있어서, 생산된 상기 다른 이종 글리코폴리펩티드를 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.