KR101194935B1 - 신선초 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 치료 및 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미나리과에 속하는 명일엽 (Angelica keiskei)의 전초인 신선초의 추출물을 유효성분으로 함유하는 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환 치료용 약학 조성물 또는 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 상기 추출물은 아세틸콜린에스테라아제의 저해능을 나타내며, 스코폴라민에 의해 유도된 기억력 감퇴 동물군의 학습증진 및 공간지각능력을 높은 수준으로 향상시키는 탁월한 효능을 나타내므로 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환 치료에 유용한 약학 조성물 또는 건강 기능 식품을 제공한다.

신선초, 추출물, 건망증, 퇴행성 뇌질환, 아세틸콜린에스테라아제

Description

신선초 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 치료 및 예방용 조성물{A composition comprising the extract of Angelica keiskei treating and preventing neuro-degenerative disease}

본 발명의 신선초 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 아세틸콜린에스테라아제의 저해능을 나타내며, 스코폴라민에 의해 유도된 기억력 감퇴 동물군의 학습증진 및 공간지각능력을 높은 수준으로 향상시키는 탁월한 효능을 나타내므로 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환 치료에 유용하다.

[문헌 1] J.A. Duke, Handbook of phytochemical constituents of GRAS herbs and other economic plants: Herbal Reference Library, CRC press, Boca Raton, Florida (1992), pp. 143144.

[문헌 2] Jin DQ et al, Anti-oxidant and anti-inflammatory activities of macelignan in murine hippocampal cell line and primary culture of rat microglial cells. Biochem Biophys Res Commun. 2005;331: 1264-1269.

[문헌 3] Lim CS et al, Antioxidant and anti-inflammatory activities of the methanolic extract of Neorhodomela aculeate in hippocampal and microglial cells. Biol Pharm Bull. 2006;29:1212-1216.

[문헌 4] Bassil and Grossberg, Novel regimens and delivery systems in the pharmacological treatment of Alzheimer's disease. CNS Drugs. 2009;23(4):293-307.

[문헌 5] Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr, Feather-stone RM, A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol. 1961;7:88-95.

[문헌 6] Aoki N, Muko M, Ohta E, Ohta S. C-geranylated chalcones from the stems of Angelica keiskei with superoxide-scavenging activity. J Nat Prod. 2008 Jul;71(7):1308-1310.

[문헌 7] Nishimura R, Tabata K, Arakawa M, Ito Y, Kimura Y, Akihisa T, Nagai H, Sakuma A, Kohno H, Suzuki T. Isobavachalcone, a chalcone constituent of Angelica keiskei, induces apoptosis in neuroblastoma. Biol Pharm Bull. 2007;30(10):1878-1883.

[문헌 8] Ogawa H, Nakamura R, Baba K. Beneficial effect of laserpitin, a coumarin compound from Angelica keiskei, on lipid metabolism in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2005;32(12):1104-9.

[문헌 9] Sugii M, Ohkita M, Taniguchi M, Baba K, Kawai Y, Tahara C, Takaoka M, Matsumura Y. Xanthoangelol D isolated from the roots of Angelica keiskei inhibits endothelin-1 production through the suppression of nuclear factor-kappaB. Biol Pharm Bull. 2005;28(4):607-610.

[문헌 10] Kimura Y, Taniguchi M, Baba K. Antitumor and antimetastatic activities of 4-hydroxyderricin isolated from Angelica keiskei roots. Planta Med. 2004;70(3):211-219.

본 발명은 신선초 추출물을 포함하는 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

의료기술의 발달로 인한 수명 연장으로 노인 인구가 증가하면서 퇴행성 신경의 질환인 채매 환자의 비율도 급증하고 있다. 치매는 개인적으로나 사회적으로 삶의 질을 크게 떨어뜨리고 본인과 주변의 사람들을 불행하게 만드는 질환으로 암, 심장질환, 뇌졸중에 이어 노인 사망의 네 번째 원인이 되고 있다. 치매는 크게 알츠하이머성 치매와 혈관성 치매로 나누는데, 알츠하이머성 치매는 서구에서 많이 관찰되는 치매의 형태로 뇌의 특정 부위에 베타 아밀로이드가 축적되어 콜린성 뉴런이 파괴되어 나타나는 병이다. 혈관성 치매는 고혈압, 뇌졸중, 고지혈증 등으로 인해 뇌로 가는 혈관의 이상으로 허혈 상태가 발생하여 해마 및 변연계통의 신경이 사멸하므로 나타나는 치매로 서구에서 보다는 동양에서 많이 나타나기 때문에 연구가 덜 되어있는 실정이다. 이들 두 치매의 형태가 원인은 다르지만 결과적으로 기억력 전달 신경물질로 알려진 아세틸콜린의 작용을 감소시켜 기억력에 손상을 가져온다는 부분에서는 동일한 기전을 가진다.

치매는 인간 본성이 파괴되며 장기간에 걸쳐 진행되는 퇴행성 질환이기 때문에 환자를 수용하는 수동적인 방법으로는 도저히 사회 경제적 부담을 감당할 수가 없으므로 예방제 및 원인 치료제를 개발하는 적극적인 시도를 해야 한다. 그러나 현재까지는 알츠하이머 질환의 근본적인 발병원인을 치료할 수 있는 치료제는 개발 되어 있지 않으며, 일반적인 치료제로서 사용 가능한 것으로는 아세틸콜린 에스테라제 저해제인 화이자사의 아리셉트(Aricept^®), 노바티스사의 엑셀론(Exelon^®), 그리고 얀센사의 레미닐(Reminyl^®)과 최근에 미국 FDA로부터 허가를 받은 NMDA 수용체의 길항제 기전의 룬드벡사의 에빅사(Ebixa: Memantine^®)가 있다. 그러나 아세틸콜린 에스테라제 저해제의 경우는 감퇴된 인지 능력을 개선해 줄 뿐 알츠하이머 질환의 근본적인 발병 원인을 치료하지는 못한다. 또한, 단지 일부 환자의 경우에서 일시적인 증세 완화 효과를 보이며, 그 약효가 오래 지속되지 못하므로 근본적인 치료제라 하기 어렵다. 또한 질환의 특성상 장기 복용을 요하게 되는데, 상기 의약품들의 경우 간 독성, 구토, 식욕감퇴를 비롯한 여러 가지 부작용을 수반하는 것 또한 문제점으로 드러나고 있다. 따라서 질환의 진행 과정을 막아 줄 수 있는 치료제의 개발이 시급한 과제가 되고 있다. 이를 위해서 많은 다국적 제약회사들이 이 분야에 대한 연구 개발에 막대한 투자를 하고 있으며 특히 알츠하이머 질환의 근본적인 발병 원인으로 추정되고 있는 40여개의 아미노산으로 구성된 베타 아밀로이드의 생성량을 감소시키는 베타 또는 감마 시크리테아제 저해제의 개발이 그 주종을 이루고 있다. 국내의 경우 알츠하이머 질환에 대한 기초 연구는 어느 정도 이루어지고 있으나 치매 치료제 개발 그 자체의 경우는 거의 전무한 실정이라고 여겨진다.

생활수준이 향상되고 인간의 수명이 증가함에 따라 노화 및 노화에 관련된 각종 질병에 관심이 커지고 있으며 산화적 스트레스가 알츠하이머 증후군, 파킨슨 증후 군, 헌팅턴 증후군과 같은 중추신경계의 퇴행성 뇌질환의 중요한 요인으로 밝혀졌다(Jin DQ et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 331: 1264-1269, 2005; Lim CS et al, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29: 1212-1216, 2006).

4급 아민 구조를 갖는 아세틸콜린은 신경전달물질이며 아세틸콜린에스테라아제 (acetylcholinesterase)는 아세틸콜린을 가수분해하여 콜린으로 만드는 작용을 한다. 치매 환자의 경우 신경전달물질인 아세틸콜린의 농도가 저하되며, 아세틸콜린에스테라아제를 억제할 경우 뇌의 아세틸콜린의 농도가 상승하여 치매환자의 증상이 개선되는 것이 보고되어 있다. FDA 승인을 받아 치매치료제로 개발되어 사용되고 있는 의약품은 타크린 (tacrine), 도네페질 (donepezil), 갈란타민 (galanthamine), 리바스티그민 (rivastigmine) 네 가지가 있는데 이들은 모두 아세틸콜린에스테라아제 저해제이다.(Bassil and Grossberg, Novel regimens and delivery systems in the pharmacological treatment of Alzheimer's disease. Drugs. 2009;23(4):293-307.)

신선초는 미나리과에 속하는 명일엽 (Angelica keiskei)의 전초를 사용하는 생약으로, 크산토케이스민(xanthokeismins) A-C, 이소바바찰콘(isobavachalcone), 크산토안젤롤(xanthoangelol) H 등 생리 활성을 나타내는 다양한 찰콘(chalcone) 류 및 쿠마린(coumarin)으로써 리세르피틴(laserpitin)을 함유한 것으로 보고된 바 있다 (Aoki N, Muko M, Ohta E, Ohta S. C-geranylated chalcones from the stems of Angelica keiskei with superoxide-scavenging activity. J Nat Prod. 2008 Jul;71(7):1308-10.; Nishimura R, Tabata K, Arakawa M, Ito Y, Kimura Y, Akihisa T, Nagai H, Sakuma A, Kohno H, Suzuki T. Isobavachalcone, a chalcone constituent of Angelica keiskei, induces apoptosis in neuroblastoma. Biol Pharm Bull. 2007 Oct;30(10):1878-83.; Ogawa H, Nakamura R, Baba K. Beneficial effect of laserpitin, a coumarin compound from Angelica keiskei, on lipid metabolism in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2005 Dec;32(12):1104-9.). 하지만 지금까지 상기 문헌의 어디에도 신선초 추출물의 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환 치료효과에 대하여 개시 또는 교시된 바가 없다.

이에 따라, 본 발명자들은 본 발명은 치매 및 건망증 개선에 효능이 탁월한 한약재를 찾고자 연구한 결과, 신선초의 추출물의 아세틸콜린에스테라아제의 억제 활성과 스코폴라민에 의해 유도된 건망증동물군의 학습증진 및 공간지각능력의 회복이 기존 치료제보다 활성이 탁월함을 확인하여 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방에 유용함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 해결하기 위해 본 발명은 신선초 추출물을 유효성분으로 함유하는 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방용 약학조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 신선초 추출물을 유효성분으로 함유하는 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 조추출물, 비극성용매 가용 추출물 및 극성용매 가용 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 조추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는, 물 또는 1-100% 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는, 약 1-70% 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 비극성용매 가용 추출물은 조추출물을 물로 현탁하여 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 등의 비극성용매로 분획한 비극성용매, 바람직하게는 에틸아세테이트에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 극성용매 가용 추출물은 조추출물을 비극성용매로 분획하여 비극성용매 가용 추출물을 제거하고 남은 아세톤, 부탄올, 메탄올 등의 극성용매, 바람직하게는 부탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

상기 퇴행성 뇌질환은 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 또는 헌팅턴 질환, 구체적으로는, 혈관성 치매 및 알츠하이머 치매을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 보다 상세하게 설명한다.

예를 들어, 본 발명의 조추출물은 신선초를 세척 및 건조시킨 후, 시료 중량의 약 1배 내지 30배, 바람직하게는 약 5배 내지 15배 (w/v) 부피의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로, 바람직하게는 물 또는 에탄올, 보다 바람 직하게는 물 또는 5 내지 80% 에탄올을 추출용매로 하여, 약 70 내지 120℃, 바람직하게는 80 내지 110℃의 반응온도에서 약 1 내지 6시간, 바람직하게는 3 내지 5시간 동안 가열추출법, 초음파 추출법, 환류 추출법 등의 통상적인 추출방법, 바람직하게는 초음파추출법으로 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복 추출하는 제 2단계; 상기 단계에서 수득한 추출액을 여과하여 감압 농축하는 제 3단계; 상기 농축된 추출물을 약 -50℃ 내지 -30℃에서 약 24 내지 72시간 동결 건조하는 제 4단계의 제조방법을 포함하는 단계를 통하여 본 발명의 신선초 조추출물을 수득가능하다.

또한 본 발명의 비극성용매 가용 추출물은 추출하는 제조예로서, 본 발명의 비극성용매 가용 추출물은 신선초 조추출물을 약 1 내지 15배 (v/v), 바람직하게는 약 2 내지 5배 부피의 물로 현탁하여 물 현탁물을 제조하는 제 1단계; 상기 현탁물을 약 1 내지 15배 (v/v), 바람직하게는 약 2 내지 5배 부피의 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트 등의 비극성용매로 분획공정을 수행하는 제 2단계 공정을 통하여 본 발명의 비극성용매 가용 추출물을 수득가능하다.

또한 본 발명의 극성용매 가용 추출물은 추출하는 제조예로서, 본 발명의 극성용매 가용 추출물은 신선초 비극성용매 가용 추출물을 제거하고 남은 물 현탁물에 아세톤, 부탄올, 메탄올 등의 극성용매로 추가로 분획공정을 수행하는 제 1 단계; 상기 극성용매가용 추출물을 수집하는 제 2단계 공정을 통하여 본 발명의 극성용매 가용 추출물을 수득가능하다.

또한 본 발명은 상기 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 신선초 추출물 을 유효성분으로 함유하는 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방을 위한 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

상기에서 제조된 신선초 추출물은 아세틸콜린에스테라아제의 억제 활성과 스코폴라민에 의해 유도된 건망증동물군의 학습증진 및 공간지각능력의 회복이 기존 치료제보다 활성이 탁월함을 확인하여 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방에 유용하다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 생약 추출물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진 제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 및 직장, 또는 정맥등의 방법을 통하여 투여 할 수 있다.

또한 본 발명은 신선초 추출물을 유효성분으로 함유하는 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 건강기능식품은 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

따라서, 또한, 본 발명은 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선 효과를 갖는 신선초 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 및 식품첨가제를 제공한다.

본 발명의 추출물을 첨가 가능한 식품형태는 캔디류의 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강보조 식품류인 식품 등을 포함한다.

본 발명의 추출물은 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물의 혼합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 미나리과에 속하는 명일엽 (Angelica keiskei)의 전초인 신선초의 추출물은 아세틸콜린에스테라아제의 저해능을 나타내며, 스코폴라민에 의해 유도된 기억력 감퇴 동물군의 학습증진 및 공간지각능력을 높은 수준으로 향상시키는 탁월한 효능을 나타내므로 건망증 개선 및 퇴행성 뇌질환 치료에 유용한 약학 조성물 또는 건강 기능 식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 하기 참고예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신선초 조추출물의 제조

1-1. 30% 에탄올 추출물(EtOH30)의 제조

경동시장 (Seoul, Korea)에서 건조된 신선초 50 g을 구입하여 완전히 건조시킨 후에 분쇄하여 30% 에탄올 500 mL (10배량(v/v))을 가하여 약 40℃ 반응온도에서 약 2 시간동안 초음파추출으로 3회 추출하여 얻어진 추출물을 여과지로 여과한 후에, 이 여과물을 감압농축기(Eyela, model N-1000, Japan)로 감압 농축하고 이를 약 -40℃ 온도에서 동결건조기(Eyela, model FDU-2000, Japan)로 동결건조하여 한 후 신선초 30% 에탄올 추출물(이하, “EtOH30”으로 명명함) 8.2g을 수득하였다(수득율: 16.4%).

1-2. 70% 에탄올 추출물 (EtOH70)의 제조

추출용매로 70% 에탄올을 사용하는 점만 제외하고 상기 실시예 1-1과 동일한 공정을 수행하여 신선초 70% 에탄올 추출물(이하, “EtOH70”으로 명명함) 6.25g을 수득하였다(수득율: 12.5%).

1-3. 100% 에탄올 추출물 (EtOH100)의 제조

추출용매로 100% 에탄올을 사용하는 점만 제외하고 상기 실시예 1-1과 동일한 공정을 수행하여 신선초 100% 에탄올 추출물(이하, “EtOH100”으로 명명함) 4.84g을 수득하였다(수득율: 9.68%).

1-4. 물 추출물 (H2O)의 제조

추출용매로 열수을 사용하는 점만 제외하고 상기 실시예 1-1과 동일한 공정을 수행하여 신선초 물 추출물(이하, “H2O”으로 명명함) 8.23g을 수득하였다(수득율: 16.46%).

실시예 2. 70% 에탄올 추출물의 용매 분획 추출물의 제조

2-1. 비극성용매가용 추출물의 제조

상기 실시예 1-2 단계에서 수득한 신선초 70% 에탄올 추출물 88.3g을 취하여 1 L의 물에 분산시켜 물 현탁물을 제조한 후에, 상기 물 현탁물에 1 L의 EtOAc를 가하여 3회 분획과정을 수행하여 EtOAc 가용 분획추출물을 얻고 이를 감압농축기(Eyela, model N-1000, Japan)로 감압 농축하여 EtOAc 분획물 (43.5g)을 얻었다(수득률 : 4.9%, 이하, “EtOAc fr.‘이라 함).

2-2. 극성용매가용 추출물의 제조

상기 실시예 2-1 단계에서 에틸아세테이트 분획물을 제거하고 남은 물층을 수합한 후 다시 1 L씩 나누어 1 L n-BuOH로 3회 분획과정을 수행하여 부탄올 가용분획물을 얻고 이를 감압농축기(Eyela, model N-1000, Japan)로 감압 농축하여 n-BuOH 분획물 (108.04g)을 얻었다(수득률 : 12.2%, 이하, “BuOH fr.‘이라 함).

2-3. 물가용 추출물의 제조

상기 실시예 2-2 단계에서 EtOAc 분획물 및 n-BuOH 분획물을 제거하고 남은 물층를 감압농축기(Eyela, model N-1000, Japan)로 감압 농축하여 물 분획물 (656.81g)을 얻었다(수득률 : 74.3%, 이하, “H2O fr.‘이라 함).

참고예 1. 약물 및 시약

스코폴라민 (scopolamin; S1875), 타크린 (tacrine; A3773)은 Sigma-Aldrich Chemistry Co. 에서 구입하여 사용하였으며, 그 외 시약은 시중에서 구입할 수 있 는 최상급을 사용하였다. 신선초는 경동시장 (Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.

참고예 2. 실험동물의 준비

6주령의 ICR 마우스 (26 - 28g)를 (주) 오리엔트 (Seoul, Korea)에서 공급받아 대구한의대학교 한방산업대학의 소독케이지(clean cage)에 약 5일간 적응시켜 사용하였으며, 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였고, 온도 (23 ± 2℃), 습도 (55 ± 10%) 및 명암주기 (12 시간)는 자동으로 조절되도록 하였다.

참고예 3. 통계처리

모든 실험 결과는 one-way ANOVA (one way analysis of variance)를 이용하여 통계 처리하였고, 유의성이 인정될 경우 Student-Newman-Keuls Test를 사용하여 p < 0.05 수준 이하에서 유의성 검정을 실시하였다.

실험예 1. 수동회피실험에서의 기억력 변화 관찰

상기 실시예에서 수득한 신선초 추출물들의 수동회피실험에서의 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. (D.H. Kim, et al., The ameliorating effect of oroxylin A on scopolamine-induced memory impairment in mice, Neurobiol Learn Mem, 87, pp.536-546, 2007)

(1) 실험방법

실시예 1에서 제조한 생약 추출물을 10% 트윈 80(Polyoxyethyl enesorbitan monooleate : Sigma, U.S.A.)에 녹인 후 여러 가지 용량으로 경구로 투여하였다. 양성 대조군은 tacrine 10mg/kg을 투여하고 대조군에는 10% 트윈을 투여하였다.

(1-1) 학습시험

약물투여 30분 후에 증류수에 녹인 스코폴라민을 1mg/kg의 용량으로 복강 투여하고, 스코폴라민 투여 30분 후에 쥐를 조명을 비춘 밝은 쪽 구획에 놓고 20초의 탐색시간 후 길로틴문 (guillotine door)이 열려 어두운 구획으로 들어갈 수 있게 하였다. 이때 길로틴문이 열린 후 40초 이내에 어두운 쪽으로 들어가지 않는 쥐는 실험에서 제외시켰다. 길로틴문이 열린 후 쥐가 어두운 쪽으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였다. 일단 쥐가 어두운 쪽으로 들어가면 길로틴문이 닫히고 0.5mA의 전기 충격이 3초 동안 격자 바닥을 통해 흐르게 되고 쥐는 이러한 전기충격을 기억하게 된다.

(1-2) 실험

학습 시험이 끝나고 24시간 후에 본 실험을 시행하였다. 쥐가 20초의 탐색시간 후 길로틴문이 열리고 어두운 쪽으로 4발이 다 들어가는데 걸리는 시간 (latency time : 머무름 시간)을 300초까지 측정하였다. 걸리는 시간이 길수록 수동회피의 학습과 기억이 좋음을 나타낸다.

(2) 실험 결과

상기 실시예들에서 각각 제조한 신선초 추출물에 대해서 스코폴라민으로 유도된 건망증 동물 모델에 대한 수동회피시험을 실시하였다. 각 그룹은 10마리의 생쥐를 사용하였다. 모든 실험에서 대조군에 비해 스코폴라민만 투여한 그룹의 머무름 시간이 유의성 있게 감소한 것으로 보아 기억력 감퇴 모델이 제작되었음을 알 수 있었다. 추출 방법별 효능 실험에서는 도 1에서 보듯이 스코폴라민만 투여한 그룹의 머무름 시간이 29.4 ± 4.2초인데 반해 EtOH70과 EtOH100에서 각각 78.4 ± 17.7 ( 그룹의 머무름), 107.8 ± 17.7 ( 그룹의 머무름)초로 유의성 있는 증가를 보였다. 이를 바탕으로 EtOH70의 용량의존성 실험을 실시한 결과 도 2에서 스코폴라민만 투여한 그룹의 머무름 시간이 23머6 ± 7.1초인데 반해 10, 20mg/kg 투여군에서 각각 110.8 ± 22.2 (p < 0.05), 86.7 ± 12.4 (p < 0.05)초로 유의성 있는 증가를 보였다.

EtOH70의 용매 분획물 비교실험 결과, 도 3, 4 5에서 스코폴라민만 투여한 그룹의 머무름 시간이 각각 28.6 ± 5.9, 32.3 ± 4.3, 29.8 ± 3.3초로 기억력이 감퇴한데 비해 EtOAc fr.의 4 및 8 mg/kg 투여군에서 머무름 시간이 각각 114.3 ± 25 및 113.5 ± 23.2 (p < 0.005)초로 유의성 있는 증가를 보였다 (도 3). (mean ± S.E.M.)

실험예 2. 아세틸콜린에스테라아제 활성 억제 실험

상기 실시예에서 수득한 신선초 추출물들의 아세틸콜린 에스테라제에 대한 저해활성을 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. (Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr, Feather-stone RM, A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol. 1961;7:88-95.)

(1) 시약

아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase)의 활성을 측정하는 데 사용한 아세틸콜린에스테라아제, 아세틸콜린 요오드화물 (axetylcholine iodide), 5,5-디티오-비스-(2-니트로벤조산), 네오스티그민 브로미드 (neostigmine bromide)는 Sigma-Aldrich Chemistry Co.에서 구입하여 사용하였다.

(2) 실험 방법

아세틸콜린에스테라아제 저해 활성 측정은 Ellman법에 따라 행하였다 (Ellman et al., 1961). 마우스의 뇌를 적출하여 10배 부피의 PBS-A (12.5M sodium phosphate buffer pH 7.0, 400mM NaCl)에 넣고 테플론 글래스 튜브를 이용하여 500rpm에서 갈아서 1000 X g에서 10분간 원심분리한다. 그 상등액에 PBS-A와 Triton X-100을 첨가하고 30분 동안 교반한 다음 10000 X g에서 10분간 원심분리 한 후 상등액을 효소로 사용하였다. 약물을 녹인 용액 1.5ml과 완충액 2.6ml, 75mM acetylthioholine iodide solution 20 ㎕, Ellman's 시약 0.1ml를 모두 섞어서 25 ℃에서 30분간 전배양한 후 여기에 효소용액을 0.4ml 넣고 30초 간격으로 5분 동안 410nm에서 흡광도를 측정하였다.

아세틸콜린에스테라아제 저해능은 하기 수학식 1에 의해 계산되었다.

(3) 실험 결과

상기 실시예에서 각각 제조한 신선초 추출물에 대해서 아세틸콜린에스테라아제 활성 억제 실험을 실시한 결과, EtOH70에서 IC₅₀가 125.4 ㎍/ml로서 매우 우수한 억제 활성을 나타냄을 확인하였다 (표 1 참조).

용량	억제율 (%)
31.25㎍/ml	5.65±0.02
62.50㎍/ml	11.99±0.13
125.00㎍/ml	20.87±0.29
250.00㎍/ml	80.73±2.33
500.00㎍/ml	81.31±5.12
1000.00㎍/ml	80.40±3.21

실험예 3. 단회투여독성시험

마우스를 사용하여 각 신선초 추출물의 단회투여독성 시험을 실시하였다. 단회투여독성 시험 결과, 각 신선초 추출물의 경우 ICH에서 정하고 있는 투여 가능 용량인 2g/kg에서 2주간 사망예를 전혀 관찰할 수 없었으며, 체중 증가, 사료 섭취량 등에서 전혀 유의한 이상을 발견할 수 없었다. 따라서 본 발명의 각 신선초 추출물의 경우는 안전한 약물임을 알 수 있었다.

하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

EtOH70 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

EtOH70 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

EtOAc fr. 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

EtOH70 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

EtOH70 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

EtOH70 1000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

EtOH70 1000 mg

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 수동회피실험에서 스코폴라민으로 유도된 기억력 감퇴 모델에서 신선초의 70% EtOH 추출물의 용량(5, 10, 20, 및 40 mg/kg)에 따른 개선효과를 나타낸 것이며;

도 2는 수동회피실험에서 스코폴라민으로 유도된 기억력 감퇴를 추출 조건별 (물추출, 30%, 70%, 100% EtOH 추출물) 신선초 추출물(10 mg/kg)의 개선효과를 나타낸 것이며;

도 3은 수동회피실험에서 스코폴라민으로 유도된 기억력 감퇴를 신선초의 70% EtOH 추출물의 EtOAC 분획물의 용량(1, 2, 4, 및 8 mg/kg)에 따른 개선효과를 나타낸 것이며;

도 4는 수동회피실험에서 스코폴라민으로 유도된 기억력 감퇴를 신선초의 70% EtOH 추출물의 BuOH 분획물의 용량(1, 2, 4, 및 8 mg/kg)에 따른 개선효과를 나타낸 것이며;

도 5는 수동회피실험에서 스코폴라민으로 유도된 기억력 감퇴를 신선초의 70% EtOH 추출물의 물 분획물의 용량(1, 2, 4, 및 8 mg/kg)에 따른 개선효과를 나타낸 것이다.

Claims (10)

1. 신선초를 세척 및 건조시킨 후, 시료 중량의 5배 내지 15배 (w/v) 부피의 물 또는 5 내지 80% 에탄올을 추출용매로 하여, 80 내지 110℃의 반응온도에서 3 내지 5시간 동안 초음파추출법으로 1 내지 10회 반복 추출하는 제 2단계; 상기 단계에서 수득한 추출액을 여과하여 감압 농축하는 제 3단계; 상기 농축된 추출물을 -50℃ 내지 -30℃에서 24 내지 72시간 동결 건조하여 신선초 조추출물을 수득하는 제 4단계; 상기 신선초 조추출물을 2 내지 5배 부피의 물로 현탁하여 물 현탁물을 제조하는 제 5단계; 상기 현탁물을 2 내지 5배 부피의 에틸아세테이트 용매로 분획공정을 수행하는 제 6단계 공정을 통하여 수득되는 신선초 에틸아세테이트 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환의 치료 및 예방용 약학조성물.
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4. 삭제
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7. 신선초를 세척 및 건조시킨 후, 시료 중량의 5배 내지 15배 (w/v) 부피의 물 또는 5 내지 80% 에탄올을 추출용매로 하여, 80 내지 110℃의 반응온도에서 3 내지 5시간 동안 초음파추출법으로 1 내지 10회 반복 추출하는 제 2단계; 상기 단계에서 수득한 추출액을 여과하여 감압 농축하는 제 3단계; 상기 농축된 추출물을 -50℃ 내지 -30℃에서 24 내지 72시간 동결 건조하여 신선초 조추출물을 수득하는 제 4단계; 상기 신선초 조추출물을 2 내지 5배 부피의 물로 현탁하여 물 현탁물을 제조하는 제 5단계; 상기 현탁물을 2 내지 5배 부피의 에틸아세테이트 용매로 분획공정을 수행하는 제 6단계 공정을 통하여 수득되는 신선초 에틸아세테이트 가용 추출물을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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