KR101184343B1

KR101184343B1 - 피페린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101184343B1
Application number: KR1020090010710A
Authority: KR
Inventors: 황성연
Original assignee: 주식회사한국전통의학연구소
Priority date: 2009-02-10
Filing date: 2009-02-10
Publication date: 2012-09-20
Anticipated expiration: 2029-02-10
Also published as: KR20100091495A

Abstract

본 발명은 피페린의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피페린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 염증 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 피페린의 신규한 용도로서, 피페린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 피페린을 포함하는 조성물은 LPS에 의해서 유발되는 염증반응을 효과적으로 억제하므로 염증성 질환의 예방 및 치료를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

피페린, 염증, 예방, 치료

Description

피페린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물{Composition for preventing and treating inflammatory disease comprising piperine or pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient}

본 발명은 피페린의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피페린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 염증 예방 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

염증 반응은 손상이나 박테리아, 곰팡이, 바이러스 등 외부물질에 의해 자극되어 각종 염증 매개인자 및 면역세포에 의한 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응이 일어나는 것을 말하며, 이로 인해 홍반, 부종, 발열, 통증 등과 같은 증상이 수반된다. 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되는 등 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상, 조직 파괴 등이 일어나고, 암, 염증성 피부질환, 염증성 장질환, 관절염 등의 질환을 초래하기도 한다.

현재까지는 상기와 같은 염증성 질환의 치료를 위해서 주로 항히스타민제, 비타민 연고, 부신피질호르몬제가 사용되어 왔다. 그러나 이러한 약물은 그 효과가 일시적인 경우가 대부분이고 부작용이 심한 경우도 많아 염증성 질환의 치료 효과가 있는 새로운 물질의 개발이 요구되어 왔다.

파이퍼 로굼(검은 후추, Piper longum) 및 파이퍼 니그룸(긴 후추, Piper nigrum)의 주요성분인 피페린은 의학적 용도로서의 긴 역사를 가진 식물성 알칼로이드이며, 구조식은 C₁₇H₁₉NO₃이다. 파이퍼 로굼(Piper longum) 및 파이퍼 니그룸(Piper nigrum)은 주로 임질, 생리통, 결핵, 수면장애, 호흡기 감염, 만성 소화관 관련 통증 등의 치료에 효과적인 치료제로 주로 사용되어왔다. 시험관내(In vitro) 및 체내 (in vivo) 연구들은 피페린을 기능적으로 항우울증제, 간보호제, 항전이제, 항갑상선제, 면역조절제 및 항암제 성분으로 적용해왔다.

이에 본 발명자들은 피페린의 새로운 생리적 활성에 대해서 연구하던 중 피페린이 LPS에 의해서 유발되는 염증반응을 억제하여 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 알아내어 피페린을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 피페린의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피페린을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피페린을 유효성분으로 포함하는 염증 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 피페린(piperine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염(또는 이의 염)을 유효성분으로 포함하며, 염증성 질환 (또는 염증)의 예방 및 치료(또는 개선)의 목적으로 사용될 수 있다.

피페린은 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당 업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다. 천연으로부터의 분리 정제는 피페린을 함유하고 있는 식물체인 장후추(Long Pepper, Piper longum), 후추(Black Pepper, Piper nigrum), 쿠베브(Cubeb, Piper cubeba) 또는 딜(Dill, Anethum graveolens)로부터 당업계에 공지된 용매 추출법 및 크로마토그래피를 이용한 분리방법에 의해 분리, 정제될 수 있다. 예를 들어, 상기 식물로부터의 피페린의 추출은 물, 에탄올, 메탄올, 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol)과 같은 탄소수 1 내지 6개의 알코올, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 헥산, 시클로헥산, 석유에테르(petrolem ether), 디에틸에테르, 벤젠과 같은 유기용매 중에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출할 수 있다. 아울러, 추출물에서 당업계에 공지된 크로마토그래피를 이용한 분리방법, 예를 들면, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피법을 이용하여 극성에 따른 분획물을 얻고 분리된 특정 분획물을 다시 역 상 컬럼 크로마토그래피법 및 고속액체크로마토그래피(HPLC)법을 통하여 분리할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 피페린의 LPS-유도성 반응을 확인하고자, LPS를 투여한 마우스에서의 반응 및 염증반응관련 전달물질을 확인하였다. 그 결과, 피페린의 투여는 LPS-유도성 엔도톡신 쇼크를 억제하고 TNF-α의 생성을 억제하는 반면 인터루킨-1b (IL-1β) 및 인터루킨-6 (IL-6)의 생성을 억제하지는 않았다. 복막 마크로파지에서, 피페린은 TNF-α의 생성을 억제하는 반면 인터루킨-1b (IL-1β) 및 인터루킨-6 (IL-6)의 생성을 억제하지는 않았다. 더욱이, 폴리 (I:C) 및 CpG-ODN-유도성 TNF-α의 생성도 억제되었다. 피페린의 상기와 같은 억제효과는 ERK1/2 및 JNK1/2의 활성 억제에 의해 조절되나, p38 MAPK 및 NF-κB에 의해서는 조절되지 않았다. 엔도톡신 쇼크의 억제에서 환원된 TNF-α의 역할을 알아보고자, TNF-α 넉아웃(knockout) 생쥐를 사용한 결과, 피페린은 TNF-α 넉아웃 생쥐에서 LPS-유도성 엔도톡신 쇼크를 억제하였다. 아울러, LPS-유도성 엔도톡신 쇼크의 억제기작을 명확히 하고자, 1형 인터페론(type I IFN)의 mRNA 발현을 조사하였다. 그 결과, 피페린은 인터페론 조절인자-1 및 7 (interferon regulatory factor (IRF-1 및 IRF-7)의 수준을 감소시켜 1형 인터페론(type I IFN)의 LPS-유도성 발현을 억제하였다. 또한, 피페린을 이용한 전처리는 IRF-3의 인산화 및 핵내 전좌(translocation)를 억제하였다. 상기 결과들을 통해 피페린이 TNF-α 및 1형 인터페론의 LPS-유도성 생성을 억제하고, 이것이 아마도 LPS에 의해 유도되는 염증반응을 억제함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 피페린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 피페린은 그 자체 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탄산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 화합물이 적용될 수 있는 염증성 질환은, 이에 제한되지는 않으나, 염증성 피부질환, 크론씨 질환(Crohn's desease) 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지 염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(charco and joint), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 다장기 기능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마치스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 등을 포함한다.

아울러, 상기 염증성 피부질환은 이에 한정되지는 않으나, 피부 염증, 급?만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 건선, 건선관절염, 일광 피부염, 일광화상 및 여드름 등을 포함한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 피페린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 ‘경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 피페린의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 피페린의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 피페린의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야 의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 피페린을 염증성 질환의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

아울러, 본 발명에 따른 피페린은 염증을 예방 및 개선하기 위한 목적으로 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 피페린 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 피페린과 염증의 예방 및 개선효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카 로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 피페린을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 피페린을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

참고로, 본 발명에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).

아울러, 본 발명의 도면은 다음 설명을 참조할 수 있다.

도 1은 LPS-유도성 엔도톡신 쇼크에 있어서의 피페린의 효과를 나타낸다. 엔도톡신 쇼크는 실시예에서 언급된대로 6-8주령 C57BL/6 암컷 생쥐에 유도하였다. (A) 엔도톡신 쇼크 생쥐(그룹당 10마리)의 생존률에 있어서의 피페린의 효과는 120시간동안의 생존을 관찰하여 확인하였다. 체내에서의 LPS-유도성 TNF-α, 인터루킨 -1β 및 인터루킨-6 생산에 있어서의 피페린의 효과를 확인하기 위해, 피페린을 생쥐(그룹당 6마리)에 1 또는 5mg/kg씩 복강주사하였다. 혈청시료는 TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6 탐지를 위하여 37.5mg/kg의 LPS를 투여한 후 3시간 경과한 다음 생쥐에서 채취하였다. 복강 마크로파지는 500ng/ml의 LPS로 24시간동안 자극하기 전에 1, 5, 또는 10uM의 피페린으로 30분동안 전처리하였다. 배양 상층액은 TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6 탐지를 위하여 수획되었다. NO, TNF-α 및 인터루킨-6의 양은 실시예에서 기술한 바와 같이 측정되었다. LPS-의존적 TNF-α 전사의 역동학은 실시간 역전사 효소중합 반응을 통하여 조사하였다. TNF-α 및 인터루킨-6 mRNA의 LPS-유도성 발현에 있어서의 피페린의 효과를 조사하기 위하여, 세포들을 500ng/ml의 LPS로 도면에 표시된 시간대에 자극하기 전에 10uM의 피페린에 30분간 전처리하였다(도 1d 및 e). *,P<0.05 vs. DMSO 처리군; †, P<0.05 vs. LPS 단독 처리군. 데이터는 2회 개별적으로 반복수행된 실험의 평균± SEM 값이다.

도 2는 복강 마크로파지에서 친염증성 사이토카인 생산에 있어서의 피페린의 효과를 나타낸다. 세포들을 (A) poly(I:C)(50ug/ml) 또는 (C) CpG-ODN(10ug/ml)로 24시간동안 자극하기 전에 1, 5, 또는 10uM의 피페린으로 30분동안 전처리하였다. 배양 상층액은 TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6 탐지를 위하여 수획되었다. CpG-ODN-의존적 TNF-α 전사의 역동학은 실시간 역전사 효소중합 반응을 통하여 조사하였다. TNF-α 및 인터루킨-6 mRNA의 LPS-유도성 발현에 있어서의 피페린의 효과를 조사하기 위하여, 세포들을 poly(I:C) 또는 CpG-ODN으로 도면에 표시된 시간 대에 자극하기 전에 10uM의 피페린에 30분간 전처리하였다. *,P<0.05 vs. DMSO 처리군; †, P<0.05 vs. LPS 단독 처리군. 데이터는 3회 개별적으로 반복수행된 실험의 평균± SEM 값이다.

도 3은 피페린이 ERK 및 JNK 인산화를 억제하지만, p38 인산화는 억제하지 않으며, Iκ-Bα 쇠퇴는 억제하지 않음을 나타낸다. ERK, p38, JNK 활성화 및 Iκ-Bα 쇠퇴를 억제함에 있어서 피페린의 효과를 알아보고자(A 및 B), 세포들을 LPS, poly(I:C) 및 CpG-ODN로 도면에 표시된 시간대에 자극하기 전에 10uM의 피페린으로 30분동안 전처리하였다. 각 세포 용해액에서 20ug의 단백질을 10% SDS-PAGE에 분리시켰다. ERK(PD98059) 및 JNK(SP60025)의 억제제를 사용하여 TNF-α생산에서 ERK 및 JNK의 기능을 확인하고자, 세포들을 500ng/ml의 LPS로 24시간동안 자극하기 전에 10uM의 PD98059 및/또는 SP60025에 30분간 전처리하였다. 배양 상층액은 (C)TNF-α 탐지를 위하여 수획되었다. *,P<0.05 vs. DMSO 처리군; †, P<0.05 vs. LPS 단독 처리군. 데이터는 2회 개별적으로 반복수행된 실험의 평균± SEM 값이다.

도 4는 TNF-α 넉아웃 생쥐의 LPS-유도성 엔도톡신 쇼크에 있어서의 피페린의 효과를 나타낸다. 엔도톡신 쇼크는 6-8주령 TNF-α 넉아웃 생쥐에 박테리아 엔도톡신(대장균 혈청형 O55:B5에서 유래한 LPS로서 37.5mg/kg)을 복강주사하여 유도하였다. 3 군의 생쥐(각 군당 10마리)에 DMSO(대조군) 및 피페린(1 또는 5mg/kg)을 투여하였다. 3시간 경과후 37.5mg의 LPS를 투하여고, 120시간동안의 생존률을 조사 하였다.

도 5는 복강 마크로파지에서 LPS-유도성 제1형 IFN 생산에 있어서의 피페린의 효과를 나타낸다. LPS-유도성 제1형 IFN(A) 및 IRF mRNA(B) 발현에 있어서 피페린의 효과를 확인하고자, 세포들을 500ng/ml의 LPS로 도면에 표시된 시간대에 자극하기 전에 10uM의 피페린에 30분간 전처리하였다. IRF-3의 인산화(C)도 또한 조사되었다. 우선 세포들을 10uM의 피페린으로 30분간 전처리하고, 500ng/ml의 LPS 또는 LPS 단독으로 도면에 표시된 시간대에 자극하였다. 각 세포 용해액에서 20ug의 단백질을 10% SDS-PAGE에 분리시켰다. IRF-3 활성화를 조사하기 위하여 웨스턴 블랏을 실시하였다. 세포들을 10uM의 피페린으로 30분간 전처리하고, 500ng/ml의 LPS 또는 LPS 단독으로 30분간 자극하였다. *,P<0.05 vs. DMSO 처리군; †, P<0.05 vs. LPS 단독 처리군. 유사한 결과값이 개별적인 3회의 실험에서 얻어졌다.

도 6은 복강 마크로파지에서 제1형 IFN 유도에 있어서의 피페린의 효과를 나타낸다. (A)poly(I:C) 또는 CpG-ODN-유도성(A) 제1형 IFN (B)IRF-1 및 IRF-7 mRNA 발현에 있어서 피페린의 효과를 조사하고자, 세포들을 10uM의 피페린의 존재 또는 부재하에서 30분간 전처리하고, poly(I:C) 또는 CpG-ODN와 배양하였다. *,P<0.05 vs. DMSO 처리군; †, P<0.05 vs. LPS 단독 처리군. 데이터는 3회 개별적으로 반복수행된 실험의 평균± SEM 값이다.

따라서, 본 발명은 피페린의 신규한 용도로서, 피페린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 피페린을 포함하는 조성물은 LPS에 의해서 유발되는 염증반응을 효과적으로 억제하므로 염증성 질환의 예방 및 치료를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험방법>

1. 시약

RPMI-1640, 우혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 페니실린 및 스트렙토마이신은 Gibco BRL 사 (그랜드 아일랜드, 뉴욕)로부터 얻었다. 인터루킨-1β, 인터루킨-6 및 TNF-α 탐지를 위한 엘라이자(Enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA)키트는 R&D System (미네아폴리스, 미네소타)에서 구매하였다. 대장균055:B5의 LPS, 피페린, poly (I:C), CpG-ODN (5’-TCCATGACGTTCCTGAATGCT-3’; 서열번호 1) 및 그리스 시약(Griess reagent)은 시그마-알드리치사(세인트루이스, 미주리)에서 구입 하였다. 티오글리콜레이트(Thioglycollate, TG)는 BD Pharmingen (샌디에고, 캘리포니아)에서 구입하였다. MAPK, IRF-1 및 IRF-3dp 대한 전체 항체와 인산특이적 항체는 Cell Signaling Technology (비벌리, 마이애미)에서, IRF-3는 Zymed (샌프란시스코, 캘리포니아)에서 구입하였다. IκB-α 단클론 항체 및 페록시데이즈-콘주게이트 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (산타크루즈, 캘리포니아)에서 구입하였다. 전염색된 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 마커들은 Bio-Rad (허큘스, 캘리포니아)에서 구입하였다. 트리졸 시약, MML-V(Moloney murine leukemia virus) 역전사효소 및 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트는 Invitrogen coorporation (칼스베트, 캘리포니아)에서 구입하였다. iNOS(Inducible nitric oxide synthase), 인터루킨-6, TNF-α, 인터루킨-1β 및 β-엑틴 올리고뉴클레오타이드 프라이머들은 Genotech (대전, 대한민국)에서 구입하였다.. TNF-α 넉아웃(B6; 129S6-TnftmlGkl/J) 및 대조군 생쥐들은 Jackson Laboratory (바 하버, 메인)에서 구입하였다. C57BL/6 생쥐는 오리엔트 바이오사 (성남 경기도, 대한민국)에서 구입하였다.

2. 엔도톡신 쇼크의 동물모델

엔도톡신 쇼크는 6-8주령의 암컷 C57BL/6 생쥐에 박테리아 엔도톡신(대장균055:B5의 LPS를 37.5 mg/kg로)을 복강주사(ip)하여 유도하였다. 3그룹의 생쥐(그룹당 10마리)에 DMSO(대조군) 또는 피페린(1 mg/kg 또는 5 mg/kg)을 복강주사하였다. 피페린 투여 1시간 경과후, 대조군 또는 피페린 투여 생쥐에 37.5 mg/kg의 LPS를 복강주사하였다. 생존도는 120시간동안 관찰되었다. 동물 사용 및 실험과정은 실험동물의 유지 및 사용에 대한 식약청 지침서에 따라 수행되었으며 실험은 원광대학교 동물보호위원회의 승인을 받았다.

3. 혈액시료의 체내 채취

생쥐에 피페린(1 또는 5 mg/kg 체중)을 복강 투여하고(그룹당 6마리), 3시간후 37.5 mg/kg의 LPS를 투여한 후, 혈청샘플을 채취하고 사용전까지 -70℃에서 보관하였다.

4. 복강내 마크로파지 배양

TG-유도성 마크로파지를 2.5 ml의 TG를 복강주사하고 4일경과 후 수집하였다. 복강세척은 10 U/ml의 헤파린이 첨가된 헹스 벨런스드 염용액 8 ml을 사용하여 수행하였다. 세포들은 10% 비동화된 우혈청이 포함된 RPMI 배지에 분주되어 12-웰 조직배양 플레이트(웰당 1x10⁶ 세포)로 옮겨졌다. 3시간동안 배양한 후, 부착되지 않은 세포들은 제거되고 부착된 세포들은 피페린의 존재 또는 부재하에서 LPS, poly (I:C) 또는 CpG-ODN로 처리되었다.

5. 아질산염 농도

복강 마크로파지(웰당 1x10⁶ 세포)를 다양한 농도의 피페린으로 30분간 처리 한 후, 24시간동안 500 ng/ml의 LPS로 자극하였다. 상기 배양후 콘디션드 배지(conditioned media)에서 100μl를 제거하고 동량의 그리스 시약 (1% sulfanilamidey/0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H₃PO₄)을 넣고 실온에서 10분간 배양하고, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아질산염은 염화 아질산염을 기준으로 측정되었다. 상기 값은 각 실험에서 측정되어 복강 마크로파지의 배지로부터 얻은 값으로 산출되었다.

6. 웨스턴 블랏

복강 마크로파지(웰당 1x10⁶ 세포)을 500 ng/ml의 LPS로 자극하였다. 핵 추출물은 세포질 및 핵 추출물 키트(promega, 메디슨, 와이오밍)을 사용하여 추출되었다. 총 세포 용해물은 복강 마크로파지를 시료 완충액(62.5 mM TrisHCl, pH 6.8, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 20% 글리세롤 및 10% 2-머켑토에탄올)에 넣고 끓여서 얻었다. 세포 용해물 내의 단백질은 10% SDS-PAGE로 분리하고 나이트로셀룰로즈 막으로 이동시켰다. 상기 막은 이후 실온에서 PBS-Tween-20(PBST)이 첨가된 5%의 탈지분유에 1시간동안 배양하여 반응을 정지시킨 후, 인산화된 ERK1/2, 인산화된 p38. 인산화된 JNK, IRF-3 및 Iκ-Bα에 대한 항체와 함께 배양하였다. PBST로 3회 세척한 후, 각 블롯을 1시간동안 2차 항체와 함께 배양하고, 항체-특이성 단백질은 제조자의 제시된 사용법에 따라 촉진 화학발광 표지 시스템(Amercham, 피스카타웨이,뉴저지)을 이용하여 가시화하였다.

7. ELISA

생쥐 복강 마크로파지를 500 ng/ml의 LPS, 50ug/ml poly(I:C) 또는 CpG-ODN로, 그리고/또는 다양한 농도의 피페린 존재하에서 24시간 동안 자극하였다. 배양 상층액을 수집하여 사용전까지 -70℃에서 보관하였다. 상층액의 사이토카인 수준은 상용 시스템(R&D System, 미네아폴리스, 미네조타)을 제조자의 지시에 따라 사용하여 조사하였다. ELISA는 TNF-α 및 인터루킨-6에 특이적인 단클론항체가 코팅된 96웰 플레이트에 고안되었다. 코팅된 플레이트는 0.05% Tween-20이 함유된 인산완충용액으로 세척하였다. 본 실험에 사용된 모든 시약은 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 사용하였다. 재조합 TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6을 희석하여 표준용액으로 사용하였다. 단계적 희석은 10ng/ml로부터 시작하여 표준곡선을 작성하였다. 실험 플레이트는 순차적으로 비오틴부착(biotinylated) 마우스 TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6 아비딘 페록시데이즈 및 30% 과산화 수소수가 함유된 ABTS(2,2'-azino-bis-[3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) 기질용액에 노출시켰다.

8. RNA 정량

정량적 실시간 역전사효소 중합반응(quantitative real-time RT-PCR)을 위하여 총 RNA를 SV Total RNA Isolation System(Promega)를 이용하여 얻었다. RNA 분리과정은 DNase I 처리를 포함시켰다. 본 발명자들은 RNA를 정량하였고 20μl 역전 사 반응당 2 μg의 총 RNA에 올리고 (dT)128 프라이머 및 역전사효소 중합반응을 위한 SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen, 칼스베트, 캘리포니아)을 사용하여 cDNA를 제조하였다. 역전사효소 중합반응은 25μl의 용액 내에서 진행되었는데, 상기 용액은 67.7 mM TrisHCl (pH 8.8); 16.6 mM (NH₄)₂SO₄ 0.01% Tween-20; dATP, dCTP, dGTP 각각 200 nM 그리고 400 nM dUTP; 4.5 mM MgCl₂; 각 프라미어 300 nM; 프로브 200 nM; 2 U Taq DNA 중합효소를 포함하며, cDNA 합성반응의 1/10 부피로 진행되었다. 반응 싸이클은 95℃에서 4분간 진행한 후, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분을 40회 반복하는 싸이클로 구성되었다. DNA 중합효소의 5‘-엑소뉴클레이즈 활성 때문에 생기는 프로브의 수화로 인한 형광은 ABI PRISM 770 Sequence Detection System(Applied Biosystems, 포스터 시티, 캘리포니아)를 이용하여 측정되었다. 임계 싸이클 값은 sequence detection SDS 1.7 소프트웨어(Applied Biosystems)을 사용하여 계산되었고, 리포터 시그널을 표준화하였다. 각 시료는 표준분포가 0.5(Ct < 33)를 넘지않는 Ct값으로 2배(Ct < 32)또는 3배(Ct > 32) 증폭되었다. Ct 값은 표준곡선에 의해 정량값으로 전환되었다. 따라서 cDNA 표준치는 실험시료에서 동일한 조건 하에서 준비되었다. 이는 실험시료에서 예상되는 타겟 mRNA의 양을 포함한 Ct 값의 범위를 단계적으로 희석하였고, 관심대상 유전자 및 내재적 조절을 분석하게 하였다. Ct 결과값은 최초 RNA 양의 로그값에 대하여 1차 함수(y=mx+b)를 생성하기 위해 사용되었다. RNA의 실험양은 표준곡선(상관계수 R2>0.990)으로부터 계산되었다. mRNA의 양은 관심대상 유전자의 전사 에서 n배씩 변화를 주었는데, 내재적 대조군 및 LPS 자극 전 야생형 발현에 대해 보정된 RNA 량의 표준화에 의해 조사되었다. 동시에, mRNA 전사의 진폭(동적 범위)는 각각의 유전형의 기초 mRNA 발현으로 보정하였다. IFN-α4의 경우, 자극하지 않은 시료에서는 기저 발현을 하지 않았다. 따라서, 야생형 세포에 있어서 전사반응을 보이는 제1차 시기는 보정기의 임의의 지점을 적용하였다.

9. 프라이머 및 프로브

순방향(forward; f) 및 역방향(reverse; r) 프라이머 (invitrogen), TaqMan 프로브 (MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany) 및 TaqMan minor groove binder (MGB) probe (Applied Biosystems)는 Primer Express 1.5 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 고안되었다. 실시간 중합효소반응 (Real-time PCR)은 하기의 프라이머들을 사용하여 수행하였다: TTGCTCGAGATGTCATGAAGGA (mHPRT-f, 서열번호 2); TGAGAGATCATCTCCACCAATAACT (mHPRT-r, 서열번호 3); CCGAAGACCTTATGAAGCTCTTTG (mIRF-1-f, 서열번호 4); GCAAGTATCCCTTGCCATCG (mIRF-1-r, 서열번호 5); CTGGAGCCATGGGTATGCA (mIRF-7-f, 서열번호 6); AAGCACAAGCCGAGACTGCT (mIRF-7-r, 서열번호 7); CCTGTGTGATGCAGGAACC (mIFN-α4-f, 서열번호 8); TCACCTCCCAGGCACTGA (mIFN-α4-r, 서열번호 9); ATGAGTGGTGGTTGCAGGC (mIFN-β-f, 서열번호 10); TGACCTTTCAAATGCAGTAGATTCA (mIFN-β-r, 서열번호 11); TCTCTTCAAGGGACAAGGCTG (mTNF-α-f, 서열번호 12); 및 ATAGCAAATCGGCTGACGGT (mTNF-α-r, 서열번호 13). TaqMan 프로브들은 5′말단에 리포터 염료인 (reporter dye) 6-carboxyfluorescein (FAM)를, 그리고 3′말단에 진정 염료인 (quencher dye) 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)가 표지된 올리고뉴클레오타이드로 구성되어 있다. TaqMan MGB probe 포맷에서, 비형광성 진정제 (a nonfluorescent quencher; NFQ)는 스펙트럼 효과를 증진시키기 위해 도입되었다. 프로브 서열은 FAM-TGGGAGGCCATCACATTGTGGC-TA MRA (mHPRT, 서열번호 14); FAM-CAGTCTGAGTGGCAGCGGACACACA-TAMRA (mIRF-1, 서열번호 15); FAM-CTGGAGGGCGTGCAGCGTGA-TAMRA (mIRF-7, 서열번호 16); FAM-AGACTCCCTGCTGGCTGTGAGGACA-MGB-NFQ (mIFN-α4, 서열번호 17); FAM-AAGCATCAGAGGCGGACTCTGGGA-TAMRA (mIFN-β, 서열번호 18); 및 FAM-CCCGACTACGTGCTCCTCACCCA-TAMRA (mTNF-α, 서열번호 19) 이었다.

10. 면역염색

복강 마크로파지 세포를 챔버 슬라이트에 분주하고 500ng/ml의 LPS와 함께 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 4% 파라포름알데하이드로 48 ℃에서 30분간 고정한 후, 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 상기 세포를 0.1% TritonX-100으로 실온에서 15분간 처리하였다. 세척후, 세포를 정지 혈청과 1시간동안 반응시키고, 1:100으로 희석한 IRF3 1차 항체(Zymed, 51-3200, invitrogen, 칼스배드, 캘리포니아 92008, 미국)와 함께 하룻밤 배양한다. 세포를 세척하고 1:50으로 희석한 Alexafluor568 염소 항-토끼 IgG(invitrogen, 미국)와 함께 4시간동안 어두운 곳에서 배양하였다. 핵 염색을 위하여, 세포를 1:1000으로 희석한 DAPI와 함께 30 분간 배양하였다. IRF 항체 염색은 붉은 형광을 띄고, 이는 형광 현미경으로 관찰될 수 있다.

11. 통계학적 분석

상기의 실험들은 최소 3회 이상의 실험들에서 나온 결과값들의 요약이며 평균 ± S.E.M.으로 나타내었다. 결과값들의 통계학적 편가는 스튜던트 t-test에 의해 수행되었으며, 유효치는 0.05의 p값에 준하였다.

<실험결과>

1. LPS-유도성 엔도톡신 쇼크 및 염증반응에 있어서 피페린의 영향

LPS-유도성 엔도톡신 쇼크에 있어서 피페린의 효과를 조사하고자, 본 발명자들은 DMSO 대조군 및 피페린 처리군을 대상으로 이들의 감수성을 비교하였다. 37.5mg/kg의 LPS 주사는 생쥐에게 치명적이며, 사망은 일반적으로 2일 이내에 나타났다(도 1A). LPS 도입 이전의 피페린 전처리 (1 또는 5mg/kg 체중)는 각각 60% 와 80%의 생존률 향상을 보여주었다(도 1A). TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6와 같은 친-염증성 사이토카인들은 다양한 염증반응의 발생을 중계한다(Dinarello, CA. 2000. Proinflammatory cytokines. Chest. 118:503-8). LPS는 TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6를 포함하는 사이토카인의 몇몇 종을 유도한다(Dinarello, CA. 2000. Proinflammatory cytokines. Chest. 118:503-8). TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6의 LPS-유도성 생산에 있어서 피페린의 효과를 검증하기 위하여 본 발명자들은 상기 사이토카인의 생산에 있어서 피페린의 효과를 검사하였다. 피페린 (1 또는 5mg/kg 체중)을 생쥐(그룹당 6마리)에 복강주사하고, 37.5mg/kg의 LPS를 주사한지 3시간후에 혈청 시료를 채쥐하였다. 치사 곡선과 일관하게 LPS의 주사는 혈청내 TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6의 수준을 높게 유도하였다. 그러나 피페린 전처리는 LPS-유도성 TNF-α 생산을 억제하였으나, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6에 대해서는 그렇지 못하였다(도 1B). LPS 반응동안 마크로파지 활성의 조절이상은 생쥐에서 엔도톡신 쇼크를 초래하였다(Kinjyo, I., Hanada, T., Inagaki-Ohara, K., Mori, H., Aki, D., Ohishi, M., Yoshida, H., Kubo, M., and Yoshimura, A. 2002. SOCS1/JAB is a negative regulator of LPS-induced macrophage activation. Immunity. 17(5):583-591). 복강 마크로파지에 있어서, 본 발명자들은 TNF-α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6를 포함하는 면역 중계자들을 조사하였다. 세포들을 1, 5, 또는 10 μM의 피페린으로 30분간 전처리한 후 500ng/ml의 LPS로 24시간동안 자극하였다. 체내 실험 결과에 따라, 피페린은 용량-의존적으로 TNF-α의 생산을 억제하였으나, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6에 대해서는 그렇지 못하였다(도 1C). LPS-의존성 TNF-α 전사의 동역학(kinetics)에 있어서, 본 발명자들은 실시간 역전사효소 중합반응을 실시하였고, 사이토카인 수준과 유의하게, 표시된 시간동안 피페린이 TNF-α mRNA의 LPS-유도성 발현을 억제함을 관찰하였다(도 1D). LPS는 MyD88-의존적 또는 MyD88-비의존적인 신호전달 기작을 활성화한다. 따라서, 본 발명자들은 poly(I:C)(MyD88-의존적 반응을 위하여) 및 CpG-ODN(MyD88-비의존적 반응을 위하여)을 사용하여 TNF-α 생산에 있어서 피페린의 이러한 억제효과를 조사하 였다. 피페린은 또한 poly(I:C) 및 CpG-ODN- 유도성 TNF-α 생산 모두를 억제하였으나, 인터루킨-1β 및 인터루킨-6에 대해서는 그렇지 못하였다(도 2A 및 2C). 이들 수준과 유의하게 TNF-α mRNA의 수준도 또한 표시된 시간동안 억제되었다(도 2B 및 2D).

2. 복강 마크로파지에서 ERK1/2 및 JNK1/2의 LPS-유도성 활성에 있어서의 피페린의 영향

p38 MAPK, ERK1/2, JNK1/2 및 전사인자 NF-κB 신호전달 기작은 마크로파지가 LPS에 의해 활성화되었을때 친-염증성 사이토카인 생산에 관여한다(Schorey, JS., and Cooper, AM. 2003. Macrophage signalling upon mycobacterial infection: the MAP kinases lead the way. Cell Microbiol. 5(3):133-142). 따라서, 본 발명자들은 이후, 상기 신호전달 기작의 억제를 통하여 발생될 수 있는 TNF-α생산에 있어서의 피페린의 억제효과를 조사하였다. LPS에 의해 자극되었을 때, 복강 마크로파지에서 poly(I:C), 또는 CpG-ODN, p38 MAPK, ERK1/2 및 JNK1/2는 강하게 활성화 되었고, Iκ-Bα는 감퇴함을 보였다(도 3A 및 B). 10μM의 피페린 전처리는 ERK1/2와 JNK1/2의 인산화를 억제하였지만, p38 MAPK의 경우에는 그러하지 못하였다(도 3A). 그러나, 피페린은 Iκ-Bα의 LPS-유도성 감퇴를 약간 억제하였다 (도 3B). 더욱이, 약학적 억제제에 의한 ERK1/2 및 JNK1/2의 봉쇄는 LPS-유도성 TNF-α 생산을 막았다.

3. TNF-α 넉아웃 생쥐의 LPS-유도성 엔도톡신 쇼크에 있어서 피페린의 영향

TNF는 LPS의 체내 독성에서 결정적인 효과를 보인다(Ito,H., Koide, N., Hassan, F., Islam, S., Tumurkhuu, G., Mori, I., Yoshida, T., Kakumu, S., Moriwaki, H., and Yokochi, T. 2006. Lethal endotoxic shock using alpha-galactosylceramide sensitization as a new experimental model of septic shock. Lab Invest. 86(3):254-61). 도 1 및 2에서 보여지는 바와 같이, 피페린은 혈청 및 복강 마크로파지에서 LPS-유도성 엔도톡신 쇼크 및 TNF-α 생산을 부분적으로 억제하였다. 상기 LPS-유도성 엔도톡신 쇼크에 있어서 피페린의 억제효과가 TNF-α에 의존적인지를 알아보고자, TNF-α 넉아웃 생쥐를 사용하였다. 생존률은 피페린(1 또는 5mg/kg 체중)을 투여하였을때 증가되었다(도 4).

4. 복강 마크로파지에서 1형 IFN의 LPS-유도성 생산에 있어서의 피페린의 영향

제1형 IFN은 LPS-유도성 치사에 기본적인 작동자이다(Karaghiosoff, M., Steinborn, R., Kovarik, P., Kriegsh, G., Baccarini, M., Donabauer, B., Reichart, U., Kolbe, T., Bogdan, C., Leanderson, T., Levy, D., Decker, T., and M, M. 2003. Central role for type I interferons and Tyk2 in lipopolysaccharide-induced endotoxin shock. Nat Immunol. 4(5):471-477). 따라서, 본 발명자들은 실시간 역전자 중합효소 반응을 통하여 제1형 IFN 및 IRF의 mRNA 발현에 있어서 피페린의 효과를 조사하였다. 공지의 결과들과 일치하 여(Karaghiosoff, M., Steinborn, R., Kovarik, P., Kriegsh, G., Baccarini, M., Donabauer, B., Reichart, U., Kolbe, T., Bogdan, C., Leanderson, T., Levy, D., Decker, T., and M, M. 2003. Central role for type I interferons and Tyk2 in lipopolysaccharide-induced endotoxin shock. Nat Immunol. 4(5):471-477), IFN-α4 및 IFN-β발현은 LPS-자극된 마크로파지에서 감소되었다. 피페린은 IFN-α4 및 IFN-β의 LPS-유도성 발현을 억제하였다(도 5A). 더욱이, 본 발명자들은 또한 피페린 전처리시 IRF의 mRNA 발현 유도를 정량화하였다. 피페린은 IRF-1 및 IRF-7 mRNA의 LPS-유도성 발현을 억제하였고 또한 LRF-3의 인산화 및 IRF-3의 핵내로의 이동(nuclear translocation)를 억제하였다(도 5B, 5C 및 5D). 게다가, 본 발명자들은 1형 IFN의 poly(I:C) 및 CpG-ODN-유도성 생산에 있어서 피페린의 영향을 조사하였다. 제1형 IFN의 생산 및 IRF-1 및 IRF-7의 생산은 피페린에 의해 억제되었다(도 6A 및 B).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 피페린의 신규한 용도로서, 피페린 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 피페린을 포함하는 조성물은 LPS에 의해서 유발되는 염증반응을 효과적으로 억제하므로 염증성 질환의 예방 및 치료를 위하여 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 LPS-유도성 엔도톡신 쇼크에 있어서의 피페린의 효과를 나타낸다.

도 2는 복강 마크로파지에서 친염증성 사이토카인 생산에 있어서의 피페린의 효과를 나타낸다.

도 3은 피페린이 ERK 및 JNK 인산화를 억제하지만, p38 인산화는 억제하지 않으며, Iκ-Bα 쇠퇴는 약하게 억제하였다.

도 4는 TNF-α 넉아웃 생쥐의 LPS-유도성 엔도톡신 쇼크에 있어서의 피페린의 효과를 나타낸다.

도 5는 복강 마크로파지에서 LPS-유도성 제1형 IFN 생산에 있어서의 피페린의 효과를 나타낸다.

도 6은 복강 마크로파지에서 제1형 IFN 유도에 있어서의 피페린의 효과를 나타낸다.

<110> Khan Medical Science Institute <120> Composition for preventing and treating inflammatory disease comprising piperine or pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient <130> NP08-0141 <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG-ODN <400> 1 tccatgacgt tcctgaatgc t 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mHPRT-f <400> 2 ttgctcgaga tgtcatgaag ga 22 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mHPRT-r <400> 3 tgagagatca tctccaccaa taact 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIRF-1-f <400> 4 ccgaagacct tatgaagctc tttg 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIRF-1-r <400> 5 gcaagtatcc cttgccatcg 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIRF-7-f <400> 6 ctggagccat gggtatgca 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIRF-7-r <400> 7 aagcacaagc cgagactgct 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIFN-alpha4-f <400> 8 cctgtgtgat gcaggaacc 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIFN-alpha4-r <400> 9 tcacctccca ggcactga 18 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIFN-beta-f <400> 10 atgagtggtg gttgcaggc 19 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIFN-beta-r <400> 11 tgacctttca aatgcagtag attca 25 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTNF-alpha-f <400> 12 tctcttcaag ggacaaggct g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTNF-alpha-r <400> 13 atagcaaatc ggctgacggt 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mHPRT <400> 14 tgggaggcca tcacattgtg gc 22 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIRF-1 <400> 15 cagtctgagt ggcagcggac acaca 25 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIRF-7 <400> 16 ctggagggcg tgcagcgtga 20 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIFN-alpha4 <400> 17 agactccctg ctggctgtga ggaca 25 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mIFN-beta <400> 18 aagcatcaga ggcggactct ggga 24 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTNF-alpha <400> 19 cccgactacg tgctcctcac cca 23

Claims

하기 화학식 I로 표시되는 피페린(piperine) 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하며, TNF-α, 제 1형 INF, IRF-1 및 IRF-7의 생산을 저해함으로써 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 박탈 피부염 및 일광 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 염증성 피부질환, 골수염 및 췌장염으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환을 예방 또는 개선하는 것을 특징으로 하는 식품조성물.

<화학식 1>
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