KR101179308B1 - 달맞이꽃 종자유 비누화물 함유 피부 미백 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 달맞이꽃 종자유 비누화물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 조성물을 제공한다.

본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물은 멜라닌 색소 생성에 필수적으로 관여하는 타이로시나아제 유전자와 멜라닌 색소 형성에 관련된 Trp1, Trp2, 및 MITF 유전자의 발현을 억제하여 뛰어난 색소 침착 저해 효과를 나타내므로 피부 미백에 유용하게 사용될 수 있다.

달맞이꽃 종자유, 비누화, 비누화물, 멜라닌, 미백, 타이로시나아제, 색소 침착

Description

달맞이꽃 종자유 비누화물 함유 피부 미백 조성물{Composition for skin-whitener containing saponified evening primrose seed oil as an effective ingredient}

본 발명은 피부 미백 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피부 세포에서 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 미백 조성물에 관한 것이다.

멜라닌 색소는 자외선을 흡수하여 자외선에 의한 손상으로부터 피부 기관을 보호하는 역할을 수행하며, 피부 내에 발생하는 유해산소나 라디칼(free radical)등의 유해 물질을 제거하는 역할을 수행하여 피부를 보호해주는 역할을 한다.

이와 같은 멜라닌 색소의 유용한 역할에도 불구하고, 멜라닌 색소가 자외선, 호르몬 변화, 염증, 또는 약제 등 여러 가지 환경적 요인에 의해 과도하게 합성되어 피부에 침착하면, 피부 색소 침착 질환을 일으켜 피부 미용에 악영향을 미치고, 더 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다.

이러한 멜라닌 색소에 의해 유발되는 피부 색소 침착 질환은 현대인의 미의 기준인 미백을 해치는 요소로 인식되어, 건강은 물론이고, 미용적인 측면에서 다양한 해결 방법이 연구되고 있다.

현재 피부 색소 침착 치료 방법으로는 하이드로퀴논 표백제, 비타민 A 연고, 국소 스테로이드 연고, 비타민 C, 글라이콜릭산, 아젤레익산 등을 혼합하여 사용하면서, 고농도의 비타민 C를 침투시키는 전기영동치료를 정기적으로 시행하는 치료 방법이 있으며, 최근에는 TCA나 글라이콜릭산을 이용한 박피술을 국소 치료와 병행하여 주기적으로 시행하는 방법도 많이 이용되고 있다.

그러나, 현재까지 피부 색소 침착 질환을 완벽하게 치료하는 방법은 없으며, 어떤 치료 방법을 사용하더라도 쉽게 재발할 가능성이 있다. 따라서, 피부의 멜라닌 생성 기전을 근본적으로 이해하고 이를 바탕으로 멜라닌 색소 생성을 억제할 수 있는 새로운 치료제의 개발이 요구된다.

한편, 멜라닌 색소는 멜라노사이트(melanocyte) 세포 내의 멜라노좀이라는 소포체에서 타이로시나제(Tyrosinase)라는 효소에 의해 티로신이 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논(DOPA quinone)으로 전환되고, 도파퀴논으로부터 자동 산화 반응과 효소 반응을 통하여 도파크롬(DOPA chrome)을 거쳐 합성된다.

이렇게 합성된 멜라닌 색소는 주변의 케라틴 세포(keratinocyte)로 전달 분배되어 피부에서 흑갈색 색소 침착 또는 피부 색소 침착 질환이라는 표현형으로 드러나게 된다.

따라서, 멜라닌 색소 합성을 억제하는 것이야말로 피부 색소 침착 질환을 치료 및 예방할 수 있는 가장 근본적인 방법이 되는 것이며, 상기 멜라닌 색소를 합성하는 멜라노사이트 세포에 대해 특이적으로 작용하는 독성 물질이나, 멜라닌 색소 대사합성 과정에 핵심적으로 관여하는 타이로시나아제 유전자의 발현을 조절하 여 피부 미백 및 피부 색소 침착 질환의 치료를 달성하고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.

현재까지 개발된 피부 색소 침착 질환의 치료제로는 파라-메톡시페놀(p-methoxyphenol), 하이드로퀴논(hydroquinone), 코지산(kojic acid), 알부틴(arbutin) 등이 사용되고 있으나, 이들은 활성이 약하거나 색소세포의 변성 또는 치사를 일으킬 수 있으며, 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 단점이 있다. 한편, 멜라닌 생성 억제를 목적으로 비타민 C 및 그 유도체 등이 사용되고 있으나, 이들 또한 저해활성이 낮다는 단점을 가지고 있다.

이들 치료제 외에 천연물, 특히 식물 중에서 미백 활성 성분을 찾기 위한 연구도 계속 이루어져 왔고, 그 중 상백피, 감초, 작약, 계피, 고삼, 갈근, 당귀, 목단피, 반하, 알로에 등의 다수의 식물 추출물 및 생약재 추출물 등이 타이로시나제에 작용하여 멜라닌 생성을 억제한다는 사실이 밝혀졌으나, 이들 역시 안전성 측면에서 화장품이나 의약품에 유효 농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점이 있고, 아직 뛰어난 효과를 나타내는 천연물은 확인되지 않고 있다.

따라서, 소량으로도 멜라닌 생합성 저해활성이 우수하고 부작용이 적은 천연물의 개발이 절실히 요구되고 있다.

상술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 소량으로도 멜라닌 생합성 저해활성이 우수하고 부작용이 적은 피부 미백 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 피부 미백 조성물을 이용하여 멜라닌 색소의 과잉 합성에 의해 유발된 피부 색소 침착 질환을 효과적으로 치료하는데 있다.

위와 같은 과제를 달성하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 피부 미백 화장료 조성물은 달맞이꽃 종자유 비누화물을 유효성분으로 함유한다.

바람직하게, 상기 비누화물은 달맞이꽃 종자유에 NaOH, LiOH, 및 KOH로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 알칼리 금속 수산화물을 처리하여 비누화될 수 있다.

바람직하게, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도우로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

바람직하게, 상기 피부 미백은 멜라닌 색소의 생성 억제에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게, 상기 피부 미백은 타이로시나아제 유전자 발현 억제에 의해 수행될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 특징에 따른 피부 색소 침착 질환 치료 및 예방용 조성물은 달맞이꽃 종자유 비누화물을 유효성분으로 함유한다.

바람직하게, 상기 피부 색소 침착 질환은 멜라닌 색소의 합성 증가로 피부에 국소적으로 발생하고, 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착, 및 피부염에서 발생하는 과색소 침착에서 선택된 하나 이상의 질환일 수 있다.

바람직하게, 상기 비누화물은 총 중량 대비 0.001 내지 99.9 중량부로 조성물에 포함될 수 있다.

바람직하게, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다.

바람직하게, 상기 피부 색소 침착 질환의 치료 및 예방은 멜라닌 색소의 생성 억제에 의해 수행되며, 타이로시나아제 유전자 발현 억제에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게, 상기 조성물은 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제, 및 카타플라스마제 중에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 타이로시나아제 활성 억제용 조성물은 달맞 이꽃 종자유 비누화물을 유효성분으로 함유한다.

본 발명의 다른 특징에 따른 타이로시나아제 유전자 발현 억제용 조성물은 달맞이꽃 종자유 비누화물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물은 멜라닌 색소 형성에 관여하는 타이로시나아제 단백질의 타이로시나아제 유전자의 전사(transcription)와 타이로시나아제 단백질의 합성을 억제하여 멜라닌 색소의 생성을 효과적으로 억제할 수 있다.

이에 따라, 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물은 멜라닌 색소의 생성 억제를 통하여 우수한 피부 미백 효과를 가지므로, 피부 미백 화장료 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물은 멜라닌 색소의 생성 억제를 통하여 멜라닌 색소의 과다 생성에 의해 유발된 피부 색소 침착 질환을 치료 및 예방하는데 효과적으로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 참고하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 설명하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 피부 미백 조성물은 달맞이꽃 종자유 비누화물을 유효성분으로 함유한다.

여기서, 상기 달맞이꽃(Oenothera odorata) 종자유는 달맞이꽃 종자를 물리적으로 분쇄한 후, 착즙하여 얻어진 기름 성분을 의미한다. 그리고, 용어 "비누화(saponification)"는 상기 달맞이꽃 종자유에 포함된 유지 성분에 있는 에스터 결합을 가수분해하여 카복실산과 알코올을 생성하는 반응, 즉 에스터화 반응의 역반응을 의미한다. 그리고, 상기 "비누화물"은 상기 달맞이꽃 종자유에 포함된 유지 성분에 있는 에스터기 결합을 "비누화 시약"으로 처리하여 가수분해된 지방산 알칼리 염을 의미하며, 이때 사용할 수 있는 상기 "비누화 시약"으로는 바람직하게 NaOH, KOH, 또는 LiOH 등의 알칼리 금속 수산화물을 들 수 있다.

상기 "피부 미백"은 멜라닌 색소의 합성을 저해하여 멜라닌 색소의 피부 침착을 억제 또는 방지하는 것을 의미하며, 피부 색소 침착 질환을 치료 또는 예방하는 것을 포함하는 의미로 사용된다.

또한, 상기 "피부 색소 침착 질환"으로는 멜라닌 색소의 합성 증가로 피부에 국소적으로 발생하는 기미, 주근깨, 흑색점, 모반 등의 증상이 있으며, 약물에 의한 색소 침착, 치유된 창상 부위에서 발견되는 염증 후 색소 침착, 또는 피부염의 증상으로 나타나는 과색소 침착 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명에서, 상기 달맞이꽃 종자유 비누화물은 멜라닌 색소 대사 합성 과정에 핵심적으로 관여하는 주효소인 타이로시나아제 유전자와, Trp1(Tyrosinase related protein 1), Trp2, 및 MITF(Microphthalmia associated transcription factor)의 관련 유전자의 발현을 억제하며, 이러한 작용 기전을 통하여 피부 미백 작용을 수행한다.

본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물 함유 조성물은 피부 미백 작용을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가 함유하여 화장료 조성물로 사용될 수 있으며, 이러한 성분의 예로는 상백피, 감초, 작약, 계피, 고삼, 갈근, 당귀, 목단피, 반하, 알로에 등의 다수의 식물 추출물 또는 생약재 추출물을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에는 필수 성분인 상기 달맞이꽃 종자유 비누화물과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있으며, 이러한 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등을 들 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상 사용되는 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있으며, 그 예로는 스킨 로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 또는 아이섀도우 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 달맞이꽃 종자유 비누화물이 자체로 멜라닌 색소 대사 합성에 관여하는 효소들의 유전자 발현을 효과적으로 억제하여 우수한 피부 미백 활성을 갖는바, 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착, 및 피부염에서 발생하는 과색소 침착 등의 피부 색소 침착 질환을 치료 또는 예방하는 용도의 약학적 조성물로도 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 약학적 조성물에 포함된 달맞이꽃 종자유 비누화물의 함량은 피부 색소 침착 질환의 종류, 증상의 경중, 사용 목적 등을 종합적으로 고려하여 조성물 총 중량 대비 0.001 내지 99.9 중량%의 함량으로 피부 색소 침착 질환의 치료 및 예방에 폭넓게 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 당업계에서 통상 피부에 도포하여 사용되는 어떠한 제형도 될 수 있으며, 그 예로는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제, 또는 카타플라스마제 등을 들 수 있다.

상기 달맞이꽃 종자유 비누화물은 세포 독성을 보이지 않아 부작용에 대한 염려 없이 피부에 사용될 수 있으며, 상기와 같이 피부 외용 제제로 사용되어, 인체에 흡수되어 부작용을 나타낼 염려도 없고, 피부 표면에 어떠한 자극도 주지 않는다.

또한, 상기 약학적 조성물은 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 이들의 혼합물과 균질하게 혼합되어 사용될 수 있으며, 이러한 담체, 부형제, 또는 희석제의 예로는 바셀린, 유동 파라핀, 파라핀, 플라스티베이스(plastibase), 라드, 식물유, 왁스, 정제 라놀린 등과 같은 유지성 기제, 폴리에틸렌글리콜 등과 같은 수용성 기제, 흡수 연고, 친수 연고와 같은 유제성 기제, 산화방지제, 방수제, 보습제, 연화보조제 등을 들 수 있다.

상기 약학적 조성물의 사용량은 피부 전체를 완전히 도포할 수 정도로 사용하면 되고, 특별히 양이 정해지는 것이 아니며, 사용 횟수 역시 사용하는 사용자의 편의에 따라서 수시로 피부에 도포하면 된다.

이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명에서 멜라닌 생성을 억제하는 유효성분은 달맞이꽃 종자유에 포함된 유지 성분에 있는 에스터기 결합을 NaOH, KOH, 또는 LiOH 등의 비누화 시약으로 처리하여 가수분해된 지방산 알칼리 염인 달맞이꽃 종자유 비누화물이다.

본 발명자들은 상기 달맞이꽃 종자유 비누화물이 멜라닌 색소의 생산을 감소시키는지 확인하기 위하여 흑색종 세포에 IBMX(Isobutylmethylxanthine)를 처리하여 멜라닌 생성을 촉진시키는 환경을 조성하고, 달맞이꽃 종자유 비누화물을 대조군과 비교하여 멜라닌 생성을 감소시키는지 확인하였다.

또한, 멜라닌 생성 감소를 세포 내 수준에서 확인하기 위해, 웨스턴 블롯(Western blotting) 기법과 실시간 PCR(real time PCR) 기법을 통해 멜라닌 생성에 관련된 타이로시나아제, TRP1, TRP2, 및 MITF 유전자의 발현 변화를 측정하였다.

구체적으로 본 발명자들은 다음 단계로 실험을 진행하여 달맞이꽃 종자유 비누화물의 피부 미백 효과를 입증하였다.

우선, 멜라닌 색소 생성 억제 효과가 있는 물질을 스크린 하기 위해 멜라닌 생성 촉진 환경에서 후보 물질들을 첨가하고, 흑색종 세포를 배양하여 멜라닌 생성량을 비교하였다. 상기 후보 물질로는 멜라닌 생성에 관여할 것으로 예상되는 생약 추출물이나 약물들이 포함되었다.

그 결과, 가장 효과가 뛰어난 달맞이꽃 종자유 비누화물이 최종 후보 물질로 선택되었다.

이렇게 선택된 달맞이꽃 종자유 비누화물을 이용하여 흑색종 세포의 멜라닌 생성을 억제시키고, 세포 내 타이로시나아제, TRP1, TRP2, 및 MITF 효소의 발현과 활성을 측정함으로써 피부 미백 효과를 확인하였다.

그리고, 달맞이꽃 종자유 비누화물이 실제 인체에도 피부 미백 효과가 있는지 검증하기 위하여 사람 피부에 자외선을 조사하여 피부의 색소침착을 일으킨 후 달맞이꽃 종자유 비누화 산물을 도포하여 피부 미백 효과를 직접 관찰하였다.

상기 실험들은 달맞이꽃 종자유 비누화 산물의 농도와 배양 조건 등을 다양하게 변화시키며 수행되었다.

이하, 본 발명을 바람직한 실시예 및 실험예를 참고로 하여 본 발명을 상세히 설명한다.

실시예 . 달맞이꽃 종자유 비누화 산물의 제조

달맞이꽃 종자유와 에탄올에 녹인 2.5M KOH 용액을 2:1 부피비로 혼합하고, 80°C로 가열하여 달맞이꽃 종자유 비누화물을 제조하였다. 비누화 반응 후에 달맞이꽃 종자유 비누화물의 pH를 7.4로 조정하여 달맞이꽃 종자유 비누화물로 사용하였다.

실험예 1. 세포 독성 실험

상기 실시예에서 제조된 달맞이꽃 종자유 비누화물의 세포 독성을 측정하기 위하여 흑색종 세포(B16 melanoma cell, 한국세포주은행, 서울)를 배양하여 문헌에 기재된 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 방 법(J. Immunol. Methods, 141(1), 15 (1991).)을 이용하여 하기와 같이 실험하였다.

MTT 방법은 세포증식이나 독성측정에 사용되는 실험법으로, 살아있는 세포의 미토콘드리아에서 숙신산탈수소효소(succinate dehydrogenase 또는 mitochondrial dehydrogenase)에 의해 황색 수용성염인 MTT가 불수용성인 자주색의 포르마잔 유도체로 환원되는 원리를 이용한 방법으로 생성된 포르마잔 유도체는 용해제 (dimethyl sulfoxide 또는 2-propanol)를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정하는 방법이다.

흑색종 세포를 1 × 10⁵ cells/well의 밀도로 우태아혈청(Fetal bovine serum, FBS; GIBCO) 10%를 함유한 DMDM(Dulbecco's Modified Eagles Medium, GIBCO) 배지가 담긴 96웰 배양플레이트에서 37℃, 5% CO₂ 환경으로 1일 배양하였다. 여기에, 실시예에 의해 제조된 달맞이꽃 종자유 비누화물을 12.5 내지 100㎍/ml의 농도(DMSO로 녹여 희석) 별로 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 후, MTT용액(2.5 mg/㎖; Sigma, 미국)을 웰당 0.1㎖씩 첨가하여 37℃에서 30분간 반응 후 MTT 용액을 제거하고, DMSO를 웰당 0.1㎖씩 첨가하였다. 실온에서 포르마잔 유도체를 녹인 후 570 nm에서 흡광도를 측정하고 달맞이꽃 종자유 비누화물을 첨가하지 않은 음성대조군과 흡광도 차이를 비교하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물은 0 내지 100㎍/ml의 농도에서, 음성 대조군과 비교하여 동일한 높은 세포 생존율을 보였으며, 50㎍/ml의 농도에서도 약 92.6%의 세포 생존율을 보여 세포 독성이 거의 없음을 알 수 있었다.

상기와 같은 세포 독성 시험 결과, 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물은 세포 및 생체에 안전하게 투여할 수 있는 물질임을 알 수 있었다.

실험예 2. 달맞이꽃 종자유 비누화물의 멜라닌 생성 억제 효과

상기 달맞이꽃 종자유 비누화물이 멜라닌 색소의 생산을 감소시키는지 확인하기 위하여 흑색종 세포에 IBMX(Isobutylmethylxanthine)를 처리하여 멜라닌 생성을 촉진시키는 환경을 조성하고, 달맞이꽃 종자유 비누화물을 대조군과 비교하여 멜라닌 생성을 감소시키는지 확인하였다.

사람 흑색종 세포에 0.1mM 농도의 IBMX를 처리하여 흑색종 세포에서 멜라닌 색소의 생산을 촉진시키고, 0 내지 100ug/ml의 농도로 달맞이꽃 종자유 비누화물을 처리하였다. 상기 달맞이꽃 종자유 비누화물이 처리된 사람 흑색종 세포를 3일 동안 배양하였다.

배양된 흑색종 세포의 멜라닌 색소 함량을 측정하기 위하여 생리식염수로 세척한 뒤 용출(lysis Buffer)로 용해시킨 뒤, 20% TCA용액으로 처리하였다. 침전물을 10% TCA 용액으로 2회 세척한 후, 다시 에탄올과 디에틸에테르의 혼합 용액(3:1), 및 디에틸에테르 용액으로 순차적으로 처리하고, 공기 중에서 건조시킨 후, 0.85M의 수산화칼륨 용액으로 용해시켜 15 분간 가열하였다. 냉각 후 440nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 수에 따른 멜라닌 색소 함량 차이를 보정하기 위해, 브래드포드 방법(Bradford Method, Anal Biochem 1976;72:248-54)으로 단백질을 정량하고, 멜라닌 색소의 측정량을 단백질량으로 나누어 1mg 단위 단백질당 멜라닌 색소 생성량 측정치(멜라닌 색소 측정량/단백질)를 도 2에 나타내었다.

도 2를 참조하면, 비누화되지 않은 달맞이꽃 종자유 처리 대조군은 100ug/ml의 농도까지 용량을 증량하여도 멜라닌 색소의 생성량이 의미있게 감소하지 않았다.

이에 반하여 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물을 처리한 군에서는 처리 용량에 의존적으로 세포 내 생성된 멜라닌 색소 함량이 감소되었으며, 100.0ug/ml 농도에서는 약 90%까지 멜라닌 색소 생성이 억제됨이 관찰 되었다.

상기와 같은 세포 실험 결과, 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물을 실제 세포 내에서 멜라닌 색소의 생성을 억제하는데 뛰어난 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 3. 달맞이꽃 종자유 비누화물의 타이로시나아제 활성 억제 효과

멜라닌 색소의 형성에 중요한 역할을 하는 타이로시나아제의 활성에 달맞이꽃 종자유 비누화물이 미치는 영향을 평가하였다.

실험예 2의 IBMX 및 달맞이꽃 종자유 비누화물이 처리된 흑색종 세포의 세포 용출물을 이용하여 도파(DOPA)가 도파 크롬(DOPA chrome)으로 산화되는 반응을 475nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하였다. 상기 반응은 신선하게 조제한 기질용액(0.1 % L-DOPA in 0.1 M sodium phosphate, pH 6.0)에 세포 용출물을 가한 후 37℃에서 부치시키면서 측정하였다.

삭제

그리고, 타이로시나아제 활성은 상기 실험예 2에서 기술된 단백질 정량 방법을 사용하여 1 mg 단위 단백질당 타이로시나아제 활성으로 보정하여 도 3에 도시하였다.

도 3을 참조하면, 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물을 처리한 군에서는 처리 용량에 의존적으로 타이로시나아제의 활성이 감소하였으며, 100.0ug/ml 처리 농도에서는 타이로시나아제의 활성이 약 20%까지 감소함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물은 멜라닌 세포의 생성에 핵심 역할을 하는 타이로시나아제의 활성 증가를 효과적으로 억제하여 우수한 피부 미백 효과를 가짐을 알 수 있었다.

실험예 4. 달맞이꽃 종자유 비누화물의 타이로시나아제 단백질 발현 억제 효과

멜라닌 색소의 형성에 중요한 역할을 하는 타이로시나아제 단백질의 발현에 달맞이꽃 종자유 비누화물이 미치는 영향을 평가하였다.

실험예 2의 IBMX 및 달맞이꽃 종자유 비누화물이 처리된 흑색종 세포의 세포 용출물에 항-타이로시나아제 항체(Goat anti-murine tyrosinase IgG antibody; Santa-Cruz Biotechnology Inc.)를 사용하여 웨스턴 블롯(Western blotting)을 수행하고, 케미루미넌트 시스템(chemiluminant system)으로 발색하여 타이로시나아제 단백질의 발현을 정량하였다.
도 4에 있어서, 실험예 2와 동일한 방법으로 1은 사람 흑색종 세포를 IBMX(Isobutylemthylxanthine) 처리 및 달맞이꽃 종자유 비누화물 처리하지 않은 것이며, 2는 IBMX를 0.1 mM 처리하여, 멜라닌 생성을 촉진시키는 환경을 조성한 것이며, 3 ~ 6 각각은 IBMX 0.1 mM 처리한 후, 달맞이꽃 종자유 비누화물을 12.5 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖씩 처리한 것이다.
도 4를 참조하면, 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물은 상기 실험예 2및 3의 결과와 마찬가지로 농도 의존적인 방식으로 타이로시나아제의 단백질 발현을 감소시켰다. 이러한 결과는 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물이 단백질 수준에서 타이로시나아제 단백질의 합성을 저해함을 의미한다.

삭제

따라서, 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물은 멜라닌 세포의 생성에 핵심 역할을 하는 타이로시나아제 단백질의 합성을 효과적으로 억제하여 우수한 피부 미백 효과를 가짐을 알 수 있었다.

실험예 5. 달맞이꽃 종자유 비누화물의 타이로시나아제 유전자 발현 억제 효과

멜라닌 색소의 형성에 중요한 역할을 하는 유전자의 발현에 달맞이꽃 종자유 비누화물이 미치는 영향을 평가하였다.

상기 유전자로는 타이로시나아제를 비롯하여 TRP-1, TRP-2, 및 MITF 유전자가 선택되었다.

실험예 2의 IBMX 및 달맞이꽃 종자유 비누화물이 처리된 흑색종 세포의 세포 용출물로부터 Trizol 용액(Invitrogen, Praisly, UK)으로 mRNA를 추출하고 역전사효소(TaKaRa, Japan)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 하기 표 1의 프라이머를 각각 첨가하고, 실시간 PCR 반응기(ABI Prism 7900HT Sequence Detection System; Applied Biosystems)를 이용하여 실시간 PCR 반응(real-time PCR reaction)을 수행하여, 달맞이꽃 종자유 비누화물 처리시 타이로시나아제 유전자의 전사 변화를 측정하였다.

달맞이꽃 종자유 비누화물에 의한 효과를 검증하기 위해, 아무것도 처리하지 않은 흑색종 세포를 대조군으로 사용하였고, IMBX만을 처리한 흑색종 세포를 IBMX 처리군으로 사용하였다.

각각의 실험군들에서 타이로시나아제, TRP-1, TRP-2, 및 MITF 유전자의 전사 변화를 측정하고, 그 결과를 도 5에 도시하였다.

[표 1]

도 5를 참조하면, 아무런 처리를 하지 않은 대조군과 비교하여, IBMX를 처리한 군은 선정된 모든 유전자들에서 전사량이 2배 이상 급격하게 증가하는 현상이 관찰되었다.

그러나, IBMX와 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물이 함께 투여된 군에서 상기 유전자들의 전사량 증가 현상은 IBMX 단독 처리군에 비해 크게 완화되어 관찰되었다.

상기 결과를 통하여 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물이 멜라닌 색소 생성에 연관된 타이로시나아제, TRP1, TRP2, 및 MITF 유전자의 전사를 억제하여 멜라닌 생성을 저해하고, 피부 미백에 효과가 있음을 알 수 있었다.

실험예 6. 달맞이꽃 종자유 비누화물에 의한 피부 미백 효과

사람의 상완부 안쪽 피부에 각각 세 곳씩, 2 X 2cm 면적에 400mJ/cm² 의 자외선(UVB)를 1주일에 5회, 1주간 조사하여(Aurora UV-Light, 조양메딕스, 성남) 색소 침착을 유도하였다.

상기 색소 침착이 유도된 사람 피부에 달맞이꽃 종자유 비누화물 원액을 자외선 조사 시작 2주 후부터 10주까지 매일 2회 지속적으로 도포하여 달맞이꽃 종자유 비누화물이 피부 미백에 미치는 효과를 평가하였다. 대조군으로는 반대쪽 상완에 동일한 조건에서 자외선을 조사한 후, 아무런 처리를 하지 않은 군을 사용하였다.

피부 미백 효과는 멕사메터(CK, Mexameter, MPA 9, Courage, Khazaka, Germany)를 이용하여 MI(melanogenic index) 값을 측정하였고, 달맞이꽃 종자유 비누화물을 도포하기 시작한 시점에서의 MI 값과의 차이(ΔMI)를 도 6에 나타내었다.

도 6을 참조하면, 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물 처리군에서는 비누화물을 처리하자마자 ΔMI 값이 감소하기 시작하였고, 8주 경과시까지 꾸준하게 ΔMI 값이 감소하여, 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물을 처리한지 8주가 경과하는 시점에서 ΔMI 값이 -30까지 감소(linearly decline) 되었다.

그러나, 본발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물이 처리되지 않은 군에서는 자외선 조사 후 4주 경과 시까지 멜라닌 생성이 증가하는 추세가 관찰되었고, 8주 경과 시에도 뚜렷한 멜라닌 색소 생성 감소 추세가 관찰되지 않았다.

상기와 같은 결과를 통하여 본 발명의 달맞이꽃 종자유 비누화물은 실제 자 외선에 의해 멜라닌 색소 형성이 유도된 피부에 작용하여 우수한 피부 미백 효과를 가짐을 알 수 있었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

도1은 달맞이꽃 종자유 비누화물의 흑색종 세포(B16 melanoma cell)에 대해 측정한 세포독성 시험 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 달맞이꽃 종자유 비누화물이 흑색종 세포에서 멜라닌 색소의 생성을 억제함을 보여주는 사진 및 그래프이다.

도 3은 달맞이꽃 종자유 비누화물이 농도 의존적으로 타이로시나아제 효소의 활성을 억제함을 보여주는 그래프이다.

도4는 달맞이꽃 종자유 비누화물이 농도 의존적으로 타이로시나아제 단백질의 합성을 억제함을 보여주는 그래프이다.

도 5은 달맞이꽃 종자유 비누화물이 농도 의존적으로 멜라닌 색소 생성과 관련된 유전자인 타이로시나아제, Trp1, Trp2, 및 MITF 유전자의 전사(transcription)을 억제함을 보여주는 실시간 RT-PCR 결과 그래프이다.

도 6은 사람에게 직접 자외선을 조사하여 색소침착을 유발 시킨 후 달맞이꽃 종자유 비누화물을 8주간 도포한 후 미백에 미치는 효과를 멕사메터(Mexameter)를 이용하여 관찰한 사진 및 그래프이다.

Claims (14)

1. 달맞이꽃 종자유 비누화물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 비누화물은 달맞이꽃 종자유에 NaOH, LiOH, 및 KOH로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 알칼리 금속 수산화물을 처리하여 비누화된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,

   상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도우로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,

   상기 피부 미백은 멜라닌 색소의 생성 억제에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서,

   상기 피부 미백은 타이로시나아제 유전자 발현 억제에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 달맞이꽃 종자유 비누화물을 유효성분으로 함유하는 피부 색소 침착 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물.
7. 제6항에 있어서,

   상기 피부 색소 침착 질환은 멜라닌 색소의 합성 증가로 피부에 국소적으로 발생하고, 기미, 주근깨, 흑색점, 모반, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착, 및 피부염에서 발생하는 과색소 침착에서 선택된 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
8. 제6항에 있어서,

   상기 비누화물은 조성물 총 중량 대비 0.001 내지 99.9 중량%인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
9. 제6항에 있어서,

   상기 조성물에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 이들의 혼 합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
10. 제 6항에 있어서,

    상기 피부 색소 침착 질환의 치료 및 예방은 멜라닌 색소의 생성 억제에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
11. 제6항에 있어서,

    상기 피부 색소 침착 질환의 치료 및 예방은 타이로시나아제의 유전자 발현 억제에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
12. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제, 및 카타플라스마제 중에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
13. 제1항에 있어서, 상기 피부 미백은 타이로시나아제 활성 억제에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
14. 삭제

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