KR101152655B1 - 머리카락 내 ｄｈｅａ 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 검출에 의한 여드름 질환의 평가방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 머리카락을 염기성 조건에서 가수분해 시킨 후, 트리에틸아민 완충용액을 전개용매로 하여 분석방해물질을 제거하고 분석물질을 농축시킨 다음, 트리에틸아민 용액과 아세토니트릴을 전개용매로 공급하고 분석물질을 용출시켜 액체 크로마토그래피-질량분석법으로 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 동시에 측정하고, 여드름 질환의 정도에 따라 차별화되는 머리카락 내 DHEA 설페이트와 콜레스테롤 설페이트의 농도를 비교분석하는 방법에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 머리카락을 사용한 여드름 질환의 평가 방법으로 응용될 수 있으리라 기대된다.

Description

머리카락 내 ＤＨＥＡ 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 검출에 의한 여드름 질환의 평가방법{Evaluation of acne progress based on quantification of DHEA sulfate and cholesterol sulfate in hair}

본 발명은 머리카락을 염기성 조건에서 가수분해 시킨 후, 트리에틸아민 완충용액을 전개용매로 하여 분석방해물질을 제거하고, 트리에틸아민 용액과 아세토니트릴을 전개용매로 공급하여 분석물질을 용출시키는 액체 크로마토그래피-질량분석법으로 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 동시에 측정하여 여드름 질환을 평가하는 방법에 관한 것이다.

여드름은 피부 부속기 질환 중 가장 흔한 것으로, 발병 기전은 명확하게 밝혀지지 않았으나, 호르몬, 피지분비, 모공의 과각질화 현상, 그리고 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 의한 염증 등의 여러 가지 요인이 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

부신 전구 호르몬인 DHEA 설페이트(dehydroepiandrosterone-sulfate)는 피지선 내에서 더 강력한 남성호르몬인 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론을 합성한다. 피지선 내의 남성호르몬의 농도의 증가는 남성호르몬 수용체와의 결합을 통해 피지를 증가시킨다. 따라서 여성 여드름 환자에서의 혈장 DHEA 황산중합체 농도 증가가 실험적으로 증명되었다[Arch. Dermatol., 1992, 128:1345-1348; Clin. Dermatol., 2004, 22:419-428; J. Dermatol., 1997, 24:223-229]. 또한 콜레스테롤 설페이트는 표피의 기저부분에서 콜레스테롤 설포트렌스퍼라제(cholesterol sulfotransferase) 효소에 의해 콜레스테롤에서 콜레스테롤 설페이트로 변한 후, 각질층에서 스테로이드 설파타제(steroid sulfatase)에 의해 다시 콜레스테롤 설페이트에서 콜레스테롤로 전환된다. 콜레스테롤 설페이트는 각질층의 분화와 표피의 방어막 형성에 중요한 작용을 하므로, 콜레스테롤과 콜레스테롤 설페이트의 균형은 각질 탈피를 조절하는데 매우 중요하며, 스테로이드 설파타제의 결핍은 여드름 발병 중 하나인 모낭의 과각질화 현상을 일으킨다. 가장 일반적인 여드름 치료제인 이소트레티노인(isotretinoin)의 경구 투여 후, 여드름 환자에서 콜레스테롤 설페이트의 농도가 감소한 실험결과가 이를 증명한다[Arch. Dermatol. Res., 1998, 280:97-102].

피지선, 모공, 표피 등 피부 부속기와 밀접한 관련이 있는 여드름 관련 연구에 있어서 생체시료 중 소변 및 혈액 등을 이용할 수 있으나, 여드름 환자의 DHEA 설페이트와 콜레스테롤 설페이트의 농도를 측정할 경우, 소변 및 혈액 내에서는 여드름의 진행 정도나 일반인과의 차별성 등을 구분할 수 없다.

따라서 여드름 환자에 있어서 생체시료를 활용하여 DHEA 셀페이트와 콜레스테롤 설페이트 농도를 활용하여 질환의 진행정도를 평가할 수 있는 생체시료의 선정이 요구되는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 소량의 머리카락을 염기성 조건에서 가수분해시킨 후, 트리에틸아민 완충용액을 전개용매로 하여 농축컬럼을 통해 머리카락 내의 분석 방해물질을 제거하고, 트리에틸아민 용액과 아세토니트릴을 전개용매로 공급하는 액체 크로마토그래피-질량분석법을 사용하여 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 동시에 측정하여 이를 분석함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 소량의 머리카락 시료 내에서 DHEA 설페이트와 콜레스테롤 설페이트의 농도를 측정하고, 여드름 환자와 정상인의 머리카락에서 DHEA 설페이트와 콜레스테롤 설페이트 농도의 차별성을 확인하고, 상기 농도의 변화에 따른 여드름의 진행정도를 평가할 수 있도록 하는데 그 목적이 있다.

본 발명은,

머리카락을 염기성 조건 하에서 가수분해 시키는 단계;

트리에틸아민 완충용액을 전개용매로 하여 농축컬럼을 통해 머리카락 내의 분석방해물질을 제거하고 분석물질을 농축시키는 단계; 및

상기 농축된 분석물질에 트리에틸아민 용액과 아세토니트릴을 전개용매로 공급하여 농축컬럼으로부터 분석물질을 용출시킨 후, 용출된 분석물질을 분석컬럼으로 도입하는 액체 크로마토그래피-질량분석법을 사용하여 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 측정하는 단계

를 포함하는 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 검출방법을 그 특징으로 한다.

또한 본 발명은,

두 시료군 간 상기 검출방법에 의하여 측정된 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 비교 확인하는 단계를 포함하는 두 시료군 간 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 차별성 분석방법을 또 다른 특징으로 한다.

본 발명은 소량의 머리카락 내의 DHEA 설페이트와 콜레스테롤 설페이트를 효과적으로 분석하여, 여드름 질환의 정도에 따라 머리카락 내 DHEA 설페이트와 콜레스테롤 설페이트의 농도가 달라지는 바, 본 발명은 여드름 질환의 평가 방법으로 응용될 수 있으리라 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트를 검출하기 위한 장치의 개략도이다.
도 2는 여드름 환자와 정상인 머리카락 내 DHEA 설페이트와 콜레스테롤 설페이트의 농도를 비교한 결과이다.
도 3은 여드름 환자의 등급에 따른 머리카락 내 콜레스테롤 설페이트의 농도를 비교한 결과이다.

이와 같은 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 머리카락을 염기성 조건에서 가수분해 시킨 후, 트리에틸아민 완충용액을 전개용매로 하여 분석방해물질을 제거하고, 트리에틸아민 용액과 아세토니트릴을 전개용매로 공급하여 분석물질을 용출시키는 액체 크로마토그래피-질량분석법으로 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.

먼저, 머리카락을 염기성 조건 하에서 가수분해시켜 가수분해물을 얻는데, 이때 사용되는 머리카락의 양은 1 ~ 40 mg이 바람직하며, 1 mg 보다 적을 경우에는 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 분석을 위한 검출한계에 문제가 있고, 40 mg 보다 많을 경우에는 콜레스테롤과 같은 머리카락 내의 농도가 높은 화합물들의 검출농도가 지나치게 높을 뿐만 아니라 머리카락을 많이 채취한다는 불편함이 있다.

본 발명에서 사용하는 시료인 머리카락은 분석하고자 하는 분석물질 이외에도 많은 친수성의 분석방해물질을 가지고 있다. 본 발명에서는 분석방해물질 제거 및 분석물질을 농축시키기 위한 농축컬럼을 사용하여 복잡한 전처리 과정을 거치지 않고 쉽게 분석물질을 검출할 수 있다.

본 발명에서는 트리에틸아민 완충용액을 전개용매로 사용하며, 0.1% 트리에틸아민 완충용액(초산으로 pH 6.0 ~ 6.5로 조정한 용액)을 사용하는 것이 바람직하다.

농축을 위하여 흘려주는 트리에틸아민 완충용액의 유속은 400 ~ 600㎕/분인 것이 바람직하며, 가장 바람직한 유속은 500 ㎕/분이다. 트리에틸아민 완충용액을 흘려주는 시간은 8 내지 12분인 것이 바람직하며 특히 10분간 흘려주는 것이 바람직하다. 친수성의 트리에틸아민 완충용액만을 흘려줄 경우 농축컬럼은 분석하고자 하는 분석물질인 DHEA 설페이트와 및 콜레스테롤 설페이트와는 충분한 상호작용을 하지만 큰 친수성을 가지는 여러 분석방해물질과는 충분한 상호작용을 하지 못해 분석물질은 농축시키고 분석방해물질을 컬럼 밖으로 유출시켜 폐기시킨다.

상기와 같이 머리카락으로부터 분석방해물질이 제거되고 분석물질이 농축되어 있는 농축컬럼에, 트리에틸아민 용액과 아세토니트릴을 전개용매로 공급하여 농축컬럼으로부터 분석물질을 용출시킨다. 아세토니트릴 용액의 양은 처음에는 적은 양으로 시작하여 시간이 경과함에 따라 그 양을 점차 늘려가다가 다시 줄이는 방식으로 공급하는 것이 바람직하다. 이 때 흘려주는 전개용매의 유속은 80 내지 120㎕/분인 것이 바람직하며, 100 ㎕/분인 것이 가장 바람직하다. 결국 트리에틸아민 완충용액만을 흘려줄 경우 유출되지 않았던 분석물질이 유기용매를 사용할 경우 농축컬럼으로부터 용출된 후, 분석컬럼에 의해 분리된다. 시료에서 분석물질을 분리시키기 위하여 액체 크로마토그래피를 사용하며, 질량분석을 통하여 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 측정한다.

본 발명의 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트 검출방법의 각 단계는 스위칭 밸브의 조절에 의하여 전개용매의 투입과 시료의 유입 및 유출이 결정될 수 있으며, 스위칭 밸브의 조정은 도 1에 나타난 바와 같이 이루어진다.

또한 두 시료군 간 상기 검출방법에 의하여 측정된 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 비교 확인하는 단계를 포함하는 두 시료군 간 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 차별성 분석방법을 또 다른 특징으로 한다.

특히 여드름환자와 정상인의 머리카락에 존재하는 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트 평균 농도를 비교하면 여드름환자에서 높게 나타나는 바, 머리카락에 존재하는 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도가 정상인 평균치보다 높게 나타나면 여드름 질환을 판단할 수 있다.

이하, 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트 검출

1) 가수분해

채취된 머리카락의 오염물질을 제거하기 위하여 증류수와 이소프로필알콜로 충분히 세척한 후 건조시킨 머리카락을 1 ~ 2 mm의 크기로 잘랐다. 시험관에 내부 표준물질(d2-DHEA sulfate, d6-cholesterol sulfate, 10 ㎍/mL) 10 ㎕와 머리카락 30 mg 넣고 0.1 M NaOH 1 mL을 넣어 염기성 조건을 형성하고 15분 동안 초음파처리(sonication)하여 가수분해 한 뒤, 0.2 ㎛의 PVDF 필터를 사용하여 시료를 준비하였다.

2) 분석방해물질 제거 및 분석물질 농축단계

농축컬럼인 Shodex MS pak PK-2A 컬럼(N-vinylacetamide copolymer, 내경 2.0 mm, 길이 10 mm, Showa Denko K.K.)에 준비된 시료를 주입한 후 0.1% 트리에틸아민 완충용액(pH 6.5)을 500 ㎕/분의 유속으로 10분간 흘려주었다. 도 1의 (가)와 같이 스위칭 밸브를 조절하여 친수성의 트리에틸아민 완충용액만을 흘려줄 경우, 농축컬럼은 분석물질인 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트와는 상호작용을 하지만 큰 친수성을 가지는 시료 내 방해물질과는 충분한 상호작용을 하지 못하므로 분석물질은 농축시키고 방해물질을 컬럼 밖으로 제거할 수 있었다.

3) 액체 크로마토그래피-질량분석법

상기와 같이 방해물질의 제거 및 농축된 분석물질에 대하여 도 1의 (나)와 같이 스위칭 밸브를 조절하여 아세토니트릴 용액을 전체 전개용매 중 0%(v/v)로부터 시작하여 5분에 50%, 13분에 100%로 증가시켜 7분간 유지 한 후 18분에 다시 0%로 감소시키고 100 ㎕/분의 유속으로 흘려주며 분석물질을 용출시켰다. 용출된 분석물질은 분석컬럼으로 도입되었다. 분석컬럼은 길이가 15 ㎝, 내경 1.5 ㎜, 입자크기가 3 ㎛인 시세이도사의 Capcell Pak C18 MG 컬럼을 사용하였다. 시료에서 분석물질을 분리시키기 위한 기기는 시세이도사의 Shiseido nanospace SI-2 고성능 액체 크로마토그래피 (Shiseido Co., Tokyo, Japan)을 사용하였으며, LCQ Advantage 질량분석기(ThermoFinnigan, version 1.0, Scan Jose, CA, USA)를 사용하여 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 분석하였다. 상기의 질량분석기는 전기스프레이 이온화기를 장착하였으며, 물질을 이온화시킬 때의 분무 조건은 속도 24 a.u.(arbitary unit)의 보조기체(질소), 4.5 KV의 분무전압, -50 V의 모세관 전압, 그리고 250 ℃의 모세관 온도를 사용하였다. 정량분석은 질량분석법의 선택적 반응 탐지법(selected reaction monitoring; SRM)에서 수행하였다. DHEA 설페이트는 m/z 367을, 콜레스테롤 설페이트는 m/z 465 를 정량이온으로 선택하여 농도를 평가하였다.

시험예 1

상기 실시예 1의 검출방법을 통하여 남성 여드름 환자 29명, 여성 여드름 환자 21명, 남성 정상인 24명, 여성 정상인 26명으로부터 머리카락 내의 DHEA 설페이트와 콜레스테롤 설페이트의 농도를 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2 (가)와 (나)의 경우, 머리카락 내 콜레스테롤 설페이트의 농도가 여드름 환자에서 높게 나타남을 확인하였으며, 도 2 (다)의 경우, 여성의 머리카락 내의 DHEA 설페이트의 농도가 여드름 환자에서 높게 나타남을 확인하였다.

시험예 2

상기 실시예 1의 검출방법을 통하여 여드름 등급과 머리카락 내 콜레스테롤 설페이트 농도와의 상관관계를 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 여성과 남성의 머리카락 내의 콜레스테롤 황산중합체 농도가 여드름 등급이 증가함에 따라 유의성 있게 증가하였음을 확인하였으며, 이들의 상관계수는 각각 0.88, 0.96 이었다.

Claims (5)

1. 머리카락을 염기성 조건 하에서 가수분해 시키는 단계;
   트리에틸아민 완충용액을 전개용매로 하여 농축컬럼을 통해 머리카락 내의 분석방해물질을 제거하고 분석물질을 농축시키는 단계; 및
   상기 농축된 분석물질에 트리에틸아민 용액과 아세토니트릴을 전개용매로 공급하여 농축컬럼으로부터 분석물질을 용출시킨 후, 용출된 분석물질을 분석컬럼으로 도입하는 액체 크로마토그래피-질량분석법을 사용하여 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 측정하는 단계
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 여드름 질환의 단계별 진단을 위한 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 동시 검출방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 각 단계는 스위칭 밸브의 조절에 의하여 전개용매의 투입과 시료의 유입 및 유출이 결정되는 것을 특징으로 하는 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 동시 검출방법.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 머리카락은 여드름 환자의 것임을 특징으로 하는 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 동시 검출방법.
   
4. 여드름 환자와 정상인의 두 시료군에서 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 차별성을 분석하는 방법으로서,
   머리카락을 염기성 조건 하에서 가수분해 시키는 단계;
   트리에틸아민 완충용액을 전개용매로 하여 농축컬럼을 통해 머리카락 내의 분석방해물질을 제거하고 분석물질을 농축시키는 단계;
   상기 농축된 분석물질에 트리에틸아민 용액과 아세토니트릴을 전개용매로 공급하여 농축컬럼으로부터 분석물질을 용출시킨 후, 용출된 분석물질을 분석컬럼으로 도입하는 액체 크로마토그래피-질량분석법을 사용하여 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 측정하는 단계; 및
   두 시료군 간 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 농도를 비교 확인하는 단계
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 여드름 질환 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자와 정상인의 시료를 비교 확인하기 위해 두 시료군 간 머리카락 내 DHEA 설페이트 및 콜레스테롤 설페이트의 차별성 분석방법.
   
   
5. 삭제

Images