KR101158756B1

KR101158756B1 - 코돈 최적화시킨 ｈｉｖ의 ｎｃ 폴리뉴클레오티드, 상기폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 ｎｃ단백질의 생산방법

Info

Publication number: KR101158756B1
Application number: KR1020060131393A
Authority: KR
Inventors: 유지창
Original assignee: (주) 에빅스젠; 유지창
Priority date: 2006-12-20
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2012-06-22
Anticipated expiration: 2026-12-20
Also published as: KR20080057751A

Abstract

본 발명은 코돈 최적화시킨 HIV의 NC 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 NC 단백질의 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 코돈 최적화시킨 HIV의 NC 폴리뉴클레오티드, 인트론 서열과 상기 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 연결시키거나 인트론 서열과 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드 하부에 mRNA 안정화 인자(mRNA stability element)를 추가적으로 연결시킨 것을 특징으로 하는 HIV의 NC 단백질 발현용 벡터 및 이를 이용한 NC 단백질의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 코돈 최적화시킨 HIV의 NC 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 HIV의 NC 단백질 발현용 벡터는 동물세포에서 천연형(wild type)의 NC 단백질을 발현시킬 수 있으며, 그 발현효율이 종래 기술에 비하여 향상되는 효과가 있어, HIV에 효과적인 항바이러스제의 개발에 이용될 수 있다.

HIV, NC(nucleocapsid), 발현, 벡터, 코돈-최적화(codon-optimization), mRNA 안정화 인자(mRNA stability element)

Description

코돈 최적화시킨 ＨＩＶ의 ＮＣ 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 이를 이용한 ＮＣ 단백질의 생산방법{Codon-optimized HIV NC poly-nucleotide, vector containing said poly-nucleotide and method for producing NC protein using the same}

도 1은 오리지널(original) NC 폴리뉴클레오티드와 코돈-최적화된 NC 폴리뉴클레오티드 서열들을 정렬(Sequence alignment)한 것이다.

도 2는 HIV NC 폴리뉴클레오티드를 코돈 최적화시키기 전과 후의 각 코돈 사용빈도를 그래프로 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 HIV NC 단백질 발현용 벡터 pCMV(-HA)/OptiNC의 제조과정을 나타낸 모식도이다.

도 4는 본 발명에 따른 HIV NC 단백질 발현용 벡터 pCMV(-HA)OptiNC/RRE 의 제조과정을 나타낸 모식도이다.

도 5는 본 발명에 따른 HIV NC 단백질 발현용 벡터들로 형질전환된 세포들에서 NC 단백질 발현량을 비교하기 위하여 웨스턴 블럿한 결과이다.

도 6은 본 발명에 따른 HIV NC 단백질 발현용 벡터 중 β-글로빈 인트론(β-globin intron)을 가진 벡터의 NC 단백질 발현량을 웨스턴 블럿으로 측정한 결과이 다.

HIV(human immunodeficiency virus)의 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid, 이하, 'NC'라 명명함)은 바이러스 개체형성을 위한 구조적 역할 뿐만 아니라, 바이러스의 생활주기(viral life cycle)에 대하여 기능적으로도 중요한 역할을 하는데 그 기능을 살펴보면 다음과 같다. 첫째, NC 단백질은 바이러스의 유전적 포막(genomic encapsidation)에 관여한다. 이러한 기능은 독특한 Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys 모티프(CCHC 모티프)로 구성되는 두 개의 징크핑거 도메인으로부터 기인하는데, 상기 도메인은 모든 레트로바이러스(retrovirus)에서 높은 보존성을 나타내 며, HIV RNA 포장(packaging)과 감염성 바이러스 생산에 필수적인 것으로 알려져 있다. 둘째, NC 단백질은 바이러스의 역전사 반응(reverstranscription, RT)동안 tRNA 프라이머 어닐링(annealing)과 가닥 이동(strand transfer)을 촉진한다고 알려져 있으며, 이로부터 NC 단백질이 바이러스 복제(viral replication)에 중요한 기능을 한다는 것을 알 수 있다. 셋째, NC 단백질은 바이러스의 생활주기에 필요한 핵산 샤페론(chaperone) 활성을 가지며, 최근에는 바이러스 DNA가 숙주세포 염색체에 삽입될 때에도 NC 단백질이 소정의 역할을 담당한다고 보고되고 있다. 따라서, 이러한 NC 단백질에 대한 연구는 HIV 생활주기에서 NC 단백질이 갖는 생물학적 기능을 밝히는데 뿐만 아니라, 핵심적인 HIV 단백질에 대한 효과적인 항바이러스제를 개발하는 측면에 있어서도 매우 중요하다 할 것이다.

생체 내에서 NC 단백질의 생물학적 기능을 이해하기 위한, 필수적인 선결 조건은 동물세포에서 NC 단백질을 효과적으로 발현시키는 방법을 개발하는 것이다. 그러나 HIV의 다른 구조 단백질의 경우에, 바이러스의 유전부호 활용(codon usage)이 동물세포의 유전부호 활용과 다르다거나, 유전자 내에 저해서열(inhibitory sequence, INS)을 포함한다는 이유로 동물세포 발현이 제한되는 경우가 있다. NC 단백질의 경우에는 HIV의 다른 구조 단백질과 달리 INS를 포함하지 않음에도 불구하고, 동물세포에서의 발현이 현저히 낮다는 문제점이 있었다. 따라서, 대부분의 NC 단백질에 대한 연구들이 대장균에서 발현시킨 재조합 NC 단백질을 이용하거나, 유전자 분석을 이용하여 진행되어 왔다. 본 발명자들은 선행연구를 통해 동물세포 에서 HIV NC 단백질을 생산하는 방법을 특허출원(한국특허등록번호 제 0553154호)한 바 있다. 상기 기술된 방법은 NC 폴리뉴클레오티드 상부에 인트론 서열을 연결시키거나 또는 NC 폴리뉴클레오티드의 상부에 FLAG 유전자를 추가로 연결시키는 것을 특징으로 한다. 그러나 NC 폴리뉴클레오티드 상부에 인트론 서열만을 연결시킬 경우 발현효율이 낮고, FLAG 유전자를 추가로 연결시킬 경우 천연형(wild type)이 아닌 변형된 NC 단백질 형태로 발현된다는 단점이 있었다.

한편, 숙주에서 드문 코돈을 숙주가 선호하는 코돈으로 변화 (코돈-최적화 (codon optimisation))시켜 이종 발현의 수준이 증진된 예가 여러가지 있다. 예를 들어, BPV (소 파필로마 바이러스)의 후기 유전자인 L1 및 L2는 포유동물 코돈 이용도 패턴에 대하여 코돈 최적화가 이루어졌고, 이로 인해 포유동물 (Cos-1) 세포 배양액에서 야생형 HPV 서열보다 증가된 수준으로 발현됨이 보고된 바 있다(Zhou et. al. J. Virol 73, 4972-4982, 1999.). 상기 기술에서는 포유동물에서보다 BPV에서 출현 빈도가 2배를 넘는 모든 BPV 코돈 (이용율>2), 및 이용율이 1.5를 초과하는 대부분의 코돈을 포유동물에서 우세하게 사용되는 코돈으로 보존적으로 치환하였다. 또한, WO97/31115호, WO97/48370호 및 WO98/34640호 (Merck ＆ Co., Inc.)에서 HIV 유전자 또는 그 단편의 코돈 최적화를 통해 단백질 발현의 증가를 초래하였고, 최적화 조작의 대상인 숙주 포유동물에서 DNA 백신으로서 코돈 최적화 서열을 사용한 경우에 면역성이 향상됨이 개시된 바 있다.

본 발명자들은 이런한 점에 착안하여 상기 제시된 문제점들을 극복할 수 있는 HIV NC 단백질의 생산방법을 연구하던 중 천연형의 HIV의 NC 폴리뉴클레오티드를 코돈 최적화시킨 다음 인트론 서열과 상기 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 연결시키거나 인트론 서열과 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드 하부에 mRNA 안정화 인자(mRNA stability element)를 추가적으로 연결시켜 발현시킬 경우 천연형(wild type)의 NC 단백질을 발현시킬 수 있으며, 그 발현효율이 향상되는 효과가 있다는 것을 확인하므로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 천연형의 HIV의 NC 폴리뉴클레오티드를 코돈 최적화시킨 다음 인트론 서열과 상기 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 연결시키거나 인트론 서열과 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드 하부에 mRNA 안정화 인자(mRNA stability element)를 추가적으로 연결시켜 발현시키는 HIV의 NC 단백질 발현용 벡터 및 이를 이용한 NC 단백질의 생산방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포유동물 세포 발현에 적합하게 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 인트론 서열과 상기 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 연결시키거나 인트론 서열과 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드 하부에 mRNA 안정화 인자(mRNA stability element)를 추가적으로 연결시켜 발현시킬 수 있는 HIV의 NC 단백질 발현용 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 HIV의 NC 단백질의 생산방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

HIV 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid, NC) 단백질의 생산은 효과적인 항바이러스제의 개발에 매우 중요하다 할 것이나, 현재까지 동물세포에서 HIV NC 단백질의 발현은 매우 저조한 상태이다. 본 발명자들은 이를 개선하기 위하여 연구를 거듭하던 중 천연형의 HIV의 NC 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 발현에 적합하게 코돈 최적화시킨 다음 인트론 서열과 상기 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 연결시키거나 인트론 서열과 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드 하부에 mRNA 안정화 인자(mRNA stability element)를 추가적으로 연결시켜 발현시킬 수 있는 HIV의 NC 단백질 발현용 벡터를 이용할 경우 HIV NC 단백질의 발현이 현저히 개선되는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 서열번호 6으로 표시되는 HIV NC 단백질을 암호화하며, 포유동물 세포에서 고발현되도록 코돈-최적화시킨 HIV NC(Optimized HIV NC) 폴리 뉴클레오티드를 제공한다.

보다 구체적으로, 상기 HIV NC 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 코돈-최적화시킨 HIV NC(Optimized HIV NC) 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 용어 "코돈-최적화"는 각종 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 암호화 영역 또는 유전자를 지칭함에 따라, DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 변화시키지 않고서 숙주 유기체의 전형적인 코돈 활용을 반영하도록 상기 핵산 분자의 암호화 영역 또는 유전자 내의 코돈을 변화시키는 것을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 유전자 및 DNA 암호화 영역을, 표 1 및 표 2를 이용하여 포유동물 세포에서의 최적의 발현을 위해 코돈-최적화시킨다.

코돈-최적화는 DNA 전부 (또는 일정 부분)을 합성하여, 전사된 mRNA에 존재할 수도 있는 이차 구조의 모든 탈안정화 서열 또는 영역을 제거할 수도 있고, DNA 전부 (또는 일정 부분)을 합성하여, 염기 조성을 목적하는 숙주 세포에서 보다 선호될 수 있는 것으로 변화시킬 수도 있다.

본 발명에서는 Upgene: A Web-Based DNA Codon Optimization Algorithm (Wentao Gao , Alexis Rzewski , Huijie Sun , Paul D. Robbins and Andrea Gambotto ) 과 GenScript Corporation(www.genscript.com)의 코돈 빈도 표(Codon Frequency Table)를 이용하여 NC 코돈을 최적화 하였으며. 이를 통해 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 11로 표시되는 포유동물 세포에서 고발현되도록 코돈- 최적화시킨 HIV-NC 폴리뉴클레오티드를 서열을 수득할 수 있었다(실시예 1 참조).

상기와 같이 제작된 코돈-최적화된 HIV-NC 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 본 발명에서는 인트론 서열과 코돈-최적화된 HIV-NC 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 HIV NC 단백질 발현용 벡터를 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 a) SV40 19s mRNA 인트론 서열, 변형된 SV40 16S mRNA 인트론 서열 및 β-글로빈 인트론 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열; 및 b) 서열번호 6으로 표시되는 HIV NC 단백질을 암호화하며, 포유동물 세포에서 고발현되도록 코돈-최적화시킨 HIV NC(Optimized HIV NC) 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결된 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV NC 단백질 발현용 벡터를 제공한다.

상기 "HIV의 NC 단백질” 이란 AIDS(acquired Immunodeficiency Syndrome, 후천성 면역결핍증)을 일으키는 병원체인 HIV(human immunodeficiency virus)의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질을 의미하며, 상기 단백질은 바이러스 게놈 RNA에 강하게 결합하여 리보 핵산단백질 코어 복합체(ribonucleoprotein core complex)를 형성한다. 본 발명의 일실시예에서 발현되는 HIV NC 단백질 서열은 ARV2/SF 계통 유래로써 GenBank No.P03349의 380번째 ~ 434번째 아미노산 서열로 개시되어 있다(서열번호 6). 한편, 본 발명의 일실시예에서 사용한 NC 폴리뉴클레오티드 서열은 pJC1 벡터에서 유래되었다(HIV Nucleocapsid Protein; Expression in E. coli, Purification and Characterization. J. Biol. Chem. 268, 16519- 16527, 1993)

본 발명에서 용어, "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다

본 발명에서 용어, “발현용 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있고, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

상기 인트론 서열로는 당업계에 공지된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, SV40 19s mRNA 인트론 서열, 변형된 SV40 16S mRNA 인트론 서열 및 β-globin 인트론 서열 등이 있다. 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 SV40 19s mRNA 인트론 서열, 서열번호 2로 표시되는 변형된 SV40 16S mRNA 인트론 서열 및 서열번호 9로 표시되는 β-글로빈 인트론(β-globin intron) 서열을 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 사용한 인트론 서열은 pCMV-HA(Clontech Laboratories, Inc) 벡터의 인트론 서열(SV40 splice donor/splice acceptor; 이하, 'SV40 SD/SA'로 표시함)로부터 유래하였는데, 상기 벡터의 672~702번째는 SV40 19S mRNA 인트론 서열이며, 672~768번째는 변형된 SV40 16S mRNA 인트론 서열이다. 본 발명의 다른 일실시예에서 사용한 인트론 서열은 pLP 벡터(Invitrogen사)에서 유래한 β-글로빈 인트론(β-globin intron) 서열이다.

본 발명의 일실시예에서는 SV40 SD/SA 인트론 서열 또는 β-글로빈 인트론 서열, 서열번호 5의 포유동물 세포에서 고발현되도록 코돈-최적화시킨 HIV NC(Optimized HIV NC) 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 벡터를 제작하고, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 NC 단백질이 고발현되는 것을 확인하였다(실시예 <2-2>, 실시예 <4> 참조).

본 발명은 또한, 상기 코돈-최적화된 HIV NC(Optimized HIV NC) 유전자 하부에 mRNA 안정화 인자(mRNA stability element)가 추가적으로 연결된 것을 특징으로 하는 벡터를 제공한다.

상기 “mRNA 안정화 인자(mRNA stability element)”란 mRNA의 3' 말단에 결합하여 안정성을 증가시키는 엘레먼트(stability element)를 말하며, 바람직하게는 RRE(Rev response element), WPRE(woodchuck post-transcriptional regulatory element), 베타-액틴 3'-UTR(β-actin 3'-untranslated regions) 및 RSV 안정화 인자 (Rous Sarcoma Virus stability element)군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 “RRE”는 Rev 반응인자(RRE: Rev responsive element)를 말하는 것으로 RRE는 HIV-l RNA의 env 유전자 내에 존재하는 시스-액팅 엘레먼트(cis-acting element)로써 Rev 단백질과 직접 결합한다. “WPRE(WPRE: woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element)”는 우드척 간염 바이러스의 유래의 "포스트-전사 조절 요소(PRE)"를 일컬으며, 포스트-전사 수준(post-transcriptional level)에서 시스(cis)로 작용하여 세포핵에서 세포질로의 수송을 조절하여 세포질내 유전자 전사물의 축적을 증가시키는 바이러스 서열을 말한다. 마지막으로, 베타-액틴 3'-UTR(β-actin 3'-untranslated regions) 및 RSV 안정화 인자(Rous Sarcoma Virus stability element)는 모두 세포핵에서 세포질로의 수송을 조절하던지 또는 분해(degradation)를 막아 세포질내에 유전자 전사물의 축적을 증가시키는 서열이다.

본 발명의 일실시예에서는 mRNA 안정화 인자(mRNA stability element)로 RRE 염기서열을 사용하였는데, 상기 RRE는 HIV HXB2 계통(strain)으로부터 유래하고, GenBank accession No. K03455로 공지된 RRE 서열을 사용하였으며, 상기 서열 중 RRE에 해당하는 7769번~8002번 서열을 서열번호 3으로 나타내었다. WPRE는 우드척 간염 바이러스 WHV8 계통으로부터 유래한 서열(Journal of Virology Apr.1999,p.2886-2892)을 사용할 수 있다. 상기 개시된 서열 중 WPRE에 해당하는 1093bp~1684bp 부분을 서열번호 4로 나타내었다. 또한,“베타-액틴 3'-UTR(β-actin 3'-untranslated regions)” 및 “RSV 안정화 인자(Rous Sarcoma Virus stability element)”은 다음 문헌에 기재되어 있는 서열을 사용할 수 있다(The 3'-end of the human beta-actin gene enhances activity of the beta-actin expression vector system: construction of improved vector., Journal of Biochemical & Biophysical Methods. 36(1):63-72, 1997; A 3' UTR sequence stabilizes termination codons in the unspliced RNA of Rous sarcoma virus., RNA-A Publication of the RNA Society., 12(1):102-10, 2006.).

본 발명자들은 선행연구(한국특허등록번호 제 0553154호)에서 CMV(cytomegalovirus) 프로모터를 포함하는 진핵세포 발현벡터에 NC 폴리뉴클레오티드를 도입하여 동물세포에서 NC 단백질 발현을 시도하였으나 발현이 되지 않았으며, 이것이 NC mRNA의 안정성 문제와 연관되어 있어 NC mRNA의 복제수 증가가 필요하다는 것을 확인할 수 있었다. 이를 해결하기 위하여 본 발명자들은 NC 폴리뉴클레오티드 상부에 인트론 서열을 도입하여 NC mRNA의 안정성을 증가시키거나 N-말단에 FLAG를 삽입하여 발현시킨 결과, NC 폴리뉴클레오티드 상부에 인트론 서열을 도입한 경우에는 미량의 NC 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, N-말단에 FLAG를 삽입한 경우에는 N-말단 FLAG 융합 NC 단백질 형태로 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 상기 방법은 NC 단백질의 발현효율이 높지 않거나, 천연형의 NC 단백질 형태가 아니라는 단점이 있어 새로운 방법의 개발이 요구되었다. 이에 본 발명자들은 순차적으로 연결된 인트론 서열과 코돈 최적화시킨 HIV NC(nucleocapsid) 폴리뉴클레오티드 하부에 mRNA 안정화 인자를 추가할 경우, HIV NC 단백질의 발현이 증가되면서도 천연형의 NC 단백질을 생산할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 종래, 상기 mRNA 안정화 인자가 HIV NC 단백질 발현을 증가시킨다는 보고는 개시된 바 없다.

본 발명의 일실시예에서는 SV40 SD/SA 인트론 서열, 서열번호 5의 포유동물 세포에서 고발현되도록 코돈-최적화시킨 HIV NC(Optimized HIV NC) 유전자가 순차적으로 연결되고 그 하부에 RRE(Rev response element)가 추가적으로 연결할 경우 NC 단백질이 고발현되는 것을 확인하였다(실시예 <3-2> 참조).

한편, 본 발명에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 다음 문헌에 기재되어 있다( Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience (1987).

본 발명은 또한, 상기 HIV의 NC 단백질 발현용 벡터로 형질전환된 세포를 제 공한다.

HIV의 NC 단백질 발현용 벡터는 통상의 형질감염 방법, 예를 들어 DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트법, 미세주사법, DNA-함유한 리포좀 방법, 리포펙타민-DNA 복합체 방법 등 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

본 발명의 벡터로 형질전환할 수 있는 세포는 특별히 한정되지 않으나 COS-7 세포, 293T세포, HEK293T, CHO 및 HeLa 등을 이용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 COS-7 세포, 293T 세포이다.

본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 HIV NC 단백질의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 HIV의 NC 단백질 발현용 벡터로 형질전환된 293T 세포를 당업계에 공지된 방법으로 배양한 결과 천연형의 HIV NC 단백질이 발현됨을 확인하였다(실시예<2-2>, 실시예<3-2>, 실시예<4> 참조.).

형질전환체에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 HIV NC 단백질을 정제할 수 있다(Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. AcademicPress. Inc., San Diego, CA(1990)).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

OptiNC 폴리뉴클레오티드의 합성

포유동물 세포에서 HIV-1 NC(Nucleocapsid) 단백질의 발현을 증가시키기 위하여 RNA 2차 구조, GC 함량 및 반복 코돈(repetitive codon) 등에 변화를 줄 수 있는데, 본 실시예에서는 Upgene: A Web-Based DNA Codon Optimization Algorithm (Wentao Gao , Alexis Rzewski , Huijie Sun , Paul D. Robbins and Andrea Gambotto ) 과 GenScript Corporation(www.genscript.com)의 코돈 빈도 표(Codon Frequency Table)를 이용하여 NC 코돈을 최적화하였다.

우선, HIV-1 Nucleocapsid (NC) 오리지널(original) 염기서열을 하기 표 1에 개시한 Upgene과 GenScript의 코돈 사용빈도 알고리즘(codon usage algorithm)을 이용하여 최적의 코돈을 선택 조합하였고, 각각의 확률 스코어(probability score)를 Upgene의 스코어로 환산하여 이를 하기 표 2에 나타내었다. 상기 표 1과 표 2를 참조하여 도 1에 개시된 바와 같이 4개의 코돈-최적화(codon-optimized)시킨 NC 폴리뉴클레오티드(Genscript01, Genscript02, Genscript03, Upgene)를 도출하였으며, 이중 GenScript01의 최적화된 NC 폴리뉴클레오티드 서열을 선택하여 GenScript에서 합성하였다. 합성된 코돈-최적화(codon-optimized)시킨 NC 폴리뉴클레오티드의 5’말단과 3’말단에는 클로닝을 위하여 HindIII와 EcoRI 제한효소 부위를 추가적으로 삽입되어 있다(서열번호 7). 한편, GenScript의 코돈 사용빈도 알고리즘(codon usage algorithm)을 이용하여 최적화된 NC 폴리뉴클레오티드인 GenScript01을 서열번호 5로, GenScript02를 서열번호 10으로, GenScript03을 서열번호 11로 나타내었으며, Upgene의 코돈 사용빈도 알고리즘(codon usage algorithm)을 이용하여 최적화된 NC 폴리뉴클레오티드를 서열번호 8로 나타내었다.

상기 합성된 코돈-최적화(codon-optimized)된 NC 폴리뉴클레오티드와 오리지널(original) NC 폴리뉴클레오티드의 서열을 정렬(Sequence alignment)하여 도 1에 나타내었다.

스코어(Score)			빈도(Frequency)
아미노산	DNA	Upgene	Genscript
ALA	GCT	17	18.6
	GCC	52	28.5
	GCA	14	16
	GCG	17	7.6
ARG	CGT	9	4.7
	CGC	39	10.9
	CGA	7	6.3
	CGG	18	11.9
	AGA	10	11.5
	AGG	17	11.4
ASN	AAT	22	16.7
	AAC	78	19.5
ASP	GAT	32	22.3
	GAC	68	26
CYS	TGT	31	9.9
	TGC	69	12.2
GLN	CAA	12	11.8
	CAG	88	34.6
GLU	GAA	24	29
	GAG	76	40.8
GLY	GGT	10	10.8
	GGC	50	22.8
	GGA	12	16.3
	GGG	28	16.4
HIS	CAT	22	10.4
	CAC	78	14.9
ILE	ATT	18	15.7
	ATC	76	21.4
	ATA	6	7.1
VAL	GTT	8	10.9
	GTC	25	14.6
	GTA	7	7
	GTG	60	28.9
LEU	TTA	3	7.2
	TTG	4	12.6
	CTT	4	12.8
	CTC	28	19.4
	CTA	3	6.9
	CTG	58	40.3
LYS	AAA	18	24
	AAG	82	32.9
TYR	TAT	24	12
	TAC	76	15.6
PRO	CCT	19	17.3
	CCC	48	20
	CCA	16	16.7
	CCG	17	7
PHE	TTT	20	16.9
	TTC	80	20.4
SER	TCT	8	14.6
	TCC	37	17.4
	TCA	7	11.7
	TCG	20	4.5
	AGT	18	11.9
	AGC	10	19.4
THR	ACT	14	12.8
	ACC	56	19.2
	ACA	14	14.8
	ACG	16	6.2
MET	ATG	100	22.3
TRP	TGG	100	12.8
STOP	TAA	100	0.7
	TAG	100	0.5
	TGA	100	1.3

	천연형 NC 코돈		최적화된 NC 코돈		최적화된 NC 코돈
		스코어	Upgene	스코어	GenScript	스코어
M	ATG	100		100		100
Q	CAG	88		88		88
R	AGA	10	CGC	39	cgg	18
G	GGC	50		50	gga	12
N	AAT	22	AAC	78		78
F	TTT	20	TTC	80		80
R	AGG	17	CGC	39	agg	17
N	AAC	78		78		78
Q	CAA	12	CAG	88		88
R	AGA	10	CGC	39	cga	7
K	AAG	82		82	aaa	18
T	ACT	14	ACC	56	aca	14
V	GTT	8	GTG	60		60
K	AAG	82		82		82
C	TGT	31	TGC	69		69
F	TTC	80		80		80
N	AAT	22	AAC	78	aat	22
C	TGT	31	TGC	69		69
G	GGC	50		50	gga	12
K	AAA	18	AAG	82		82
E	GAA	24	GAG	76		76
G	GGG	28	GGC	50		50
H	CAC	78		78		78
I	ATA	6	ATC	76		76
A	GCC	52		52	gct	17
K	AAA	18	AAG	82		82
N	AAT	22	AAC	78		78
C	TGC	69		69		69
R	AGG	17	CGC	39	cgg	18
A	GCC	52		52		52
P	CCT	19	CCC	48		48
R	AGG	17	CGC	39	aga	10
K	AAA	18	AAG	82		82
K	AAG	82		82	aaa	18
G	GGC	50		50		50
C	TGT	31	TGC	69		69
W	TGG	100		100		100
R	AGA	10	CGC	39	aga	10
C	TGT	31	TGC	69		69
G	GGA	12	GGC	50		50
R	AGG	17	CGC	39	aga	10
E	GAA	24	GAG	76		76
G	GGA	12	GGC	50		50
H	CAC	78		78		78
Q	CAA	12	CAG	88		88
M	ATG	100		100		100
K	AAA	18	AAG	82		82
D	GAT	68		68		68
C	TGC	69		69		69
T	ACT	14	ACC	56	act	14
E	GAG	76		76		76
R	AGA	10	CGC	39		39
Q	CAG	88		88		88
A	GCT	17	GCC	52	gca	14
N	AAT	22	AAC	78		78
STOP	TGA	100		100		100

	Total	2286		3706		3106

한편, 상기에서 합성한 HIV NC 폴리뉴클레오티드(GenScripte01)의 코돈 최적화시키기 전(도 2의 A)과 후(도 2의 B) 각 코돈 사용빈도를 도 2에 나타내었다. 상기 그래프는 포유동물 세포에서 사용되는 코돈 사용빈도(codon preferenece)에 따라서 자연형 NC 및 코돈 최적화된 NC 서열에 실제 사용된 코돈의 변화를 백분율(percentage)로 나타낸 것이다.

< 실시예 2>

pCMV (- HA )/ OptiNC 벡터를 이용한 NC 단백질의 생산

<2-1> pCMV (- HA )/ OptiNC 벡터의 구축

SV40 SD/SA 인트론 서열 및 코돈-최적화된 HIV NC(Optimized HIV NC) 유전자가 순차적으로 연결된 HIV NC 단백질 발현용 벡터를 구축하였다.

벡터의 구축과정은 도 3에 도시하였다. 상기 실시예 1에서 합성된 OptiNC DNA(서열번호 5)를 EcoR I/Hind III로 제한효소 처리한 다음 상기 제한효소 처리된 단편을 먼저 준비해 둔 EcoR I/Hind III로이 처리된 pUC57 벡터(Genescript사)에 클로닝하였고 이를 pUC57/OptiNC라 명명하였다. 상기 pUC57/OptiNC와 pcDNA4/TO(Invitrogen사)를 HindIII와 EcoRI으로 절단한 다음 라이게인션하여 pcDNA4/TO/OpicNC를 제작하였다. 상기 pcDNA4/TO/OptiNC를 HindIII와 NotI으로 처리한 다음 절단된 DNA에 클리나우(Klenow) 단편을 처리하였다. pCMV(-HA) 벡터(Clontech Laboratories, Inc.)도 EcoRI 및 NotI으로 처리한 다음 절단된 DNA에 클리나우(Klenow) 처리하였다. 상기 클리나우(Klenow) 단편이 처리된 두 단편을 라이게이션하여 이를 pCMV(-HA)/OptiNC라 명명하였다.

<2-2> pCMV (- HA )/ OptiNC 벡터를 이용한 NC 단백질의 발현

293T 세포를 1% 스트렙토마이신/페니실린과 10%(v/v) 우배아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배양액에서 배양하였다. 형질도입 하루 전에, 배양한 세포를 12 웰 플레이트에 웰 당 1x106 정도의 밀도로 접종하여 형질도입시 60 ~ 80% 정도의 조밀도(confluency)를 보이도록 배양하였다. 한편, 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 pCMV(-HA)/OptiNC 벡터 1㎍을 2㎕의 JetPEI제제(Polyplus-transfection Inc)와 혼합한 후, 200㎕의 무혈청 배양액과 함께 실온에서 20분간 반응시켰다. 이어, 형질도입시킬 세포의 배양액을 1㎖의 무혈청 배양액으로 교환하고, 상기 무혈청 배양액에 상기 반응액을 첨가하여, 이산화탄소 세포 배양기에서 4시간 동안 추가로 배양하였다. 추가 배양 후에, 세포 배양액을 10%(v/v) FBS를 포함하는 DMEM 배양액으로 교환한 후, 2일 동안 다시 배양하고, 세포를 수득하였다.

한편, 상기 형질전환된 세포에서 NC 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 먼저, 수득된 세포에서 단백질을 추출하기 위하여, 각 세포를 lysis 용액(50mM Tris-HCl(pH7.4), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% TyitonX-100, 1% Sodium deoxycholate, 1% SDS, protase inhibitor coktail) 으로 용해시킨 후, 15,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 수득한 다음 15% SDS-PAGE를 수행하였다. 이후, Anti-NC 단클론 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하였으며(도 5의 A), 그 발현량을 수치로 나타내었다(도 5의 B).

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, pCMV(-HA)/OptiNC 벡터로 형질전환된 세포에서의 NC 단백질 발현량 267.88 IOD로 나타났다. 이는 천연형의 NC 폴리뉴클레오티드가 삽입된 pCMV(-HA)NC에 비하여 그 발현량이 월등히 향상되는 것을 나타내는 것으로(레인 2, 레인 3 참조), 천연형의 NC 폴리뉴클레오티드를 코돈 최적화된 NC 폴리뉴클레오티드로 치환할 경우 NC 단백질이 높은 수율로 발현될 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

pCMV (- HA )OptiNC/ RRE 벡터를 이용한 NC 단백질의 생산

<3-1> pCMV (- HA )OptiNC/ RRE 벡터의 구축

SV40 SD/SA 인트론 서열, 코돈-최적화된 HIV NC(Optimized HIV NC) 유전자 및 RRE(Rev response element)가 순차적으로 연결된 HIV NC 단백질 발현용 벡터를 구축하였다. 벡터의 구축과정은 도 4에 도시하였다.

먼저, pLP/OptiNC 벡터는 다음과 같이 제조하였다. pLP1 벡터(Invitrogen사)에 PmlI/AvrII/BspEI 을 처리하여 GAG-POL 유전자를 잘라내고, OptiNC 폴리뉴클레오티드는 pCMV(-HA)/OptiNC 벡터에서 XmaI/EcoRI 처리하여 수득하였다. 상기 pLP1 벡터와 수득한 OptiNC 폴리뉴클레오티드 모두 클리나우(Klenow) 처리하여 평활말단 라이게이션(Blunt end ligation)하여 이를 pLPOptiNC/RRE 벡터라 명명하였다.

상기 수득된 pLPOptiNC/RRE 벡터를 XmaI/SacII로 처리하여 OptiNC와 RRE가 연결된 유전자 단편을 수득한 다음 상기 수득된 단편을 먼저 준비해 둔 XmaI/SacII이 처리된 pCMV(-HA)/OptiNC 벡터에 클로닝하였고 이를 pCMV(-HA)OptiNC/RRE라 명명하였다.

<3-2> pCMV (- HA )OptiNC/ RRE 벡터를 이용한 NC 단백질의 발현

상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 pCMV(-HA)OptiNC/RRE 벡터를 293T세포에 형질전환시켜 배양한 다음 NC 단백질 발현여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿을 수행하였으며(도 5의 A), 그 발현량을 수치로 나타내었다(도 5의 B).

실험결과, 도 5에 도시된 바와 같이, pCMV(-HA)OptiNC/RRE 벡터로 형질전환된 세포에서의 NC 단백질 발현량 557.66 IOD로 나타났다. 이는 인트론 서열 하부에 OptiNC와 RRE 서열을 함께 조합하여 연결할 경우 NC 단백질의 발현량에 있어 상승효과가 있음을 나타내는 것이다(레인 3, 레인 4 참조). 한편, 본 발명자들의 선행연구(한국특허등록번호 제 0553154호)에서는 NC 폴리뉴클레오티드 상부에 FLAG 유전자를 추가로 연결하여 NC 단백질의 발현량을 증가시켰으나, 천연형의 NC 단백질이 아닌 FLAG가 연결된 변형된 형태의 NC 단백질이라는 문제점이 있었다. 그러나 본 발명에서는 OptiNC와 RRE 서열을 함께 조합하여 발현시키므로, NC 단백질 발현량은 NC 폴리뉴클레오티드 상부에 FLAG 유전자를 추가로 연결된 것(pCMV(-HA)Flag NC)과 비슷하면서도 천연형의 NC 단백질을 발현시킬 수 있었다(레인 4, 레인 5 참조).

< 실시예 4>

pLPOptiNC / RRE 벡터를 이용한 NC 단백질의 생산

인트론 서열로 SV40 19s mRNA 인트론 서열 및 변형된 SV40 16S mRNA 인트론 서열 외에도 β-글로빈 인트론(β-globin intron)을 사용하였을 경우에도 NC 단백질의 발현효율이 향상되는 효과가 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>에서 제조한 pLPOptiNC/RRE 벡터를 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 293T 세포에 형질전환시켜 배양한 다음 NC 단백질 발현여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

실험결과 도 6에 나타난 바와 같이, β-글로빈 인트론(β-globin intron) 서열을 사용하였을 경우에도 NC 단백질 발현량은 NC 폴리뉴클레오티드 상부에 FLAG 유전자를 추가로 연결된 것(pCMV(-HA)Flag NC)과 비슷하면서도 천연형의 NC 단백질을 발현시킬 수 있음을 확인할 수 있었다(레인 3, 레인 5 참조).

상기한 바와 같이, 포유동물 세포 발현에 적합하게 코돈 최적화시킨 HIV의 NC 폴리뉴클레오티드, 인트론 서열과 상기 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 연결시키거나 인트론 서열과 코돈-최적화시킨 NC 폴리뉴클레오티드 하부에 mRNA 안정화 인자(mRNA stability element)를 추가적으로 연결시킨 것을 특징으로 하는 HIV의 NC 단백질 발현용 벡터는 동물세포에서 천연형(wild type)의 NC 단백질을 발현시킬 수 있으며, 그 발현효율이 종래 기술에 비하여 향상되는 효과가 있다.

<110> YOU, JI CHANG <120> Codon-optimized HIV NC poly-nucleotide, vector containing said poly-nucleotide and method for producing NC protein using the same <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> SV40 late 19s mRNA intron <400> 1 gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca 30 <210> 2 <211> 97 <212> DNA <213> Modified SV40 late 16S mRNA intron <400> 2 gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60 agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctag 97 <210> 3 <211> 234 <212> DNA <213> RRE(Rev response element) : NL4-3 strain <400> 3 aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 60 gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120 gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180 gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct 234 <210> 4 <211> 592 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis B virus (WPRE region) <400> 4 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180 tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240 ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300 attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360 ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420 gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480 aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540 cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg 592 <210> 5 <211> 168 <212> DNA <213> Codon-optimized HIV NC poly-nucleotide(GenScript) <220> <221> CDS <222> (1)..(165) <400> 5 atg cag cgg gga aac ttc agg aac cag cga aaa act gtg aag tgc ttc 48 Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe 1 5 10 15 aat tgc gga aag gag ggc cac atc gct aag aac tgc cgg gcc ccc aga 96 Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg 20 25 30 aag aaa ggc tgc tgg aga tgc ggc aga gag ggc cac cag atg aag gac 144 Lys Lys Gly Cys Trp Arg Cys Gly Arg Glu Gly His Gln Met Lys Asp 35 40 45 tgc act gag cgg cag gca aac tga 168 Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn 50 55 <210> 6 <211> 55 <212> PRT <213> Codon-optimized HIV NC poly-nucleotide(GenScript) <400> 6 Met Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe 1 5 10 15 Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg 20 25 30 Lys Lys Gly Cys Trp Arg Cys Gly Arg Glu Gly His Gln Met Lys Asp 35 40 45 Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn 50 55 <210> 7 <211> 193 <212> DNA <213> Codon-optimized HIV NC for cloning <400> 7 aagcttcccg ggaatgcagc ggggaaactt caggaaccag cgaaaaactg tgaagtgctt 60 caattgcgga aaggagggcc acatcgctaa gaactgccgg gcccccagaa agaaaggctg 120 ctggagatgc ggcagagagg gccaccagat gaaggactgc actgagcggc aggcaaactg 180 actgcaggaa ttc 193 <210> 8 <211> 168 <212> DNA <213> Codon-optimized HIV NC poly-nucleotide(Upgene) <400> 8 atgcagcgcg gcaacttccg caaccagcgc aagaccgtga agtgcttcaa ctgcggcaag 60 gagggccaca tcgccaagaa ctgccgcgcc ccccgcaaga agggctgctg gcgctgcggc 120 cgcgagggcc accagatgaa ggactgcacc gagcgccagg ccaactga 168 <210> 9 <211> 340 <212> DNA <213> Human beta-globin intron <400> 9 tacacatatt gaccaaatca gggtaatttt gcatttgtaa ttttaaaaaa tgctttcttc 60 ttttaatata cttttttgtt tatcttattt ctaatacttt ccctaatctc tttctttcag 120 ggcaataatg atacaatgta tcatgcctct ttgcaccatt ctaaagaata acagtgataa 180 tttctgggtt aaggcaatag caatatttct gcatataaat atttctgcat ataaattgta 240 actgatgtaa gaggtttcat attgctaata gcagctacaa tccagctacc attctgcttt 300 tattttatgg ttgggataag gctggattat tctgagtcca 340 <210> 10 <211> 168 <212> DNA <213> Codon-optimized HIV NC poly-nucleotide(Genscript02) <400> 10 atgcagcggg gaaacttcag gaaccagcgg aaaactgtga agtgcttcaa ttgcggaaag 60 gagggccaca tcgctaagaa ctgccgcgcc cccagaaaga aaggctgctg gagatgcggc 120 agagagggcc accagatgaa ggactgcaca gagcgccagg caaactga 168 <210> 11 <211> 168 <212> DNA <213> Codon-optimized HIV NC poly-nucleotide(Genscript03) <400> 11 atgcagcggg gaaacttcag gaaccagagg aaaactgtga agtgcttcaa ttgcggaaag 60 gagggccaca tcgctaagaa ctgcagggcc cccagaaaga aaggctgctg gagatgcggc 120 agagagggcc accagatgaa ggactgcacg gagaggcagg caaactga 168

Claims

HIV NC 단백질을 암호화하며, 포유동물 세포에서 고발현되도록 코돈-최적화시킨 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 HIV NC(Optimized HIV NC) 폴리뉴클레오티드.
삭제
제1항의 코돈-최적화시킨 HIV NC(Optimized HIV NC) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HIV NC 단백질 발현용 벡터.
제3항에 있어서, 상기 벡터가 a) SV40 19s mRNA 인트론 서열, 서열번호 2로 표시되는 변형된 SV40 16S mRNA 인트론 서열 및 β-글로빈 인트론 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열; 및 b) HIV NC 단백질을 암호화하며, 포유동물 세포에서 고발현되도록 코돈-최적화시킨 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 10 및 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 군에서 선택된 HIV NC(Optimized HIV NC) 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결된 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 HIV NC 단백질 발현용 벡터.
제4항에 있어서, 상기 코돈-최적화시킨 HIV NC(Optimized HIV NC) 폴리뉴클레오티드 하부에 mRNA 안정화 인자(mRNA stability element)가 추가적으로 연결된 것을 특징으로 하는 벡터.
제4항에 있어서, 상기 SV40 19s mRNA 인트론 서열은 서열번호 1로 이루어지며, β-글로빈 인트론(β-globin intron) 서열은 서열번호 9로 이루어진 것을 특징으로 하는 벡터.
제4항에 있어서, 상기 HIV NC 단백질 발현용 벡터는 도 3에 개시된 pCMV(-HA)/OptiNC 벡터의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 벡터.
제5항에 있어서, 상기 mRNA 안정화 인자는 RRE(Rev response element), WPRE(woodchuck post-transcriptional regulatory element), 베타-액틴 3'-UTR(β-actin 3'-untranslated regions) 및 RSV 안정화 인자 (Rous Sarcoma Virus stability element)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 벡터.
제5항에 있어서, 상기 HIV NC 단백질 발현용 벡터는 도 4에 개시된 pCMV(-HA)/OptiNC/RRE 벡터의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 벡터.
제3항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환된 세포.
제10항에 있어서, 상기 세포가 COS-7 또는 293T 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
제10항의 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 HIV NC 단백질의 생산방법.