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KR101156745B1 - 지지세포 비함유, 이종 비함유의 인간 배아줄기세포의 조제방법 및 이들을 사용하여 조제되는 줄기세포 배양물 - Google Patents

지지세포 비함유, 이종 비함유의 인간 배아줄기세포의 조제방법 및 이들을 사용하여 조제되는 줄기세포 배양물 Download PDF

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KR101156745B1
KR101156745B1 KR1020057011099A KR20057011099A KR101156745B1 KR 101156745 B1 KR101156745 B1 KR 101156745B1 KR 1020057011099 A KR1020057011099 A KR 1020057011099A KR 20057011099 A KR20057011099 A KR 20057011099A KR 101156745 B1 KR101156745 B1 KR 101156745B1
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KR1020057011099A
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Inventor
미쉘 아밋
조셉 이츠코비츠-엘도르
Original Assignee
테크니온 리서치 앤드 디벨롭먼트 파운데이션 리미티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 지지세포를 함유하지 않고, 이종을 함유하지 않는 배양 시스템을 사용하여 인간 배아줄기세포주를 확립 및 확대하는 방법, 및 이종 혼입물 및 지지세포를 함유하지 않는 배양에서 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 것이 가능한 줄기세포에 관련된다.
Figure R1020057011099
인간 배아 줄기 세포주, 미분화, 지지세포, 이종

Description

지지세포 비함유, 이종 비함유의 인간 배아줄기세포의 조제방법 및 이들을 사용하여 조제되는 줄기세포 배양물{METHODS OF PREPARING FEEDER CELLS-FREE, XENO-FREE HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS AND STEM CELL CULTURES PREPARED USING SAME}
본 발명은 지지세포(예를 들면, 지지세포층(feeder cell layer), 지지세포층(feeder layer)으로도 알려져 있다)를 함유하지 않고, 이종을 함유하지 않는 배양 시스템을 사용하는 인간 배아줄기세포주를 조제하는 방법, 및, 이종 혼입물 및 지지세포를 함유하지 않는 배양에서 다능성 및 증식성의 미분화 상태에 유지하는 것이 가능한 줄기세포에 관한 것이다.
배아줄기세포(ESC)는 전능성이므로, 임의의 타입의 세포에 발달하고, 또 완전한 생물체를 포함하여 임의의 타입의 조직 또는 기관 또는 신체부분을 발생시키는 잠재적 능력을 가지고 있다. 그러므로, 정상의 클론성 인간ESC를 요구에 응하여 제공하는 것이 가능하고, 또 그 분화를 조작하는 것이 가능한 것은 생물의학분야, 산업분야 및 과학분야에서 근본적인 진보의 원동력이 될 수 있는 강력한 툴을 제공하는 것이 예상된다. ESC의 잠재적인 용도는 광범위에 걸쳐있고, 이것에는 약물의 발견 및 시험, 이식에 사용되는 세포, 조직 및 기관의 제조, 생체분자의 제조, 화합물의 독성 및/또는 기형발생의 시험, 및 발달프로세스 및 다른 생물학적 프로세스의 연구의 촉진이 포함된다. 예를 들면, ESC 또는 ESC 유래 세포의 치료적 이식에 의해 처치가능한 것이 현재 기대되는 질환에는 파킨슨병, 심근경색, 연소자형 당뇨병 및 백혈병이 포함된다(Gearhart,J., Science, 1998, 282:1061; Rossant 및 Nagy, Nature Biotech., 1999, 17:23).
그러나, 인간ESC의 실용적인 이용에 중대한 장해가 있다.
인간ESC를 미분화 상태로 유지하기 위해서는 ES배양물은 세포증식을 유지하고, ES세포의 분화를 저해하고, 다능성을 지속시키는 인자가 보충되어야 한다.
또 세포치환치료 및 조직재생치료의 경우, 인간ESC는 완전한 동물 비존재의 환경에서, 그리고 ES배양물의 완전한 재생산을 가능하게 하는 양호하게 규정된 배양조건의 존재 하에서 배양되어야 한다.
현재 실용화되어 있는 ES배양방법은 주로 줄기세포의 증식을 위해 필요한 인자를 분비하고, 한편으로 동시에 그 분화를 저해하는 지지세포층의 사용에 기초하고 있다. 지지세포 비함유 시스템도 또 ES세포의 배양에서 사용되어 있고, 그와 같은 시스템에서는 지지세포층의 대체물로서, 혈청, 사이토카인 및 증식인자가 보충된 매트릭스가 이용되고 있다.
지지세포층에 기초한 배양
마우스 지지세포층-ES세포를 배양하기 위한 가장 일반적인 방법은 ES세포의 증식 및 다능성을 지원하는 혈청 또는 백혈병저해인자(LIF)를 함유하는 조직배양배지가 보충된 지지세포층으로서의 마우스 배아섬유아세포(MEF)에 기초하고 있다[Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM(1998), 인간 배반포에 유래하는 배아줄기세포주, Science, 282:1145-7; Reubinoff BE, Pera MF, Fong C,Trounson A, Bongso A(2000), 인간 배반포 유래의 배아줄기세포주:인비트로 에서의 체세포분화, Nat.Biotechnol., 18:399-404]. MEF세포는 소태아혈청이 보충된 배지에서 12일령-13일령의 마우스 배로부터 얻어진다. 이들 조건 하에서 마우스 ES세포는 그 표현형 및 기능적 특징을 지속시키면서 다능성 줄기세포로서 배양상태에 유지하는 것이 가능하다. 그러나, 마우스 ES세포와 달리 외부로부터 첨가된 LIF의 존재 하에서는 인간 ES세포의 분화는 방해되지 않는다(Thomson 등, 1998, Science, 282:1145-7; Reubinoff 등, 2000, Nat.Biotechnol., 18:399-404). 더욱, 지지세포의 사용은 제조비용을 실질적으로 증대시키고, 인간 ES세포배양의 규모확대를 실시불가능하게 한다. 또 지지세포는 지지세포가 줄기세포를 성장시키지 않도록 대사적으로 불활성화되어 있고, 따라서, 인간 ES배양의 각각의 분할을 위해 신선한 지지세포를 가지는 것이 필요하다. 현재, 대량배양에서 조제된 배세포로부터의 지지세포성분의 분리는 효율적으로 달성하는 것이 불가능하므로, 지지세포층으로 조제된 ES배양물은 인간 치료에는 적합하지 않다.
ES세포는 또 염기성 섬유아세포증식인자(bFGF)가 보충된 혈청 대체물을 사용하는 혈청 비함유 상태 하에서 MEF 상에서 배양하는 것이 가능하다[Amit M, Carpenter MK, Inokuma MS, Chiu CP, Harris CP, Waknitz MA, Itskovitz-Eldor J, Thomson JA(2000), 클론적으로 얻어진 인간 배아줄기세포주는 다능성 및 증식능을 장기간의 배양에 걸쳐 유지한다, Dev.Biol., 227:271-8]. 이들 조건 하에서는 ES세포의 클론화 효율은 소태아혈청의 경우보다도 4배 높다. 또 혈청 대체물 하에서의 6개월의 배양의 후, ES세포는 배의 3개의 배엽의 전체를 함유하는 기형종을 형성하는 그 능력에 의해 보여지는 바와 같이, 그 다능성을 여전히 유지하고 있다. 이 시스템에서는 보다 양호하게 규정된 배양조건이 사용되지만 배양에서의 마우스 세포의 존재에 의해 인간 배양물은 세포에 기초하는 치료에서의 그 사용를 제한하는 병원체에 노출된다.
지지세포층으로서의 인간 배아섬유아세포 또는 성인 난관 상피세포-인간 ES세포는 인간 배아섬유아세포 또는 성인 난관 상피세포를 사용하여 성장되고, 또 유지되는 것이 가능하다. 이들 인간 지지세포 상에서 성장될 때, 인간 ES세포는 정상의 핵형을 나타내고, 알칼리 포스파타제 활성을 제공하고, Oct-4 및 다른 태아성 세포표면 마아커(이것에는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 GCTM-2가 포함된다)를 발현하고, 기형종을 인비보에서 형성하고, 또, 전체의 중요한 형태학적 특징을 유지한다[Richards M, Fong CY, Chan WK, Wong PC, Bongso A(2002), 인간 지지세포는 인간의 내부세포집단 및 배아줄기세포의 장기에 걸친 미분화 성장을 지원한다, Nat.Biotechnol., 20:933-6]. 그러나, 인간 배아섬유아세포 또는 성인 난관 상피세포를 지지세포로서 사용하는 것의 큰 결점은 이들 세포주는 모두 8회-10회에 지나지 않는 한정된 계대배양능력을 가지고, 그 결과, 장기에 걸친 ES성장기간의 능력을 제한한다는 것에 있다. 장기에 걸친 배양기간의 경우, ES세포는 다수의 대상체로부터 유래하는 인간 지지세포에서 성장되어야 하므로, 이것은 배양조건에서의 변동성의 증대를 초래한다.
포피 지지세포층-인간 ES세포는 미국특허출원제10/368045호에 개시되는 바와 같이 인간 포피 지지세포층 상에서 배양하는 것이 가능하다. 포피 유래의 지지세포층은 인간 ES세포를 배양하기 위해 적합한 완전한 동물 비존재의 환경으로 구성된다. 또 포피 세포는 그 유도 이후, 42회의 계대배양의 길이에 걸쳐 배양상태로 유지하는 것이 가능하고, 그 결과 ES세포에는 비교적 일정한 환경이 제공된다. 이들 조건 하에서는 인간 ES세포는 대체 프로토콜(예를 들면, MEF)를 이용하여 성장된 세포와 기능적으로 상이한 것이 발견되었다. 분화후, ES세포는 인비트로 에서는 배의 3개의 배엽의 전체에 관련하는 유전자를 발현하고, 인비보에서는 3개의 배엽의 전체로부터 발생하는 조직으로 구성되는 기형종을 형성했다. 또 인간 난관 상피세포 또는 인간 배아섬유아세포와 달리, 포피 지지세포층에서 배양된 인간 ES세포는 적어도 87회의 계대배양에 걸쳐 다능성 의 미분화 상태로 배양에서 유지되었다. 그러나, 포피 세포는 장기간(즉, 42회의 계대배양)에 걸쳐 배양상태에 유지하는 것이 가능하지만, 포피 배양 시스템은 별개의 배취 사이에서의 차이로 인해 양호하게 규정되어있지 않다. 또 인간 지지세포층에 기초한 배양 시스템에서는 지지세포층 및 hES세포의 양자의 동시성장이 여전히 요구된다. 따라서, 다양한 지지세포 비함유 배양 시스템이 개발되고 있다.
포피 지지세포층-인간 ES세포는 미국특허출원제10/368045호에 개시되는 바와 같이 인간 포피 지지세포층 상에서 배양하는 것이 가능하다. 포피 유래의 지지세포층은 인간 ES세포를 배양하기 위해 적합한 완전한 동물 비존재의 환경으로 구성된다. 또 포피 세포는 그 유도 이후, 42회의 계대배양의 길이에 걸쳐 배양상태로 유지하는 것이 가능하고, 그 결과 ES세포에는 비교적 일정한 환경이 제공된다. 이들 조건 하에서는 인간 ES세포는 대체 프로토콜(예를 들면, MEF)를 이용하여 성장된 세포와 기능적으로 상이한 것이 발견되었다. 분화후, ES세포는 인비트로 에서는 배의 3개의 배엽의 전체에 관련하는 유전자를 발현하고, 인비보에서는 3개의 배엽의 전체로부터 발생하는 조직으로 구성되는 기형종을 형성했다. 또 인간 난관 상피세포 또는 인간 배아섬유아세포와 달리, 포피 지지세포층에서 배양된 인간 ES세포는 적어도 87회의 계대배양에 걸쳐 다능성 의 미분화 상태로 배양에서 유지되었다. 그러나, 포피 세포는 장기간(즉, 42회의 계대배양)에 걸쳐 배양상태에 유지하는 것이 가능하지만, 포피 배양 시스템은 별개의 배취 사이에서의 차이로 인해 양호하게 규정되어있지 않다. 또 인간 지지세포층에 기초한 배양 시스템에서는 지지세포층 및 hES세포의 양자의 동시성장이 여전히 요구된다. 따라서, 다양한 な지지세포 비함유 배양 시스템이 개발되고 있다.
지지세포 비함유 배양
줄기세포는 배양배지의 존재하에서 세포외 매트릭스(예를 들면, MatrigelRTM 또는 라미닌) 등의 고체표면에서 성장시키는 것이 가능하다. 지지세포 및 줄기세포의 동시성장이 요구되고, 또 혼합된 세포집단을 초래할 수 있는 지지세포형 배양과는 달리, 지지세포 비함유 시스템에서 성장된 줄기세포는 표면으로부터 용이하게 분리된다. 줄기세포를 성장시키기 위해 사용되는 배양배지는 분화를 효과적으로 저해하고, 그 성장을 촉진시키는 인자(예를 들면, MEF 조건화 배지 및 Bfgf 등)을 함유한다. 그러나, 일반적으로 사용되어 있는 지지세포 비함유 배양 시스템에서는 마우스 혈청 또는 소 혈청 또는 MEF 조건화 배지가 보충된 동물계 매트릭스(예를 들면, MatrigelRTM)가 이용되고 있고[Xu C 등(2001), 미분화 인간 배아줄기세포의 지지세포 비함유성장, Nat Biotechnol, 19:971-4], 이들은 인간 ES세포에 대한 동물 병원체의 교차전이의 위험성을 초래하고, 따라서, 장래의 임상적 적용을 위험하게 한다.
미국특허출원제10/368045호에 더욱 개시되는 바와 같이, 줄기세포는 포피 유래의 조건화 배지가 보충된 매트릭스 표면에서 배양하는 것이 가능하다. 그러나, 이배지는 동물 비존재 시스템을 제공하고 있으나 배양조성의 점에서는 아직 양호하게 규정되어있지 않다.
보다 규정된 배양조성에서 인간 배아줄기세포를 배양하는 최근의 시도에서는 Matrigel 또는 라미닌의 표면 및 증식인자의 혼합물이 이용되었다. 그러나, 미국특허출원제20030017589호에 개시되는 바와 같이, 이들 조건 하에서는 세포의 50%-70%만이 미분화 세포의 형태를 보이고 있을 뿐이었다. 또 줄기세포는 더욱, 19시간의 비교적 짧은 배가시간을 나타냈다. 이것은 줄기세포가 종양형성성이 된다는 것을 시사하고 있다(Amit 외, 2000, Dev.Biol., 227:271-8를 참조할 것).
따라서, 인간 ES세포를 증식성 및 다능성 의 미분화 상태로 유지하는 것이 가능한, 상기의 제한을 가지지 않는 지지세포 비함유 및 이종 비함유의 배양 시스템이 필요하다는 것이 널리 인식되어 있고, 따라서, 그와 같은 배양 시스템을 가지는 것은 매우 바람직하다.
발명의 요약
본 발명의 하나의 태양에 의하면 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 것이 가능한 지지세포 비함유의 인간 배아줄기세포주를 확립하는 방법으로서, (a) 인간 배아줄기세포를 얻는 것, 및 (b) 지지세포를 함유하지 않고, 매트릭스와, TGFβ1, bFGF 및/또는 LIF가 보충된 조직배양배지를 함유하는 배양조건 하에서 상기 인간 배아줄기세포를 배양하고, 그 결과, 지지세포 비함유의 인간 배아줄기세포주를 얻는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 이 방법은 상기 배양조건 하에서의 공정(b)로부터 얻어지는 인간 배아줄기세포주로부터 세포를 클론화하는 것을 더욱 포함한다.
본 발명의 다른 태양에 의하면 지지세포를 함유하지 않는 배양조건 하에서 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 인간 배아줄기세포주를 확대하는 방법으로서, 인간 배아줄기세포주의 세포를, 매트릭스와, TGFβ1, bFGF 및/또는 LIF가 보충된 조직배양배지에 기초하여 배양하고, 그 결과, 인간 배아줄기세포주의 세포를 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 의하면 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 것이 가능한 지지세포 비함유의 인간 배아줄기세포주를 확립하는 방법으로서, (a) 인간 배아줄기세포를 얻는 것, 및 (b) 지지세포를 함유하지 않고, 피브로넥틴 매트릭스와, TGFβ1, bFGF 및/또는 LIF가 보충된 조직배양배지를 함유하는 배양조건 하에서 상기 인간 배아줄기세포를 배양하고, 그 결과, 지지세포 비함유의 인간 배아줄기세포주를 얻는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 의하면 지지세포를 함유하지 않는 배양조건 하에서 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 인간 배아줄기세포주를 확대하는 방법으로서, 인간 배아줄기세포주의 세포를, 피브로넥틴 매트릭스와, TGFβ1, bFGF 및/또는 LIF가 보충된 조직배양배지에 기초하여 배양하고, 그 결과, 인간 배아줄기세포주의 세포를 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 의하면 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 것이 가능한 특정의 종의 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배아줄기세포주를 확립하는 방법으로서, (a) 배아줄기세포를 얻는 것, 및 (b) 지지세포 및 이종 혼입물을 함유하지 않고, 종 유래의 매트릭스와, 조직배양배지를 함유하는 배양조건 하에서 상기 배아줄기세포를 배양하고, 그 결과, 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 특정의 종의 배아줄기세포주를 얻는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 의하면 지지세포 및 이종 혼입물을 함유하지 않는 배양조건 하에서 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 특정의 종의 배아줄기세포주를 확대하는 방법으로서, 특정의 종의 배아줄기세포주의 세포를, 종 유래의 매트릭스와, 조직배양배지에 기초하여 배양하고, 그 결과, 특정의 종의 배아줄기세포주의 세포를 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 태양에 의하면 미분화 상태로, 다능성 및 증식성의 인간 배아줄기세포를 배양배지에 함유하는 세포 배양물이 제공되고, 이 경우, 세포 배양물은 이종 및/또는 지지세포의 혼입물을 실질적으로 함유하지 않는다.
본 발명의 추가의 태양에 의하면 매트릭스 및 조직배양배지를 함유하는 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양 시스템이 제공되고, 이 경우, 이 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양 시스템은 이배양 시스템에서 배양된 인간 배아줄기세포를 증식성 및 다능성 의 미분화 상태로 유지하는 것이 가능하도록 선택된다.
본 발명의 추가의 태양에 의하면 세포치환 및/또는 조직재생을 필요로 하는 개체를 처치하는 방법으로서, 이종 및 지지세포의 혼입물을 함유하지 않는 인간 배아줄기세포 조제물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 이 방법은 인간 배아줄기세포 조제물을 투여 전에 조제하는 것을 포함하고, 이 경우, 조제는 (a) 인간 배아줄기세포를 얻는 것, 및 (b) 지지세포 및 이종 혼입물을 함유하지 않고, 인간 유래의 피브로넥틴 매트릭스와, TGFβ1, bFGF 및/또는 LIF가 보충된 조직배양배지를 함유하는 배양조건 하에서 상기 인간 배아줄기세포를 배양하고, 그 결과 인간 배아줄기세포 조제물을 조제하는 것에 의해 달성된다.
본 발명의 추가의 태양에 의하면 지지세포를 함유하지 않는 배양조건 하에서 인간 배아줄기세포를 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 방법으로서, 매트릭스와, 적어도 25시의 배가시간을 수반하여 적어도 56회의 계대배양에 걸쳐 줄기세포를 유지하는 것이 가능한 선택된 농도범위로 제공되는 적어도 하나의 증식인자가 보충된 조직배양배지를 함유하는 배양조건 하에서 인간 배아줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 매트릭스는 피브로넥틴 매트릭스다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 피브로넥틴은 소 피브로넥틴, 재조합 소 피브로넥틴, 인간 피브로넥틴, 재조합 인간 피브로넥틴, 마우스 피브로넥틴, 재조합 마우스 피브로넥틴, 및 합성 피브로넥틴으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 배양조건은 이종 혼입물을 실질적으로 함유하지 않고, 한편, 매트릭스는 인간 혈장 피브로넥틴 매트릭스, 재조합 인간 혈장 피브로넥틴 매트릭스, 인간 세포 피브로넥틴 매트릭스, 재조합 인간 세포 피브로넥틴 매트릭스, 및 합성 피브로넥틴으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 인간 배아줄기세포주는 적어도 85%의 미분화 인간 배아줄기세포를 포함한다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 인간 배아줄기세포주의 세포는 적어도 25시의 배가시간을 유지한다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 조직배양배지는 더욱 혈청 및/또는 혈청 대체물을 포함한다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 혈청 및/또는 혈청 대체물은 적어도 10%의 농도로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 혈청 및/또는 혈청 대체물은 15%의 농도로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 TGFβ1은 적어도 0.06ng/ml의 농도로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 TGFβ1은 0.12ng/ml의 농도로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 bFGF는 적어도 2ng/ml의 농도로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 bFGF는 4ng/ml의 농도로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 LIF는 적어도 500u/ml의 농도로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 LIF는 1000u/ml의 농도로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 매트릭스는 종 유래의 피브로넥틴 매트릭스다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 지지세포 비함유의 배양조건은 이종 혼입물을 실질적으로 함유하지 않는다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 특정의 종의 배아줄기세포주의 세포는 적어도 20시간의 배가시간을 유지한다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 조직배양배지는 종 유래의 혈청 및/또는 혈청 대체물을 포함한다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 종 유래의 혈청은 적어도 5%의 농도로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 조직배양배지는 적어도 하나의 증식인자를 더욱 포함한다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 적어도 하나의 증식인자는 TGFβ1, bFGF, LIF으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 조직배양배지는 종 유래의 조건화 배지이다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 인간 배아줄기세포주는 적어도 38회의 계대배양에 대하여 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지 가능하다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 TGFβ1는 0.06ng/ml-0.24ng/ml의 농도범위로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 bFGF는 2ng/ml-8ng/ml의 농도범위로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 LIF는 500u/ml-2000u/ml의 농도범위로 제공된다.
기재된 바람직한 실시형태에 있어서 추가의 특징에 의하면 배양조건은 15%의 농도의 혈청 대체물, 0.12ng/ml의 농도의 TGFβ1, 1000u/ml의 농도의 LIF, 및 4ng/ml의 농도의 bFGF를 포함한다.
본 발명은 지지세포 비함유 및 이종 비함유의 배양 시스템을 사용하여 인간 배아줄기세포주를 확립 및 확대하는 방법, 이종 혼입물 및 지지세포를 함유하지 않는 배양에서 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 것이 가능한 줄기세포를 제공하는 것에 의해, 현재 알려져 있는 형태의 결점에 대처하는 것에 성공하고 있다.
별도 정의되지 않는 경우, 본 명세서 중에 사용되는 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서 중에 기재되는 방법 및 재료와 유사 또는 동등의 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용하는 것이 가능하지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. 모순되는 경우에는 정의를 포함하여, 본 특허 명세서가 우선한다. 또 재료, 방법 및 실시예는 예시에 지나지 않고, 한정하는 것은 의도되지 않는다.
본 발명은 예시로서만, 첨부되어 있는 도면을 참조하여, 본 명세서 중에 기재된다. 다음에 도면을 상세히 참조하여, 도시되어 있는 세부사항은 예시적인 것이고, 또 본 발명의 바람직한 실시형태의 예시적인 논의를 위한 것이고, 따라서, 본 발명의 원리 및 개념적 태양의 가장 유용하고 또 용이하게 이해되는 기술인 것으로 생각되는 것을 제공하기 위해 도시되어 있다는 것이 강조된다. 이러한 면에서, 본 발명의 본질적인 이해에 필요한 것 이상으로 본 발명의 구조적인 세부사항을 보여주려는 시도는 하지 않았으며, 발명의 상세한 설명과 첨부 도면을 통해 본 발명의 여러 형태가 어떻게 실제로 구현될 있는지가 당업자에게 자명해진다.
도면에서,
도 1a-도 1d는 지지세포 비함유 시스템에서 소 유래의 피브로넥틴 매트릭스에서 성장된 ES세포 콜로니 및 단일 ES세포를 예시하는 현미경사진이다. 혈청 대체물 및 다양한 조합의 증식인자의 존재 하에서 피브로넥틴 상에서 성장된 다양한 ES세포주의 명시야상(bright field images)이 도시된다. 도 1a-31회의 계대배양에 걸쳐 TGFβ1, LIF 및 bFGF(TLF)의 존재 하에서 성장된 I-6ES세포주(사이즈바아는 100μM를 표시한다); 도 1b-21회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장된 I-3ES세포주(사이즈바아는 50μM를 표시한다); 도 1c-31회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장된 I-6ES세포주(사이즈바아는 50μM를 표시한다); 도 1d-20회의 계대배양에 걸쳐 TGFβ1 및 bFGF(TF)에서 성장된 I-3ES세포주(사이즈바아는 38μM를 표시한다). 세포 사이의 간격(도 1a-도 1c) 및 인간 ES세포에 전형적인 높은 핵 대 세포질 비율(도 1d)에 유의할 것.
도 1e-도 1h는 지지세포 비함유 시스템에서 소 유래의 피브로넥틴 매트릭스에서 성장된 인간 I-3ES세포주 및 I-6ES세포주에 있어서의 미분화 세포에 전형적인 표면 마아커의 발현을 예시하는 면역조직화학 현미경사진이다. 17회의 계대배양에 걸쳐 TF의 존재 하에서 성장하고, 항SSEA4항체로 표지된 인간 ES세포(계통I-3)의 형광상(도 1e, 사이즈바아는 50μM를 표시한다); 38회의 계대배양에 걸쳐 TLF의 존재 하에서 성장하고, 항SSEA4항체로 표지된 I-3ES세포의 형광상(도 1f, 사이즈바아는 6μM를 표시한다); 30회의 계대배양에 걸쳐 TLF의 존재 하에서 성장하고, 항TRA-60항체로 표지된 I-6ES세포의 형광상(도 1g, 사이즈바아는 6μM를 표시한다); 21회의 계대배양에 걸쳐 TF의 존재 하에서 성장하고, 항TRA-81항체로 표지된 I-3ES세포의 형광상(도 1h, 사이즈바아는 6μM를 표시한다)이 도시된다. 형광상은 도립형 형광현미경(도 1e) 또는 공초점 현미경(도 1f-도 1h) 중의 하나를 사용하여 기록되었다.
도 2a-도 2c는 지지세포 비함유 시스템에서 소 유래의 피브로넥틴 매트릭스에서 성장된 hES세포의 인비트로 분화를 예시한다. 지지세포 비함유 시스템에서 성장된 세포에 유래하는 EB의 조직학적 단면이 도시된다. 도 2a-TF에서 28회의 계대배양에 걸쳐 성장된 후의 I-3세포주에 유래하는 24시간 경과한 순수한 EB(사이즈바아는 100μM를 표시한다); 도 2b-TF에서 28회의 계대배양에 걸쳐 성장된 I-3세포주에 유래하는 14일령의 EB(사이즈바아는 50μM를 표시한다); 도 2c-TLF에서 30회의 계대배양에 걸쳐 성장된 세포주I-3에 유래하는 14일령의 EB(사이즈바아는 25μM를 표시한다). EB의 외측의 보호적 상피(도 2b, 화상표), 및 간엽조직에 의해 둘러싸인 주상 상피(columnar epithelium)로 구성되는 구형상 구조(도 2c)에 유의할 것.
도 2d-도 2f는 본 발명의 지지세포 비함유 시스템에서 소 유래의 피브로넥틴 매트릭스에 있어서의 다양한 배지에서 성장된 ES세포로부터 형성된 14일령의 EB에 유래하는 세포에 있어서의 중배엽 및 외배엽의 대표적인 마아커의 발현을 예시한다. 다양한 ES세포주에 유래하는 EB세포가 다양한 항체 프로브로 형광면역염색되었다. 도 2d-22회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장하고, 신경 특이적 튜블린에 대한 항체를 사용하여 면역염색된 I-6세포주(사이즈바아는 6μM를 표시한다). 도 2e-30회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장하고, 평활근 액틴에 대한 항체를 사용하여 면역염색된 I-3세포주(사이즈바아는 6μM를 표시한다). 도 2f-28회의 계대배양에 걸쳐 TF에서 성장하고, CD31에 대한 항체를 사용하여 면역염색된 I-3세포주(사이즈바아는 6μM를 표시한다).
도 3은 지지세포 비함유 시스템에서 소 유래의 피브로넥틴 매트릭스에서 성장된 I-3ES세포 또는 I-6ES세포의 분화단계 및 이들에 유래하는 배양체(embryoid body; EB)의 분화단계의 RT-PCR결정을 예시한다. RT-PCR반응이 I-3ES세포, I-6ES세포, 또는 이들에 유래하는 E로부터 추출된 RNA 샘플에 대해 행해진다. 레인1-19회의 계대배양에 걸쳐 TF에서 성장된 I-3ES세포; 레인2-20회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장된 I-3ES세포; 레인3-23회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장된 I-3ES세포에 유래하는 14일령의 EB; 레인4-28회의 계대배양에 걸쳐 TF에서 성장된 I-3ES세포에 유래하는 14일령의 EB; 레인5-30회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장된 I-3ES세포에 유래하는 14일령의 EB; 레인6-29회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장된 I-3ES세포에 유래하는 14일령의 EB; 레인7-22회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장된 I-6ES세포에 유래하는 14일령의 EB. 반응의 특이성이 RNA의 비존재 하에서 확인되었다(도 3, 레인8). 레인3-6의 EB 샘플은 1-3ES세포의 4개의 다른 배취에 유래 했다는 것에 유의할 것.
도 4a-도 4c는 지지세포 비함유 시스템에서 소 유래의 피브로넥틴 매트릭스에서의 TLF에서 각각 26회 및 19회의 계대배양에 걸쳐 성장된 I-3ES세포주 및 I-6ES세포주에 유래하는 기형종의 조직학적 단면을 예시한다. 기형종의 단면에는 유수신경(도 4a), 히알린 연골의 상세부(도 4b), 및 배세포(goblet cell)가 많은 분비상피(도 4c)가 포함된다. 사이즈바아는 25μM를 표시한다.
도 5a-도 5c는 지지세포 비함유 시스템에서 인간 유래의 피브로넥틴 매트릭스에서 성장된 ES세포 콜로니 를 예시하는 형태학 현미경사진이다. 혈청 대체물 및 증식인자의 TF조합의 존재 하에서 22회의 계대배양에 걸쳐 인간 세포 피브로넥틴에서 성장된 I-3ES세포주의 명시야상이 도시된다.
도 5d-도 5f는 지지세포 비함유 시스템에서 인간 유래의 피브로넥틴 매트릭스에서 성장된 인간 I-3ES세포주 및 인간 H-9ES세포주에 있어서의 미분화 세포에 전형적인 표면 마아커의 발현을 예시하는 면역조직화학 현미경사진이다. 16회의 계대배양에 걸쳐 TF의 존재 하에서 인간 세포 피브로넥틴에서 배양되고, 항TRA-1-60항체(도 5d) 또는 항TRA-1-81항체(도 5e)로 표지된 인간 I-3ES세포주의 명시야상, 및 10회의 계대배양에 걸쳐 TLF의 존재 하에서 인간 혈장 피브로넥틴에서 배양되고, 항SSEA4항체로 표지된 인간 H-9ES세포주의 명시야상(도 5f)이 도시된다.
도 6a-도 6c는 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 상태 하에서 인간 피브로넥틴 매트릭스에서 성장된 hES세포의 인비트로 분화를 예시한다. 다양한 배양조건 하에서 성장된 I-3ES세포에 유래하는 14일령의 EB의 상이 도시된다. 도 6a-17회의 계대배양에 걸친 TLF증식인자의 존재 하에서의 인간 세포 피브로넥틴 매트릭스; 도 6b-17회의 계대배양에 걸친 TF증식인자의 존재 하에서의 인간 세포 피브로넥틴 매트릭스; 도 6c-16회의 계대배양에 걸친 TLF증식인자의 존재 하에서의 인간 혈장 피브로넥틴 매트릭스.
도 7은 지지세포 비함유 시스템에서 인간 유래의 피브로넥틴 매트릭스에서 성장된 I-3세포의 분화단계 및 그것에 유래하는 배양체(EB)의 분화단계의 RT-PCR결정을 예시한다. RT-PCR반응이 I-3ES세포 또는 그것에 유래하는 E로부터 추출된 RNA 샘플에 대해 행해진다. 레인1-22회의 계대배양에 걸쳐 TF에서 성장된 I-3ES세포; 레인2-18회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장된 I-3ES세포; 레인3-17회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장된 I-3ES세포; 레인4-17회의 계대배양에 걸쳐 TF에서 성장된 I-3ES세포에 유래하는 14일령의 EB; 레인5-17회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장된 I-3ES세포에 유래하는 14일령의 EB; 레인6-16회의 계대배양에 걸쳐 TLF에서 성장된 I-3ES세포에 유래하는 14일령의 EB. 반응의 특이성이 RNA의 비존재 하에서 확인되었다(도 7, 레인7).
도 8a-도 8c는 다양한 배양조건 하에서의 I-3hES세포주의 성장속도(도 8a), I-6hES세포주의 성장속도(도 8b) 및 H-9hES세포주의 성장속도(도 8c)를 예시한다. 소 피브로넥틴 매트릭스에서, 증식인자의 TLF조합의 존재 하에서 배양되었을 때의, I-3hES세포주, I-6hES세포주 및 H-9hES세포주의 성장속도(각각, 도 8a, 도 8b 및 도 8c, 핑크색 곡선), 또는 TF조합의 존재 하에서 배양되었을 때의 이들의 성장속도(각각, 도 8a, 도 8b 및 도 8c, 흑색 곡선), 또는 인간 피브로넥틴 매트릭스에서, 증식인자의 TF조합의 존재 하에서 배양되었을 때의 이들의 성장속도(각각, 도 8a, 도 8b 및 도 8c, 명청색 곡선), 또는 MEF지지세포 상에서 배양되었을 때의 이들의 성장속도(각각, 도 8a, 도 8b 및 도 8c, 암청색의 곡선)가 도시된다.
도 8d는, 미분화 hES세포의 성장을 지원하는 다양한 배양조건의 능력을 예시하는 막대그래프이다. 인간 ES세포가 하기의 배양조건 하에서 배양되었다: 마우스 배아섬유아세포(MEF), TGFβ, LIF 및 bFGF의 존재 하에서의 소 피브로넥틴 (TLF BF), TGFβ, LIF 및 bFGF의 존재 하에서의 인간 피브로넥틴 (TLF HF), TGFβ 및 bFGF의 존재 하에서의 소 피브로넥틴 (TF BF), TGFβ 및 bFGF의 존재 하에서의 인간 피브로넥틴 (TF HF), LIF 및 TGFβ의 존재 하에서의 소 피브로넥틴 (LT), LIF 및 bFGF의 존재 하에서의 소 피브로넥틴 (LF), TGFβ만의 존재 하에서의 소 피브로넥틴 (T), 및 bFGF만의 존재 하에서의 소 피브로넥틴 (F). 미분화 세포의 백분율이 2일씩 연장하여 측정되었다.
도 9a-도 9f는 다양한 조건 하에서의 지지세포 비함유 시스템에서 성장된 인간 ES세포 및 인간 ES세포 콜로니 를 예시한다. 지지세포 비함유 시스템에서 성장된 다양한 ES세포주의 명시야상이 도시된다. 도 9a-5회의 계대배양에 걸쳐 TLF의 존재 하에서 포피 매트릭스에서 성장된 I-6세포주(사이즈바아는 75μM를 표시한다); 도 9b-MEF 조건화 배지의 존재 하에서 12회의 계대배양에 걸쳐 MatrigelRTM에서 성장된 I-3.2세포주(사이즈바아는 50μM를 표시한다); 도 9c-다수회의 계대배양에 걸쳐 TLF의 존재 하에서 MEF 매트릭스에서 성장된 I-6세포주(사이즈바아는 75μM를 표시한다); 도 9d-TF의 존재 하에서 21회의 계대배양에 걸쳐 피브로넥틴에서 성장된 I-3세포주(사이즈바아는 50μM를 표시한다); 도 9e-TLF의 존재 하에서 12회의 계대배양에 걸쳐 MatrigelRTM에서 성장된 I-6세포주(사이즈바아는 75μM를 표시한다); 도 9f-20회의 계대배양에 걸쳐 피브로넥틴에서 성장된 I-3세포주(사이즈바아는 38μM를 표시한다).
도 10a-도 10f는 피브로넥틴 (도 10a 및 도 10b), MEF 매트릭스(도 10c, 도 10e 및 도 10f) 또는 MatrigelRTM(도 10d)에서 성장된 I-6ES세포주 및 I-3ES세포주에 유래하는 SCID베이지 마우스에 있어서의 기형종의 조직학적 단면을 예시한다. 기형종의 단면은 헤마톡시린＆에오신(Hematoxylin & Eosin)으로 염색되고, 단면에는 배세포를 함유하는 장양상피(gut-like epithelium; 도 10a), 성숙한 연골조직(도 10b 및 도 10c), 배근관(도 10d), 층상상피(도 10e) 및 유수신경(도 10f)이 포함된다. 사이즈바아는 40μM를 표시한다.
바람직한 태양의 상세한 설명
본 발명은 지지세포 비함유 및 이종 비함유의 배양조건을 이용하여 인간 배아줄기세포주를 확립 및 확대하는 방법에 관련된다. 본 발명은 더욱 이종 혼입물을 함유하지 않고, 또 배양에서 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 것이 가능하고, 따라서, 인간 치료를 위한 매우 적합한 인간 배아줄기세포주에 관련된다.
본 발명에 따라서, 지지세포 및 이종의 혼입물을 함유하지 않는 인간 배아줄기세포주를 조제하는 방법의 원리 및 조작은 도면 및 부수하는 기술을 참조하여 보다 잘 이해할 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 실시형태를 상세히 설명하기 전에 본 발명은 그 적용에서 하기의 기술에서 설명되는 세부, 또는 실시예에 의해 예시되는 세부에 한정되지 않는다는 것을 이해해야한다. 본 발명은 다른 실시형태가 가능하고, 또는 다양한 방법으로 실시하는 것이 가능하고, 또는 다양한 방법으로 실시된다. 또, 본원에서 이용되는 어구 및 용어는 설명을 위한 것이며 제한의 의미로 간주되어서는 아니 됨을 이해하여야 한다.
인간 ES세포를 미분화 상태로 유지하기 위해, ES배양에서는 세포증식을 유지하고, ES세포의 분화를 저해하고, 또 다능성을 지속시키는 조건을 세포에 제공해야한다. 그와 같은 배양조건은 전형적으로는 줄기세포의 증식을 위해 필요한 인자를 분비하고, 한편으로 동시에 그 분화를 저해하는 지지세포층을 이용하는 것에 의해 달성된다.
지지세포층의 사용에 관련된 제한(예를 들면, 지지세포의 혼입 및 규정되지 않은 배양 시스템 등)에 대항하기 위해, 보다 규정된 지지세포 비함유 배양 시스템이 개발되고 있다. 지지세포 비함유 배양 시스템에서는 ES세포가 접착하는 매트릭스와, 세포증식을 위해 필요한 사이토카인 및 증식인자를 ES세포에 제공하고, 한편으로 동시에 세포분화를 저해하는 배양배지가 이용된다.
일반적으로 사용되고 있는 매트릭스에는 Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)마우스 육종으로부터 추출된 기저막 조제물(예를 들면, MatrigelRTM), 또는 소의 피브로넥틴/라미닌이 포함된다. 그와 같은 매트릭스는 통상 마우스 배아섬유아세포(MEF) 조건화 배지가 보충되거나 또는 소 혈청 및 증식인자가 보충된 합성배지가 보충된다.
지지세포 비함유 배양 시스템을 사용하여 인간 ES세포를 배양하기 위한 이전의 시도에서는 신선한 배양배지 및 증식인자혼합물이 보충된 MatrigelRTM 매트릭스 또는 라미닌 매트릭스가 이용되었다(미국특허출원제20030017589호). 그러나, 이들 지지세포 비함유 매트릭스릭스는 동물조직에 유래하고 있고, 따라서 인간 ES세포를 동물 병원체에 노출할 수 있다. 또 이들 실험에서는 6개의 다른 증식인자의 조합이 배양된 세포에 불가역적인 손상을 줄 수 있는 극히 높은 농도로 사용되었다. 실제로, 미국특허출원제20030017589호에서 명시된 바와 같이 ES세포의 배가시간은 약 19시간이었다. 이것은 종양형성성의 표현형을 시사하고 있다. 더욱 이들 조건 하에서는 세포의 50%-70%만이 지지세포 비함유 배양 시스템에서의 14회의 계대배양의 후에 미분화 세포의 형태학을 나타내고 있을 뿐이었다.
그와 같은 배양조건은 연구목적을 위해서는 적합할 수 있으나, 인간 ES세포는 인간에 있어서의 세포치환치료 또는 조직재생을 위해 이용될 때에는 동물재료를 본질적으로는 함유하지 않는 양호하게 규정된 배양조건 하에서 배양되어야 한다.
본 발명을 실시에 이행할 때, 본 발명자들은 이종의 혼입물을 함유하지 않고, 그것에도 불구하고, 적어도 38회의 계대배양에 걸쳐 배양에서 인간 줄기세포를 지속시키는 것이 가능한 지지세포 비함유의 배양조건을 고안했다. 하기의 실시예란에서 예시되는 바와 같이, 그와 같은 조건 하에서 배양된 줄기세포는 다능성 , 불사성, 미분화 증식능력 및 정상의 핵형을 함유하는 ES세포의 특징을 전부 유지했다. 따라서, 본 발명의 지지세포 비함유 배양 시스템은 증식성상태에 적어도 38회의 계대배양에 걸쳐 인간 ES세포를 유지하는 것이 가능하고, 그 한편으로, ES의 다능성을 지속시키는 것이 가능한 완전한 동물 비존재 배양환경을 최초로 제공한다. 또 그와 같은 조건 하에서 배양된 ES세포의 85% 이상이 미분화 세포의 형태학을 30시간 - 35시간의 배가시간과 함께 나타냈다.
따라서, 본 발명에 의하면 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 것이 가능하고, 또 이종의 혼입물을 실질적으로 함유하지 않는 인간 배아줄기세포주를 확립하는 방법이 제공된다.
본 명세서 중에 사용되는 표현인 "줄기세포주(stem cell line)"는 특정의 전문화된 기능을 가지는 다른 세포타입(즉, "완전히 분화된"세포)으로 분화하는 것이 가능한 세포, 또는 미분화 상태로 유지하는 것이 가능한 세포(이후, "다능성 줄기세포")를 의미한다.
본 발명의 줄기세포는 임의의 연령의 개체의 골수조직으로부터, 또는 신생아 개체의 제대혈로부터 얻어지는 조혈 줄기세포, 임신후에 형성되는 배조직(예를 들면, 배반포)로부터 얻어지는 배성 줄기(ES)세포, 또는 배성 생식(EG)세포일 수 있다. 줄기세포의 유도 및 조제는 본 명세서 중 하기에서 더욱 기재된다. 본 발명의 바람직한 줄기세포는 인간 배아줄기세포이다.
본 발명의 하나의 태양에 의하면 본 발명의 방법은 인간 배아줄기세포를 얻는 것, 매트릭스와, 증식인자를 함유하는 조직배양배지를 함유하는 지지세포 비함유 배양조건 하에서 인간 배아줄기세포를 배양하고, 그 결과 인간 배아줄기세포주를 확립하는 것에 의해 달성된다.
본 발명의 이 태양에 의하면 배양은 세포의 생존 및 증식을 촉진하지만 분화를 제한하는 세포밀도에서 줄기세포를 매트릭스에 치상(plating)하는 것에 의해 달성된다. 전형적으로는 약 15000세포/cm2-약 200000세포/cm2의 치상밀도가 사용된다.
줄기세포의 단일 세포 현탁물이 통상의 경우에는 파종되지만, 작은 클러스터(clusters)도 사용될 수 있는 것이 이해된다. 이 목적을 위해, 클러스터 파괴를 위해 이용되는 효소소화(하기의 실시예란의 실시예1을 참조할 것)가 줄기세포가 완전히 분산되기 전에 정지되고, 세포가 괴(clumps; 즉, 10세포-200세포)가 형성되도록 피펫으로 분쇄된다. 그러나, 다양한 대책이 세포의 분화를 발생시키는 큰 클러스터를 피하기 위해 취해진다.
본 발명의 줄기세포는 널리 알려져 있는 세포배양방법을 사용하여 얻을 수 있다. 예를 들면, 인간 배아줄기세포를 인간 배반포로부터 단리하는 것이 가능하다. 인간 배반포는 전형적으로는 인간의 인비보에서의 착상 전의 배로부터, 또는 체외수정(IVF)배로부터 얻어진다. 또는 단일 세포의 인간 배를 배반포단계에 확대하는 것이 가능하다. 인간 ES세포를 단리하기 위해, 투명대가 배반포로부터 제거되고, 내측의 세포집단(ICM)이 영양 외배엽세포가 용해되고, 온건한 피페팅에 의해 무상의 ICM으로부터 제거되는 면역수술에 의해 단리된다. 그 후, ICM은 그 성장을 가능하게 하는 적절한 배지를 함유하는 조직배양 플라스크에 넣어진다. 9-15일후에 ICM 유래의 성장물이 기계적 해리 또는 효소적 분해의 어느 것에 의해 괴로 해리되고, 그 후, 세포는 신선한 조직배양배지에 재 치상된다. 미분화의 형태학을 보이는 콜로니 가 마이크로피펫에 의해 개별적으로 선택되고, 괴로 기계적으로 해리되고, 재 치상된다. 얻어지는 ES세포는 그 후, 1주간-2주간 마다 절차에 따라 분할된다. 인간 ES세포의 조제방법에 관한 추가의 상세에 대해서는 Thomson 외[미국특허제5843780호; Science, 282:1145, 1998; Curr.Top.Dev.Biol., 38:133, 1998; Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 92:7844, 1995]; Bongso 외[Hum Reprod, 4:706, 1989]; Gardner 외[Fertil.Steril., 69:84, 1998]를 참조할 것.
시판의 줄기세포도 본 발명의 이 태양에 관하여 사용할 수 있는 것이 이해된다. 인간 ES세포를 NIH인간 배아줄기세포 등록부문(http://escr.nih.gov)으로부터 구입하는 것이 가능하다. 시판의 배아줄기세포주의 비한정적인 예에는 BG01, BG02, BG03, BG04, CY12, CY30, CY92, CY10, TE03 및 TE32가 있다.
본 발명에 의해 사용되는 줄기세포는 또 인간의 배성생식(EG)세포로부터 얻는 것이 가능하다. 인간 EG세포는 당업자에 알려져 있는 연구실 기술을 사용하여 임신의 약 8주-11주의 인간 태아로부터 얻어지는 원시 생식세포로부터 조제된다. 생식 융기부가 분리되고, 작은 괴로 절단되고, 괴는 그 후 기계적 해리에 의해 세포로 분할된다. EG세포는 그 후 적절한 배지를 갖춘 조직배양 플라스크에서 성장된다. 세포는 EG세포와 일치하는 세포형태학이 관측될 때까지 배지를 매일 교체해 가면서 배양된다(전형적으로는 7일-30일 또는 1회-4회의 계대배양의 후). 인간 EG세포의 조제방법에 관한 추가의 상세에 대해서는 Shamblott 외[Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95:13726, 1998] 및 미국특허제6090622호를 참조할 것.
본 명세서 중 상기에서 기술되는 바와 같이 줄기세포는 바람직하게는 지지세포층 대신 매트릭스를 함유하는 지지세포 비함유 배양 시스템에서 배양된다. 본 명세서 중에 사용되는 용어 "매트릭스"는 지지세포의 세포 부착기능을 대용하는 것이 가능한 임의의 매트릭스를 의미한다. 그와 같은 매트릭스는 전형적으로는 줄기세포가 부착하는 것이 가능한 세포외 성분을 함유하고, 따라서, 적합한 세포기질을 제공한다.
본 발명과의 사용을 위해 특히 적합한 것은 기저막에 유래하는 세포외 매트릭스성분, 또는 접착분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성하는 세포외 매트릭스성분이다. Matrigel(등록상표)은 본 발명과의 사용을 위해 적합한 시판 매트릭스의 일예(Becton Dickinson, 미국)이다. Matrigel(등록상표)은 실온에서 겔화하여, 재구성된 기저막을 형성하는 Engelbreth-Holm-Swarm종양세포로부터 얻어지는 가용성의 조제물이다. Matrigel(등록상표)는 또 증식인자 저하 조제물로서 얻는 것이 가능하다. 본 발명과의 사용을 위해 적합한 다른 세포외 매트릭스성분 및 세포외 매트릭스 성분 혼합물에는 단독 또는 다양한 조합의 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등이 포함된다. 본 발명의 바람직한 매트릭스는 피브로넥틴 유래 매트릭스다.
완전한 동물 비존재 배양조건이 필요한 경우, 매트릭스는 바람직하게는 인간 기원에 유래되거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 합성된다. 그와 같은 매트릭스에는 예를 들면 인간 유래 피브로넥틴, 재조합 피브로넥틴, 인간 유래 라미닌, 포피 섬유아세포 매트릭스, 또는 합성 피브로넥틴 매트릭스가 포함된다. 인간 유래 피브로넥틴은 혈장 피브로넥틴 또는 세포 피브로넥틴으로부터 유래할 수 있다. 이들 모두는 Sigma(St.Louis, MO, 미국)로부터 얻는 것이 가능하다. 인간 유래 라미닌 및 포피 섬유아세포 매트릭스는 Sigma(St.Louis, MO, 미국)로부터 얻는 것이 가능하다. 합성 피브로넥틴 매트릭스는 Sigma(St.Louis, MO, 미국)로부터 얻는 것이 가능하다.
매트릭스 단백질의 재조합 합성을 발현 벡터를 사용하는 것에 의해 달성하는 것이 가능하다. 매트릭스 단백질(예를 들면, 인간 혈장 피브로넥틴)을 코드하는 폴리뉴클레오티드 세그먼트를 포유동물세포(예를 들면, HeLa세포 등)를 형질전환하기 위해 적합하고, 또 형질전환된 세포 내에서 이 효소의 발현을 실행시키기 위해 적합한 시판의 발현 벡터 시스템에 연결하는 것이 가능하다. 그와 같은 시판의 벡터 시스템은 기존의 프로모터 배열 또는 인핸서 배열을 치환하고, 또는 복제하고, 또는 변이시키기 위해, 및/또는 임의의 추가의 폴리뉴클레오티드 배열(예를 들면, 추가의 선택 마아커를 코드하는 배열, 또는 레포터 폴리펩티드를 코드하는 배열 등)을 도입하기 위해, 일반적으로 사용되는 다양한 재조합 기술에 의해 용이하게 개변될 수 있는 것이 이해된다.
적합한 포유동물 발현 벡터에는 pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1(이들은 Invitrogen로부터 입수가능하다), pCI(이것은 Promega로부터 입수가능하다), pBK-RSV 및 pBK-CMV(이들은 Stratagene로부터 입수가능하다), pTRES(이것은 Clontech로부터 입수가능하다), 및 이들의 유도체가 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 의하면 배양배지는 세포증식을 위해 필요한 사이토카인 및 증식인자[예를 들면, 염기성 섬유아세포 증식인자(bFGF) 및 백혈병 저해제 인자(LIF)], 및 줄기세포의 분화를 저해하는 트랜스포밍 증식인자β1(TGFβ1) 등의 인자를 포함한다.
그와 같은 배양배지는 합성된 조직배양배지, 예를 들면, 혈청, 혈청 대체물 및/또는 증식인자가 보충된 Ko-DMEM(Gibco-Invitrogen Corporation product(Grand Island, NY, 미국))등일 수 있다.
혈청은 소태아혈청, 염소 혈청 또는 인간 혈청을 함유하는 임의의 공급원의 것이 가능하다. 바람직하게는 인간 혈청 또는 대체혈청TM(Gibco-Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, 미국)이 동물 비존재의 환경을 인간 ES세포에 제공하기 위해 이용된다.
대체혈청TM은 알부민 또는 대용알부민, 아미노산, 비타민, 트랜스페린 또는 대용트랜스페린, 항산화제, 인슐린 또는 대용인슐린, 콜라겐 전구체, 및 미량원소를 함유한다(국제특허출원공개WO98/30679(Price,P.J 외)). 동물 비존재의 배양조건을 제공하기 위해, 알부민 또는 대용알부민은 바람직하게는 인간 공급원에 유래 하고, 및/또는 재조합 단백질이다.
배양배지, 혈청 및 혈청 대체물을, 조직배양 제품의 임의의 시판의 공급자로부터 얻는 것이 가능하고, 예에는 Gibco-Invitrogen Corporation(Grand Island, NY, 미국), Sigma(St.Louis, MO, 미국) 및 ATCC(Manassas, VA, 미국)가 포함된다.
본 발명에 의해 사용되는 혈청 및 혈청 대체물은 1%-40%(더 바람직하게는 5%-35%, 가장 바람직하게는 10%-30%)의 농도범위로 제공된다.
현시점에서 바람직한 실시형태에 의하면 혈청 대체물은 15%의 농도로 제공된다(실시예란의 실시예1 및 실시예4를 참조할 것).
본 발명의 증식인자는 임의의 조합으로 사용하는 것이 가능하고, ES세포의 증식을 위해, 그 한편으로 동시에 ES세포의 분화를 저해하기 위해 적합한 임의의 농도로 줄기세포에 제공되는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 적합한 증식인자에는 트랜스포밍 증식인자β1(TGFβ1), 염기성 섬유아세포 증식인자(bFGF) 및 인간 재조합 백혈병 저해제 인자(LIF), 모양체 신경영양 인자(CNTF), 재조합 인간 온코스타틴M, 인터로킨6(IL-6)Flt-3 리간드 및 줄기세포인자(SCF) 등이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 그와 같은 증식인자는 조직배양시약의 임의의 공급자로부터, 예를 들면 Gibco Invitrogen Corporation Products(미국), R＆D Systems Inc.(Minneapolis, MN, 미국) 및 Chemicon International Inc.(Temecula, CA, 미국) 등으로부터 얻는 것이 가능하다.
하기의 실시예란의 실시예1에 보여지는 바와 같이, ES세포가 20%혈청 대체물이 보충된 배양배지의 존재 하에서 소 피브로넥틴 상에서 배양될 때, 증식인자의 TGFβ1 및 bFGF의 조합(TF)과, 증식인자의 TGFβ1, LIF 및 bFGF의 조합(TLF)은 함께 인간 ES세포를 적어도 53회 및 56회의 계대배양에 걸쳐 각각 유지하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에 의하면 지지세포 비함유 시스템에서 배양될 때 ES세포에 보충하기 위해 사용되는 증식인자에는 TGFβ1, bFGF 및/또는 LIF가 포함된다.
지지세포 비함유 배양 시스템 하에서는 TGFβ1은 0.06ng/ml-0.24ng/ml의 농도범위로 제공되고, 더 바람직하게는 0.10ng/ml-0.20ng/ml로, 가장 바람직하게는 0.12ng/ml로 제공되고, LIF는 500u/ml-2000u/ml의 농도범위로 제공되고, 더 바람직하게는 750u/ml-1500u/ml로, 가장 바람직하게는 1000u/ml로 제공되고, bFGF는 2ng/ml-8ng/ml의 농도범위로 제공되고, 더 바람직하게는 3ng/ml-6ng/ml로, 가장 바람직하게는 4ng/ml로 제공된다.
그다지 바람직하지는 않으나, hES세포의 배양은 혈청 또는 혈청 대체물이 보충된 배지의 대신에 조건화 배지를 사용하여 실행하는 것이 가능하다.
조건화 배지는 특정의 배양기간의 후에 존재하는 단층세포 배양물(즉, 지지세포)의 증식배지이다. 조건화 배지에는 배양에 있어서의 단층세포에 의해 분비된 증식인자 및 사이토카인이 포함된다.
조건화 배지는 배양에서 단층을 형성하는 다양한 세포로부터 회수하는 것이 가능하다. 예에는 MEF 조건화 배지, 포피 조건화 배지, 인간 배아섬유아세포 조건화 배지, 및 인간 난관 상피세포 조건화 배지 등이 포함된다.
특히 적합한 조건화 배지는 인간 세포에 유래하는 조건화 배지이고, 예를 들면, 조건화 배지를 제조하기 위해 적합한 조건 하에서의 증식배지에서 인간 포피 세포를 배양하는 것에 의해 제조되는 포피 조건화 배지 등이다.
그와 같은 증식배지는 지지세포를 배양하기 위해 적합한 임의의 배지일 수 있다. 증식배지에는 미분화 상태에서의 줄기세포의 성장에 도움이 되는 다양한 영양성의 인자, 예를 들면, 아미노산(예를 들면, L-글루타민), 항산화제(예를 들면, β-메르캅토에탄올) 및 증식인자 등을 보충하는 것이 가능하다. 혈청 및 혈청 대체물이, 다른 곳(미국특허출원제10/368045호)에 기재된 바와 같은 효과적인 농도범위로 첨가된다.
지지세포는 미분화 상태로의 줄기세포의 증식을 지원하기 위해 분비된 인자의 적합한 축적을 가능하게 하기 위해 충분한 기간에 걸쳐 증식배지에서 배양된다. 전형적으로 배지는 37℃에서 4시간 -24시간 배양하는 것에 의해 조건화된다. 그러나, 배양기간은 줄기세포의 성장 및 분화에 대한 조건화 배지의 영향을 평가하는 것에 의해 증감하는 것이 가능하다.
배지를 조건화하기 위한 장치의 선택은 조건화 배지의 규모 및 목적에 기초한다. 대규모의 제조에서는 바람직하게는 전용의 장치를 사용하는 것이 필요하다. 연속 세포배양 시스템은 Furey(2000), Genetic Eng.News, 20:10에 총설되어 있다.
충분한 인자가 배지에 축적된 후, 증식배지(즉, 조건화 배지)는 지지세포로부터 분리되고, 회수된다. 지지세포는 세포가 배지를 조건화하는 능력을 유지한다면 추가의 배양기간에 걸쳐 배지의 추가의 배취를 조건화하기 위해 반복 사용할 수 있는 것이 이해된다.
바람직하게는 조건화 배지는 사용 전에 멸균된다(예를 들면, 20 μM 필터를 사용하는 여과). 본 발명의 조건화 배지는 줄기세포에 대해 직접적으로 가해질 수 있고, 또는 염여과 등에 의해 효과적인 인자를 농축하도록 추출하는 것이 가능하다. 추가의 사용을 위해 조건화 배지는 바람직하게는 -80℃로 동결저장된다.
본 발명의 방법에 의하면 줄기세포는 인간 배아줄기세포주를 확립하기 위해, 지지세포 비함유 배양조건 하에서 배양된다.
확립된 인간 배아줄기세포주는 미분화 줄기세포에 의해 특징지을 수 있다. 본 발명에 의하면 미분화 줄기세포주는 적어도 50%, 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 85%의 미분화 줄기세포를 포함한다.
하기의 실시예란의 실시예1 및 실시예4에서 기재되는 바와 같이, 미분화 줄기세포는 당업자에 의해 배 기원 또는 성체기원의 분화된 세포로부터 명료하게 구별가능한 형태학을 가진다. 전형적으로는 미분화 줄기세포는 큰 핵/세포질 비율, 뚜렷한 핵, 및 세포간 결합이 양호하게 식별될 수 없는 밀집된 콜로니 형성을 가진다. 미분화 줄기세포의 추가의 특징이 본 명세서 중 하기에 기재된다.
본 발명의 교시에 따라 배양되었을 때, 줄기세포의 성장은 그 분화상태를 결정하기 위해 모니터된다. 예를 들면, 형태학적인 측정을 포함하여, 몇 가지 방법을 본 명세서 중에 기재되도록 배양된 세포의 세포분화를 판정하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 의하면 배양조건은 증식성 상태 및 그럼에도 불구하고 미분화 상태에 줄기세포를 무한히 유지하는 것이 가능한 완전한 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 환경을 줄기세포에 제공한다. 따라서, 배양조건에는 인간 유래(또는 재조합) 매트릭스와, TGFβ1, LIF 및 bFGF의 증식인자가 보충된 세포배지가 포함된다.
하기의 실시예란의 실시예4 및 실시예5에 보여지는 바와 같이, 본 발명자들은 ES세포를 인간 혈청 또는 혈청 대체물이 보충된 인간 유래 피브로넥틴 매트릭스에서 배양하는 것이 가능하고, 그 결과, 동물 병원체 또는 어떠한 다른 혼입물을 함유하지 않는 다능성 줄기세포 배양물이 제공되는 것을 예시하고 있다. 이들 조건 하에서는 본 발명의 교시를 사용하여 얻어진 ES세포주는 증식성 및 미분화의 상태를 적어도 38회의 계대배양에 걸쳐 유지했다.
배양공정 중, 줄기세포는 그 분화상태에 대하여 더욱 모니터된다. 세포분화는 분화를 지시하는 것이 알려져 있는 세포 특이적 또는 조직 특이적인 마아커를 조사했을 때에 결정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 영장류 ES세포는 단계 특이적인 태아성 항원(SSEA)4, 종양거절 항원(TRA)-1-60 및 TRA-1-81을 발현할 수 있다.
하기의 실시예란의 실시예2 및 실시예4에 보여지는 바와 같이, 이종 비함유 배양배지 및 선택된 증식인자가 보충된 지지세포 비함유 배양에서 성장된 ES세포는 미분화 세포에 대해 전형적인 세포표면 마아커인 SSEA4, TRA-1-60 및 TRA-1-81를 발현했다.
조직/세포 특이적인 마아커는 이분야에 널리 알려져 있는 면역학적 기술을 사용하여 검출하는 것이 가능하다(Thomson JA 외(1998), Science, 282:1145-7). 예에는 막결합 마아커대한 플로우 사이토메트리(flow cytometry), 세포외 마아커 및 세포내 마아커에 대한 면역조직화학, 및 분비된 분자 마아커에 대한 효소면역어세이(immunoassay)가 포함되지만, 이것에 한정되지 않는다.
ES세포의 분화의 결정은 또 알칼리 포스파타제 활성의 측정에 의해 행하는 것이 가능하다. 미분화의 인간 ES세포는 4%파라포름알데히드를 이용하여 세포를 고정처리하고, 제조자의 설명서(Vector Laboratories, Burlingame, California, 미국)에 따라 Vector Red 기질 키트를 이용하여 발색시키는 것에 의해 검출될 수 있는 알칼리 포스파타제 활성을 가진다.
상기에서 기술되는 바와 같이 본 발명의 줄기세포주는 다능성을 적어도 38회의 계대배양에 걸쳐 유지한다. 그와 같은 다능성은 배양체(EB)의 형성에 의해 인비트로에서 모니터하는 것이 가능하고, 또 마찬가지로 기형종의 형성에 의해 인비보에서 모니터하는 것이 가능하다.
배양체는 ES세포를 지지세포층 또는 지지세포 비함유 배양 시스템로부터 취출시킬 때 형성된다. ES세포의 취출은 한정된 시간의 IV형 콜라게나제 처리를 사용하여 행하는 것이 가능하다. 배양표면으로부터 해리된 후, 세포는 혈청 및 아미노산이 보충된 배양배지를 함유하는 조직배양 플레이트로 이동된다. 하기의 실시예란의 실시예3 및 실시예5에 보여지는 바와 같이, 현탁배양에서 14일후, 본 발명의 교시에 따라 얻어진 ES세포는 배의 중배엽세포, 외배엽세포 및 내배엽세포를 함유하는 EB로 분화했다. 따라서, 이것은 본 발명의 ES세포주가 본 발명에 의해 사용되는 지지세포 비함유 배양조건 하에서는 다능성을 유지하고 있는 것을 명료하게 입증하고 있다.
EB세포의 분화 레벨은 Oct-4의 발현의 상실, 및 다른 마아커(예를 들면, α-페토프로틴, NF-68kDa, α-카르디액 및 알부민 등)의 증대된 발현 레벨을 추적하는 것에 의해 모니터하는 것이 가능하다. 특이적인 유전자의 발현 레벨을 모니터하기 위해 유용한 다양한 방법이 이 분야에 널리 알려져 있고, 이들에는 RT-PCR, RNA 인시츄 하이브리다이제이션, 웨스턴 블럿 분석 및 면역조직화학이 포함된다.
EB세포주의 다능성 능력은 또 세포를 SCID마우스에 주입하는 것에 의해 확인하는 것이 가능하다[Evans MJ 및 Kaufman M(1983), 정상의 마우스 배로부터 직접적으로 성장된 다능성 세포, Cancer Surv., 2:185-208]. 이 경우, SCID마우스는 주입될 때 기형종을 형성한다. 기형종은 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정처리되고, 3개의 배엽(즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽)에 대하여 조직학적으로 조사된다.
하기의 실시예란의 실시예3에 보여지는 바와 같이, 본 발명의 선택된 증식인자의 조합(즉, TF조합 및 TLF조합)가 보충된, 피브로넥틴에 기초한 지지세포 비함유 배양 시스템에서 배양된 ES세포는 기능적인 기형종을 형성했다. 이것은 인비보에서 분화하는 ES세포의 다능성 능력을 입증하고 있다.
분화상태를 모니터하는 것에 더하여, 줄기세포는 많은 경우, 전체의 염색체가 존재하고, 또 배양기간 중에 검출가능하게 변화하지 않는 세포학적인 정배수성(euploidity)을 확인하기 위해, 핵형에 대하여 모니터되고 있다. 배양된 줄기세포는 표준적인 김사(Giemsa) 염색을 사용하여 핵형을 결정하는 것이 가능하고, 대응하는 종의 발표되어 있는 핵형과 비교하는 것이 가능하다.
본 발명의 교시에 따라 배양된 줄기세포는 TF조합 또는 TLF조합의 증식인자가 보충되었을 때, 피브로넥틴 매트릭스에 있어서의 30회 및 32회의 계대배양의 후, 각각 정상의 핵형을 유지하고 있다(실시예란의 실시예 2를 참조할 것).
증식성 및 미분화의 상태를 적어도 38회의 계대배양에 걸쳐 유지하는 그 다능성 및 능력은 본 발명의 교시에 따라 얻어진 ES세포 배양물을 단일 세포 클로닝을 위해 우수한 공급원이 되게 한다.
따라서, 상기의 방법은 더욱 바람직하게는 이종을 함유하지 않고, 또 세포를 함유하지 않는 본 발명의 배양조건 하에서 상기의 인간 배아줄기세포주에 유래하는 단일 세포를 배양하고, 그 결과, 단일 세포에 유래하는 ES배양물을 확립하는 추의 공정을 포함할 수 있다.
단일 세포 클로닝의 다양한 방법이 이분야에서는 널리 알려져 있다(예를 들면, 미국특허제6548655호, Amit 외, 2000, Dev.Biol., 227:271-8을 참조할 것). 그와 같은 방법에서는 전형적으로는 세포군을 세포 배양물로부터 선택하는 것, 그 세포군을 단일 세포에 해리하는 것, 및 세포증식을 촉진시키고, 그 한편으로 동시에 세포분화를 저해하는 조건에서 단일 세포를 별도로 성장시키는 것이 포함된다. 단일 세포 클론이 얻어지면, 단일 세포 클론은 적합한 배양조건 하에서 ES세포주로 확대하는 것이 가능하다.
본 발명의 ES세포주는 이종 혼입물 및 지지세포혼입물을 함유하지 않으므로, 인간의 세포에 기초한 치료 및 조직재생을 위해 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 태양에 의하면 세포치환 및/또는 조직재생을 필요로 하는 개체를 처치하는 방법으로서 이종 혼입물 및 지지세포혼입물을 함유하지 않는 hES세포조제물을 개체에 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
바람직하게는 이 방법은 더욱 본 명세서 중 상기 기재되는 방법론을 사용하여 hES세포조제물을 조제하는 공정을 포함한다.
본 명세서 중에 사용되는 "세포치환 및/또는 조직재생을 필요로 하는 개체를 처치한다"는 장해(예를 들면, 세포치환 및 조직재생을 필요로 하는 신경학적 장해, 근육 장해, 심장혈관장해, 혈액학적 장해, 피부장해 및 간장장해 등)에 걸린 개체를 처치하는 것을 의미한다.
표현 "처치하다"는 질환, 장해 또는 상태에 걸려있는 개체, 또는 질환, 장해 또는 상태로 진단된 개체에서 질환, 장해 또는 상태의 발달을 저해하거나, 또는 정지시키는 것, 및/또는 질환, 장해 또는 상태의 경감, 완화 또는 퇴행을 발생시키는 것을 의미한다. 당업자는 질환, 장해 또는 상태의 발달을 평가하기 위해 사용하는 것이 가능한 다양한 방법론 및 분석, 유사하게, 질환, 장해 또는 상태의 경감, 완화 또는 퇴행을 평가하기 위해 사용하는 것이 가능한 다양한 방법론 및 분석을 알고 있다.
본 명세서 중에 사용되는 "투여하다"는 임의의 적합한 경로를 사용하여, 예를 들면, 경구투여, 설하투여, 정맥내투여, 피하투여, 경피투여, 근육내투여, 피내투여, 수강내(intrathecal)투여, 복강내투여, 비장내투여, 간장내투여, 췌장내투여, 심장내투여, 경막외투여, 안내투여, 두개내투여, 흡입투여, 직장투여, 질투여 및 유사한 투여를 사용하여, 인간 ES세포조제물을 개체에 제공하기 위한 수단을 의미한다.
본 명세서에서 얻어진 줄기세포는 그 대로(즉, 미분화 조제물), 또는 부분적 또는 완전한 분화 후에 투여하는 것이 가능하다. 배양된 인간 ES세포는 한정된 발달계보의 세포로, 또는 최종 분화세포로 분화시키는 것이 가능하다. 줄기세포의 분화는 배양체를 형성시키는 현탁배양에서 미분화의 인간 ES세포를 과도성장(overgrowth)시키는 것에 의해, 또는 특정의 양식으로 분화를 촉진시키는 조건에 기초하여 ES세포를 치상(plating)하는 것에 의해 개시시키는 것이 가능하다. 그와 같은 조건에는 영양물, 증식인자 또는 사이토카인을 배지로부터 제거하는 것, 또는 영양물, 증식인자 또는 사이토카인을 배지에 가하는 것, 또는 산소압력을 변화시키는 것, 또는 배양표면에 있어서의 기질을 변경하는 것이 포함될 수 있다.
미분화 줄기세포 또는 분화줄기세포는 다양한 장해를 처치하는 것에서 이용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 희돌기신경교세포계보의 부분적으로 분화된 ES세포를, 미에린(myelin) 장해를 처치하기 위해 사용할 수 있다(미에린 질환의 수복:동물 모델에 있어서의 방침 및 진보, Molecular Medicine Today, 1997, 554-561페이지). 연골세포 또는 간엽계보의 부분적으로 분화된 ES세포를 골장해 및 연골장해의 처치에서 사용할 수 있다(미국특허제4642120호). 또 상피계보의 부분적으로 분화된 ES세포를 창상 또는 화상의 피부재생에서 사용할 수 있다(미국특허제5716411호).
세포치환치료에 더하여, 본 발명의 ES세포주는 또 지지세포 유래의 cDNA를 이용하여 비교적 오염되지 않은 cDNA 라이브러리를 조제하기 위해 이용할 수 있다. mRNA가 표준적인 기술에 의해 ES세포로부터 조제되고, 더욱 역전사되어 cDNA가 형성된다. cDNA조제물은 이 분야에 알려져 있는 기술에 의해 배아섬유아세포 및 불필요한 특이성의 다른 세포로부터 얻어진 뉴클레오티드를 이용하여 서브트랙션되어 서브트랙션된 cDNA 라이브러리를 얻는 것이 가능하다.
본 발명의 ES세포주는 줄기세포의 특성에 영향을 미치는 인자(예를 들면, 소분자 약물, 펩티드 및 폴리뉴클레오티드 등) 또는 조건(예를 들면, 배양조건 또는 조작 등)에 대하여 스크리닝하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 성장에 영향을 미치는 물질, 독소 또는 잠재적인 분화인자를 배양배지에 이들을 첨가하는 것에 의해 시험할 수 있다.
본 발명의 추가의 목적, 이점 및 신규의 특징은 하기 실시예를 고찰하면 당업자에는 명확하게 될 것이다. 또 이들 실시예는 본 발명을 한정하는 것이 아니다.. 더욱, 앞에서 상술되고 또 본원의 특허청구의 범위의 항에 특허청구되어 있는 본 발명의 각종 실시태양과 관점은 각각 하기실시예의 실험에 의해 지지되고 있다.
상기 설명과 함께 이하의 실시예를 참조하여 본 발명을 예시한다. 또 이들 실시예에 의해 본 발명은 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어와 본 발명에서 이용되는 실험방법에는 분자생화학, 미생물학 및 재조합DNA의 기법이 일반적으로 포함된다. 이들 기법은 문헌에 상세하게 설명되어 있다[예를 들면, 이하의 제문헌이 참조된다. "Molecular Cloning:A laboratory Manual"Sambrook 외 1989年; Ausubel, R.M.편 1994년"Current Protocols in Molecular Biology"I-III권; Ausubel 외저 1989년"Current Protocols in Molecular Biology"John Wiley and Sons, 미국메릴랜드주 볼티모어; Perbal저"A Practical Guide to Molecular Cloning"John Wiley ＆ Sons, 미국 뉴욕 1988년; Watson외, "Recombinant DNA"Scientific American Books, 미국 뉴욕; Birren외편"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series"1-4권, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 미국 뉴욕 1998년; 미국특허의 4666828호, 4683202호, 4801531호, 5192659호 및 5272057호에 기재되는 방법; Cellis, J.E.편"Cell Biology:A Laboratory Handbook"I-III권1994년; Freshney"Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique"Wiley-Liss,N.Y.,1994년; Coligan, J.E.편"Current Protocols in Immunology"I-III권1994년; Stites 외편"Basic and Clinical Immunology" (제8판), Appleton & Lange, 미국코네티컷주 노워크 1994년; Mishell과 Shiigi편"Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., 미국 뉴욕 1980년; 또는 이용가능한 면역검정법은 예를 들면 이하의 특허와 과학문헌에 광범위에 걸쳐 기재되고 있다. 미국특허의 3791932호, 3839153호, 3850752호, 3850578호, 3853987호, 3867517호, 3879262호, 3901654호, 3935074호, 3984533호, 3996345호, 4034074호, 4098876호, 4879219호, 5011771호 및 5281521호; Gait,M.J.편"Oligonucleotide Synthesis"1984년; Hames, B.D. 및 Higgins S.J.편"Nucleic Acid Hybridization"1985년; Hames,B.D. 및 Higgins S.J.편"Transcription and Translation"1984년; Freshney, R.I.편"Animal Cell Culture"1986년; "Immobilized Cells and Enzymes"IRL Press 1986년; Perbal,B.저"A Practical Guide to Molecular Cloning"1984년 및 "Methods in Enzymology"1-317권, Academic Press; "PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications", Academic Press, 미국캘리포니아주 샌디에고1990년; Marshak외, "Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual", CSHL Press, 1996년; Robertson EJ저"Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach"Oxford:IRL Press,1987년; Nagy A외"Manipulating the Mouse Embryo"Cold Spring Harbor Lab Press,Third Edition,2003년; Thomson,J.A.,Marshall,V.S.Primate embryonic stem cells. Current Topics in Developmental Biology 38,133-165,1998년; Marshall,V.S.,Waknitz,M.A.,Thomson,J.A.Isolation and maintenance of primate embryonic stem cells.Methods in Molecular Biology 158,11-18,2001년; 또 이들 문헌류는 마치 본원에 완전히 기재되어 있는 것처럼 원용하는 것이다]. 그 외의 일반적인 문헌은 본 명세서를 통해 제공된다. 본 명세서에 기재된 방법은 당업계에서 주지인 것으로 생각되고, 독자의 편의를 위해 제공된다. 본 명세서에 포함되는 전체의 정보는 본원에 원용하는 것이다.
실시예 1
이종 비함유배지가 보충된 지지세포 비함유 배양 시스템은 ES세포주를 성장시키기 위해 적합하다
인간 ES세포를 지지세포 비함유의 양호하게 규정된 환경을 ES세포 배양물에 제공하기 위해 혈청 대체물 및 선택된 증식인자의 존재 하에서 피브로넥틴에 기초한 배양 시스템에 이동시켰다.
재료 및 실험방법
ES세포 배양물: 인간 ES세포주의 I-6, I-3[Amit,M.&Itskovitz-Eldor,J., 인간 배아줄기세포의 유도 및 자연분화, J Anat., 200, 225-232(2002)] 및 H-9[Thomson,J.A.외, 인간 배반포에 유래하는 배아줄기세포주, Science, 282, 1145-7(1998)]가 15%의 혈청 대체물(SR)이 보충된 85%의 Ko-DMEM, 2mM의 L-글루타민, 0.1mM의 β-메르캅토에탄올, 1%의 비필수아미노산 스톡액, 및 4ng/ml의 bFGF로 구성되는 배양배지(이들은 전체가 Gibco Invitrogen corporation products(미국)로부터 얻어진다)에서, 46회, 39회 및 25회의 계대배양에 걸쳐 각각 마우스 배아섬유아세포(MEF)와 함께 배양되었다. ES세포는 그 후, 20%의 SR, 80%의 배양배지, 및 증식인자의 하기 조합의 하나의 존재 하에서의 소 유래 피브로넥틴 피복 플레이트(50μg/10cm2, Biological Industries(Beth Haemek, 이스라엘))에 이동되었다: "T"-0.12ng/ml의 TGFβ1(R&D Systems Inc.(Minneapolis, MN, 미국)); "TF"-0.12ng/ml의 TGFβ1 및 4ng/ml의 bFGF(Gibco Invitrogen corporation products(미국)); "LF"-1000u/ml의 백혈병 저해제 인자(LIF, CHEMICON International,Inc.(Temecula, CA, 미국)) 및 4ng/ml의 bFGF; 또는 "TLF"-0.12ng/ml의 TGFβ1, 1000u/ml의 LIF 및 4ng/ml의 bFGF. 부착성세포가 1mg/ml의 IV형 콜라게나제(Gibco Invitrogen corporation products(미국))을 30분간 사용하여 4일-6일마다 분할되고, 신선한 배지를 함유하는 플라스크에 재 치상되었다. 동결 프로토콜에 따라 세포를 10%의 DMSO(Sigma(St.Louis, MO, 미국)), 10%의 인간 혈청(CHEMICON International,Inc.(Temecula, CA, 미국)) 또는 15%의 SR, 및 80%의 Ko-DMEM(Gibco Invitrogen corporation products(미국))로 구성되는 동결액을 사용하여 액체질소로 동결 했다.
형태학적 평가-ES세포를 위상차를 이용하는 도립형 현미경(Olympus, IX70, 일본)으로 조사했다(생세포).
실험 결과
지지세포 비함유 배양 시스템에 있어서의 hES세포의 증식능력-I-3, I-6 및 H-9의 계통에 유래하는 ES세포를, 본 명세서 중 상기의 방법에 상세히 기재되는 바와 같이, 선택된 증식인자가 보충된 혈청 대체물의 존재 하에서의 피브로넥틴 피복 플레이트에 이동했다. 배양배지에 bFGF만이 보충되었을 때, 또는 LIF 및 bFGF가 보충되었을 때(LF), 세포는 수회의 계대배양에 걸쳐 증식이 계속되고, 그 후 분화로 변경되었다. 또 ES배양배지에 TGFβ만이 보충되었을 때, ES세포는 10회를 초과하는 계대배양에 걸쳐 미분화 상태로 유지되었으나 증식이 불충분하고, 15회의 계대배양까지 서서히 소실되었다. 다른 한편, ES배양배지에 TGFβ1 및 bFGF가 보충되었을 때(TF), 또는 TGFβ1, LIF 및 bFGF가 보충되었을 때(TLF), 세포는 증식을 계속하고, MEF에서 성장된 hES세포와 유사하게 hES세포의 정상의 특징을 유지하고 있었다. 그러나, TF의 조합에 의해 성장된 세포는 각각의 계대배양의 기간중, 1매의 플레이트로 분할되었으나, TLF의 조합에 의해 성장된 세포는 MEF에서 성장된 ES세포와 유사하게 2매-3매의 플레이트로 분할되었다. 이것은 증식속도가 TLF의 조합의 존재 하에서는 높다는 것을 입증하고 있다. 따라서, TLF조합의 증식인자가 보충된 지지세포 비함유 배양 시스템은 MEF에서 성장된 ES세포의 배가시간과 유사한 적어도 25시간의 배가시간을 수반하여 hES세포의 정상 성장을 지원할 수 있었다.
지지세포 비함유 배양 시스템에 있어서의 ES콜로니 및 ES세포의 형태학적 특징-지지세포 비함유 배양 시스템에서 성장된 ES콜로니의 형태학적 특징은 TLF조합의 증식인자가 보충되었을 때에는 (224일을 초과하는) 56회를 초과하는 계대배양의 후에도, TF조합의 증식인자가 보충되었을 때에는 (212일을 초과하는) 53회를 초과하는 계대배양의 후에도, MEF에서 성장된 ES콜로니의 형태학적 특징과 구별될 수 없었다(도시생략). 또 본 발명의 피브로넥틴 지지세포 비함유 시스템에서의 이들의 계대배양으로부터 4일 경과시, hES세포 배양물은 30-35시간의 배가시간을 가지는 85%-90%의 미분화 세포로 구성되었다. 이배가시간은 MEF에서 성장된 hES세포의 배가시간과 일치한다.
보다 고배율로 보았을 때, 지지세포 비함유 배양 시스템에서 성장된 hES세포는 큰 핵 대 세포질 비율, 1-3개의 핵의 뚜렷한 존재 및 세포 사이의 전형적인 간격을 수반하여 작고 또 원형이었다(도 1a-도 1d).
지지세포 비함유 배양 시스템에서 성장된 ES세포는 MEF에서 성장된 ES세포의 존재율과 유사한 존재율을 가진다-ES저장을 위해 지지세포 비함유 배양 시스템에서 성장된 ES세포를 15%의 SR 및 10%의 DMSO의 존재 하에서 동결 했다. 동결 ES세포가 더욱 해동되고, 재 치상되었을 때, 동결 ES세포는 MEF에서 성장된 ES세포의 존재율과 유사한 존재율을 나타냈다.
따라서, 이들 결과는 TF조합 및 TLF조합의 증식인자가 hES배양물을 위해 적합하고, 그러나 TF의 조합은 낮은 증식능력 때문에 TLF의 조합보다 열등한 것을 입증하고 있다. 더욱, 지지세포 비함유 배양 시스템에서 성장된 ES세포는 MEF에서 성장된 ES세포의 형태학적 특징 및 존재율과 유사한 형태학적 특징 및 존재율을 나타냈다.
실시예 2
이종 비함유배지가 보충된 지지세포 비함유 배양 시스템은 표현형이 일치하는 ES세포의 성장을 지원한다.
이종 비함유배지가 보충된 지지세포 비함유 배양 시스템에서 성장된 hES세포의 표현형 특징이 미분화 세포에 전형적인 세포표면 마아커를 사용하여 평가되었다.
재료 및 실험 방법
핵형분석-ES세포의 유사분열중기가 콜세미드(colcemid)(KaryoMax 콜세미드 용액, Invitrogen(Grand island, NY, 미국))를 사용하여 저지되고, 핵막이 표준적인 프로토콜(인간 세포유전학 명명법에 관한 국제 시스템, ISCN)에 의한 저장 용액에서 용해되었다. 염색체의 G밴드형성이 제조자(Giemsa, Merck)의 설명서에 따라 행해진다. 샘플 당 적어도 20개의 세포의 핵형이 ISCN에 따라 분석 및 보고되었다.
면역조직화학-세포가 4% 파라포름알데히드에서 20분간 고정처리되고, PBS(Biological Industries(Beth Haemek, 이스라엘))에서의 2%의 정상염소 혈청에서 15분간 블로킹처리되고, SSEA1, SSEA3, SSEA4의 마우스 항인간 항체(Hybridoma bank(Iowa, 미국)), TRA-60, TRA-81의 마우스 항인간 항체(P Andrews(Shefield대학(영국)에 의해 제공)의 1:50희석물을 이용하여 4℃에서 하룻밤 인큐베이션되었다. 그 후, 세포는 PBS로 세정되고, 플루오로크롬 Cys3에 콘쥬게이트화(conjugated)된 당나귀 항마우스 IgG항체(Chemicon International(Temecula, CA, 미국))의 1:100희석물을 이용하여 더욱 인큐베이션되었다. 세포를 도립형 형광현미경(CARL Zeiss, 독일) 또는 공초점 현미경(Bio-Rad laboratories(Hertfordshire, 영국))으로 가시화했다.
실험 결과
이종 비함유배지가 보충된 피브로넥틴형 지지세포 비함유 배양 시스템은 다른 지지세포형 프로토콜과 같은 일치하는 핵형을 가지는 ES세포를 제공한다-핵형분석이 이종 비함유배지가 보충된 피브로넥틴형 지지세포 비함유 배양 시스템에서의 연속 배양의 후의 hES세포에 대해 행해졌다. 핵형분석은 2개의 배지조건(TF 및 TLF), 및 지지세포 비함유 배양 시스템에서의 6회-32회의 계대배양의 다른 단계에 있어서의 3개의 hES세포주(I-3, I-6 및 H-9)를 나타내는 9개의 별개의 배양물에 대해 행해진다. 이 분석에 의해 정상의 핵형이 TH배지에서 배양되었을 때의 30회의 계대배양, 및 TLF배지에서 배양되었을 때의 32회의 계대배양에서 조사된 140개의 세포 중의 136개의 세포에서 밝혀졌다. 동일군의 4개의 세포에서, 47의 비정상 핵형(즉, XXX)이 발견되었다. 이들 4개의 세포는 TLF가 보충된 지지세포 비함유 배양 시스템에서 그 중 20회의 계대배양이 행해진 유도후 71회의 계대배양에서 거의 1년간에 걸쳐 배양되었다. 이 전에 보고되어 있는 바와 같이[Amit,M., 클론유도된 인간 배아줄기세포주는 다능성 및 증식능력을 장기간의 배양에 걸쳐 유지한다. Dev.Biol., 227:271-8(2000)], 염색체의 불안정성이, MEF에서 8개월간에 걸쳐 배양되었을 때, ES세포에서 발생할 수 있다. 정리하면, 이들 결과로부터 본 발명의 지지세포 비함유 배양 시스템은 hES세포의 정상 및 안정한 핵형을 지원하는 것이 시사된다.
이종 비함유배지가 보충된 지지세포 비함유 배양 시스템에서 배양된 인간 ES세포는 태아성 표면 마아커를 발현한다-인간 ES세포의 정상 성장을 유지시키는 피브로넥틴형 지지세포 비함유 배양 시스템의 능력을 더욱 특징화하기 위해, IHC가 TRA-1-60, SSEA4, TRA-1-81, SSEA3 및 SSEA1을 함유하는 태아성 표면 마아커항체를 이용하여 인간 ES세포에 대해 행해진다. TF증식인자 및 TLF증식인자가 보충된 배양에 있어서의 17회 및 38회의 계대배양의 후, I-3, I-6의 인간 ES세포는 단계 특이적인 태아성 항원4(SSEA4), 종양거절 항원(TRA)-1 및 TRA-1-81의 큰 발현 레벨이 입증되었다(도 1e-도 1h). 이들 마아커는 미분화 ES세포의 전형적인 특징이다[Thomson JA외 (1998), 인간 배반포에 유래하는 배아줄기세포주, Science, 282:1145-7; Thomson JA외(1996), 커몬 마모세트(common marmoset)(Callithrix jacchus)의 배반포에 유래하는 다능성 세포주, Biol.Reprod, 55:254-9; Thomson JA외(1995), 영장류 배아줄기세포물의 단리, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 92:7844-8]. 뚜렷하게, 단계 특이적인 태아성 항원3(SSEA3)가 적절한 정도로 발현하고 있을 뿐이고, 한편 단계 특이적인 태아성 항원1(SSEA1)(마우스 ES세포의 특이 마아커)의 발현은 검출되지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
이들 결과는 TF 또는 TLF의 증식인자가 보충된 지지세포 비함유 배양 시스템은 장기간의 배양기간의 후에도, 인간 ES세포를 미분화 상태로 유지하는 것이 가능한 것을 입증하고 있다.
실시예 3
이종 비함유배지가 보충된 지지세포 비함유 배양 시스템은 기능적인 ES세포의 성장을 지원한다
혈청 대체물 및 이종 비함유증식인자가 보충된 피브로넥틴형 지지세포 비함유의 배양 시스템에서 성장된 인간 ES세포가, 인비트로에서 배양체를 형성하고, 또 인비보에서 기형종을 형성하는 그 능력에 대하여 조사되었다.
재료 및 실험 방법
인간 ES세포로부터의 배양체(EB)의 형성-지지세포 비함유 배양 시스템에서 성장된 인간 ES세포를 IV형 콜라게나제(1mg/ml)에 의해 6 웰 플레이트(40cm2-60cm2) 배양물로부터 취출하고, 1000㎕의 Gilson 피펫 팁을 사용하여 작은 괴로 더욱 해리시켰다. 그 후, 해리된 세포를 20%의 규정된 소태아혈청(FBSd, HyClone(Utah, 미국))이 보충된 80%의 Ko-DMEM, 1mM의 L-글루타민, 0.1mM의 β-메르캅토에탄올, 및 1%의 비필수아미노산 스톡액로 구성되는 배지로 58mm 페트리 디쉬(Greiner, 독일)에서 배양했다. 별도 기재되지 않으면, 전부 Gibco Invitrogen corporation(미국)로부터 구입되었다. EB의 형성이 현탁상태에 14일후에 조사되었다.
기형종의 형성-ES세포를 6 웰 플레이트(60cm2)에서의 6개의 컨퓰루언트 웰(confluent well)로부터 취출하고, 4주령의 수컷SCID베이지 마우스(Harlan(Jerusalem, 이스라엘))의 후각근육에 주사했다. 주사후 적어도 12주째에 얻어진 기형종은 포름알데히드에서 고정처리되고, 조직학적으로 조사되었다.
역전사효소(RT) 결합 PCR-총RNA를 17회-25회의 계대배양에 걸쳐 지지세포 비함유 배양 시스템에서 성장된 미분화의 인간 ES세포, 또는 지지세포 비함유조건에서 성장된 ES세포로부터 얻어진 14일령의 EB의 어느것으로부터 Tri시약키트(Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis, MO, 미국))를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 단리했다. cDNA합성이 MMLV RT-RNaseH-마이너스(Promega Corp.(Madison, WI, 미국))를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 1μg의 총RNA 템플레이트에 대해 행해졌다. PCR프라이머 및 반응조건이 본 명세서 중 하기의 표1에 기재되었다. 전체의 PCR반응은 94℃에서 5분간의 최초의 쇄의 변성을 포함하였다. PCR생성물은 2%아가로스겔 전기영동을 사용하여 사이즈분획(size-fraction)되었다.
Figure 112008077979113-pct00011
실험 결과
ES세포는 지지세포 비함유 배양 시스템로부터 취출된 후, 인비트로에서 배의 배엽세포타입으로 자연분화한다-피브로넥틴에 기초한 지지세포 비함유의 배양 시스템에서 배양된 인간 ES세포가 지지세포에 기초하는 프로토콜에 의해 얻어지는 인간 ES세포와, 표현형 뿐 아니라 기능적으로 일치하는 것을 확인하기 위해, ES세포를 TLF에 있어서의 22회-30회의 계대배양의 후 및 TF에 있어서의 28회의 계대배양의 후의 지지세포 비함유 배양로부터 취출하고 현탁상태에서 성장되었다. 그 결과, hES세포는 MEF에서 성장된 ES세포에 의해 생성된 배양체(EB)와 유사한 배양체를 형성하였다(도 2a-도 2c). 단리된 EB의 기능성이 다양한 태아성 세포 마아커를 사용하는 IHC에 의해 더욱 조사되었다. 도 2d-도 2f에 더욱 보여지는 바와 같이, EB는 외배엽기원에 유래하는 신경 특이적 튜블린, 평활근 액틴, 및 중배엽기원의 CD-31 마아커를 발현했다.
EB내에 있어서의 ES일치의 유전자 발현이 RT-PCR을 사용하여 더욱 확인되었다. EB내에서 줄기세포는 배의 3개의 배엽(즉, 중배엽, 내배엽 및 외배엽)의 대표적인 세포로 분화했다. 도 3에서 보이는 바와 같이, TLF 또는 TF가 보충된 지지세포 비함유 배양 시스템에서 성장된 미분화 ES세포는 고 레벨의 Oct4(도 3), 즉 다능성 배아줄기세포 및 배성 생식세포에 대한 마아커[Pesce M 및 Scholer HR, Oct-4:포유동물발생의 개시에 있어서의 게이트키퍼(gatekeeper),(2001), Stem Cells, 19:271-8]를 발현하였으나, 14일령의 EB로부터 채취된 세포는 배의 외배엽과 관련되는 신경필라멘트(NF-68kD), 배의 중배엽에 관련하는 α-심장 액틴, 및 모두 배의 내배엽의 지표인 α-페토프로틴 및 알부민을 함유하는 세포분화에 관련하는 다양한 유전자를 발현했다. EB 샘플에 있어서의 감소된 Oct4발현은 전능성세포가 체세포계보로 분화된 후에 있어서의 감소된 Oct4발현의 이전의 보고[Thomson JA외(1998), 인간 배반포에 유래하는 배아줄기세포주, Science, 282:1145-7; Reubinoff BE외(2000), 인간 배반포 유래의 배아줄기세포주:인비트로에서의 체세포분화, Nat.Biotechnol., 18:399-404]와 일치하였다. 이 전에 다른 곳에서 보고되어 있는 바와 같이[Sculdiner M.외, 인간 ES세포에 유래하는 세포의 분화에 대한 8개의 증식인자의 영향, Proc Natl Acad Sci USA, 97:11307-12(2000); Amit, M.외, 인간 배아줄기세포주를 위한 인간 지지세포층, Biol.Reprod., 68:2150-2156(2003); Kehat,I.외, 인간 배아줄기세포주는 심근세포의 구조적 성질 및 기능적 성질을 가지는 근세포로 분화하는 것이 가능하다, J Clin Invest, 108:407-14(2001)], ES세포 배양물은 어느 정도의 백그라운드 분화를 가질 수 있다. 실제로, 세포 특이적 유전자의 일부(알부민 및 α-심장 액틴 등)도 본 발명의 미분화 ES세포에서 발현되었다(도 3).
따라서, 이들 결과는 본 발명의 지지세포 비함유 배양에서 성장된 인간 ES세포는 다양한 체세포계보로 분화되는 세포와 함께 기능적인 EB를 발생시키는 것이 가능하다는 것을 입증하고 있다.
지지세포 비함유 배양에서 성장된 인간 ES세포는 인비보에서 배의 배엽으로 분화한다-배의 배엽에의 인간 ES세포의 분화를 지원하는 본 발명의 지지세포 비함유 배양 시스템의 능력을 더욱 입증하기 위해, ES세포는 인비보에서의 기형종 형성에 대하여 조사되었다. SCID베이지 마우스에의 주사 후, TLF에서 26회 및 19회의 계대배양에 걸쳐 각각 배양된 I-3세포 및 I-6세포는 기형종을 형성하는 것이 가능하였다. 각각의 기형종은 외배엽 기원의 유수신경(도 4a), 중배엽기원인 히알린연골의 상세(도 4b), 및 내배엽과 관련되는 배세포가 많은 분비상피(도 4c)를 함유하는 배의 3개의 배엽의 대표적인 조직을 함유하고 있었다.
정리하면, 본 발명의 지지세포 비함유 배양 시스템에서 성장된 인간 ES세포는 이와 같이 지지세포에 기초하는 배양에서 성장된 세포와 기능적으로 다르지 않다. 분화후, ES세포는 배의 3개의 배엽의 전체에 관련하는 유전자를 인비트로에서 발현하고, 유사하게 3개의 배엽의 전체로부터 생성되는 조직으로 구성되는 기형종을 인비보에서 형성했다. 다른 지지세포 비함유 프로토콜과 달리, 본 발명의 배양 시스템은 인간 ES세포를 증식시키기 위해 적합한 양호하게 규정된 이종 비함유의 배양배지를 함유했다.
실시예 4
완전한 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양 시스템은 표현형이 일치하는 인간 ES세포를 성장시키기 위해 적합하다.
동물 비존재의 환경은 인간 ES세포의 어떠한 장래의 임상적 사용을 위해 매우 중요한 것이므로, 완전한 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양 시스템이 hES세포를 배양하기 위한 매트릭스로서 인간 기원의 피브로넥틴 및 이종 비함유의 보충된 배지 및 증식인자를 사용하여 개발되었다.
실험 결과
이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양 시스템은 인간 ES세포의 성장을 지원한다-hES세포배양을 위한 완전한 동물 비존재의 양호하게 규정된 환경을 얻기 위해 인간 기원의 피브로넥틴이 지지세포 비함유 배양 시스템으로서 사용되었다. 배양배지에는 본 명세서 중 상기의 실시예1에 있어서의 재료 및 실험방법에 기재되는 T, LF, TF 및 TLF의 증식인자조합이 보충된 혈청 대체물(15%)이 포함되었다. 인간 혈장 피브로넥틴(인간 혈장으로부터 얻어지는 피브로넥틴(Sigma, St.Louis, MO, 미국)) 및 세포 피브로넥틴(인간 포피 섬유아세포로부터 얻어지는 세포 피브로넥틴(Sigma, St.Louis, MO, 미국))은 모두 TF 및 TLF의 양자의 증식인자조합의 존재 하에서 적어도 38회의 계대배양(약 110회의 배가)에 걸쳐 hES세포의 미분화 성장을 지원하는 것이 발견되었다. 또 본 발명의 피브로넥틴 -지지세포 비함유 시스템에서의 계대배양로부터 4일째에서 hES세포 배양물은 MEF에서 성장된 hES세포의 배가시간과 일치하는 30-35시간의 배가시간을 가지는 85%-90%의 미분화 세포로 구성되었다. 이것은 hES세포의 정상 성장을 전파하는 이들 이종 비함유 배양 시스템의 능력을 입증하고 있다.
이들 결과는 장기간 지속하는 증식성 및 미분화의 인간 ES세포 배양물의 성장을 지원하는 이종 비함유 배양 시스템이 보충된 인간 기원의 피브로넥틴의 능력을 입증하고 있다.
이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양 시스템에서 성장된 인간 ES세포는 소 유래 피브로넥틴에 기초한 지지세포 비함유의 배양 시스템에서 성장된 ES세포와 표현형을 구별하는 것이 불가능하다-혈청 대체물 및 TF증식인자가 보충된 인간 세포 피브로넥틴 배양 시스템에서 22회의 계대배양에 걸쳐 성장된 세포는 미분화 세포의 형태학을 유지하고 있었다. ES세포는 큰 핵 대 세포질 비율, 1개-3개의 핵의 뚜렷한 존재, 및 세포 사이의 전형적인 간격을 수반하여, 작고 원형이었다(도 5a-5c).
또 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양 시스템에서 성장된 인간 ES세포는 32회의 계대배양의 후 정상 핵형을 가지는 것이 발견되었다(도시생략).
더욱 IHC에 의해 더욱 해명된 바와 같이, 완전한 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 시스템에서 16회의 계대배양에 걸쳐 배양된 인간 ES세포는 TRA-1-60, SSEA4, TRA-1-81을 함유하는 전체의 특징적인 태아성 표면 마아커를 발현하였다(도 5d-도 5f).
따라서, 이들 결과는 정상 및 안정한 핵형을 가지는 높은 증식성의 배양을 유지하고, 또, 전체의 전형적인 태아성 표면 마아커를 발현하는 표현형이 일치하는 인간 ES세포를 지원하는 완전한 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 시스템의 능력을 입증하고 있다.
따라서, 이들 결과로부터 인간 ES세포의 유도 및 배양을 위한 본 발명의 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양 시스템의 사용이 시사된다.
실시예 5
완전한 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양 시스템에서 성장된 인간 ES세포는 다른 배양 시스템에서 성장된 ES세포와 기능적으로 구별하는 것이 불가능하다.
혈청 대체물 및 이종 비함유증식인자가 보충된 인간 피브로넥틴형 지지세포 비함유 배양 시스템에서 성장된 인간 ES세포가 인비보에서 배양체를 형성하는 그 능력에 대하여 조사되었다.
ES세포는 지지세포 비함유 배양 시스템로부터 취출된 후, 인비트로에서 배의 배엽세포타입으로 자연분화한다-이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양 시스템에서 배양된 인간 ES세포가 지지세포에 기초하는 프로토콜에 의해 얻어지는 인간 ES세포와 표현형 뿐 아니라 기능이 일치하는 것을 확인하기 위해, ES세포를 인간 세포 피브로넥틴 매트릭스 및 인간 혈장 피브로넥틴 매트릭스에서 각각, 17회 및 16회의 계대배양의 후의 지지세포 비함유 배양로부터 취출했다. 그 결과, hES세포는 MEF에서 성장된 ES세포에 의해 생성된 배양체(EB)와 유사한 배양체를 형성하였다(도 6a-도 6c).
EB내에 있어서의 ES일치의 유전자 발현이 RT-PCR을 사용하여 더욱 확인되었다. EB내에서 줄기세포는 배의 3개의 배엽(즉, 중배엽, 내배엽 및 외배엽)의 대표적인 세포로 분화했다. 도 7에서 보이는 바와 같이, TLF 또는 TF가 보충된 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양 시스템에서 성장된 미분화 세포는 고 레벨의 Oct4 및 LIF수용체를 발현하였으나(도 7), 14일령의 E로부터 채취된 세포는 배의 외배엽과 관련되는 신경필라멘트(NF-68kD), 배의 중배엽에 관련하는 α-심장 액틴, 및 모두 배의 내배엽의 지표인 α-페토프로틴 및 알부민을 함유하는 세포분화에 관련하는 다양한 유전자를 발현했다.
따라서, 이들 결과는 본 발명의 완전한 이종 비함유 및 지지세포 비함유의 배양에서 성장된 인간 ES세포는 다양한 체세포계보로 분화하는 세포와 함께 기능적인 EB를 발생시키는 것이 가능하다는 것을 입증하고 있다.
실시예 6
지지세포 비함유 배양 시스템은 미분화의 인간 배아줄기세포의 정상 성장속도 및 큰 백분율을 지원한다.
인간 배아줄기세포를 증식하는 지지세포 비함유 배양 시스템의 능력을 더욱 특징화하기 위해, 미분화 줄기세포의 성장속도 및 백분율이 다양한 배양조건 하에서의 hES세포에서 밝혀졌다.
지지세포 비함유 배양 시스템은 지지세포에 기초하는 배양 시스템과 유사한 미분화 인간 ES세포의 정상 성장속도 및 큰 백분율을 유지한다-hES의 성장을 지원하는 본 발명의 지지세포 비함유 배양 시스템의 능력을 판정하기 위해, 미분화 줄기세포의 성장속도 및 백분율이 지지세포 비함유 배양 시스템에서 측정되었다. 도 8a-도 8c에 보여지는 바와 같이, hES세포가 TLF조합의 증식인자의 존재 하에서 소 유래의 피브로넥틴 매트릭스에서 배양되었을 때, I-3hES세포의 성장속도(도 8a, 핑크색 곡선), I-6hES세포의 성장속도(도 8b, 핑크색 곡선) 및 H-9hES세포의 성장속도(도 8c, 핑크색 곡선)는 MEF에서 배양된 hES세포의 성장속도와 유사하였다. 더욱 hES세포가 TF조합의 증식인자만의 존재 하에서 인간 유래의 피브로넥틴 매트릭스에서 배양되었을 때, I-3hES세포의 성장속도(도 8a, 명청색 곡선), I-6hES세포의 성장속도(도 8b, 명청색 곡선) 및 H-9hES세포의 성장속도(도 8c, 명청색 곡선)는 MEF에서 배양된 hES세포의 성장속도와 유사하였다. 다른 한편, 이들 세포가 TF조합의 증식인자의 존재 하에서 소 유래의 피브로넥틴 매트릭스에서 배양되었을 때, I-3hES세포의 성장속도(도 8a, 흑색 곡선), I-6hES세포의 성장속도(도 8b, 흑색 곡선) 및 H-9hES세포의 성장속도(도 8c, 흑색 곡선)의 성장속도는 MEF에서 배양된 hES세포의 성장속도와 비교하여 낮아지고 있었다. 따라서, TLF조합의 증식인자가 보충된 소 피브로넥틴 매트릭스, 및 TF조합의 증식인자만이 보충된 인간 피브로넥틴 매트릭스는 MEF에서 달성되는 성장속도와 유사한 hES세포의 큰 정상 성장속도를 지원한다.
지지세포 비함유 배양 시스템에서 배양된 인간 ES세포는 미분화 세포의 큰 백분율을 유지한다-미분화 hES세포주를 증식하는 본 발명의 지지세포 비함유 시스템의 능력을 더욱특징화하기 위해, 미분화 세포의 백분율이 배양에서의 4일후, 6일후 및 10일후에 측정되었다. 도 8d에서 보이는 바와 같이, hES세포가 TF조합 또는 TLF조합의 증식인자의 존재하에서 인간 유래의 피브로넥틴 매트릭스 또는 소 유래의 피브로넥틴 매트릭스의 어느 것에서 배양되었을 때, 세포의 큰 백분율(85%-90%)이 배양에서의 6일후에도 미분화 상태를 유지하였다. 다른 한편, hES세포가 LT조합, LF조합, T조합 또는 F조합의 증식인자의 존재 하에서 소 피브로넥틴 매트릭스에서 배양되었을 때, 미분화 세포의 백분율은 배양에서의 4일후 77%-85%이고, 배양에서 6일후 60%-75%로 감소했다. 따라서, 이들 결과는 피브로넥틴 및 TF증식인자 또는 TLF증식인자를 이용하는 본 발명의 지지세포 비함유 배양 시스템이 MEF 하에서 달성되는 백분율과 유사한 미분화 세포의 큰 백분율을 유지하는 것이 가능하다는 것을 입증하고 있다.
실시예 7
TLF조합 및 TF조합의 증식인자는 다른 지지세포 비함유 배양 시스템에서 ES세포를 유지하기 위해 적합하다.
다른 지지세포 비함유 시스템을 보충하는 TLF조합 및 TF조합의 증식인자의 능력을 더욱 입증하기 위해, 추가의 매트릭스가 사용되었다.
실험 결과
최초에 MEF에서 배양된 인간 ES세포를 하기의 지지세포 비함유 배양 시스템으로 이동시켰다: MatrigelRTM, 자가제작의 MEF 매트릭스, 및 자가제작의 포피 섬유아세포 매트릭스, 이들 모두에 혈청 대체물 및 선택된 조합의 증식인자가 보충되었다. TLF조합 또는 TF조합의 증식인자를 사용할 때, hES세포는 MatrigelRTM, MEF 매트릭스 및 포피 섬유아세포 매트릭스에서 성공적으로 성장되었다(도 9a-도 9f). MatrigelRTM 매트릭스 또는 MEF 매트릭스의 어느 하나가 이용되었을 때, 세포는(120일을 초과하는) 미분화 상태로 30회의 계대배양을 초과하고, EB를 생성하고, 기형종을 형성하였다(도 10c-도 10f). 그러나, 이들 매트릭스는 동물 비존재도 아니고, 또 양호하게 규정된 것도 아니므로 피브로넥틴에는 유리한 선택 가능성이 남는다.
ES세포가 SR, TF증식인자 및 TLF증식인자가 보충된 포피 섬유아세포 매트릭스에서 성장될 때, 세포는 (20일을 초과하는) 미분화 상태로 5회의 계대배양을 초과하고, 전형적인 ES세포의 형태학적 특징을 지속하였다(도 9a). 이 매트릭스는 동물 비존재 및 지지세포 비함유의 배양 시스템이지만 포피 섬유아세포 매트릭스는 피브로넥틴 매트릭스와 비교한 경우 양호하게 규정된 시스템이 아니다.
따라서, 이들 결과는 혈청 대체물 및 TLF조합 또는 TF조합의 증식인자로 구성되는 이종 비함유의 양호하게 규정된 배양배지는 다양한 지지세포 비함유 배양 시스템에서 hES세포를 유지 및 증식하기 위해 적합하다는 것을 입증하고 있다.
명확을 기하기 위해 별도의 양태의 맥락에서 기재되는 본 발명의 특정의 특질이 단일 양태로 함께 제공될 수 있음이 인식된다. 이와 반대로, 간결을 위해 단일 양태의 맥락으로 설명되는 본 발명의 다양한 특질이 또한 별도로 또는 임의의 적당한 서브 조합으로 제공될 수도 있다.
본 발명을 특정의 실시형태와 함께 기재하고 있으나 다수의 변경형태, 수정형태, 및 변형형태가 당업자에 자명한 것이 명백하다. 따라서, 첨부한 특허청구의 범위의 정신 및 범위에 포함되는 이와 같은 변경형태, 수정형태, 및 변형형태가 포함되는 것이 의도된다. 모든 간행물, 본 명세서중에 기재한 특허 및 특허 출원은 그 전체가 각각의 간행물, 본 명세서 중에 기재된 특허 및 특허 출원이 마치 특별 또는 개별적으로 본 명세서중에서 참고로서 원용되는 듯이 나타나는 범위에 본 명세서 중에서 참고로서 원용된다. 더욱, 본출원에 있어서의 임의의 인용예의 인용 또는 식별에 의해 이와 같은 인용례가 선행기술로서 본 발명에서 이용가능하다는 것을 승인해서는 안된다.
<110> AMIT, MICHAL ITSKOVITZ-ELDOR, JOSEPH <120> METHODS OF PREPARING FEEDER CELLS-FREE, XENO-FREE HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS AND STEM CELL CULTURES PREPARED USING SUCH METHODS <130> 25365 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 1 gagaacaatg agaaccttca gga 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 2 ttctggcgcc ggttacagaa cca 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 3 tgcttgaatg tgctgatgac aggg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 4 aaggcaagtc agcagccatc tcat 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 5 gctggattgt ctgcaggatg gggaa 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 6 tcccctgaag aaaattggtt aaaat 25 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 7 gagtgaaatg gcacgatacc ta 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 8 tttcctctcc ttcttcacct tc 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 9 ggagttatgg tgggtatggg tc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 10 agtggtgaca aaggagtagc ca 22 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 11 caaaagagtg tctgtgag 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 12 ccatgtattt acattggc 18 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 13 atctggcacc acaccttcta caatgagctg cg 32 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 14 cgtcatactc ctgcttgctg atccacatct gc 32

Claims (152)

  1. 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지될 수 있는, 지지세포 비함유의 인간 배아줄기세포주를 확립하는 방법으로서,
    지지세포를 함유하지 않으며, 매트릭스, 그리고 TGFβ1 및 bFGF가 보충된 조직배양배지를 포함하는 배양조건 하에서 상기 인간 배아줄기세포를 배양하여, 이로써, 지지세포 비함유의 인간 배아줄기세포주를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간배아줄기세포주를 확립하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양조건 하에서의 상기 인간 배아줄기세포주로부터 세포를 클로닝하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 지지세포를 함유하지 않는 배양조건 하에서, 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 인간 배아줄기세포주를 확대하는 방법으로서, 매트릭스, 및 TGFβ1과 bFGF가 보충된 조직배양배지 상에서 인간 배아줄기세포주의 세포를 배양하고, 이로써, 상기 인간 배아줄기세포주의 세포를 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지될 수 있는, 이종 병원균 비함유 (xeno-free), 지지세포 비함유(feeder cell-free)의 특정종의 배아줄기세포주를 확립하는 방법으로서,
    지지세포가 없고 이종 병원균 (xeno pathogens)을 함유하지 않으며, 및 특정의 종 유래의 매트릭스, 그리고 TGFβ1 와 bFGF를 포함하는 조직배양배지를 포함하는 배양조건 하에서 배아줄기세포를 배양하고, 이로써, 이종 병원균 비함유 및 지지세포 비함유의, 특정 종의 배아줄기세포주를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 지지세포 및 이종 병원균을 함유하지 않는 배양조건 하에서, 특정의 종의 배아줄기세포주를 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 확대하는 방법으로서, 특정의 종 유래의 매트릭스, 및 TGFβ1 와 bFGF를 포함하는 조직배양배지 상에서 특정의 종의 배아줄기세포주의 세포를 배양하고, 이것에 의해, 상기 특정의 종의 배아줄기세포주의 세포를 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항, 3항, 4항 또는 5항에 있어서, 상기 매트릭스는 피브로넥틴 매트릭스인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 3항에 있어서, 상기 배양조건은 동물 병원균을 함유하지 않고, 및 상기 매트릭스는, 인간 혈장 피브로넥틴 매트릭스, 재조합 인간 혈장 피브로넥틴 매트릭스, 인간 세포 피브로넥틴 매트릭스, 재조합 인간 세포 피브로넥틴 매트릭스, 및 합성 피브로넥틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포주는 적어도 85 %의 미분화 인간 배아줄기세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포주의 세포는 적어도 25시간의 배가시간을 유지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 조직배양배지는 인간 혈청 또는 혈청대체물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 조직배양배지는 특정 종 유래의 혈청 또는 혈청대체물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 혈청 또는 상기 혈청대체물은 적어도 10 %의 농도로 제공되는 방법.
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  14. 제1항, 제3항, 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 TGFβ1은 적어도 0.06 ng/ml의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 삭제
  16. 제1항, 제3항, 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 bFGF는 적어도 2 ng/ml의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 삭제
  18. 제1항, 제3항, 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 조직배양배지는 LIF를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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  20. 제18항에 있어서, 상기 LIF는 적어도 500 u/ml의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 삭제
  22. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 매트릭스는 특정의 종 유래의 피브로넥틴 매트릭스인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 조직배양배지는 특정의 종 유래의 조건화 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. TGFβ1 와 bFGF를 포함하는 배양배지에 다능성 및 증식성의 미분화된 인간 배아줄기세포를 포함하는 세포배양물로서, 동물성 병원균 또는 지지세포를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 세포배양물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 배양배지는 혈청대체물을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양물.
  26. 삭제
  27. 제24항에 있어서, 상기 배양배지는 LIF를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양물.
  28. 제24항에 있어서 상기 TGFβ1는 적어도 0.06 ng/ml의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 세포배양물.
  29. 제24항에 있어서 상기 bTGF는 적어도 2 ng/ml의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 세포배양물.
  30. 제27항에 있어서, 상기 LIF는 적어도 500 u/ml의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 세포배양물.
  31. 제24항에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포는, 적어도 10번의 계대배양에 대하여 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지될 수 있는 것을 특징으로 하는 세포배양물.
  32. 매트릭스 그리고 TGFβ1 와 bFGF를 포함하는 조직배양배지를 포함하는, 이종 병원균 비함유 및 지지세포 비함유 배양장치로서, 이 배양장치에서 배양된 인간 배아줄기세포를 증식성 및 다능성의 미분화 상태로 유지할 수 있는 것을 특징으로 하는 이종 병원균 비함유 및 지지세포 비함유 배양장치.
  33. 제32항에 있어서, 상기 매트릭스는 인간 유래의 피브로넥틴인 것을 특징으로 하는 배양장치.
  34. 세포치환 또는 조직재생용 의약품의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는, TGFβ1 와 bFGF를 포함하는 배양배지에서 배양된 이종 병원균 및 지지세포 미함유 인간 배아줄기세포 배양물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제조는,
    지지세포 및 이종병원균을 함유하지 않고, 및 인간 유래의 피브로넥틴 매트릭스와, TGFβ1과 bFGF가 보충된 조직배양배지를 포함하는 배양조건 하에서 인간 배아줄기세포를 배양하고, 이것에 의해 인간 배아줄기세포 배양물을 만드는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이종병원균 및 지지세포 미함유 인간 배아줄기세포 배양물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 배양배지는 LIF를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이종병원균 및 지지세포 미함유 인간 배아줄기세포 배양물.
  37. TGFβ1과 bFGF를 함유하는 것으로서, 상기 TGFβ1 는 0.06-0.24 ng/ml의 농도범위로 제공되며 및 상기 bFGF는 적어도 2 ng/ml의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 조직배양배지.
  38. 제37항에 있어서, 무혈청인 것을 특징으로 하는 조직배양배지.
  39. 제31항에 있어서, 지지세포를 함유하지 않는 배양 조건하에서 배양될 때 인간 배아줄기세포를 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 조직배양배지.
  40. 제37항에 있어서, LIF를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조직배양배지.
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  43. 제40항에 있어서, 상기 LIF는 적어도 500 u/ml의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 조직배양배지.
  44. 제39항에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포는 적어도 10번의 계대배양에 대하여, 다능성 및 증식성의 미분화 상태로 유지될 수 있는 것을 특징으로 하는 조직배양배지.
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