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KR101142591B1 - 바이오센서 - Google Patents

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KR101142591B1
KR101142591B1 KR1020087028230A KR20087028230A KR101142591B1 KR 101142591 B1 KR101142591 B1 KR 101142591B1 KR 1020087028230 A KR1020087028230 A KR 1020087028230A KR 20087028230 A KR20087028230 A KR 20087028230A KR 101142591 B1 KR101142591 B1 KR 101142591B1
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enzyme
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hematocrit
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준코 나카야마
요시후미 다카하라
에리코 야마니시
요시히로 이토
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파나소닉 주식회사
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Abstract

본 발명의 바이오센서는, 글루코오스와 특이적으로 반응하는 효소를 포함하는 시약층 중에 BSA를 함유시켜, 시료액인 전혈 중의 글루코오스 농도를 전기화학적으로 계측했다. 시료액으로서 전혈을 이용한 경우의 센서 응답 특성을 계측하면, 헤마토크릿값 25 내지 65%인 범위에서는 센서 응답 특성에 BSA 첨가 효과는 인정되지 않았지만, 헤마토크릿값이 25% 이하인 범위에서는 BSA의 첨가량에 따라 센서 응답 특성에 대한 헤마토크릿의 영향이 완화되었다.
이에 의해, 헤마토크릿의 영향, 온도의 영향을 저감할 수 있어 고정밀도의 측정을 할 수 있다.

Description

바이오센서{BIOSENSOR}
본 발명은, 시료액 중의 특정 성분을 분석하는 바이오센서에 관한 것으로, 특히 바이오센서의 시약층을 구성하는 시약 구성에 관한 것이다.
바이오센서는, 미생물, 효소, 항체 등의 생물재료의 분자인식 능력을 이용하여, 생물재료를 분자식별 소자로서 응용한 센서이다. 즉, 고정화된 생물재료가 원하는 특정 성분을 인식했을 때에 일어나는 반응, 미생물의 호흡에 의한 산소의 소비, 효소 반응, 발광 등을 이용한 것이다.
바이오센서 중에서도 효소 센서의 실용화는 진행되고 있고, 예컨대, 글루코오스, 락트산, 콜레스테롤, 락토오스, 요산, 요소, 아미노산용 효소 센서는, 의료계 쪽이나 식품 공업에 이용되고 있다. 효소 센서는, 검체인 시료액에 포함되는 기질과 효소의 반응에 의해 생성되는 전자에 의해 전자 수용체를 환원하고, 측정 장치가 그 전자 수용체의 산화환원량을 전기화학적으로 계측함으로써 검체의 정량 분석을 한다.
이러한 바이오센서의 일례로서, 도 5에 3전극 방식의 바이오센서의 분해 사 시도를 나타낸다.
도 5에 나타내는 바이오센서는, 절연성 기판(1)상에 스퍼터링 증착법이나 스크린 인쇄법 등에 의해 전기 전도층을 형성한 다음, 레이저 등을 이용하여 슬릿을 설치함으로써, 작용극(2), 대극(3) 및 검지전극(4)을 형성하고, 이들 전극상에 시료액 중의 특정 성분과 반응하는 효소 및 전자 전달체를 포함하는 시약층(5)을 형성하여 이루어지는 것이다. 또한, 시약층(5) 및 전극(2, 3, 4)상에는 노칭부(6a)를 갖는 스페이서(6)와 커버(8)를 접합함으로써 시료액이 공급되는 캐비티(7)가 형성되어 있다. 한편, 캐비티(7)로부터 바이오센서로의 시료액 공급은 모세관 현상에 의해 실현되지만, 캐비티(7) 내의 공기를 바이오센서 외부로 보내기 위한 공기 구멍(9)을 커버(8)에 설치하여, 시료액의 원활한 공급을 실현하고 있다.
이러한 구성의 바이오센서 캐비티(7)의 입구에 시료액을 첨가하면, 시료액은 캐비티(7)의 입구로부터 모세관 현상에 의해 캐비티(7) 내로 공급되고, 시약층(5)의 위치에 도달하면, 시료액 중의 특정 성분이 시약층(5)에 포함되는 시약과 반응한다. 이 반응에 의해 생기는 전류의 변화량을, 작용극(2), 대극(3), 검지전극(4)의 각각의 리드부(10, 11, 12)를 통하여 접속된 외부 측정 장치에 의해 읽어낸다. 읽어낸 전류값을 특정 성분의 농도로 환산함으로써, 시료액 중의 특정 성분을 정량하고 있다.
특허문헌 1: 일본 공개특허공보 제2000-171428호
특허문헌 2: 일본 공개특허공보 제2001-343350호
특허문헌 3: 일본 공개특허공보 제2002-207022호
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
그러나, 종래의 바이오센서는, 시료액이 혈액인 경우, 헤마토크릿(hematocrit)의 영향에 의해 올바른 검사 결과가 얻어지지 않는다는 문제가 있었다. 특히, 글루코오스용 효소 센서는, 식전의 인슐린 주사시의 측정이나, 저혈당의 평가에 사용되는 경우가 많고, 헤마토크릿의 영향에 의해 글루코오스 농도가 높게 표시되어 버리면, 인슐린의 과잉 투여나 저혈당의 간과를 초래할 우려가 있다. 그 때문에, 시료액이 혈액인 경우에 헤마토크릿의 영향을 받지 않는 고정밀도의 바이오센서가 요구된다.
또한, 종래의 바이오센서는, 환경 온도의 영향에 의해 올바른 검사 결과가 얻어지지 않는다는 문제가 있었다. 이 문제를 해결하기 위해, 온도 제어 장치 등을 이용하여 검사 결과를 보정하고 있지만, 온도 제어 장치가 급격한 온도 변화에 대응하지 못하고 온도를 잘못 인식해버린 경우에는, 잘못된 보정을 하게 되어 올바른 검사 결과를 얻을 수 없다. 그 때문에, 보다 환경 온도의 영향을 받기 어려운 바이오센서가 요구된다.
본 발명은 상기 문제점을 해소하기 위해 이루어진 것으로서, 헤마토크릿의 영향이나 환경 온도의 영향을 회피할 수 있는 고정밀도의 바이오센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 청구항 1에 따른 바이오센서는, 시료 액의 특정 성분의 농도를 계측하는 바이오센서에 있어서, 상기 시료액 중의 특정 성분과 특이적으로 반응하는 시약을 포함하는 시약층 중에 가용화 단백질을 함유시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 청구항 2에 따른 바이오센서는, 청구항 1에 기재된 바이오센서에 있어서, 상기 가용화 단백질은 소혈청 알부민, 난알부민, 젤라틴 또는 콜라겐인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 청구항 3에 따른 바이오센서는, 청구항 1에 기재된 바이오센서에 있어서, 상기 가용화 단백질의 함유량은 효소 1U당 0.0004 내지 0.008㎎의 범위내인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 청구항 4에 따른 바이오센서는, 청구항 1에 기재된 바이오센서에 있어서, 상기 가용화 단백질의 함유량은 1센서당 0.0007 내지 0.014㎎의 범위내인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 청구항 5에 따른 바이오센서는, 청구항 3에 기재된 바이오센서에 있어서, 상기 가용화 단백질의 함유량은 효소 1U당 0.0035 내지 0.004㎎의 범위내인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 청구항 6에 따른 바이오센서는, 청구항 4에 기재된 바이오센서에 있어서, 상기 가용화 단백질의 함유량은 1센서당 0.007㎎인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 청구항 7에 따른 바이오센서는, 청구항 1에 기재된 바이오센서에 있어서, 상기 특정 성분의 농도를, 절연성 기판상에 설치된 적어도 작용극 과 대극으로 이루어지는 전극을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 청구항 8에 따른 바이오센서는, 청구항 7에 기재된 바이오센서에 있어서, 상기 시약층은 적어도 효소 및 전자 전달체를 포함하고, 상기 전극상에 형성되거나, 또는 상기 시약층의 시약이 시료액에 용해되어 확산되는 확산 구역내에 전극이 배치되도록 형성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 청구항 9에 따른 바이오센서는, 청구항 8에 기재된 바이오센서에 있어서, 상기 효소가, 플라빈아데닌다이뉴클레오타이드를 보조효소로 하는 글루코오스 디하이드로지네이즈(Glucose dehydrogenase) 또는 피롤로퀴놀린퀴논(Pyrroloquinoline quinone)을 보조효소로 하는 글루코오스 디하이드로지네이즈인 것을 특징으로 한다.
발명의 효과
본 발명의 바이오센서에 따르면, 시료액의 특정 성분의 농도를 계측하는 바이오센서에 있어서, 상기 시료액 중의 특정 성분과 특이적으로 반응하는 시약을 포함하는 시약층 중에 가용화 단백질을 함유시킴으로써 헤마토크릿의 영향, 온도의 영향이 저감된 고정밀도의 바이오센서를 실현할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시 형태 1의 바이오센서에 있어서, 시약층에 BSA를 첨가한 경우의 센서 응답 특성에 대한 헤마토크릿의 영향을 나타내는 도면이다.
도 2는 상기 실시 형태 1의 바이오센서에 있어서, 시약층에 BSA를 첨가한 경 우의 센서 응답 특성에 대한 온도의 영향을 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 실시 형태 2의 바이오센서에 있어서, 시약층에 BSA를 첨가한 경우의 센서 응답 특성에 대한 헤마토크릿의 영향을 나타내는 도면이다.
도 4는 상기 실시 형태 2의 바이오센서에 있어서, 시약층에 BSA를 첨가한 경우의 센서 응답 특성에 대한 온도의 영향을 나타내는 도면이다.
도 5는 종래의 3전극 방식의 바이오센서의 분해 사시도를 나타내고 있다.
<부호의 설명>
1: 기판
2: 작용극
3: 대극
4: 검지전극
5: 시약층
6: 스페이서
6a: 노칭부
7: 캐비티
8: 커버
9: 공기구멍
10, 11, 12: 리드부
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하에서, 본 발명의 실시 형태에 대하여 도면을 참조하면서 설명한다. 한편, 이하에 설명하는 본 발명의 각 실시 형태에서는 시료액 중의 특정 성분과 특이적으로 반응하는 분자식별 소자로서 효소를 이용하는 효소 센서를 예로 들어 설명한다.
(실시 형태 1)
본 발명의 실시 형태 1에 따른 바이오센서에 대하여 설명한다.
본 실시 형태 1의 바이오센서는, 도 5에서 나타낸 바이오센서의 시약층(5)에 가용화 단백질을 첨가한 것을 특징으로 한다. 여기서는, 효소로서 플라빈아데닌다이뉴클레오타이드를 보조효소로 하는 글루코오스 디하이드로지네이즈(이하, FAD-GDH라고 부름)를 이용했다. 또한, 가용화 단백질로서 소혈청 알부민(이하, BSA라고 부름)을 이용했다.
이하, 본 실시 형태 1의 작용, 효과에 대하여 설명한다.
도 1은 본 실시 형태 1의 바이오센서에 있어서, 시약층(5) 중에 BSA를 첨가한 경우의 센서 응답 특성에 대한 헤마토크릿의 영향을 나타내는 도면이다. 도 1에 있어서, 세로축은 헤마토크릿값이 45%인 때의 센서 감도로부터의 괴리를 나타내고, 가로축은 헤마토크릿값을 나타낸다.
시료액은 글루코오스 농도가 350mg/dL로 조제된 전혈을 이용했다. 또한, FAD-GDH의 효소량은 1센서당 2U(유닛)으로 했다.
본 실시 형태 1의 바이오센서를 구성하는 시약층(5) 중에 첨가하는 BSA의 농도는, 상기 시약액 중에 효소 1U당 0 내지 0.0035mg, 바꿔 말하면 1센서당 0 내지 0.007mg으로 변화시켜 센서 응답값을 계측했다.
계측 결과, 헤마토크릿값이 25 내지 65%인 농도 범위에서는, BSA를 첨가하여도 센서 응답값에 변화는 보이지 않았다. 한편, 헤마토크릿값이 25% 이하인 저농도 범위에서는, BSA의 첨가량에 따라 센서 응답 특성에 대한 헤마토크릿의 영향이 저감되어 있었다.
이와 같이, 시약층(5) 중에 FAD-GDH와 BSA를 함유시킨 경우, 헤마토크릿값이 25% 이상인 농도 범위에서는 BSA의 첨가 효과는 인정되지 않았지만, 헤마토크릿값이 0 내지 25%인 낮은 농도 범위에서는 BSA의 첨가 효과가 인정되었다.
도 2는 본 실시 형태 1의 바이오센서에 있어서, 시약층(5) 중에 BSA를 첨가한 경우의 센서 응답 특성에 대한 온도의 영향을 나타내는 도면이다. 도 2에 있어서, 세로축은 온도 25℃ 감도로부터의 괴리를 나타내고, 가로축은 온도를 나타낸다.
시료액은 글루코오스 농도가 350mg/dL로 조제된 전혈을 이용했다. 또한, FAD-GDH의 효소량은 1센서당 2U로 했다.
본 실시 형태 1의 바이오센서를 구성하는 시약층(5) 중에 첨가하는 BSA의 농도는, 상기 시약액 중에 효소 1U 당 0 내지 0.0035mg, 바꿔 말하면 1센서당 0 내지 0.007mg으로 변화시켜 센서 응답 특성을 계측했다.
계측 결과, 5 내지 25℃의 온도 범위에서는 BSA를 첨가하여도 센서 응답값에 변화는 보이지 않았다. 한편, 25℃ 이상의 고온도 범위에서는 BSA의 첨가량에 따라 센서 응답 특성에 대한 온도의 영향이 완화되어 있었다.
이와 같이, 시약층(5) 중에 FAD-GDH와 BSA를 함유시킨 경우, 온도 25℃ 이하의 온도 범위에서는 BSA의 첨가 효과는 인정되지 않았지만, 온도 25℃ 이상의 온도범위에서는 BSA의 첨가 효과가 인정되었다.
이상의 점에서, 시약층(5) 중에 BSA를 효소 1U당 0.0035mg, 또는 1센서당 0.007mg 함유시킨 경우에, 헤마토크릿과 온도 양쪽의 특성이 향상된다고 판단할 수 있다.
이러한 실시 형태 1의 바이오센서에 따르면, 효소 FAD-GDH를 포함하는 시약층(5)에 BSA를 다량으로 함유시킴으로써 센서 응답 특성에 대한 헤마토크릿의 영향이나 온도의 영향을 개선할 수 있다.
(실시 형태 2)
본 발명의 실시 형태 2에 따른 바이오센서에 대하여 설명한다.
본 실시 형태 2의 바이오센서는, 도 5에서 나타낸 바이오센서의 시약층(5)에 가용화 단백질을 첨가한 것을 특징으로 한다. 여기서는, 효소로서 피롤로퀴놀린퀴논을 보조효소로 하는 글루코오스 디하이드로지네이즈(이하, PQQ-GDH라고 부름)를 이용했다. 또한, 가용화 단백질로서 소혈청 알부민(이하, BSA라고 부름)을 이용했다.
이하, 본 실시 형태 2의 작용, 효과에 대하여 설명한다.
도 3은 본 실시 형태 2의 바이오센서에 있어서, 시약층(5) 중에 BSA를 첨가한 경우의 센서 응답 특성에 대한 헤마토크릿의 영향을 나타내는 도면이다. 도 3에 있어서, 세로축은 헤마토크릿값이 45%인 때의 센서 감도로부터의 괴리를 나타내고, 가로축은 헤마토크릿값을 나타낸다.
시료액으로는 글루코오스 농도가 350mg/dL로 조제된 전혈을 이용했다. 또한, PQQ-GDH의 효소량은 1센서당 1.7U로 했다.
본 실시 형태 2의 바이오센서를 구성하는 시약층(5) 중에 첨가하는 BSA의 농도를, 상기 시약액 중에 효소 1U당 0 내지 0.008mg, 바꿔 말하면 1센서당 0 내지 0.014mg으로 변화시켜 센서 응답값을 계측했다.
측정 결과, 헤마토크릿값이 25 내지 65%인 범위에서는 센서 응답값에 대한 BSA의 첨가 효과는 인정되지 않았다. 한편, 헤마토크릿값이 25% 이하인 저농도 범위에서는 BSA의 첨가량에 따라 센서 응답 특성에 대한 헤마토크릿의 영향이 완화되어 있었다.
이와 같이, 시약층(5) 중에 PQQ-GDH와 BSA를 함유시킨 경우, 헤마토크릿값이 25% 이상인 농도 범위에서는 BSA의 첨가 효과는 인정되지 않았지만, 헤마토크릿값이 0 내지 25%인 낮은 농도 범위에서는 BSA의 첨가 효과가 인정되었다.
도 4는 본 실시 형태 2의 바이오센서에 있어서, 시약층(5) 중에 BSA를 첨가한 경우의 센서 응답 특성에 대한 온도의 영향을 나타내는 도면이다. 도 2에 있어서, 세로축은 온도 25℃ 감도로부터의 괴리를 나타내고, 가로축은 온도를 나타낸다.
시료액은 글루코오스 농도가 350mg/dL에 조제된 혈장을 이용했다. 또한, PQQ-GDH의 효소량은 1센서당 1.7U로 했다.
본 실시 형태 2의 바이오센서를 구성하는 시약층(5) 중에 첨가하는 BSA의 농도를, 상기 시약액 중에 효소 1U당 0 내지 0.008mg, 바꿔 말하면 1센서당 0 내지 0.014mg으로 변화시켜 센서 응답 특성을 계측했다.
계측 결과, 25 내지 45℃의 온도 범위에서는 BSA를 첨가하여도 센서 응답값에 변화는 보이지 않았다. 한편, 25℃ 이하의 저온도 범위에서는 BSA의 첨가량에 따라 센서 응답 특성에 대한 온도의 영향이 완화되어 있었다.
이와 같이, 시약층 중에 PQQ-GDH와 BSA를 함유시킨 경우, 온도 25℃ 이상인 경우에는 BSA의 첨가 효과는 인정되지 않았지만, 온도 25℃ 이하인 경우에는 BSA의 첨가 효과가 인정되었다.
이상의 점에서, 시약층(5) 중에 BSA를 효소 1U당 0.0004 내지 0.008mg, 또는 1센서당 0.0007 내지 0.014mg 함유시킨 경우에, 헤마토크릿과 온도 양쪽의 특성이 향상된다고 판단할 수 있다. 또한, BSA를 효소 1U당 0.004mg, 또는 1센서당 0.007mg 이상 첨가한 경우의 효과가 변하지 않는다는 점에서, 그 최적값은 효소 1U당 0.004mg, 또는 1센서당 0.007mg이라고 판단할 수 있다.
이러한 실시 형태 2의 바이오센서에 따르면, 효소 PQQ-GDH를 포함하는 시약층(5)에 BSA를 다량으로 함유시킴으로써 센서 응답 특성에 대한 헤마토크릿의 영향이나 온도의 영향을 개선할 수 있다.
한편, 상기 실시 형태 1, 2에서는, 시약층(5) 중의 효소로서 FAD-GDH, PQQ-GDH를 예로 들어 설명했지만, 그 외에, 콜레스테롤 옥시데이즈, 콜레스테롤 에스터레이즈, 콜레스테롤 디하이드로지네이즈, 리포프로테인 리페이즈, 카탈레이즈, 퍼옥시데이즈, 락테이트 옥시데이즈, 락테이트 디하이드로지네이즈, 유레이즈(urease), 유리케이즈(uricase), 글루코오스 옥시데이즈, 글루코오스 디하이드로지네이즈, 헥소카이네이즈(hexokinase), 아스코르브산 옥시데이즈, 아스코르브산 디하이드로지네이즈, 다이아포레이즈(diaphorase) 등의 임상 검사에 사용되는 효소를 이용할 수 있다.
또한, 상기 실시 형태 1, 2에서는 가용화 단백질로서 BSA를 이용하여 설명했지만, 난알부민, 젤라틴, 콜라겐 등을 이용한 경우에도 같은 효과가 얻어진다. 가용화 단백질의 첨가량은, 그 최적값이 효소 1U당 0.004mg, 또는 1센서당 0.007mg이라고 판단할 수 있다.
또한, 상기 실시 형태 1, 2에서는 3전극 방식의 바이오센서에 대하여 나타내었지만, 2전극 방식의 바이오센서를 이용해도 좋다.
본 발명의 바이오센서는, 헤마토크릿의 영향, 온도의 영향을 완화할 수 있는 고정밀도의 효소 센서로서 이용가능하다.

Claims (9)

  1. 절연성 기판상에 작용극과 대극을 포함하는 전극이 설치된 바이오센서로서,
    시료액 중의 특정 성분과 특이적으로 반응하는 시약을 포함하는 시약층은, 효소 및 전자 전달체를 포함하고, 상기 전극상에 형성되거나, 또는 상기 시약층의 시약이 시료액에 용해되어 확산되는 확산 구역내에 전극이 배치되도록 형성되고,
    나아가, 상기 시약층에는 가용화 단백질을 포함하고,
    상기 가용화 단백질은 소혈청 알부민, 난알부민, 젤라틴 또는 콜라겐이며,
    상기 특정 성분의 농도를 측정할 때에, 당해 센서 응답 특성에 대한 헤마토크릿의 영향 및 온도의 영향을 저감시키는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 가용화 단백질의 함유량은 효소 1U당 0.0004 내지 0.008㎎의 범위내인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 가용화 단백질의 함유향은 1센서당 0.0007 내지 0.014㎎의 범위내인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 가용화 단백질의 함유량은 효소 1U당 0.0035 내지 0.004㎎의 범위내인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 가용화 단백질의 함유량은 1센서당 0.007㎎인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 효소가, 플라빈아데닌다이뉴클레오타이드를 보조효소로 하는 글루코오스 디하이드로지네이즈, 또는 피롤로퀴놀린퀴논을 보조효소로 하는 글루코오스 디하이드로지네이즈인 것을 특징으로 하는 바이오센서.
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