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KR101132579B1 - 파골 세포 관련 단백질을 표적으로 한 항체 - Google Patents

파골 세포 관련 단백질을 표적으로 한 항체 Download PDF

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KR101132579B1
KR101132579B1 KR1020067016069A KR20067016069A KR101132579B1 KR 101132579 B1 KR101132579 B1 KR 101132579B1 KR 1020067016069 A KR1020067016069 A KR 1020067016069A KR 20067016069 A KR20067016069 A KR 20067016069A KR 101132579 B1 KR101132579 B1 KR 101132579B1
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요시하루 히루마
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상꾜 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 파골 세포에서 강하게 발현하는 유전자를 사용한 골 대사 이상의 검출 방법, 골 대사 이상 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 화합물의 스크리닝법, 및 골 대사 이상 치료 및/또는 예방용 의약 조성물에 관한 것이다. 즉, 본 발명은, 인간 DC-STAMP 유전자의 발현을 지표로 한 골 대사 이상의 검출 방법, 및 인간 DC-STAMP 를 특이적으로 인식하여, 파골 세포의 형성을 억제하는 활성을 갖는 항체를 함유하는 의약 조성물의 제공 등.
파골 세포, 골 대사 이상

Description

파골 세포 관련 단백질을 표적으로 한 항체{ANTIBODY TARGETING OSTEOCLAST-ASSOCIATED PROTEIN}
본 발명은, 골(骨) 대사 이상증의 치료 및/또는 예방제로서 유용한 물질, 골 대사 이상증의 치료 및/또는 예방제로서 유용한 물질의 스크리닝 방법, 골 대사 이상증의 검사 방법 그리고 골 대사 이상증의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
뼈는, 자체의 형태 변화나 혈중 칼슘 농도의 유지를 위해, 항상 형성과 흡수를 반복하여 재구축을 실시하는 동적인 기관으로서 알려져 있다. 정상적인 뼈에서는 골 아세포에 의한 골 형성과 파골 세포에 의한 골 흡수와는 평형 관계에 있고, 골량은 일정하게 유지되고 있다. 한편, 골 형성과 골 흡수의 평형 관계가 무너지면, 골다공증 등의 골 대사 이상이 된다 (Endocrinological Review 13, 66-80, 1992, Principles of Bone Biology p87-102, 1996, Academic Press, New York).
골 대사를 조절하는 인자로서는, 전신성 호르몬이나 국소성 사이토카인이 많이 보고되어 있고, 그들 인자의 공동 작용에 의해 뼈의 형성과 유지가 영위되고 있다 (Endocrinological Review 13, 66-80, 1992, Endocrinological Review 17, 308-332, 1996). 가령(加齡)에 의한 골 조직의 변화로서는, 골다공증의 발증이 널 리 알려져 있지만, 그 발증 기구는 성 호르몬의 분비 저하나 그 리셉터 이상, 노화 유전자의 발현, 파골 세포나 골 아세포의 분화 혹은 기능 부전 등 다방면에 걸쳐 있고, 가령에 의한 생리 현상으로서 이해하는 것은 곤란하다. 골다공증은 에스트로겐의 분비 저하에 의한 폐경 후 골다공증과 가령에 의한 노인성 골다공증으로 크게 나뉘어지는데, 그 발증 기구의 해명과 치료약 개발을 위해서는, 골 흡수와 골 형성의 조절 기구에 대한 기초적 연구의 진전이 필수이다.
파골 세포는, 조혈간세포에 유래하는 다핵 세포이며, 뼈와의 접착면에 염소 이온과 수소 이온을 방출함으로써, 세포와 골 접착면의 틈을 산성화한다 (American Journal of Physiology 260, C1315-C1324, 1991). 이 결과, 인산칼슘의 분해와 산성 프로테아제의 활성화가 일어나 골 흡수가 진행된다.
파골 세포의 전구 세포는 뼈 표면의 골 아세포/스트로마 세포의 세포막 상에 발현하는 RANKL (Receptor activator of NF-κB ligand) 의 자극을 받아, 파골 세포로 분화하는 것이 밝혀졌다 (Procedings of the National Academy of Science of the Uited States of America 95, 3597-3602, 1998, Cell 93, 165-176, 1998). RANKL 은 골 아세포/스트로마 세포가 생성하는 막 결합 인자이며, 그 발현은 골 흡수 인자에 의해 조절되는 것, 및, RANKL 은 파골 세포 전구 세포로부터 다핵 파골 세포에 대한 분화를 유도하는 것 등이 밝혀졌다 (Procedings of the National Academy of Science of the Uited States of America 95, 3597-3602, 1998, Journal of Bone and Mineral Research 23, S222, 1998). 또한, RANKL 을 녹 아웃 한 마우스가, 전형적인 대리석병을 발병하는 것이 발견되고, RANKL 이 생리적 인 파골 세포 분화 유도 인자인 것이 증명되었다 (Nature 397, 315-323, 1999).
뼈에 관계되는 질환의 치료나 치료 기간의 단축을 도모하는 의약품으로서, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D3, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬 제제, SERMs (Selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K2 (메나테트레논) 및 칼슘 제제등이 사용되고 있다. 그러나, 이들의 약제는, 치료 결과에 있어서 반드시 만족할 수 있는 것이 아니고, 보다 치료 효과가 높은 약제의 개발이 요망되고 있었다.
수지상 세포 (dendritic cell, 이하, 「DC」 라고 한다.) 는, 면역계의 전문적인 항원 제시 세포로, 신체 전체에 산재하고 있다. 수지상 세포 특이적 세포막 관통 단백질 (dendritic cell-specific transmembrane protein, 이하, 「DC-STAMP 」 라고 한다.) 은, 수지상 세포의 세포막을 관통하는 단백질로서 단구(單球) 유래 DC 의 cDNA 라이브러리로부터 클로닝된 단백질이다 (European Journal of Immunology 30, 3585-3590, 2000). DC-STAMP 의 cDNA 에 대해서는 지금까지 인간에서 1 종류 보고되어 있고 (GenBank 억세션 번호 :NM_030788), 마우스에서는, 제3 엑손을 포함하는 긴 서열 (GenBank 억세션 번호 : AB109560) 과, 제3 엑손이 짧은 스플라이스 밸리언트 (GenBank 억세션 번호 : AB109561) 의 2 종류가 보고되어 있다. 인간 유래의 DC-STAMP 와 마우스 유래의 DC-STAMP 사이에서의 아미노산 서열의 상동성은, 약 74% 이다. 아미노산 서열의 소수성 해석의 결과로부터 DC-STAMP 는 7 개의 막 관통 도메인을 갖는다고 추정되고 있다. 또, 마우스에 있어서의 제3 엑손이 짧은 스플라이스 밸리언트는, 제7 번째의 막 관통 도메인이 결실되어 있다고 생각되며, 이하 DC-STAMP ΔT7 이라고 표기한다.
DC-STAMP 에 대해서는, 단핵 탐식 세포를 IL-4 에 의해 불(不)활성화되면 그 발현이 상승하고, 덱사메타존에 의해 불활성화되는 것과 반대로 발현이 감소한다는 보고가 있지만 (Immunogenetics 53, 105-113, 2001), DC-STAMP 와 파골 세포 분화의 관련은 밝혀지지 않았다.
발명의 개시
본 발명의 목적은, 골다공증, 관절 류머티즘, 암 세포의 뼈 전이 등에서 보이는, 뼈 파괴 등의 각종 골 대사 이상시에 특이적으로 발현하는 유전자, 파골 세포의 활동을 저해하는 물질, 골 대사 이상의 예방 또는 치료제를 시험하기 위한 신규 방법, 및 파골 세포의 활동을 저해하는 물질, 골 대사 이상의 예방제 및/또는 치료제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 골 대사 이상증의 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 물질을 탐색하는 목적으로, 파골 세포의 분화, 성숙 및 활성화 기능의 해명을 목표로 한 바, DC-STAMP 가 파골 세포의 분화, 성숙 및 활성화에 관여하고 있는 것을 발견하고, DC-STAMP 의 발현을 억제하면, 파골 세포의 분화가 억제되는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은,
(1) DC-STAMP 와 특이적으로 결합하여, 파골 세포의 형성을 억제하는 항체,
(2) 서열표의 서열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 서열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 서열표의 서열 번호 6 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질과 특이적으로 결합하여, 파골 세포의 형성을 억제하는 항체,
(3) 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는, (1) 또는 (2) 에 기재된 항체,
(4) 인간화되어 있는 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 항체,
(5) 완전 인간 항체인 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 항체,
(6) IgG 항체인 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 항체,
(7) 하기 공정 1) 내지 4) 를 포함하는, 골 대사 이상의 검출 방법 :
1) 피험자로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 획분을 추출하는 공정 ;
2) 정상인으로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 획분을 추출하는 공정 ;
3) 상기 공정 1) 유래의 전체 RNA 획분과 상기 공정 2) 유래의 전체 RNA 획분에 있어서의, 하기의 a) 또는 b) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드의 발현양을 측정하는 공정 ;
a) 서열표의 서열 번호 1, 3 및 5 중 적어도 어느 하나에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드,
b) 상기 a) 에 기재된 폴리뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드 ;
4) 상기 공정 1) 유래의 전체 RNA 획분과 상기 공정 2) 유래의 전체 RNA 획분 사이에 있어서의 상기 공정 3) 에 의해서 측정된 폴리뉴클레오티드의 발현양의 차이를 해석하여, 상기 공정 1) 에 기재된 피험자의 골 대사 이상을 검출하는 공정,
(8) 하기 공정 1) 내지 3) 을 포함하는, 골 대사 이상의 검출 방법 :
1) 피험자로부터 채취한 검체에 있어서의, 서열표의 서열 번호 2, 4 및 6 중 적어도 어느 하나에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 발현양을 측정하는 공정 ;
2) 정상인으로부터 채취한 검체에 있어서의, 상기 공정 1) 에 기재된 적어도 어느 하나의 단백질의 발현양을 측정하는 공정;
3) 상기 공정 1) 에서 검출된 단백질의 발현양과 상기 공정 2) 에서 측정된 그 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험자의 골 대사 이상을 검출하는 공정,
(9) 골 대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘 및/또는 암성(癌性) 고칼슘 혈증인 것을 특징으로 하는, (7) 또는 (8) 에 기재된 방법,
(10) 골 대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는, (7) 또는 (8) 에 기재된 방법,
(11) 골 대사 이상이 관절 류머티즘인 것을 특징으로 하는, (7) 또는 (8) 에 기재된 방법,
(12) 골 대사 이상이 암성 고칼슘 혈증인 것을 특징으로 하는, (7) 또는 (8) 에 기재된 방법,
(13) 폴리뉴클레오티드의 발현양을 측정하는 방법이, 노던 블롯법, 도트 블롯법, 슬롯 블롯법, RT-PCR, 리보뉴클레아제보호 에세이 또는 런 온?에세이인 것을 특징으로 하는, (7), (9) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 방법,
(14) 폴리뉴클레오티드의 발현양을 측정하는 방법이 검체 유래의 상보적 DNA 군 또는 그 DNA 군의 각 DNA 의 부분 서열로 이루어지는 DNA 로 제작된 유전자 칩 또는 어레이를 사용하는 것을 특징으로 하는, (7), (9) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 방법,
(15) 단백질의 발현양의 측정 방법이, 그 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드를 사용하는 것을 특징으로 하는, (8) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 방법,
(16) 단백질의 발현양의 측정 방법이, 웨스턴 블롯법, 도트 블롯법, 슬롯 블롯법 또는 고상 효소 면역 정량법 (ELISA 법) 인 것을 특징으로 하는, (8) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 방법,
(17) 하기의 1) 내지 3) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 함유하는 골 대사 이상의 검출용 키트 :
1) 서열표의 서열 번호 l, 3 및 5 중 적어도 어느 하나에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭하기 위한 15 내지 30 염기 길이가 연속된 올리고 뉴클레오티드 프라이머 ;
2) 서열표의 서열 번호 1, 3 및 5 중 적어도 어느 하나에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 그 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 15 뉴클레오티드 이상이 연속된 폴리뉴클레오티드 프로브 ;
3) 서열표의 서열 번호 1, 3 및 5 중 적어도 어느 하나에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드가 고정된 고상화 시료,
(18) 하기의 1) 및 2) 를 함유하는 골 대사 이상의 검출용 키트 :
1) 서열표의 서열 번호 2, 4 및 6 중 적어도 어느 하나에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질에 특이적으로 결합하고, 그 단백질을 검출하기 위한 항체 ;
2) 상기 1) 에 기재된 항체에 결합할 수 있는 2 차 항체,
(19) 골 대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘 또는 암성 고칼슘 혈증인 것을 특징으로 하는, (17) 또는 (18) 에 기재된 키트,
(20) 골 대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는, (17) 또는 (18) 에 기재된 키트,
(21) 골 대사 이상이 관절 류머티즘인 것을 특징으로 하는, (17) 또는 (18) 에 기재된 키트,
(22) 골 대사 이상이 암성 고칼슘 혈증인 것을 특징으로 하는, (17) 또는 (18) 에 기재된 키트,
(23) (1) 내지 (6) 에 기재된 항체 중 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는, 골 대사 이상의 치료용 의약 조성물,
(24) (1) 내지 (6) 에 기재된 항체 중 적어도 어느 하나, 그리고 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D3, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬 제제, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K2 (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone) 제제, 비스테로이드성 항염증제, 항 TNFα 항체, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 RANKL 항체 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는, 골 대사 이상의 치료용 의약 조성물,
(25) 서열표의 서열 번호 1, 3 및 5 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나 또는 그 서열의 부분 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 함유하는 골 대사 이상의 치료용 의약 조성물,
(26) 골 대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘 또는 암성 고칼슘 혈증인 것을 특징으로 하는, (23) 내지 (25) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
(27) 골 대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는, (23) 내지 (25) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
(28) 골 대사 이상이 관절 류머티즘인 것을 특징으로 하는, (23) 내지 (25) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
(29) 골 대사 이상이 암성 고칼슘 혈증인 것을 특징으로 하는, (23) 내지 (25) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물,
(30) 하기 공정 1) 내지 4) 를 포함함으로써 이루어지는, 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 갖는 물질의 스크리닝 방법 :
1) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포로부터, 전체 RNA 획분을 추출하는 공정 ;
2) 피험 물질을 첨가하지 않고 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포로부터, 전체 RNA 획분을 추출하는 공정 :
3) 상기 공정 1) 유래의 전체 RNA 획분과 상기 공정 2) 유래의 전체 RNA 획분에 있어서의, 하기 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 부분 폴리뉴클레오티드의 발현양을 측정하는 공정 ;
서열표의 서열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 5 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리뉴클레오티드,
4) 상기 공정 1) 유래의 전체 RNA 획분과 상기 공정 2) 유래의 전체 RNA 획분 사이에 있어서의 상기 공정 3) 에 의해서 측정된 폴리뉴클레오티드의 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의, 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정,
(31) 하기 공정 1) 내지 4) 를 포함함으로써 이루어지는, 골 대사 이상의 치료 효과 및/또는 예방 효과를 갖는 물질의 스크리닝 방법 :
1) 피험 물질을 투여한 포유 동물 개체로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 획분을 추출하는 공정 ;
2) 피험 물질을 투여하지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 획분을 추출하는 공정 ;
3) 상기 공정 1) 유래의 전체 RNA 획분과 상기 공정 2) 유래의 전체 RNA 획분에 있어서의, 하기 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 그 부분 폴리뉴클레오티드의 발현양을 측정하는 공정 ;
서열표의 서열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 5 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리뉴클레오티드,
4) 상기 공정 1) 유래의 전체 RNA 획분과 상기 공정 2) 유래의 전체 RNA 획분 사이에 있어서의 상기 공정 3) 에 의해서 측정된 폴리뉴클레오티드의 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정,
(32) 하기 공정 1) 내지 3) 을 포함함으로써 이루어지는, 골 대사 이상의 치료 효과 및/또는 예방 효과를 갖는 물질의 스크리닝 방법 :
1) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포에 있어서의, 하기 중 어느 하나에 기재된 단백질 또는 그 부분 폴리펩티드의 발현양을 측정하는 공정 ;
서열표의 서열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 서열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 서열 번호 6 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 단백질,
2) 피험 물질을 첨가하지 않은 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포에 있어서의, 상기 공정 1) 중 어느 하나에 기재된 단백질의 발현양을 그 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드를 사용하여 검출하는 공정 ;
3) 상기 공정 1) 에서 검출된 단백질의 발현양과, 상기 공정 2) 에서 검출된 그 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정,
(33) 하기 공정 1) 내지 3) 을 포함함으로써 이루어지는, 골 대사 이상의 치료 효과 및/또는 예방 효과를 갖는 물질의 스크리닝 방법 :
1) 피험 물질을 투여한 포유 동물 개체로부터 채취한 검체에 있어서의, 하기 중 어느 하나에 기재된 단백질 또는 그 부분 폴리펩티드의 발현양을 측정하는 공정 ;
서열표의 서열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 서열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 서열 번호 6 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 단백질,
2) 피험 물질이 투여되지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체에 있어서의, 상기 공정 1) 중 어느 하나에 기재된 단백질 또는 그 부분 폴리펩티드의 발현양을 측정하는 공정 ;
3) 상기 공정 1) 에서 검출된 단백질의 발현양과, 상기 공정 2) 에서 검출된 그 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정,
(34) 폴리뉴클레오티드의 발현양을 측정하는 방법이, 노던 블롯법, 도트 블롯법, 슬롯 블롯법, RT-PCR, 리보뉴클레아제보호 에세이 또는 런 온?에세이인 것을 특징으로 하는, (30) 또는 (31) 에 기재된 방법,
(35) 폴리뉴클레오티드의 발현양을 측정하는 방법이 동물 조직 또는 동물 세포 유래의 상보적 DNA 군 또는 그 DNA 군의 각 DNA 의 부분 서열로 이루어지는 DNA 로 제작된 유전자 칩 또는 어레이를 사용하는 것을 특징으로 하는 (30) 또는 (31) 에 기재된 방법,
(36) 단백질의 발현양의 측정 방법이, 그 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드를 사용하는 것을 특징으로 하는, (32) 또는 (33) 에 기재된 방법으로 이루어진다.
도 1 은, RANKL 자극에 의한 각 RAW264 서브 클론 세포의 파골 세포에 대한 분화를 나타낸 그래프이다.
도 2 는, RAW-D 세포의 파골 세포에 대한 분화에 수반하는 DC-STAMP 의 m-RNA 의 발현을 나타낸 도면이다.
도 3 은, RANKL, TNFα 및 MIP-1α 로 자극한 RAW-D 세포에 있어서의 DC-STAMP 의 m-RNA 의 발현을 나타낸 도면이다.
도 4 는, 활성형 비타민 D3 으로 자극한 초대 골수 세포에 있어서의 DC-STAMP 의 m-RNA 의 발현을 나타낸 도면이다.
도 5 는, DC-STAMP 의 siRNA 에 의한, RAW-D 세포로부터 파골 세포에 대한 분화의 억제를 나타낸 그래프이다.
도 6 은, DC-STAMP 단백질의 강제발현에 의한, RAW-D 세포로부터의 파골 세포 형성 촉진을 나타낸 그래프이다.
도 7 은, 항 DC-STAMP 항체에 의한, RAW-D 세포로부터의 파골 세포 형성 저해를 나타낸 그래프이다.
도 8 은, 항 DC-STAMP 항체에 의한, 마우스 골수 세포로부터의 파골 세포 형성 저해를 나타낸 그래프이다.
도 9 는, 항 DC-STAMP 항체에 의한, 흡수와(窩) 형성의 억제를 나타낸 그래프이다.
도 10 은, 거(巨)세포종에 있어서의 인간 RANK, RANKL, 카텝신 K 및 TRAP 유전자의 발현 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 11 은, 거세포종에 있어서의 인간 DC-STAMP 유전자의 발현 프로파일을 나타낸 그래프이다.
도 12 는, 항 DC-STAMP 항체에 의한, 인간 말초 혈단 핵구로부터의 파골 세포 형성 저해를 나타낸 그래프이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에 있어서, 「스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈 한다」 란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (크론테크사 제조) 중, 68℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는, DNA 를 고정시킨 필터를 사용하여 0.7 - 1.0M 의 NaCl 존재 하 68℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 - 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 는 150mM NaCl, 15mM 시트르산 나트륨으로 이루어진다) 을 사용하여, 68℃ 에서 세정함으로써 분류할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 말한다.
1. DC-STAMP
본 발명자들에 의해, DC-STAMP 는 거세포종에 있어서 특이적으로 발현하고 있는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들에 의해서 DC-STAMP 는 단구 유래 세포주가 파골 세포에 분화할 때에 발현양이 증가하는 것도 발견하였다.
본 발명에서 사용하는 DC-STAMP 는, 인간, 혹은 비인간 포유 동물 (예를 들어, 모르모트, 래트, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 단구 세포, 수상(樹上) 세포 혹은 골수 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 또는 상기 세포 의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있고, 또한, DC-STAMP 를 in vitro 로 합성하거나, 또는 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생성시킴으로써 얻을 수 있다. 유전자 조작에서는, 구체적으로는, DC-STAMP 를 발현 가능한 벡터에 주입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 DC-STAMP 를 발현시킴으로써, 그 단백질을 얻을 수 있다.
인간 DC-STAMP 의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열은, GenBank 에 억세션 번호 : NM_030788 로 등록되어 있고, 서열표의 서열 번호 1 에도 나타내어져 있고, 그 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 2 에 나타내어져 있다. 마우스 DC-STAMP 의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열은, 제3 엑손을 포함하는 긴 서열이 GenBank 에 억세션 번호 : AB 109560 으로 등록되어 있고, 서열표의 서열 번호 3 에도 나타내어져 있고, 그 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 4 에 나타내어져 있다. 마우스 DC-STAMP 의 제3 엑손이 짧은 스플라이스 밸리언트의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열은 GenBank 에 억세션 번호 : AB109561 로 등록되어 있고, 서열표의 서열 번호 5 에도 나타내어져 있고, 그 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 6 에 나타내어져 있다. DC-STAMP 의 cDNA 는 예를 들어, DC-STAMP 를 발현하고 있는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, DC-STAMP 의 cDNA 를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제연쇄 반응 (이하 「PCR」 이라고 한다) (Saiki, R.K., et al., Science, (1988) 239, 487-49) 을 실시하는, 이른바 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.
또, 서열표의 서열 번호 1, 3 및 5 에서 선택되는 적어도 어느 하나에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한, DC-STAMP 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 DC-STAMP 의 cDNA 에 포함된다. 또한, 인간 혹은 마우스 DC-STAMP 유전자 좌(座)로부터 전사되는 스플라이싱 밸리언트 또는 이것에 스트린젠트 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 또한, DC-STAMP 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 DC-STAMP 의 cDNA 에 포함된다.
또한, 서열표의 서열 번호 2, 4 및 6 에서 선택되는 적어도 어느 하나에 나타내어지는 아미노산 서열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, DC-STAMP 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 DC-STAMP 에 포함된다. 또한, 인간 혹은 DC-STAMP 유전자좌로부터 전사되는 스플라이싱 밸리언트에 코드되는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 한편, DC-STAMP 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 DC-STAMP 에 포함된다.
2. 골 대사 이상의 검출
DC-STAMP 유전자는, 인간 각종 골 조직 검체군에 있어서의 유전자의 발현양을 해석하면, 파골형 다핵 거세포가 다수 출현하는 골 종양이고, 임상적 소견으로서 골 용해성의 골 파괴를 특징으로 한다 (Bullough et at., Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, pp17.6-17.8, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992)) 거세포종 (Giant cell tumor ; GCT) 에 있어서 유의하게 발현양이 증가하 고 있는 것이 발견된다.
또한, DC-STAMP 는 단구 유래 세포주가 파골 세포에 분화할 때에 발현양이 증가하는 것도 발견하였다.
따라서, DC-STAMP 는 GCT 와 같은 골 흡수가 항진하는 인간의 병태에 있어서 관여하고 있다고 생각된다. 즉, DC-STAMP 의 각 세포, 및/또는 각 조직에 있어서의 발현양을 측정함으로써 DC-STAMP 의 과잉 발현에 기인하여 발생한다고 생각되는 골 대사 이상 질환의 상태를 판정할 수 있다. 또, 본 명세서에 있어서의 골 대사 이상 질환이란, 골다공증 (폐경 후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제사용에 의한 연발성 골다공증, 관절 류머티즘에 수반하는 골다공증), 관절 류머티즘의 골 파괴, 암성 고칼슘 혈증, 다발성 골수종이나 암의 골 전이에 수반되는 골 파괴, 치근막염에 의한 치아의 상실, 인공 관절 주위의 골 융해, 만성 골수염에 있어서의 골 파괴, 골 페젯병, 신장성 골 이영양증, 골 형성 부전증 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
또, 본 발명에 DC-STAMP 의 발현양을 조사하는 대상이 되는 「검체」로는, 피험자나 임상 검체 등으로부터 얻어진, 혈액, 골수, 뼈, 체액, 전립선, 정소, 음경, 방광, 신장, 구강, 인두, 입술, 혀, 잇몸, 비인후, 식도, 위, 소장, 대장, 결장, 간장, 담낭, 췌장, 비, 폐, 연부 조직, 피부, 유방, 자궁, 난소, 뇌, 갑상선, 림프절, 근육, 지방 조직 등의 조직 또는 배설물 등의 시료를 의미하지만, 본 발명에 있어서는 혈액 또는 골수가 보다 바람직하다.
(1) DC-STAMP 유전자의 발현양을 사용한 골 대사 이상의 검출 방법
DC-STAMP 유전자의 발현양을 사용한 골 대사 이상의 검출 방법은, 구체적으로는, 이하의 공정 1) 내지 4) 를 포함하는 방법이다.
1) 피험자로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 획분을 추출하는 공정 ;
2) 정상인으로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 획분을 추출하는 공정 ;
3) 상기 공정 1) 에 기재된 전체 RNA 획분과 상기 공정 2) 에 기재된 전체 RNA 획분에 있어서의 DC-STAMP 유전자의 발현양을 측정하는 공정 ;
4) 상기 공정 1) 유래의 전체 RNA 획분과 상기 공정 2) 유래의 전체 RNA 획분 사이에 있어서의 상기 공정 3) 에 의해서 측정된 유전자 발현양의 차이를 해석하여, 상기 공정 1) 에 기재된 피험자의 골 대사 이상을 검출하는 공정.
이하, 각 공정을 구체적으로 설명한다.
a) 공정 1) 피험자로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 획분을 추출하는 공정 ;
검체로부터 전체 RNA 획분을 추출할 때에는, 적절한 실험의 윤리 기준에 적합한 방법으로 입수한 인간 유래 조직을 RNA 추출용 용매 (예를 들어 페놀 등, 리보뉴클레아제를 불활성화 하는 작용을 갖는 성분을 함유하는 것) 로 직접 용해하거나 또는, 그 조직의 세포를 파괴하지 않도록, 스크레이퍼로 신중하게 긁어내거나, 혹은 트립신 등의 단백질 분해 효소를 사용하여 부드럽게 조직으로부터 세포를 추출하는 등의 방법에 의해, 세포를 회수한 후, 신속하게 RNA 추출 공정으로 이행한다.
RNA 의 추출 방법으로서는, 티오시안산구아니딘?염화세슘 초원심법, 티오시 안산구아니딘?핫 페놀법, 구아니딘 염산법, 산성 티오시안산구아니딘?페놀?클로로포름법 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987), 162, 156-159) 등을 채용할 수 있지만, 산성 티오시안산구아니딘?페놀?클로로포름법이 바람직하다. 또한, 시판되는 RNA 추출용 시약 (예를 들어, ISOGEN (닛폰 진 주식회사 제조), TRIZOL 시약 (기브코?피알엘사 제조)) 등을 시약으로 첨부된 프로토콜에 따라 사용할 수도 있다.
얻어진 전체 RNA 획분은, 필요에 따라 추가로 mRNA 만으로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 정제방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 비오틴화한 올리고 (dT) 프로브에 mRNA 를 흡착시켜, 또한 스트렙토아비딘을 고정화한 상자성 입자에, 비오틴/스트렙토아비딘 간의 결합을 사용하여 mRNA 를 포착하여 세정 조작한 후, mRNA 를 용출함으로써, mRNA 를 정제할 수 있다. 또한, 올리고 (dT) 셀룰로오스 칼럼에 mRNA 를 흡착시키고, 다음으로 이것을 용출하여 정제하는 방법도 채용할 수 있다. 다만, 본 발명의 방법을 위해서는, 이들 mRNA 의 정제공정은 필수가 아니라, 검출 대상의 폴리뉴클레오티드 발현의 검출이 가능한 한, 전체 RNA 획분을 그 후의 공정에 사용할 수도 있다.
b) 공정 2) 정상인으로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 획분을 추출하는 공정 : 본 발명에 있어서, 정상인이란, 골 대사 이상을 갖지 않는 사람을 의미한다. 정상인지의 여부는, DC-STAMP 의 농도를 측정하여, 미리 정상인의 수치로서 정해져 있는 수치 범위에 들어가는지의 여부로 판정할 수도 있고, DC-STAMP 의 발현양과, 정상인의 골 대사 이상의 형성도의 상관을 미리 조사해 둠으로써, 피험 자로부터 채취한 검체에 있어서의 DC-STAMP 의 발현양을 측정함으로써, 피험자가 정상인인지의 여부를 판정할 수도 있다. 정상인으로부터의 전체 RNA 획분의 조제는, 상기 공정 1) 과 동일하게 실시할 수 있다.
c) 공정 3) 상기 공정 1) 에 기재된 전체 RNA 획분과 상기 공정 2) 에 기재된 전체 RNA 획분에 있어서의 DC-STAMP 유전자의 발현양을 측정하는 공정 :
여기서, DC-STAMP 유전자의 발현양은 서열표의 서열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열을 포함함으로써 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는, 서열표의 서열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드의 발현양으로 나타내어진다.
DC-STAMP 유전자의 발현양의 측정 방법으로서, 고상화 시료를 사용한 측정 방법과, 그 이외의 몇 개의 측정 방법에 대해서 설명한다.
(a) 고상화 시료를 사용한 측정 방법
(i) 고상화 시료
고상화 시료로서는, 예를 들어 이하의 것을 들 수 있다.
(가) 유전자 칩 :
데이터베이스 상의 EST (expressed sequence tag) 서열 또는 mRNA 서열을 기초로 합성한 안티센스 올리고 뉴클레오티드가 고상화 된 유전자 칩을 사용할 수 있다. 이러한 유전자 칩으로서는 어피메트릭스 (Affymetrix) 사 제조의 유전자 칩 (Lip shutz, R. J. et., Nature Genet. (1999) 21, supplement, 20-24) 을 사용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않고, 공지된 방법에 기초하여 제작해도 된다. 인간 세포 유래의 mRNA 를 해석하는 경우에는, 인간 유래인 것이 바람직하고, 예를 들어, 어피메트릭스사 제조 인간 U95 세트 또는 U-133 세트를 사용할 수 있다. 그러나, 그들에 한정되지 않고, 예를 들어 근친종의 동물 유래인 것도 사용할 수 있다.
(나) 인간, 전체 RNA 혹은 특정 조직으로부터 얻은 전체 RNA 로부터 제작된 cDNA 또는 RT-PCR 산물이 고정화된, 어레이 또는 멤브레인 필터 :
상기 cDNA 또는 RT-PCR 산물은, 인간의 EST 데이터베이스 등의 서열 정보를 기초로 제작된 프라이머로 역전사 효소 반응이나 PCR 를 실시함으로써 클론화 된 것이다. 이 cDNA 나 RT-PCR 산물은, 미리 골 대사 이상을 갖는 인간과 골 대사 이상을 갖지 않는 인간 사이에서 발현양이 상이한 전체 RNA 를, 서브트랙션법 (Diatchenki, L, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1996) 93, 6025-6030), 디퍼런셜 디스플레이법 (Liang, P., et alNucleic Acids Res., (1992) 23, 3685-3690) 등을 사용하여 선택된 것이어도 된다. 또한, 어레이나 필터는 시판되는 것 (예를 들어, 인텔리진 : 타카라 바이오사 제조 등) 을 사용해도 되고, 상기 cDNA 나 RT-PCR 산물을 시판되는 스폿터 (예를 들어, GMS417 어레이어 : 타카라 바이오사 제조 등) 를 사용하여 고상화함으로써 제작해도 된다.
(ⅱ) 프로브의 제작과 해석
표지 프로브는, 특정의 mRNA 클론이 아니라, 발현하고 있는 모든 mRNA 를 표지한 것을 사용한다. 프로브 제작을 위한 출발 재료로서는 정제하지 않은 mRNA 를 사용해도 되지만, 전술한 방법으로 정제한 폴리 (A) +RNA 를 사용하는 것이 바람직하다. 이하에, 각종 고상화 시료를 사용한 경우의, 표지 프로브의 조제방법과 검출, 해석 방법에 대해서 설명한다.
(가) 어피메트릭스사 제조 유전자 칩 :
어피메트릭스사 제조 유전자 칩에 첨부된 프로토콜 (어피메트릭스사 발현 해석 기술 매뉴얼) 에 따라 비오틴 표지한 cRNA 프로브를 제작한다. 이어서 어피메트릭스사 제조 유전자 칩에 첨부된 프로토콜 (발현 해석 기술 메뉴얼) 에 따라, 어피메트릭스사 제조의 해석 장치 (GeneChip Fluidics Station 400) 를 사용하여 하이브리다이제이션 및 해석을 실시하여, 아비딘에 의한 발광을 검출, 해석을 실시한다.
(나) 어레이
역전사 효소 반응에 의해 폴리 (A) +RNA 로부터 cDNA 를 제작할 때에, cDNA 를 검출할 수 있도록 cDNA 를 표지해 두는 것이 필요하고, 형광 색소로 표지하는 경우에는, 형광 색소 (예를 들어 Cy3, Cy5 등) 로 표지된 d-UTP 등을 첨가하여 둠으로써 cDNA 를 형광 표지한다. 이 때, 피험자로부터 채취한 검체 유래의 폴리 (A) +RNA 와 정상인으로부터 채취한 검체 유래의 폴리 (A) +RNA 를 각각 다른 색소로 표지해 두면, 다음의 하이브리다이제이션시에는 양자를 혼합하여 사용할 수 있다. 어레이로서 예를 들어, 타카라 바이오 주식회사의 시판 어레이를 사용하는 경우, 동사의 프로토콜에 따라 하이브리다이제이션 및 세정을 실시하여, 형광 시그 널 검출기 (예를 들어 GMS418 어레이 스캐너 (타카라 바이오 주식회사 제조) 등) 로 형광 시그널을 검출한 후, 해석을 실시한다. 다만, 사용되는 어레이로서는 시판되는 것에 한정되지 않고, 자가제(自家製)인 것, 특별히 제작한 것이어도 된다.
(다) 멤브레인 필터 :
역전사 효소로 폴리 (A) +RNA 로부터 cDNA 를 제작할 때에, 방사성 동위 원소 (예를 들어, d-CTP 등을 첨가함으로써 표지 프로브를 조제하고, 통상적인 방법에 의해 하이브리다이제이션을 실시하여, 예를 들어, 시판되는 필터 제조 마이크로어레이인, 아트라스 시스템 (크론테크사 제조) 을 사용하여 하이브리다이제이션 및 세정을 실시한 후, 해석 장치 (예를 들어, 아트라스 이미지 : 크론테크사 제조 등) 를 사용하여 검출, 해석을 실시한다.
상기 (가) 내지 (다) 중 어느 하나에 기재된 방법도, 동일 롯트의 고상화 시료에 인간 각 조직 유래의 프로브를 하이브리다이즈시킨다. 이 때, 사용하는 프로브 이외의 하이브리다이제이션의 조건은 동일하게 한다. 형광 표지 프로브를 사용하는 경우에는, 각각의 프로브를 상이한 형광 색소로 표지하여 두면 하나의 고상화 시료에 양 프로브의 혼합물을 한 번에 하이브리다이즈시켜 형광 강도를 판독할 수 있다 (Brown, P.O. et al. Nature Genet., (1999) 21, supplement, 33-37).
(b) 그 이외의 측정 방법
상기 이외의 측정 방법으로서 서브 트랙션 클로닝법 (실험 의학 별책 신유전자 공학 핸드북, 요오도사 간행행 (1996) p.32-35 참조), 디퍼런셜 디스플레이법 (기초 생화학 실험법 4 핵산?유전자 실험 Ⅱ. 응용편, 도쿄 화학 동인 (2001), p125-128), 리포터 유전자를 사용한 방법 (클로람페니콜아세틸트랜스퍼라아제(예를 들어, pCAT3-Basic 벡터 : 프로메가사 제조의 것을 사용.) 이나 β-갈락토시다아제(예를 들어, pβgal-Basic : 프로메가사 제조의 것을 사용.), 분비형 알칼리포스파타아제(예를 들어, pSEAP2-Basic : 크론테크사 제조의 것을 사용.), 녹색 형광 단백질 (green-fluorescent protein) (예를 들어, pEGFP-1 : 크론테크사 제조를 사용.)) 이 있지만 이들에 한정되지 않는다.
d) 공정 4) 상기 공정 1) 유래의 전체 RNA 획분과 상기 공정 2) 유래의 전체 RNA 획분 사이에 있어서의 상기 공정 3) 에 의해서 측정된 유전자 발현양의 차이를 해석하여, 상기 공정 1) 에 기재된 피험자의 골 대사 이상을 검출하는 공정.
정상인 유래의 검체와 피험자 유래의 검체 사이에서 DC-STAMP 의 발현양의 차이를 해석하여, DC-STAMP 의 발현양이 유의하게 증가하고 있는 검체에서는 골 대사 이상이 존재할 가능성이 높다고 판정할 수 있고, 골 대사 이상을 검출할 수 있다. 발현양이 유의하게 증가하고 있다는 것은, 예를 들어, 어피메트릭스사의 유전자 칩을 사용하여, 어피메트릭스사의 microarray Suite Ver 3.0 을 사용하여 해석한 경우, DC-STAMP 유전자의 Average difference 값이 정상인 유래의 검체에 비해 유의하게 증가하고 있는 경우를 말한다. 또한, DC-STAMP 유전자의 농도를 측정하여, 미리 정상인의 값으로 해서 정해져 있는 수치 범위에 들어가는지의 여부 를 해석하여 정상인의 값으로서 정해져 있는 범위를 초과하고 있는 경우에는 골 대사 이상을 가진다고 판정함으로써 골 대사 이상을 검출할 수 있고, DC-STAMP 유전자의 발현양과, 정상인의 골 대사 이상의 형성도의 상관을 미리 조사해 둠으로써, 피험자로부터 채취한 검체에 있어서의 DC-STAMP 유전자의 발현양을 측정함으로써 피험자가, 정상인인지의 여부를 판정할 수도 있다.
(2) DC-STAMP 의 발현양 (단백질의 발현양) 을 사용한 골 대사 이상의 검출 방법
DC-STAMP 의 발현양을 사용한 골 대사 이상의 검출 방법은, 구체적으로는, 이하의 공정 1) 내지 3) 을 포함하는 방법이다.
1) 피험자로부터 채취한 검체에 있어서의, DC-STAMP 의 발현양을 측정하는 공정 :
2) 정상인으로부터 채취한 검체에 있어서의, 상기 1) 에 기재된 단백질의 발현양을 측정하는 공정 :
3) 상기 공정 1) 으로 측정된 단백질의 발현양과 상기 공정 2) 에서 측정된 그 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험자의 골 대사 이상을 검출하는 공정.
이하, 각 공정을 구체적으로 설명한다.
1) 공정 1) 피험자로부터 채취한 검체에 있어서의, DC-STAMP 의 발현양을 측정하는 공정 :
(a) 검체로부터 단백질 측정용 시료의 조제
검체는, 필요에 따라 고속 원심을 실시함으로써, 불용성 물질을 제거한 후, 이하와 같이 ELISA/RIA 용 시료나 웨스턴 블롯팅용 시료로서 조제한다.
ELISA/RIA 용 시료로서는, 예를 들어 회수한, 혈액 또는 골수 조직의 추출액을 그대로 사용하거나, 완충액으로 적절히 희석한 것을 사용한다. 웨스턴 블롯팅용 (전기 영동용) 시료는, 예를 들어, 혈액 또는 골수 조직의 추출액을 그대로 사용하거나, 완충액으로 적절히 희석하여, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동용 2-메르카톨에탄올을 함유하는 샘플 완충액 (시그마 (Sigma) 사 제조 등) 과 혼합한다. 도트/슬롯 블롯팅의 경우에는, 예를 들어 회수한 혈액 또는 골수 조직의 추출액 그 자체, 또는 완충액으로 적절히 희석한 것을, 블롯팅 장치를 사용하는 등 하여, 직접 멤브레인에 흡착시킨다.
(b) 시료의 고상화
상기와 같이 하여 얻어진 시료 중의 단백질을 특이적으로 검출하기 위해서는, 시료를 면역 침강법, 리간드의 결합을 사용한 방법 등에 의해, 침전시켜, 고상화시키지 않고 검출할 수도 있고, 그대로 검출하는 그 시료를 고상화할 수도 있다. 단백질을 고상화시키는 경우에 있어서, 웨스턴 블롯법, 도트 블롯법 또는 슬롯 블롯법에 사용되는 멤브레인으로서는, 니트로셀룰로오스멤브레인 (예를 들어, 바이오랏드사 제조 등), 나일론 멤브레인 (예를 들어, 하이본드-ECL (아마샴?파르마시아사 제조) 등), 코튼 멤브레인 (예를 들어, 블롯 압소벤트 필터 (바이오랏드사 제조) 등) 또는 폴리비닐리덴?디플루오르화물 (PVDF) 멤브레인 (예를 들어, 바이오랏드사 제조 등) 등을 들 수 있다.
ELISA 법/RIA 법에 의해 단백질의 검출?정량을 실시하기 위해서는, 전용의 96 웰 플레이트 (예를 들어, 임뮤노프레이트?맥시소프 (눈크사 제조) 등) 에 시료 또는 그 희석액 (예를 들어 0.05% 아지화나트륨을 함유하는 인산 완충 생리 식염수 (이하 「PBS」 라고 한다) 로 희석한 것) 을 넣어 4℃ 내지 실온에서 하룻밤, 또는 37℃ 에서 1 내지 3 시간 정치함으로써, 웰내 저면에 단백질을 흡착시켜 고상화한다.
DC-STAMP 에 대한 항체는, 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어, 신세이 화학 실험 강좌 1, 단백질 1, p.389-397, 1992 참조.), DC-STAMP 또는 DC-STAMP 의 아미노산 서열에서 선택되는 임의의 폴리펩티드를 동물에 면역시켜, 생체 내에 생성되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 또한, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature, (1975) 256, 495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody, (1980) 365-367, Prenum Press, N.Y.) 에 따라, DC-STAMP 에 대한 항체를 생성하는 항체 생성 세포와 골수종 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.
또, 항원이 되는 DC-STAMP 는 DC-STAMP 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생성시킴으로써 얻을 수 있다. 구체적으로는, DC-STAMP 유전자를 발현 가능한 벡터를 제작하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시켜, 발현한 DC-STAMP 를 정제하면 된다. 혹은, DC-STAMP 를 발현시킨 숙주 세포 그 자체 혹은 막 단편을 항원으로서 사용해도 된다.
(c) DC-STAMP 의 발현양의 측정
DC-STAMP 의 발현양은, 서열표의 서열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 서 열로 이루어지는 단백질의 발현양으로 나타내어진다.
발현양의 측정은, 상기 항 DC-STAMP 항체를 사용하여 웨스턴 블롯법이나 도트/슬롯 블롯법 등 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다.
2) 공정 2) 정상인으로부터 채취한 검체에 있어서의, 상기 1) 에 기재된 단백질의 발현양을 측정하는 공정 :
정상인으로부터 채취한 검체에 있어서의 DC-STAMP 의 발현양의 측정은 상기 공정 1) 과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.
3) 공정 3) 상기 공정 1) 에서 측정된 단백질의 발현양과 상기 공정 2) 에서 측정된 그 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험자의 골 대사 이상을 검출하는 공정.
정상인 유래의 검체와 피험자 유래의 검체 사이에 DC-STAMP 의 발현양의 차이를 해석하여, DC-STAMP 의 발현양이 유의하게 증가하고 있는 검체에서는 골 대사 이상이 존재할 가능성이 높다고 판정할 수 있고, 골 대사 이상을 검출할 수 있다.
또한, DC-STAMP 의 농도를 측정하여, 미리 정상인의 값으로서 정해져 있는 수치 범위에 들어가는지의 여부를 해석하여 정상인의 값으로서 정해져 있는 범위를 초과하고 있는 경우에는 골 대사 이상을 가진다고 판정함으로써 골 대사 이상을 검출할 수 있고, DC-STAMP 의 발현양과 정상인의 골 대사의 상관을 미리 조사해 둠으로써, 피험자로부터 채취한 검체에 있어서의 DC-STAMP 의 발현양을 측정함으로써 피험자가, 정상인인지의 여부를 판정할 수도 있다.
3. DC-STAMP 유전자 및 DC-STAMP 의 검정
DC-STAMP 유전자 및 DC-STAMP 는 거세포종에 있어서 특이적으로 발현하고, 또 단구 유래 세포주가 파골 세포에 분화할 때에 발현양이 증가한다.
(1) DC-STAMP 의 과잉 발현을 사용한 DC-STAMP 유전자 및 DC-STAMP 의 기능 해석
DC-STAMP 의 기능을 조사하는 방법으로서는, 우선, DC-STAMP 를 발현하고 있는 세포 유래의 cDNA 라이브러리로부터, 콜로니하이브리다이제이션법 등, 공지된 방법에 따라, 완전 길이 cDNA 를 취득한다. 이 완전 길이 cDNA 를 인간 유래 세포 또는 비인간 포유 동물 유래 세포 (예를 들어, 모르모트, 래트, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 유래 세포 등) 에 도입하여 고발현 시키고, 세포에 영향이 발생하는지의 여부를 검토한다.
cDNA 를 동물 개체 내에서 발현시키기 위해서는, 얻어진 완전 길이 cDNA 를 바이러스 벡터에 넣어, 동물에 투여하는 방법을 들 수 있다. 바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 방법으로서는 예를 들어, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 폴리오 바이러스 등의 DNA 바이러스, 또는 RNA 바이러스에 cDNA 를 주입하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 그 중에서도, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아 바이러스를 사용한 방법이 바람직하다.
비(非)바이러스성 유전자 도입 방법으로서는, 발현 플라스미드를 직접 근육 내에 투여하는 방법 (DNA 백신법), 리포솜법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션 등을 들 수 있고, 그 중에서도, DNA 백신법, 리포솜법이 바람직하다.
또한, 배양 세포에 대하여, 완전 길이 cDNA 를 인간 유래 세포, 비인간 포유 동물 유래 세포 (예를 들어, 모르모트, 래트, 마우스, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 유래 세포 등) 의 단구 유래 세포, 림프절 유래 세포, 근육 세포, 간세포, 지방세포, 혹은 피부 세포 등에 도입하고, 고발현시켜, 각 표적 세포가 갖는 기능, 구체적으로는, 파골 세포의 분화나 성숙 등의 골 대사에 관계하는 기능, 혹은 세포의 형태에 어떠한 영향이 나타나는지를 검토할 수 있다.
완전 길이 cDNA 를 동물 또는 세포에 도입하는데 있어서는, 적당한 프로모터 및 형질 발현에 관련되는 서열을 포함하는 벡터에 그 cDNA 를 주입하고, 그 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환시킨다. 척추 동물 세포의 발현 벡터로서는, 통상 발현하려고 하는 유전자의 상류에 위치하는 프로모터, RNA 의 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열 등을 갖는 것을 사용할 수 있고, 또한 이것은 필요에 의해 복제기점을 갖고 있어도 된다. 그 발현 벡터의 예로서는, SV40 의 초기 프로모터를 갖는 pSV2dhfr (Subramani, S. et al., Mol. Cell. Biol., (1981) 1, 854-864), CMV 의 초기 프로모터를 갖는, pCI-neo (프로메가 (Promega) 사 제조), 레트로 바이러스 벡터 pLNCX, pLNSX, pLXIN, pSIR (클로날테크 (Clontech) 사 제조), 코스미드 벡터 pAxCw (타카라 바이오사 제조) 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 그 발현 벡터는, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-덱스트란 (Luthman, H.and Magnusson, G., Nucleic Acids Res., (1983) 11, 1295-1308), 인산칼슘-DNA 공침전법 (Graham, F. L. and van der Eb, A. J., Virology, (1973) 52, 456-457), 및 전기 펄스 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., (1982) 1, 841-845) 등에 의해 마우스 단구 유래 세포 RAW264.7 (ATCC Cat. No. TIB-71), RAW264 세포 (ECACC Cat. No. 85062803), RAW-D 세포 (Watanabe et al., J. Endocrinol., (2004) 180, 193-201), 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, 175-182, ATCC : CRL-1650) 이나 차이니즈?햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC : CCL-61) 의 디히드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4126-4220), 인간 태아 신장 유래 293 세포 (ATCC : CRL-1573) 등에 주입할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이렇게 해서 목적으로 하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.
또한, 유전자 조작에 의해, 정상 동물에 있어서, 목적으로 하는 유전자가 고발현하도록 트랜스제닉 동물을 제작하여, 세포의 형태에 어떠한 영향이 나타나는지를 검토할 수도 있다.
(2) DC-STAMP 의 발현양을 억제하는 것에 의한 DC-STAMP 의 기능 해석
DC-STAMP 의 발현양을 억제함으로써 파골 세포의 분화나 파골 세포의 성숙, 세포의 형태에 어떠한 영향이 나타나는지를 조사함으로써도 DC-STAMP 의 기능을 해석할 수 있다.
DC-STAMP 의 발현을 억제하는 물질로서는 DC-STAMP 유전자에 대한 안티센스 핵산, siRNA 등을 들 수 있다. DC-STAMP 의 기능을 저해하는 물질로서는 DC-STAMP 에 특이적으로 결합하는 항체를 들 수 있다.
DC-STAMP 의 발현을 억제하거나, 혹은 DC-STAMP 의 기능을 저해하였을 때에 각 표적 세포가 갖는 기능, 구체적으로는, 파골 세포의 분화나 성숙 등의 골 대사에 관계하는 기능, 혹은 세포의 형태에 어떠한 영향이 나타나는지를 검토할 수 있다. 또한, 골 대사 이상을 갖는 동물 또는 골 대사 이상을 갖지 않는 동물에 있어서, DC-STAMP 유전자를 파괴시킨 녹 아웃 동물을 제작하여 세포나 조직 상태를 판정할 수 있다.
4. DC-STAMP 유전자 및/또는 DC-STAMP 검출용 키트
DC-STAMP 유전자 및/또는 DC-STAMP 는, 이하의 1) 내지 5) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나 이상을 포함하는 키트를 사용하여 검출할 수 있다.
1) 서열표의 서열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 5 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭시키기 위한 15 내지 30 염기 길이의 연속된 올리고뉴클레오티드 프라이머 ;
2) 서열표의 서열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 5 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리뉴클레오티드에 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 그 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 15 뉴클레오티드 이상이 연속된 폴리뉴클레오티드 프로브 ;
3) 서열표의 서열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 3 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 5 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리뉴클레오티드가 고정된 고상화 시료 ;
4) 서열표의 서열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질, 서열 번호 4 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 서열 번호 6 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질에서 선택되는 적어도 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합하고, 그 단백질을 검출하기 위한 항체 ;
5) 상기 4) 에 기재된 항체에 결합할 수 있는 2 차 항체.
상기 1) 에 기재된 프라이머는, DC-STAMP 유전자의 뉴클레오티드 서열 (서열표의 서열 번호 1, 3 및/또는 5 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열) 에 기초하는 시판되는 프라이머 설계 소프트 (예를 들어, Wisconsin GCG package Version 10.2) 를 사용하는 등, 통상적인 방법에 의해 용이하게 설계하여, 증폭시킬 수 있다. 또한, 상기 2) 에 기재된 프로브는, DC-STAMP 에 특이적으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 100 내지 1500 염기 길이, 바람직하게는 300 내지 600 염기 길이이다. 이들의 프라이머나 프로브는, 적당한 표지에 의해 라벨 (예를 들어, 효소 표지, 방사성 표지, 형광 표지 등) 되어 있어도 되고, 또한, 링커를 부가하고 있어도 된다.
상기 3) 에 기재된 고상화 시료는, 상기 2) 에 기재된 프로브를 유리판, 나 일론 멤브레인 등의 고상에 고정함으로써 제작된다. 이러한 고상화 시료의 작성 방법에 대해서는, 이미 「2. 골 대사 이상의 검출」 항의 「(1) DC-STAMP 유전자의 발현양을 사용한 골 대사 이상의 검출 방법」 의 항에서 설명한 바와 같고, 예를 들어, 유전자 칩, cDNA 어레이, 올리고어레이, 멤브레인 필터 등을 들 수 있다.
본 발명의 키트에는, 추가로 내열성 DNA 폴리머라아제, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 의 혼합물) 및 완충액을 함유할 수도 있다. 내열성 DNA 폴리머라아제로서는 Taq DNA 폴리머라아제, LA Taq DNA polymerase (타카라 주조사 제조), Tth DNA 폴리머라아제, Pfu DNA 폴리머라아제등을 예시할 수 있다. 완충액은 사용하는 DNA 폴리머라아제에 따라서 선택되고, 필요에 따라 Mg2 + 등이 첨가되어 있다.
상기, 4) 및 5) 에 기재된 항체는 상기 「2. 골 대사 이상의 검출」 항의 「 (2) DC-STAMP 의 발현양 (단백질의 발현양) 을 사용한 골 대사 이상의 검출 방법」 의 항이나 「6. 항 DC-STAMP 항체의 제조」 항에 기재된 방법에 의해 제작할 수 있다. 그 항체는, 적당한 표지에 의해 라벨 (예를 들어, 효소 표지, 방사성 표지, 형광 표지 등) 되어 있어도 된다.
본 발명의 키트는 DC-STAMP 유전자 및/또는 DC-STAMP 의 검출에 사용할 수 있고, 골 대사 이상의 유무의 판정이나, 골 대사 이상의 병태의 진행을 억제하는 물질의 스크리닝에도 사용할 수 있다.
5. 파골 세포에 대한 분화 억제물질의 스크리닝 방법
본 발명 중 하나의 양태로서, DC-STAMP 유전자 및/또는, DC-STAMP 의 발현양을 측정함으로써, 파골 세포에 대한 분화 억제물질의 스크리닝 방법을 들 수 있다.
본 발명 중 하나의 양태로서, DC-STAMP 의 파골 세포 분화 촉진 활성을 저해하는 물질을 동정함으로써, 골 대사 이상증의 치료 효과 및/또는 예방 효과를 갖는 물질을 스크리닝하는 방법을 들 수 있다.
또한, 「피험 물질」 이란, 본 발명의 스크리닝 방법으로 파골 세포에 대한 분화 억제활성을 조사하는 대상이 되는 물질을 말한다. 피험 물질로서는, 화합물, 미생물의 대사 산물, 식물이나 동물 조직의 추출물, 그들의 유도체 또는 그들의 혼합물 등을 들 수 있다. 또한, DC-STAMP 의 발현양을 저하하도록 설계된 핵산 또는 그 유도체 (안티센스 올리고 뉴클레오티드, 리포자임, dsRNA , siRNA 등을 포함한다) 를, 피험 물질로서 사용할 수도 있다. 피험 물질의 투여량이나 농도는 적절히 설정하거나, 또는 예를 들어 희석 계열을 작성하는 등 하여 복수종의 투여량을 설정해도 되고, 고체, 액체 등 적당한 상태로 투여할 수 있고, 적당한 버퍼에 용해하거나, 혹은 안정화제등을 첨가해도 된다. 배양 세포를 사용하는 스크리닝 방법의 경우에는, 배지에 첨가하여 배양할 수 있다. 배지에 첨가하는 경우에는 배양 개시시부터 첨가해도 되고, 배양 도중에 첨가해도 되고, 또한, 첨가 횟수도 1 회에 한정되지 않는다. 피험 물질 존재 하에서 배양시키는 기간도 적절하게 설정해도 되지만, 바람직하게는 30 분 내지 2 주일이며, 보다 바람직하게는, 30 분 내지 48 시간이다. 포유 동물 개체에 피험 물질을 투여하는 경우에 는, 피험 물질의 물성 등에 의해 경구 투여, 정맥 주사, 복강내 주사, 경피 투여, 피하 주사 등의 투여 형태를 구사한다. 또한 피험 물질의 투여로부터, 검체를 얻을 때까지의 시간은 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서 사용되는 배양 세포는, DC-STAMP 를 발현하는 포유 동물 세포인 한에 있어서, 정상적인 세포에서도, 암 세포 등의 이상인 증식을 나타내는 세포여도 되고, 예를 들어, 마우스 단구 유래 세포 RAW264.7 (ATCC Cat. No TIB-71), RAW264 세포 (ECACC Cat. No. 85062803), RAW-D 세포 (Watanabe et al., J. Endocrinol., (2004) 180, 193-201), 마우스 골수 유래 초대 배양 세포 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 배양 세포의 포유 동물종으로서는, 인간, 마우스 또는 그 외의 포유 동물 (모르모트, 래트, 닭, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 이 바람직하지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 배양 세포로서는 DC-STAMP 를 과잉 발현하고 있는 포유 동물 세포를 사용하는 것이 보다 바람직하고, 예를 들어 DC-STAMP 유전자를 그 프로모터 영역과 함께 도입하여, DC-STAMP 를 과잉 발현하는 RAW264.7 세포, RAW264 세포, RAW-D 세포 등을 들 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에는, 배양 세포를 사용하지 않고, 포유 동물 개체에 피험 물질을 투여하고, 그 후 그 동물 개체로부터 적출된 그 장기 또는 조직 세포에 있어서의 DC-STAMP 유전자의 발현을 검출하는 방법도 포함된다. 유전자 발현의 검출 대상이 되는 장기 또는 조직은, DC-STAMP 를 발현하는 것이면 되지만, 바람직하게는 골 대사 이상이 발생되고 있는 조직이며, 보다 바람직하게는 골수이 다. 포유 동물종으로서는 비인간 포유 동물을 사용할 수 있고, 마우스, 래트 또는 햄스터가 바람직하고, 마우스 또는 래트가 보다 바람직하다. 또, 골 대사 이상을 나타내는 동물 모델로서, 난소 적제동물, 정소 적제동물, 종양 세포를 피하, 피내, 좌심실, 골수, 정맥 혹은 복강 등에 이식한 담암 동물, 좌골 신경 절제동물, 아쥬반트 관절염 모델 동물, 콜라겐 유발성 관절염 모델 동물, 글루코코르티코이드 유발성 골다공증 모델 동물, 노화 촉진 마우스 (SAMP6 마우스, Matsushita et al., Am. J. Pathol. 125, 276-283 (1986)), 갑상선?부갑상선 적제동물, 부갑상선 호르몬 관련 펩티드 (PTHrP) 지속 주입 동물, 파골 세포 형성 억제인자 (OCIF) 녹 아웃 마우스 (Mizuno et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 247, 610-615) 등을 사용할 수 있다. 또한, 치주병에 의한 치아 상실 모델 동물이나, DC-STAMP 를 과잉 발현시킨 동물을 사용할 수도 있다. 또한 스크리닝에 의해 선택된 피검 물질을 상기 동물 모델에 투여하고, 골 조직에 있어서의 파골 세포의 수, 골 밀도, 골 강도 혹은 혈중 Ca 농도 등, 골 대사 이상에 의해 변동하는 파라미터를 측정함으로써, 그 피검 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 평가할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 사용되는 배양 세포는, 피험 물질을 첨가하지 않는 경우에 RANKL 및 TNF-α 를 첨가하면 DC-STAMP 를 발현 가능한 조건이면, 어떠한 조건에서 배양해도 된다. 예를 들어, 그 배양 세포에 대해서 공지된 배양 조건이 알려져 있고, 그 조건 하에 있어서 그 세포가 DC-STAMP 를 발현하는 경우에는, 그 조건으로 배양해도 된다. 또한, 포유 동물 개체로부터 적출한 장기 또는 조 직에 있어서의 DC-STAMP 의 발현을 검출하는 경우에 있어서의, 그 동물의 사육 조건도, 피험 물질을 첨가하지 않는 경우에 DC-STAMP 를 발현 가능한 조건이면 된다.
또한, 피험 물질의, DC-STAMP 의 발현에 대한 영향을 조사하기 위해서는, DC-STAMP 유전자의 발현양을 측정하는 방법과 DC-STAMP 유전자의 번역 산물인, DC-STAMP 의 발현양을 측정하는 방법이 있다. DC-STAMP 유전자, 및/또는, DC-STA MP 의 발현을 억제하는 피험 물질은 골 대사 이상, 바람직하게는 골다공증, 관절 류머티즘 및/또는 암성 고칼슘 혈증에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 갖는 물질이라고 생각된다.
배양 세포로부터의, 전체 RNA 의 추출, DC-STAMP 유전자의 발현양의 측정, DC-STAMP 의 발현양의 측정에 대해서는, 상기 「2. 골 대사 이상의 검출」 항에 기재한 방법에 따라 실시할 수 있다. 또, 포유 동물 유래 배양 세포를 사용하는 경우에는, 필요에 따라 배지에는 피험 물질과 함께 RANKL 및 TNF-α 를 적당량 첨가하고, 피험 물질을 첨가하지 않는 컨트롤에 있어서도 RANKL 및 TNF-α 를 적절하게 첨가한다.
(1) DC-STAMP 유전자를 사용하는 방법
본 발명의 스크리닝 방법으로서는 예를 들어, 포유 동물 유래 배양 세포를 사용하는 방법, 및 포유 동물 개체를 사용하는 방법에 대해서 각각 이하와 같이 된다.
(a) 포유 동물 유래 배양 세포를 사용하는 방법
(i) 이하의 공정 가) 내지 다) 를 포함한다 :
가) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정 ;
나) 가) 유래의 전체 RNA 와 피험 물질을 첨가하지 않고 배양시킨 포유 동물 배양 세포 유래 전체 RNA 의 사이에 있어서의, DC-STAMP 유전자 발현양의 차이를 검출하는 공정 ;
다) 가) 에 기재된 유전자 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의, 골 대사 이상에 대한 치료, 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅱ) 이하의 공정 가) 내지 라) 를 포함한다.
가) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정 ;
나) 피험 물질을 첨가하지 않은 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정.
다) 상기 가) 유래의 전체 RNA 와 나) 유래의 전체 RNA 에 있어서의, DC-STAMP 유전자의 발현양을 측정하는 공정 ;
라) 상기 가) 유래의 전체 RNA 와 나) 유래의 전체 RNA 사이에 있어서의 상기 다) 에 의해 측정된 유전자 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의, 골 대사 이상에 대한 치료, 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(b) 포유 동물 개체를 사용하는 방법
(i) 이하의 공정 가) 내지 다) 를 포함한다.
가) 피험 물질을 투여한 포유 동물 개체로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정 ;
나) 가) 유래의 전체 RNA 와 피험 물질을 투여하지 않은 동물 개체로부터 채취한 검체로부터 얻은 전체 RNA 사이에 있어서의, DC-STAMP 유전자 발현양의 차이를 검출하는 공정 ;
다) 상기 나) 에 기재된 유전자 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료, 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅱ) 이하의 공정 가) 내지 라) 를 포함한다.
가) 피험 물질을 투여한 포유 동물 개체로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정 ;
나) 피험 물질을 투여하지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체로부터, 전체 RNA 를 추출하는 공정 ;
다) 상기 공정 가) 유래의 전체 RNA 와 상기 공정 나) 유래의 전체 RNA 에 있어서의, DC-STAMP 유전자의 발현양을 측정하는 공정 ;
라) 다) 에 기재된 유전자 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(2) DC-STAMP 를 사용하는 방법
DC-STAMP 의 발현양을 측정하는 것을 사용한 스크리닝 방법에 대해서는 포유 동물 배양 세포를 사용한 방법과 동물 개체를 사용한 방법에 대하여 각각 이하의 공정을 포함한다.
(a) 포유 동물 유래 배양 세포를 사용하는 방법
(i) 이하의 공정 가) 및 나) 를 포함한다 :
가) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포에 있어서의, DC-STAMP 의 발현양을 측정하는 공정 ;
나) 가) 에서 측정된 단백질의 발현양과, 피험 물질을 첨가하지 않은 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포에 있어서의 그 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅱ) 이하의 공정 가) 내지 다) 를 포함한다 :
가) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포에 있어서의, DC-STAMP 의 단백질의 발현양을 측정하는 공정 ;
나) 피험 물질을 첨가하지 않은 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포에 있어서의, 상기 가) 에 기재된 단백질의 발현양을 측정하는 공정 ;
다) 상기 가) 에서 측정된 단백질의 발현양과, 상기 나) 에서 측정된 그 단백질의 발현양의 차이를 검출하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅲ) 이하의 공정 가) 내지 다) 를 포함한다 :
가) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포로부터 얻은 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
나) 상기 고상화 단백질에 있어서의, DC-STAMP 의 단백질의 발현양을 측정하는 공정 ;
다) 상기 나) 에서 검출된 DC-STAMP 의 발현양과 피험 물질을 첨가하지 않은 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포로부터 얻은 전체 단백질에 있어서의 그 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅳ) 이하의 공정 가) 내지 마) 를 포함한다 :
가) 피험 물질을 첨가한 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포로부터 얻은 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
나) 피험 물질을 첨가하지 않은 배지에서 배양시킨 포유 동물 유래 배양 세포로부터 얻은 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
다) 상기 공정 가) 에 기재된 고상화 단백질에 있어서의 DC-STAMP 의 단백질의 발현양을 그 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드를 사용하여 측정하는 공정 ;
라) 상기 공정 나) 에 기재된 고상화 단백질에 있어서의 DC-STAMP 의 발현양을 그 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드를 사용하여 측정하는 공정 ;
마) 상기 공정 다) 에서 측정된 단백질의 발현양과, 상기 공정 라) 에서 측정된 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의, 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(b) 포유 동물 개체를 사용하는 방법
(ⅰ) 이하의 공정 가) 및 나) 를 포함한다 :
가) 피험 물질이 투여된 포유 동물 개체로부터 채취한 검체에 있어서의, DC-STAMP 의 단백질의 발현양을 측정하는 공정 ;
나) 상기 공정 가) 에서 측정된 DC-STAMP 의 발현양과, 피험 물질이 투여되지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체에 있어서의 그 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅱ) 이하의 공정 가) 내지 다) 를 포함한다 :
가) 피험 물질이 투여된 포유 동물 개체로부터 채취한 검체에 있어서의, DC-STAMP 의 단백질의 발현양을 그 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드를 사용하여 측정하는 공정 ;
나) 피험 물질이 투여되지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체에 있어서의, 그 단백질의 발현양을 측정하는 공정 ;
다) 가) 에서 측정된 DC-STAMP 의 단백질의 발현양과 나) 에서 측정된 그 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅲ) 이하의 공정 가) 내지 다) 를 포함한다 :
가) 피험 물질이 투여된 포유 동물 개체로부터 채취한 검체 중의 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
나) 상기 고상화 단백질에 있어서의, DC-STAMP 의 단백질의 발현양을 측정하는 공정 ;
다) 상기 나) 에서 검출된 DC-STAMP 의 단백질의 발현양과, 피험 물질이 투여되지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체 중에 있어서의 그 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(ⅳ) 이하의 공정 가) 내지 마) 를 포함한다 :
가) 피험 물질이 투여된 포유 동물 개체로부터 채취한 검체 중의 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
나) 피험 물질이 투여되지 않은 포유 동물 개체로부터 채취한 검체 중의 전체 단백질을 고상화시키는 공정 ;
다) 상기 공정 가) 에 기재된 고상화 단백질에 있어서의, DC-STAMP 의 단백질의 발현양을 그 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드를 사용하여 검출하는 공정 ;
라) 상기 나) 에 기재된 고상화 단백질에 있어서의, DC-STAMP 의 단백질의 발현양을 그 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 리간드를 사용하여 검출하는 공정 ;
마) 상기 다) 에서 검출된 단백질의 발현양과, 상기 라) 에서 검출된 그 단백질의 발현양의 차이를 해석하여, 피험 물질의 골 대사 이상에 대한 치료 효과 및/또는 예방 효과를 판정하는 공정.
(3) 그 이외의 방법
DC-STAMP 를 과잉 발현시킨 포유 동물 개체에 피험 물질을 투여한 경우와 투 여하지 않은 경우에 대해서, 경시적으로 골 대사 이상의 발생율, 골 대사 이상의 정도, 및/또는 생존율 등을 측정한다. 피험 물질을 투여한 포유 동물에서 골 대사 이상의 발생율이 유의하게 저하되고 있는, 골 대사 이상의 정도가 유의하게 작은, 및/또는, 생존율이 약 10% 이상, 바람직하게는 약 30% 이상, 보다 바람직하게는, 약 50% 이상 상승한 경우에, 피험 물질은 골 대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 화합물로서 선택할 수 있다.
6. 항 DC-STAMP 항체의 제조
(1) 항원의 조제
항 DC-STAMP 항체를 제작하기 위한 항원으로서는, DC-STAMP 또는 그 적어도 6 개의 연속된 부분 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 혹은 이들에 임의의 아미노산 서열이나 담체가 부가된 유도체를 들 수 있다.
DC-STAMP 는, 혈구 세포 또는 골수 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 혹은 이들 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있고, 또한, DC-STAMP 를 in vitro 로 합성하는, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생성시킴으로써 얻을 수 있다.
원핵 세포의 숙주로서는, 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli) 이나 고초균 (Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 목적으로 하는 유전자를 이들의 숙주 세포 내에서 형질 전환 시키는 데에는, 숙주와 적합할 수 있는 종 유래의 레플리콘 즉 복제기점과, 조절 서열을 포함하고 있는 플라스미드 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환시킨다. 또한, 벡터로서는, 형질 전환 세포에 표현 형질 (표현 형) 의 선택성을 부여할 수 있는 서열을 갖는 것이 바람직하다.
예를 들어, 대장균으로서는 K12 주 등이 많이 사용되고, 벡터로서는, 일반적으로 pBR322 나 pUC 계의 플라스미드가 사용되지만, 이들에 한정되지 않고, 공지된 각종 균주, 및 벡터를 모두 사용할 수 있다.
프로모터로서는, 대장균에 있어서는, 트립토판 (trp) 프로모터, 락토스 (lac) 프로모터, 트립토판?락토스 (tac) 프로모터, 리포프로테인 (lpp) 프로모터, 폴리펩티드 사슬 신장 인자 Tu (tufB) 프로모터 등을 들 수 있고, 어느 프로모터도 목적으로 하는 폴리펩티드의 생성에 사용할 수 있다.
고초균으로서는, 예를 들어 207-25 주가 바람직하고, 벡터로서는 pTUB228 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) 등이 사용되지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 고초균의 α -아밀라아제의 시그널 펩티드 서열을 코드하는 DNA 서열을 연결함으로써, 균체 외에서의 분비 발현도 가능해진다.
진핵 세포의 숙주 세포에는, 척추 동물, 곤충, 효모 등의 세포가 포함되고, 척추 동물 세포로서는, 예를 들어, 마우스 단구 유래 세포 RAW264.7 (ATCC Cat. No TIB-71), RAW264 세포 (ECACC Cat. No.85062803), RAW-D 세포 (Watanabe et al. J. Endocrinol., (2004) 180, 193-201), 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, 175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 섬유아세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) 이나 차이니즈?햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디히드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1980) 77, 4126-4220) 등이 많이 사용되고 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
척추 동물 세포의 발현 프로모터로서는, 통상 발현하려고 하는 유전자의 상류에 위치하는 프로모터, RNA 의 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열 등을 갖는 것을 사용할 수 있고, 또한 이것은 필요에 따라 복제기점을 갖고 있어도 된다. 그 발현 벡터의 예로서는, 사이토메갈로 바이러스 초기 프로모터를 갖는 pCDNA 3.1 (인비트로젠사 제조), SV40 의 초기 프로모터를 갖는 pSV2dhfr (Subramani, S. et. al., Mol. Cell. Biol., (1981) 1, 854-864) 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다
숙주 세포로서 COS 세포 혹은 NIH3T3 세포를 사용하는 경우를 예로 들면, 발현 벡터로서는, SV40 복제기점을 갖고, COS 세포 혹은 NIH3T3 세포에 있어서 자립 증식이 가능하고, 또한 전사 프로모터, 전사 종결 시그널, 및 RNA 스플라이스 부위를 갖춘 것을 사용할 수 있다. 그 발현 벡터는, DEAE-덱스트란법 (Luthman, H. and Magnusson, G., Nucleic Acids Res., (1983) 11, 1295-1308), 인산칼슘-DNA 공 침전법 (Graham, F. L. and van der Eb, A. J., Virology, (1973) 52, 456-457), 및 전기 펄스 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., (1982) 1, 841-845) 등에 의해 COS 세포, 혹은 NIH3T3 세포에 주입시킬 수 있고, 이렇게 해서 목적으로 하는 형질 전환 세포를 얻을 수 있다. 또한, 숙주 세포로서 CHO 세포를 사용하는 경우에는, 발현 벡터와 함께, 항생 물질 G418 내성 마커로서 기능하는 neo 유전자를 발현할 수 있는 벡터, 예를 들어 pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989) : “Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY) 나 pSV2neo (Southern, P. J. and Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., (1982) 1, 327- 341) 등을 코?트랜스펙트 하고, G418 내성의 콜로니를 선택함으로써, 목적으로 하는 폴리펩티드를 안정적으로 생성하는 형질 전환 세포를 얻을 수 있다.
상기와 같이 하여 얻어지는 형질 전환체는, 통상적인 방법에 따라 배양할 수 있고, 그 배양에 의해 세포 내, 세포막 상 또는 세포 외에 목적으로 하는 폴리펩티드가 생성된다. 그 배양에 사용되는 배지로서는, 채용된 숙주 세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적절하게 선택할 수 있고, 예를 들어, 상기 COS 세포이면, RPMI1640 배지나 둘베코 변법 이글 배지 (이하 「DMEM」 이라고 한다) 등의 배지에, 필요에 따라 소태아 혈청 등의 혈청 성분을 첨가한 것을 사용할 수 있다.
상기 배양에 의해, 형질 전환체의 세포 내, 세포막 상 또는 세포 외에 생성 되는 재조합 단백질은, 그 단백질의 물리적 성질이나 화학적 성질 등을 사용한 각종의 공지된 분리 조작법에 의해 분리?정제할 수 있다. 그 방법으로서는, 구체적으로는 예를 들어, 통상의 단백질 침전제에 의해 처리, 한외 여과, 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합 등을 예시할 수 있다. 또한, 발현시키는 재조합 단백질에 6 잔기로 이루어지는 히스티딘을 연결함으로써, 니켈 어피니티 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다. 상기 방법을 조합함으로써 용이하게 고수율, 고순도에서 목적으로 하는 폴리펩티드를 대량으로 제조할 수 있다. 또한, 상기 단백질이 세포막 상에 생성되는 경우에는, 세포막 획분을 조제함으로써, 분리, 조(粗) 정제할 수 있다.
(2) 항 DC-STAMP 모노클로날 항체의 제조
DC-STAMP 와 특이적으로 결합하는 항체의 예로서, DC-STAMP 와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 들 수 있지만, 그 취득 방법은, 이하에 기재하는 바와 같다.
모노클로날 항체의 제조에 있어서는, 일반적으로 하기와 같은 작업 공정이 필요하다. 즉,
(a) 항원으로서 사용하는 생체 고분자의 정제,
(b) 항원을 동물에 주사함으로써 면역시킨 후, 혈액을 채취하고 그 항체값을 검정하여 췌장 적출의 시기를 결정하고 나서, 항체 생성 세포를 조제하는 공정,
(c) 골수종 세포 (이하 「골수종」 이라고 한다) 의 조제,
(d) 항체 생성 세포와 골수종의 세포 융합,
(e) 목적으로 하는 항체를 생성하는 하이브리도마군의 선별,
(f) 단일 세포 클론에 대한 분할 (클로닝),
(g) 경우에 따라서는, 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육,
(h) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성, 및 그 결합 특이성의 검토, 혹은 표지 시약으로서의 특성의 검정, 등이다.
이하, 모노클로날 항체의 제작법을 상기 공정을 따라 상세하게 설명하는데, 그 항체의 제작법은 이것에 제한되지 않고, 예를 들어 췌(膵) 세포 이외의 항체 생성 세포 및 골수종을 사용할 수도 있다.
(a) 항원의 정제
항원으로서는, 상기한 바와 같은 방법으로 조제한 DC-STAMP 또는 그 일부를 사용할 수 있다. 또한, DC-STAMP 의 발현 재조합 체세포로부터 조제한 막 획분, 나아가 DC-STAMP 의 발현 재조합 체세포 자신, 또한, 당업자에게 주지된 방법을 사용하여, 화학 합성한 본 발명의 단백질의 부분 펩티드를 항원으로서 사용할 수도 있다.
(b) 항체 생성 세포의 조제
공정 (a) 에서 얻어진 항원과 프로인드의 완전 또는 불완전 아쥬반트, 또는 칼리명반과 같은 보조제를 혼합하여, 면역원으로서 실험 동물에게 면역시킨다. 실험 동물은 공지된 하이브리도마 제작법에 사용되는 동물을 지장 없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 등을 사용할 수 있다. 단, 적출한 항체 생성 세포와 융합시키는 골수종 세포의 입수 용이성 등의 관점에서, 마우스 또는 래트를 피면역 동물로 하는 것이 바람직하다. 또한, 실제로 사용하는 마우스 및 래트 계통은 특별히 제한되지 않고, 마우스의 경우에는, 예를 들어 각 계통 A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BR, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, RⅢ, SJL, SWR, WB, 129 등이, 또한 래트의 경우에는, 예를 들어, Low, Lewis, Spraque, Daweley, ACI, BN, Fischer 등을 사용할 수 있다. 이들의 마우스 및 래트는 예를 들어 닛폰 쿠레아, 닛폰 챨스리버, 닛폰 SLC, The Jackson Laboratories 등 실험 동물 사육 판매업자로부터 입수할 수 있다. 이 중, 후술하는 골수종 세포와의 융합 적합성을 감안하면, 마우스에서 는 BALB/c 계통이, 래트에서는 low 계통이 피면역 동물로서 특히 바람직하다. 또한, 항원의 인간과 마우스에서의 상동성을 고려하여, 자기 항체를 제거하는 생체 기구를 저하시킨 마우스, 즉 자기 면역 질환 마우스를 사용하는 것도 바람직하다. 또, 이들 마우스 또는 래트의 면역시의 주령은, 바람직하게는 5 ～ 12 주령, 더욱 바람직하게는 6 ～ 8 주령이다.
DC-STAMP 또는 이 재조합체에 의해 동물을 면역시키는 데에는, 예를 들어, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol.Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) 등에 자세하게 기재되어 있는 공지된 방법을 사용할 수 있다. 이들의 면역법 중, 이 발명에 있어서 바람직한 방법을 구체적으로 나타내면, 예를 들어 이하와 같다. 즉, 우선, 항원인 막단백 획분, 혹은 항원을 발현시킨 세포를 동물의 피내 또는 복강내에 투여한다. 단, 면역 효율을 높이기 위해서는 양자의 병용이 바람직하고, 전반은 피내 투여를 실시하고, 후반 또는 최종회만 복강내 투여를 실시하면, 특히 면역 효율을 높일 수 있다. 항원의 투여 스케줄은, 피면역 동물의 종류, 개체차 등에 따라 상이하지만, 일반적으로는, 항원 투여 회수 3 ～ 6 회, 투여 간격 2 ～ 6 주일이 바람직하고, 투여 회수 3 ～ 4 회, 투여 간격 2 ～ 4 주일이 더욱 바람직하다. 투여 회수를 과도하게 늘리면 항원을 낭비하고, 또한 투여 간격을 지나치게 넓히면 동물의 노화에 의한 세포의 저활성화를 초래하기 때문에 바람직하지 않다. 또한, 항원의 투여량은, 동물의 종류, 개체차 등에 의 해 상이하지만, 일반적으로는, 0.05 ～ 5㎖, 바람직하게는 0.1 ～ 0.5㎖ 정도로 한다. 추가 면역은, 이상과 같이 항원 투여의 1 ～ 6 주일 후, 바람직하게는 2 ～ 4 주일 후, 더욱 바람직하게는 2 ～ 3 주일 후에 실시한다. 이 추가 면역의 시기가 6 주일째보다 늦거나, 혹은 1 주일째보다 지나치게 빠르면 추가 면역의 효과가 적다. 또, 추가 면역을 실시할 때의 항원 투여량은, 동물의 종류, 크기 등에 의해 상이하지만, 일반적으로, 예를 들어 마우스의 경우에는, 0.05 ～ 5㎖, 바람직하게는 0.1 ～ 0.5㎖, 더욱 바람직하게는 0.1 ～ 0.2㎖ 정도로 한다. 불필요한 대량 투여는 면역 효과를 저하시킬 뿐만 아니라 피면역 동물에 있어서도 바람직하지 않다.
상기 추가 면역으로부터 1 ～ 10 일 후, 바람직하게는 2 ～ 5 일 후, 더욱 바람직하게는 2 ～ 3 일 후에 피면역 동물로부터 항체 생성 세포를 포함하는 췌장 세포 또는 림프구를 무균적으로 취출한다. 또, 그 때에 항체값을 측정하여, 항체값이 충분히 높아진 동물을 항체 생성 세포의 공급원으로서 사용하면, 이후의 조작 효율을 높일 수 있다.
여기서 사용되는 항체값의 측정법으로서는, RIA 법, ELISA 법, 형광 항체법, 수신(受身) 혈구 응집 반응법 등 각종 공지 기술을 들 수 있지만, 검출 감도, 신속성, 정확성, 및 조작의 자동화 가능성 등의 관점에서, RIA 법 또는 ELISA 법이 보다 바람직하하다.
본 발명에 있어서의 항체값의 측정은, 예를 들어 ELISA 법에 의하면, 이하에 기재하는 바와 같은 순서에 의해 실시할 수 있다. 우선, 정제 또는 부분 정제 한 항원을 ELISA 용 96 웰 플레이트 등의 고상 표면에 흡착시키고, 또한 항원이 흡착하고 있지 않는 고상 표면을 항원과 무관한 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민 (이하 「BSA」 라고 한다) 에 의해 덮고, 그 표면을 세정한 후, 제1 항체로서 단계 희석한 시료 (예를 들어 마우스 혈청) 에 접촉시켜, 상기 항원에 시료 중의 모노클로날 항체를 결합시킨다. 또한 제2 항체로서 효소 표지된 마우스 항체에 대한 항체를 첨가하여, 마우스 항체에 결합시키고, 세정한 후 그 효소의 기질을 첨가하여, 기질 분해에 기초하는 발색에 의한 흡광도의 변화 등을 측정함으로써, 항체값을 산출한다.
이들의 췌장 세포 또는 림프구로부터의 항체 생성 세포의 분리는, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler et al., Nature, (1975) 256, 495 ; Kohler et al., Eur. J. Immnol., (1977) 6,511, ; Milstein et al., Nature, (1977) 266, 550 ; Walsh. Nature, (1977) 266, 495) 에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 췌장 세포의 경우에는, 세포를 가늘게 절단하여 스테인레스 메시에서 여과시킨 후, 이글 최소 필수 배지 (MEM) 에 부유시켜 항체 생성 세포를 분리하는 일반적 방법을 채용할 수 있다.
(c) 골수종 세포 (이하, 「골수종」 라고 한다) 의 조제
세포 융합에 사용하는 골수종 세포에는 특별한 제한은 없고, 공지된 세포주로부터 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 단, 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택할 때의 편리성을 고려하여, 그 선택 수속이 확립되어 있는 HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) 결손주를 사용하는 것이 바람 직하다. 즉, 마우스 유래의 X63-Ag8 (X63), NS1-Ag4/1 (NS1), P3X63-Ag8.Ul (P3Ul), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO, BU.1 등, 래트 유래의 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) 등, 인간 유래의 U266AR (SK0-007), GM1500?GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR/NIP4-1 (NP41) 등이다. 이들의 HGPRT 결손주는 예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) 등으로부터 입수할 수 있다.
이들의 세포주는, 적당한 배지, 예를 들어 8-아자구아닌 배지 [RPMI-1640 배지에 글루타민, 2-메르캅토에탄올, 겐타마이신, 및 소태아 혈청 (이하 「FCS」 라고 한다) 을 첨가한 배지에 8-아자구아닌을 첨가한 배지], 이스코브 개변 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium ; 이하 「IMDM」 이라고 한다), 또는 둘베코 개변 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium ; 이하 「DMEM」 이라고 한다) 에서 계대 배양 하지만, 세포 융합의 3 내지 4 일전에 정상 배지 [예를 들어, 10% FCS 를 함유하는 ASF104 배지 (아지노모토 주식회사 제조)] 에서 계대 배양시켜, 융합 당일에 2 × 107 이상의 세포수를 확보하여 둔다.
(d) 세포 융합
항체 생성 세포와 골수종 세포의 융합은, 공지된 방법 (Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol.Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E.A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) 등) 에 따라, 세포의 생존율을 극도로 저하시키지 않는 정도의 조건 하에서 적절하게 실시할 수 있다. 그러한 방법은, 예를 들어, 폴리에틸렌?글리콜 등의 고농도 폴리머 용액 중에서 항체 생성 세포와 골수종 세포를 혼합하는 화학적 방법, 전기적 자극을 사용하는 물리적 방법 등을 사용할 수 있다. 이 중, 상기 화학적 방법의 구체적인 예를 나타내면 이하와 같다. 즉, 고농도 폴리머 용액으로서 폴리에틸렌?글리콜을 사용하는 경우에는, 분자량 1500 ～ 6000, 바람직하게는 2000 ～ 4000 의 폴리에틸렌?글리콜 용액 중에서, 30 ～ 40℃, 바람직하게는 35 ～ 38℃ 의 온도에서 항체 생성 세포와 골수종 세포를 1 ～ 10 분간, 바람직하게는 5 ～ 8 분간 혼합한다.
(e) 하이브리도마군의 선택
상기 세포 융합에 의해 얻어지는 하이브리도마의 선택 방법은 특별히 제한되지 않지만, 통상 HAT (히포크산틴?아미노브테린?티미딘) 선택법 (Kohler et al., Nature, 256, 495 (1975) ; Milstein at. al., Nature 266, 550 (1977)〕이 사용된다. 이 방법은, 아미노브테린에서 생존 할 수 없는 HGPRT 결손주의 골수종 세포를 사용하여 하이브리도마를 얻는 경우에 유효하다. 즉, 미융합 세포 및 하이브리도마를 HAT 배지에서 배양함으로써, 아미노브테린에 대한 내성을 가진 하이브리도마만을 선택적으로 잔존시키고, 또한 증식시킬 수 있다.
(f) 단일 세포 클론에 대한 분할 (클로닝)
하이브리도마의 클로닝법으로서는, 예를 들어 메틸셀룰로오스법, 연(軟)아가로스법, 한계 희석법 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다〔예를 들어 Barbara, B. M. and Stanley, M. S. : Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980) 참조〕. 이 클로닝법으로서는, 플레이트의 1 웰에 1 개의 하이브리도마가 포함되도록 희석하여 배양시키는 한계 희석법, 연한천 배지 중에서 배양시켜 콜로니를 회수하는 연한천법, 마이크로머뉴피레이타에 의해서 1 개씩 세포를 꺼내어 배양시키는 방법, 셀 소터에 의해 1 개의 세포를 분리하는 「소터 클론」 등을 들 수 있다. 이들 방법 중, 특히 한계 희석법이 바람직하다. 이 방법에서는, 마이크로 플레이트에 래트 태아 유래 섬유아세포주, 혹은 정상 마우스 췌장 세포, 흉선 세포, 복수 세포 등의 피더 (feeder) 를 접종하여 둔다. 한편, 미리 하이브리도마를 0.2 ～ 0.5개/0.2㎖ 가 되도록 배지 속에서 희석하고, 이 희석한 하이브리도마의 부유액을 각 웰에 0.1㎖ 씩 넣고, 일정 기간마다 (예를 들어 3 일마다) 약 1/3 의 배지를 새로운 것으로 교환하면서 2 주일 정도 배양을 계속함으로써 하이브리도마의 클론을 증식시킬 수 있다.
항체값이 확정된 웰에 대해서, 예를 들어 한계 희석법에 의한 클로닝을 2 ～ 4 회 반복, 안정적으로 항체값이 확정된 것을 항 DC-STAMP 모노클로날 항체 생성 하이브리도마주로서 선택한다.
(g) 하이브리도마 배양에 의한 모노클로날 항체의 조제
이와 같이 하여 선택된 하이브리도마는, 이것을 배양함으로써, 모노클로날 항체를 효율적으로 얻을 수 있지만, 배양에 앞서, 목적으로 하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 스크리닝하는 것이 바람직하다. 이 스크리닝에는 그 자체 기존의 방법을 채용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 항체값의 측정은, 예를 들어 ELISA 법에 의하면, 이하에 기재하는 바와 같은 순서에 의해 실시할 수 있다. 우선, 정제 또는 부분 정제한 DC-STAMP, 혹은 DC-STAMP 를 발현시킨 세포를 ELISA 용 96 웰 플레이트 등의 고상 표면에 흡착시키고, 또한 항원이 흡착하지 않은 고상 표면을 항원과 무관한 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민 (이하 「BSA」 라고 한다) 에 의해 덮고, 그 표면을 세정한 후, 제1 항체로서 단계 희석한 시료 (예를 들어 하이브리도마의 배양상청) 에 접촉시켜, 상기 항원에 시료 중의 항 DC-STAMP 항체를 결합시킨다. 또한 제2 항체로서 효소 표지 된 마우스 항체에 대한 항체를 첨가하여 마우스 항체에 결합시키고, 세정한 후 그 효소의 기질을 첨가하여, 기질 분해에 기초하는 발색에 의한 흡광도의 변화 등을 측정함으로써, 항체값을 산출한다. 또, 이러한 스크리닝은, 상기한 바와 같이 하이브리도마를 클로닝한 다음에 실시해도 되고, 그 전에 실시해도 된다.
이상과 같은 방법에 따라 얻은 하이브드마는, 액체 질소 중 또는 -80℃ 이하의 냉동고 중에 동결 상태로 보존할 수 있다.
클로닝을 완료한 하이브리도마는, 배지를 HT 배지로부터 정상 배지로 바꾸어 배양된다. 대량 배양은, 대형 배양병을 사용한 회전 배양, 혹은 스피너 배양에 의해 실시된다. 이 대량 배양에 있어서의 상청을, 겔 여과 등, 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 정제함으로써, 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 또한, 동일 계통의 마우스 (예를 들어, 상기 BALB/c), 혹은 Nu/Nu 마우스의 복강내에 하이브리도마를 주사하고, 그 하이브리도 마를 증식시킴으로써, 본 발명의 모노클로날 항체를 대량으로 함유하는 복수를 얻을 수 있다. 복강내에 투여하는 경우에는, 사전 (3 ～ 7 일전) 에 2,6,10,14- 테트라메틸펜타데칸 (2,6,10,14-tetramethyl pentadecane) (프리스턴) 등의 광물유를 투여하면, 보다 다량의 복수가 얻어진다. 예를 들어, 하이브리도마와 동일 계통의 마우스의 복강내에 미리 면역 억제제를 주사하여, T 세포를 불활성화시킨 후, 20 일 후에 106 ～ 107 개의 하이브리도마?클론 세포를 혈청을 함유하지 않는 배양기 중에 부유 (0.5㎖) 시켜 복강내에 투여하여, 통상 복부가 팽만하고, 복수에 고인 곳으로부터 마우스로부터 복수를 채취한다. 이 방법에 의해, 배양액 중에 비해 약 100 배 이상의 농도의 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.
상기 방법에 의해 얻은 모노클로날 항체는, 예를 들어 Weir, D. M. : Handbook of Experimental Immunology Vol.Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978) 에 기재되어 있는 방법에 의해 정제할 수 있다. 즉, 유안(硫安) 염석법, 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피법, 어피니티 크로마토그래피법 등이다. 이들의 방법 중, 유안 염석법을 3 ～ 4 회, 바람직하게는 3 ～ 6회 반복함으로써, 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 그러나 이 방법에서는 정제 모노클로날 항체의 수율이 매우 낮아진다. 그 때문에, 유안 분획법을 1 ～ 2 회 실시한 조(粗)정제 모노클로날 항체에 대하여, 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피법, 어피니티 크로마토그래피법 등에서 선택된 적어도 1 종류, 바람직하게는 2 종류의 방법을 실시함으로써, 고순도로 정제된 모노클로날 항체를 고수율로 얻을 수 있다. 유안 염석법과 다른 법의 조합 및 순서로서는, (i) 유안 염석법-이온 교환 크로마토그래피법-겔 여과법, (ⅱ) 유안 염석법-이온 교환 크로마토그래피법-어피니티 크로마토그래피법, (ⅲ) 유안 염석법-겔 여과법-어피니티 크로마토그래피법 등을 예시할 수 있지만, 고순도로 또한 고수율로 모노클로날 항체를 얻기 위해서는, 상기 (ⅲ) 의 편성이 특히 바람직하다.
정제의 간편한 방법으로서는, 시판되는 모노클로날 항체 정제키트 (예를 들어, MAbTrap GⅡ 키트 ; 파르마시아사 제조) 등을 사용할 수도 있다.
이렇게 해서 얻어지는 모노클로날 항체는, DC-STAMP 에 대하여 높은 항원 특이성을 갖는다.
(h) 모노클로날 항체의 검정
이렇게 하여 얻어진 모노클로날 항체의 아이소타이프 및 서브 클래스의 결정은 이하와 같이 실시할 수 있다. 우선, 분류법으로서는 오우쿠텔로니 (Ouchterlony) 법, ELISA 법, 또는 RIA 법을 들 수 있다. 오우크텔로니법은 간편한 것은 아니지만, 모노클로날 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축 조작이 필요하다. 한편, ELISA 법 또는 RIA 법을 사용한 경우에는, 배양 상청을 그대로 항원 흡착 고상과 반응시키고, 또한 제２ 차 항체로서 각종 임뮤노글로블린아이소타이프, 서브 클래스에 대응되는 항체를 사용함으로써, 모노클로날 항체의 아이소타이프, 서브 클래스를 동정할 수 있다. 또한, 더욱 간편한 방법으로서 시판되는 분류용 키트 (예를 들어, 마우스 타이퍼 키트 ; 바이오랏드사 제조) 등을 사용할 수도 있다.
또한 단백질의 정량은, 포린로우리법, 및 280㎚ 에 있어서의 흡광도 [1.4 (OD280) = 임뮤노글로블린 1㎎/㎖] 로부터 산출하는 방법에 의해 실시할 수 있다.
(3) 인간화 항 DC-STAMP 항체의 제작
면역 글로블린 G (이하, 단순하게 「IgG」 라고 한다.) 는, 분자량 약 23000 의 경폴리펩티드 사슬 (이하 「경쇄」 라고 한다.), 분자량 약 50000 의 중폴리펩티드 사슬 (이하 「중쇄」 라고 한다.) 각 2 개씩으로 된다. 중쇄, 경쇄 모두 약 110 잔기로 이루어지는, 아미노산 서열이 보존되어 있는 영역의 반복 구조를 갖고, 이들은 IgG 의 3 차원 구조의 기본 단위 (이하, 「도메인」 이라고 한다.) 를 구성한다. 중쇄 및 경쇄는, 각각 연속된 4 개, 및 2 개의 도메인으로 구성되어 있다. 중쇄, 경쇄 어느 쪽에 있어서도, 아미노 말단의 도메인은 다른 도메인에 비해 각 항체 분자 사이에서의 아미노산 서열의 변이가 크고, 이 도메인은 가변 도메인 (variable domain : 이하, 「V 도메인」 이라고 한다.) 이라고 불린다. IgG 의 아미노 말단에 있어서는, 중쇄, 경쇄의 V 도메인이 상보적으로 회합하여 가변 영역을 형성하고 있다. 이것에 반하여, 잔여 도메인은, 전체적으로 정상 영역을 형성한다. 정상 영역은, 각 동물 종에 특징적인 서열을 갖고, 예를 들어, 마우스 IgG 의 정상 영역은 인간 IgG 의 정상 영역과는 상이하므로, 마우스 IgG 는 인간의 면역계에 의해서 이물로서 인식되고, 그 결과, 인간 항마우스 항체 (Human Anti Mouse Antibody : 이하 「HAMA」 라고 한다.) 응답이 일어난다 (슈롭 등, Cancer Res., (1985) 45, 879-85). 따라서, 마우스 항체는 인간에 반복 투여할 수 없다. 이러한 항체를 인간에 투여하기 위해서는, 항체의 특이성을 보관 유 지한 채로 HAMA 응답을 일으키지 않도록 항체 분자를 수식할 필요가 있다.
X 선 결정 구조 해석의 결과에 의하면, 일반적으로, 이러한 도메인은 3 개 내지 5 개의 β 쇄로 이루어지는 역평행 β 시트가 2 층 서로 겹쳐진 타원 통 형상의 구조를 갖는다. 가변 영역에서는, 중쇄, 경쇄의 V 도메인 각각에 있어서 각 3 개의 루프가 집합하여, 항원 결합 부위를 형성한다. 이 각 루프는 상보성 결정 영역 (complementarity determining region : 이하, 「CDR」 이라고 한다.) 이라고로 불리우며, 아미노산 서열의 변이가 가장 현저하다. 가변 영역의 CDR 이외의 부분은, 일반적으로, CDR 의 구조를 보관 유지하는 역할을 갖고, 「프레임워크」 라고 불린다. 카바트 등은, 중쇄, 경쇄의 가변 영역 중 1 차 서열을 다수 수집하고, 서열의 보존성에 기초하여, 각각의 1 차 서열을 CDR 및 프레임 워크로 분류한 표를 작성하였다. (카바트 등, SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E. A. Kabatt et al.). 또한, 각 프레임워크는, 아미노산 서열이 공통된 특징을 갖는 복수의 서브 그룹으로 분류되었다. 또한, 인간과 마우스 사이에서 대응되는 구성이 존재하는 것도 알아내었다.
이러한 IgG 의 구조적 특징에 관한 연구로부터 이하의 인간화 항체의 제작법이 고안되었다.
연구 초기 단계에서는, 마우스 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합된 키메라 항체가 제안되었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 참조). 그러나, 그러한 키메라 항체는, 여전히, 많은 비인 간 아미노산 잔기를 함유하므로, 특히 장기간 투여한 경우에는 HAMA 응답을 유도할 수 있다 (Begent et al., Br. J. Cancer, (1990) 62, 487).
인간에 대하여 HAMA 응답을 발현할 가능성이 있는, 비인간 포유 동물 유래의 아미노산 잔기를 더욱 적게 하는 방법으로서 CDR 부분만을 인간 유래의 항체에 주입하는 방법이 제안되었지만 (Nature, 321, 522-525, (1986) 참조), 일반적으로, 항원에 대한 면역 글로블린 활성을 보관 유지하는 데에는 CDR 만의 이식으로는 불충분하였다.
한편, 쳐치아 등은, 1987 년, X 선 결정 구조 해석 데이터를 사용하여,
(a) CDR 의 아미노산 서열 중에는, 항원에 직접 결합하는 부위와 CDR 자체의 구조를 유지하는 부위가 존재하고, CDR 이 취할 수 있는 3 차원 구조는, 복수의 전형적인 패턴 (캐노니컬 구조) 으로 분류되는 것,
(b) 캐노니컬 구조의 클래스는, CDR 뿐만 아니라 프레임워크 부분의 특정 위치의 아미노산의 종류에 의해 결정되는 것을 찾아냈다 (J. Mol. Biol., (1987) 196, 901-917).
이 지견에 기초하여, CDR 이식법을 사용하는 경우, CDR 의 서열에 더하여 일부 프레임워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식할 필요성이 시사되었다 (일본 공표특허공보 평4-502408호 참조).
일반적으로, 이식해야 할 CDR 를 갖는 비인간 포유 동물 유래의 항체는 「도너」, CDR 이 이식되는 측의 인간 항체는 「억셉터」 라고 정의되지만, 본 발명도 이 정의에 따르는 것으로 한다.
CDR 이식법을 실시할 때에 고려해야 할 점은, 가능한 한 CDR 의 구조를 보존하고, 면역 글로블린 분자의 활성을 보관 유지하는 것에 있다. 이 목적을 달성하기 위해서 :
(a) 억셉터는, 어느 서브 그룹에 속하는 것을 선택해야 할 것인가 ;
(b) 도너의 구성으로부터 어느 아미노산 잔기를 선택해야 할 것인가
의 2 점에 유의할 필요가 있다.
퀸 등은, 도너의 프레임워크의 아미노산 잔기가, 이하의 기준 중 적어도 하나에 해당하는 경우, CDR 서열과 함께 억셉터에 이식하는 디자인 방법을 제창하였다 (일본 공표특허공보 평4-502408호 참조) :
(a) 억셉터의 프레임워크 영역 중의 아미노산이 그 위치에 있어서 드물고, 도너의 대응하는 아미노산이 억셉터의 상기 위치에 있어서 보통이다.
(b) 그 아미노산이 CDR 중 하나의 바로 근처이다.
(c) 그 아미노산이 3 차원 면역 글로불린 모델에 있어서 CDR 의 약 3Å 이내에 측쇄 원자를 갖고, 그리고 항원과 또는 인간화 항체의 CDR 과 상호 작용할 수 있다고 예상된다.
본 발명의 항 DC-STAMP 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코드하는 DNA 는, 상기 항 DC-STAMP 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA 를 조제하고, 그 mRNA 를 역전사 효소에 의해 cDNA 로 변환하고 나서, 그 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코드하는 DNA 를 각각 단리함으로써 얻어진다.
mRNA 의 추출에 있어서는, 구아니딘?티오시아네이트?핫?페놀법, 구아니딘 ?티오시아네이트구아니딘?염산법 등도 채용할 수 있지만, 구아니딘?티오시아네이트?염화세슘법이 매우 바람직하다. 세포로부터의 mRNA 의 조제는, 우선 전체 RNA 를 조제하고, 그 전체 RNA 로부터 올리고 (dT) 셀룰로오스나 올리고 (dT) 라텍스비즈 등의 폴리 (A)+RNA 정제용 담체를 사용하여 정제하는 방법, 또는 세포 라이세이트로부터 그 담체를 사용하여 직접 정제하는 방법에 의해 실시할 수 있다. 전체 RNA 의 조제방법으로서는, 알칼리 자당 밀도 구배 원심 분리법 (Dougherty, W. G. and Hiebert, E., Viology, (1980) 101, 466-474), 구아니딘티오시아네이트?페놀법, 구아니딘티오시아네이트?트리플루오로세슘법, 페놀?SDS 법 등도 채용할 수 있지만, 구아니딘티오시아네이트 및 염화세슘을 사용하는 방법 (Chirgwin, J. M., et al., (1979) Biochemistry, (1979) 18, 5294-5299) 이 바람직하다.
상기와 같이 하여 얻어진 폴리 (A)+RNA 를 주형으로 하여, 역전사 효소 반응에 의해 1 본 쇄 cDNA 를 합성한 후, 이 1 본 쇄 cDNA 로부터 2 본 쇄 cDNA 를 합성할 수 있다. 이 방법으로서는 S1 뉴클레아제법 (Efstratiadis A., et al., Cell, (1976) 7, 279-288), 구블러 호프만법 (Gubler, U. and Hoffman, B. J., Gene, (1983) 25, 263-269), 오카야마 버그법 (Okayama, H. and Berg, P., Mol. Cell. Biol., (1982) 2, 161-170) 등을 채용할 수 있지만, 본 발명에 있어서는, 1 본 쇄 cDNA 를 주형으로 하여 폴리머라아제연쇄 반응 (이하 「PCR」 이라고 한다) (Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, 487-49) 을 실시하는, 이른바 RT-PCR 법이 바람직하다.
이와 같이 하여 얻어진 2 본 쇄 cDNA 를 클로닝 벡터에 삽입하고, 얻어진 재조합 벡터를 대장균 등의 미생물에 도입하여 형질 전환시키고, 테트라사이클린 내성 혹은 암피실린 내성 등을 지표로 하여 형질 전환체를 선택할 수 있다. 대장균의 형질 전환은, 하나한법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., (1983) 166, 557-580), 즉 염화칼슘이나 염화마그네슘 또는 염화루비듐을 공존시켜 조제한 컨피턴트 세포에, 그 재조합 DNA 벡터를 첨가하는 방법에 의해 실시할 수 있다. 또, 벡터로서 플라스미드를 사용하는 경우에는, 상기 약제내성 유전자를 갖는 것이 필요하다. 또한, 플라스미드 이외의 클로닝벡터, 예를 들어 람다계의 살균 바이러스 등을 사용할 수도 있다.
상기에 의해 얻어진 형질 전환주로부터, 목적으로 하는 항 DC-STAMP 모노클로날 항체의 각 서브 유닛을 코드하는 cDNA 를 갖는 주를 선택하는 방법으로서는, 예를 들어 이하에 나타내는 각종 방법을 채용할 수 있다. 또, 상기 RT-PCR 법에 의해 목적으로 하는 cDNA 를 특이적으로 증폭한 경우에는, 이들의 조작을 생략할 수 있다.
(3-1) 폴리머라아제연쇄 반응을 사용하는 방법
목적 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부가 해명되고 있는 경우, 그 아미노산 서열의 일부에 대응하는 센스 스트랜드와 안티센스 스트랜드의 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 합성하고, 이들을 조합하여 폴리머라아제연쇄 반응 (Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, 487-49) 를 실시하여, 목적으로 하는 항 DC-STAMP 항체 중쇄 혹은 경쇄 서브 유닛을 코드하는 DNA 단편을 증폭시킨다. 여 기서 사용하는 주형 DNA 로서는, 예를 들어 항 DC-STAMP 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마의 mRNA 로부터 역전사 효소 반응으로 합성한 cDNA 를 사용할 수 있다.
이와 같이 하여 조제한 DNA 단편은, 시판되는 키트 등을 사용하여 직접 플라스미드 벡터에 삽입할 수도 있고, 그 단편을 32P, 35S 혹은 비오틴 등으로 표지하고, 이것을 프로브로서 사용하여 콜로니 하이브리다이제이션 또는 플라크 하이브리다이제이션을 실시함으로써 목적으로 하는 클론을 선택할 수도 있다.
예를 들어, 본 발명의 항 DC-STAMP 모노클로날 항체의 각 서브 유닛의 부분 아미노산 서열을 조사하는 방법으로서는, 전기 영동이나 칼럼 크로마토그래피 등의 주지의 방법을 사용하여 각 서브 유닛을 단리하고 나서, 자동 프로테인시크엔서 (예를 들어, 시마즈 제작소 주식회사 제조 PPSQ-10) 등을 사용하여 각각의 서브 유닛의 N 말단 아미노산 서열을 해석하는 방법이 바람직하다.
상기와 같이 하여 얻어진 목적으로 하는 형질 전환주로부터, 항 DC-STAMP 모노클로날 항체 단백질의 각 서브 유닛을 코드하는 cDNA 를 채취하는 방법은, 공지된 방법 (Maniatis, T., et al. (1982) in "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY.) 에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어 세포로부터 벡터 DNA 에 상당하는 획분을 분리하고, 그 플라스미드 DNA 로부터 목적으로 하는 서브 유닛을 코드하는 DNA 영역을 잘라냄으로써 실시할 수 있다.
(3-2) 합성 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용하는 스크리닝법
목적 단백질의 아미노산 서열의 전부 또는 일부가 해명되어 있는 경우 (그 서열은, 복수 개 연속된 특이적 서열이면, 목적 단백질의 어느 영역의 것이라도 된다), 그 아미노산 서열에 대응하는 올리고 뉴클레오티드를 합성하여 (이 경우, 코돈 사용 빈도를 참고로 추측되는 뉴클레오티드 서열, 또는 생각되는 뉴클레오티드 서열을 조합한 복수 개의 뉴클레오티드 서열을 모두 채용할 수 있고, 또한 후자의 경우 이노신을 포함시켜 그 종류를 줄일 수도 있다), 이것을 프로브 (32P, 35S 혹은 비오틴 등으로 표지한다) 로, 형질 전환주의 DNA 를 변성 고정시킨 니트로셀룰로오스 필터와 하이브리다이즈시켜, 얻어진 포지티프 주를 선별한다.
이와 같이 하여 얻어지는 DNA 서열의 결정은, 예를 들어 맥샘 길버트의 화학 수식법 (Maxam, A. M. and Gilbert, W., Methods in Enzy㏖ogy, (1980) 65, 499-576) 이나 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법 (Messing, J. and Vieira. J., Gene (1982) 19, 269-276) 등에 의해 실시할 수 있다.
또한 최근, 형광 색소를 사용한 자동 염기 서열 결정 시스템이 보급되어 있다 (예를 들어 파킨에르머재팬사 제조 시퀀스 로보트 "CATALYST 800" 및 모델 373A DNA 시크엔사 등).
이러한 시스템을 사용함으로써, DNA 뉴클레오티드 서열 결정 조작을 능률적, 또한 안전하게 실시할 수도 있다. 이와 같이 하여 결정된 본 발명의 DNA 의 각 뉴클레오티드 서열, 및 중쇄 및 경쇄의 각 N 말단 아미노산 서열 데이터로부터, 본 발명의 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 전체 아미노산 서열을 결정할 수 있다.
임뮤노글로블린의 중쇄 및 경쇄는, 모두 가변 영역 및 정상 영역으로 이루어지고, 가변 영역은 또한 상보성 결정 영역 (이하 「CDR」 이라고 한다 ; 중쇄?경쇄 모두 각 3 곳) 및 그들에 인접하는 프레임워크 영역 (중쇄?경쇄 모두 각 4 곳) 으로 이루어진다.
이 중, 정상 영역의 아미노산 서열은, 항원의 종류에 관계없이, 임뮤노글로블린 서브 클래스가 동일한 항체 사이에서는 공통된다. 한편, 가변 영역, 특히 CDR 의 아미노산 서열은 각 항체에 고유한 것이지만, 수많은 항체의 아미노산 서열 데이터를 비교한 연구에 의하면, CDR 의 위치나 구성 서열의 길이는, 동일한 서브 그룹에 속하는 항체 유닛 사이에서는 거의 유사한 있는 것이 알려져 있다 (Kabat, E. A., et al., in "Sequence of Proteins of Immunological Interest Vol.Ⅱ" : U.S. Department of Health and Human Services, (1991)). 따라서, 예를 들어 항 DC-STAMP 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 각 아미노산 서열과 그들 공지된 아미노산 서열 데이터를 비교함으로써, 각 아미노산 서열에 있어서의 CDR 이나 프레임워크 영역 및 정상 영역의 위치를 결정할 수 있다. 또, FRH1, 즉 중쇄의 가장 N 말단측의 프레임워크 영역의 사슬 길이에 대해서는, 통상 (30 아미노산) 보다 짧은 경우가 있고, 예를 들어, 그 프레임워크 영역이 최소 18 아미노산인 예 등이 알려져 있다 (전출 Kabat et al.). 이 점에서 본 발명의 항체에 있어서는, 항 DC-STAMP 항체로서의 기능을 해치지 않는 한에서, 중쇄의 N 말단의 프레임워크 영역의 사슬 길이를 18 아미노산 이상 30 아미노산 이하로 하지만, 바람직하게는 30 아미노산이다.
또, 상기와 같이 하여 결정된 경쇄 또는 중쇄의 각각 CDR 과 동일한 아미노산 서열, 혹은 그 중의 연속된 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드를, 인위적인 수식 조작을 행하여 그 CDR 이 항 DC-STAMP 항체 분자 중에서 형성되는 입체 구조에 근접함으로써, 단독으로 DC-STAMP 에 대한 결합 활성을 부여하게 할 수 있다 [예를 들어, 미국 특허 제5331573호 참조]. 따라서, 그와 같이 수식된, CDR 과 동일한 아미노산 서열, 혹은 그 중의 연속된 부분 아미노산 서열을 갖는 펩티드도, 본 발명의 분자에 포함된다.
아미노산 서열 중의 임의의 한 개 혹은 두 개 이상의 아미노산을 결실시킨 개변체를 제작함에 있어서는, 카셋트 변이법 (키시모토 토시미츠, “신생 화학 실험 강좌 2?핵산 Ⅲ 재조합 DNA 기술" 242-251 참조) 등을 따를 수 있다.
이와 같은 각종 DNA 는, 예를 들어 포스파이트?트리에스테르법 (Hunkapiller, M., et al., Nature (1984) 310, 105-111) 등의 통상적인 방법에 따라, 핵산의 화학 합성에 의해 제조할 수도 있다. 또, 목적으로 하는 아미노산에 대한 코돈은, 그 자체가 공지된 것이며, 그 선택도 임의로 되고, 예를 들어 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도를 고려하여 통상적인 방법에 따라 결정할 수도 있다. 이들 뉴클레오티드 서열 코돈의 일부 개변은, 통상적인 방법에 따라, 목적으로 하는 개변을 코드하는 합성 올리고 뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머를 사용한 부위 특이적 변이 도입법 (사이토스페시픽?뮤타제네시스) (Mark, D. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984)81, 5662-5666) 등에 따를 수 있다.
또한, 어느 DNA 가 본 발명의 항 DC-STAMP 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코드하는 DNA 와 하이브리다이즈하는지의 여부는, 예를 들어, 그 DNA 를, 랜덤 프라이머법 (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B., Anal. biochem., (1983) 132, 6-13) 이나 닉 트랜스레이션법 (Maniatis, T., et al., in "Molecular Cloning A laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1982)) 등에 따라 [α - 32P] dCTP 등으로 표지한 프로브 DNA 를 사용하여, 이하에 기재하는 바와 같은 실험을 실시함으로써 조사할 수 있다.
우선 조사하려고 하는 DNA 를, 예를 들어 니트로셀룰로오스 막이나 나일론 막 등에 흡착시켜, 필요에 따라 알칼리 변성 등의 처리를 실시하고 나서, 가열 혹은 자외선 등에 의해 고상화시킨다. 이 막을, 6 × SSC (1 × SSC 는 0.15M 염화나트륨, 0.015M 시트르산 3 나트륨 용액) 와 5% 덴하트 용액, 0.1% 도데실황산나트륨 (SDS) 을 함유하는 프레하이브리다이제이션 용액에 침지시켜, 55℃ 에서 4 시간 이상 보온하고 나서, 먼저 조제한 프로브를 동일한 프레하이브리다이제이션 용액에 최종 비(比)활성 1 × 106cpm/㎖ 가 되도록 첨가하여, 60℃ 에서 하룻밤 보온한다. 그 후, 막을 실온 하에서 6 × SSC 로 5 분간 세정하는 조작을 몇 차례 반복하고, 추가로 2 × SSC 로 20 분간 세정하고 나서, 오토라디오그래피를 실시한다.
상기와 같은 방법을 사용하여, 임의의 cDNA 라이브러리 또는 게놈라이브러리로부터, 본 발명의 인간화 항 DC-STAMP 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코드하는 DNA 와 하이브리다이즈하는 DNA 를 단리시킬 수 있다 (Maniatis. T., et al., in "Molecular Cloning A laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory. NY., (1982)).
상기와 같이 하여 얻어지는 각 DNA 를, 각각 발현 벡터에 주입함으로써, 원핵 생물 또는 진핵 생물의 숙주 세포에 도입하고, 그들의 숙주 세포에 의해 각 유전자를 발현시키는 것이 가능하다. 발현 방법은 상기 「6. 항 DC-STAMP 항체의 제조」 항의 「(1) 항원의 조제」 의 항에 기재한 방법과 동일한 방법에 의해 실시할 수 있다.
형질 전환체의 세포 내 또는 세포 외에 생산되는, 항 DC-STAMP 항체 단백질을 함유하는 획분은, 그 단백질의 물리적 성질이나 화학적 성질 등을 이용한 각종 공지된 단백질 분리 조작법에 의해, 분리?정제할 수 있다. 이러한 방법으로서는, 구체적으로는 예를 들어 통상의 단백질 침전제에 의한 처리, 한외 여과, 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등의 각종 크로마토그래피, 투석법, 및 이들의 조합 등을 채용할 수 있다.
항 DC-STAMP 마우스 모노클로날 항체를 인간화하기 위해서는, 결정된 CDR 서열 전체 및 FR 서열 중 일부의 아미노산 잔기를 인간 항체에 이식하도록, 가변 영역의 아미노산 서열을 설계할 필요가 있다. 이 설계는, 이하의 방법에 따른다.
종래, 인간화의 디자인을 실시하는 경우, 억셉터의 서브 그룹의 선택 지침으로서는, (a) 천연의 아미노산 서열을 갖는 공지된 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 천연 의 조합을 전부 그대로 사용한다,
(b) 중쇄, 경쇄가 속하는 서브 그룹으로서의 조합은 보존하지만, 중쇄, 경쇄로서는, 각각 상이한 인간 항체에 유래하고, 도너의 중쇄, 경쇄의 아미노산 서열과 동일성이 높은 아미노산 서열, 또는, 컨센선스 서열을 사용하는 것 중 어느 하나가 선택되어 있다. 본 발명에 있어서도, 상기 지침에 따를 수 있지만, 이들과 상이한 방법으로서,
(c) 서브 그룹의 조합을 고려하지 않고, 도너의 FR 과 가장 동일성이 높은 중쇄, 경쇄의 FR 을 인간 항체의 1 차 서열의 라이브러리 중에서 선택한다,
라는 방법을 채용할 수도 있다. 이들의 선택법에 의해, 도너 및 억셉터 사이에서의, FR 부분의 아미노산의 동일성을 적어도 70% 이상으로 하는 것이 가능해진다. 이 방법을 채용함으로써, 도너로부터 이식하는 아미노산 잔기의 수를 보다 줄일 수 있게 되고, HAMA 응답 유도를 감소시킬 수 있다.
또한, 항체 분자의 1 차 서열로부터 3 차 구조를 예측하는 조작 (이하, 이 조작을 「분자 모델링」 이라고 한다) 은 그 예측 정밀도에 한계가 있어, 그 도너가 속하는 서브 그룹에 있어서 좀처럼 출현하지 않는 아미노산 잔기의 역할을 충분하게 특정할 수 없다. 퀸 등의 방법에 따라, 이러한 위치에 있어서 도너, 억셉터 중 어느 아미노산 잔기를 선택할 것인가를 판단하는 것은 일반적으로 곤란하다. (c) 의 선택법에 의하면, 이러한 판단을 할 기회를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명자 등은, 도너의 CDR 의 구조 및 기능을 유지하기 위해서 중요한 도너의 FR 유래의 아미노산을 분류하기 위한 신규 방법을 제공함으로써, 이 인간화 방법을 더욱 개량하고 있다.
경쇄, 중쇄 각각의 인간 억셉터 분자가 선택된 후, 도너의 FR 로부터 이식하는 아미노산 잔기를 선택하는 방법은, 이하에 기재하는 바와 같다.
도너와 억셉터의 아미노산 서열을 늘어놓고, 양자의 FR 의 대응하는 위치에서 아미노산 잔기가 상이한 경우, 어느 쪽의 잔기를 선택할 것인가를 결정할 필요가 있지만, 이 선택에 있어서는, 도너 유래의 CDR 의 3 차원 구조를 해치지 않도록 선택을 실시할 필요가 있다.
퀸 등은 전술한 일본 공표특허공보 평4-502408호에 있어서, FR 상의 아미노산 잔기가, 이하의 요건 중 적어도 하나에 해당하는 경우, CDR 서열과 함께 억셉터에 이식하는 방법을 제창하였다 :
1) 억셉터의 인간 FR 영역 중의 아미노산이 그 위치에 있어서 드물고, 도너의 대응하는 아미노산이 억셉터의 상기 위치에 있어서 보통이다 ;
2) 그 아미노산이 CDR 중 하나의 바로 근처이다;
3) 그 아미노산이 3 차원 면역 글로블린 모델에 있어서 CDR 의 약 3Å 이내에 측쇄 원자를 갖고, 그리고 항원과 또는 인간화 항체의 CDR 과 상호 작용할 수 있다고 예상된다.
여기서 2) 로 나타내어진 잔기는 자주 3) 의 성질을 나타냄으로써, 본 발명에서는 이 2) 의 요건을 삭제하고, 별도로 새롭게 2 종의 요건을 마련한다. 즉, 본 발명에서는, CDR 과 함께 이식해야 할 도너의 FR 상의 아미노산 잔기에 대해서는 :
a) 억셉터의 FR 중의 아미노산이 그 위치에 있어서 드물고 도너의 대응하는 아미노산이 당해 위치에 있어서 보통이거나 ;
b) 그 아미노산이 3 차원 구조 모델에 있어서, CDR 의 구성 아미노산 원자와 항원 또는 이식해야 할 CDR 루프의 상호 작용이 예상되거나 ;
c) 당해 위치가 캐노니컬클래스 결정 잔기이거나 ;
d) 당해 위치가 중쇄와 경쇄의 접촉면을 구성하는지,
인 경우에, 도너의 FR 로부터 당해 아미노산 잔기를 이식하기로 한다.
a) 의 요건에서는, 전술한 카바트의 표에 따라, 동일 서브 클래스의 항체에 대해서 당해 위치에서 90% 이상의 빈도로 발견되는 아미노산을 「보통」, 10% 미만의 빈도로 발견되는 아미노산을 「희박」 이라고 정의한다.
c) 의 요건에서는, 「당해 위치가 캐노니컬클래스 결정 잔기인지」 아닌지에 대해서는, 전술한 쳐치아의 표에 따라, 일의적으로 결정할 수 있다.
b), d) 의 요건에 대해서는, 미리 항체 가변 영역의 분자 모델링이 필요하다. 분자 모델링용 소프트웨어로서는, 시판되는 것이면 어느 것이라도 채용할 수 있지만, 바람직하게는, AbM (옥스포드?몰레큘러?리미티드사 제조) 을 사용할 수 있다.
분자 모델링의 예측 정밀도에는 일정한 한계가 있으므로, 본 발명에 있어서는, 각종 항체의 가변 영역의 X 선 결정 해석의 실험 결과를 참조함으로써, 분자 모델링으로부터 얻어지는 구조 예측의 확실함을 2 단계로 구별한다.
본 발명에 있어서는, AbM 등의 분자 모델링용 소프트웨어에 의해 구축된 곳 의 가변 영역의 3 차원 구조에 있어서, 2 원자 간의 거리가, 각각의 반데르발스 반경의 합에 0.5Å 를 더한 값보다 짧을 경우, 당해 2 원자 간은 반데르발스 접촉하고 있다고 추정하였다. 주쇄 및 측쇄의 아미드 질소, 카르보닐 산소 등 극성의 원자간 거리가 평균의 수소 결합 거리인 2.9Å 에 0.5Å 더한 거리보다 짧은 경우에는, 그 사이에 수소 결합이 존재한다고 추정하였다. 또한 상반되는 전가(電價)를 갖는 원자 사이가, 2.85Å 에 0.5Å 더한 거리보다 짧은 경우에는, 그 사이에 이온 쌍이 형성되어 있는 것이라고 추정하였다.
한편, 각종 항체의 가변 영역의 X 선 결정 구조 해석의 실험 결과로부터, 서브 그룹과 관계없이, 고빈도로 CDR 와의 접촉이 발견되는 FR 상의 위치로서, 경쇄에서는, l, 2, 3, 4, 5, 23, 35, 36, 46, 48, 49, 58, 69, 71, 88 번의 위치, 중쇄에서는, 2, 4, 27, 28, 29, 30, 36, 38, 46, 47, 48, 49, 66, 67, 69, 71, 73, 78, 92, 93, 94, 103 번의 위치가 특정된다 (숫자는 모두 전출 카바트 등의 문헌에 있어서 정의되는 아미노산 번호를 나타낸다. 이하에서 동일). 분자 모델링과 동일한 기준을 적용한 경우, 이들 위치의 아미노산 잔기는, 공지된 항체 가변 영역의 3 분의 2 에 있어서 COR 의 아미노산 잔기와의 접촉이 인정된다. 이들의 지견에 기초하여, b) 의 「그 아미노산이 3 차원 구조 모델에 있어서, CDR 의 구성 아미노산 원자가 항원 또는 이식해야 할 CDR 루프와의 상호 작용이 예상된다」 란, 이하의 요건을 의미한다.
분자 모델링에 있어서, FR 과 CDR 의 접촉 가능성이 예견된 FR 의 위치가, X 선 결정 해석에 의해 실험적으로 FR 과 CDR 의 접촉이 고빈도로 검출되는 위치 중 어느 한 쪽에 일치하는 경우에는, 도너의 아미노산 잔기의 이식을 우선한다.
그 이외의 경우에는, 이 요건 b) 는 고려하지 않는다.
d) 의 「당해 위치가 중쇄와 경쇄의 접촉면을 구성한다」 란, 이하의 요건을 의미한다. 각종 항체의 가변 영역의 X 선 결정 해석의 실험 결과로부터, 경쇄 에 있어서는, 36, 38, 43, 44, 46, 49, 87, 98 번째의 아미노산 잔기, 중쇄에 있어서는, 37, 39, 45, 47, 91, 103, 104 번째의 아미노산 잔기가, 고빈도로 중쇄-경쇄간 접촉을 하는 것이 인정되어 있다. 분자 모델링에 있어서, 중쇄-경쇄간 접촉의 가능성이 예견되고, 그 위치가 상기에서 설명한 위치 중 어느 한 쪽에 일치하는 경우에는, 도너의 아미노산 잔기의 이식을 우선한다. 그 이외의 경우에는, 이 요건 d) 는 고려하지 않는다.
본 발명의 인간화 항 DC-STAMP 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA 는, 이하에 기재하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
예를 들어, 60 내지 70 뉴클레오티드의, 그 DNA 의 부분 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 복수의 폴리뉴클레오티드 단편을, 센스측 및 안티센스측에 있어서 서로 상이하도록 화학 합성하고, 그 후 각 폴리뉴클레오티드 단편을 어닐링하여, DNA 리가제에 의해 결합하여, 목적으로 하는 인간화 항 DC-STAMP 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA 를 갖는 DNA 를 얻을 수 있다.
다른 방법으로서, 억셉터의 가변 영역의 전체 아미노산 서열을 코드하는 D NA 를 인간 림프구로부터 분리하고, CDR 을 코드하는 영역에 당업자가 주지된 방법에 의해 뉴클레오티드 치환을 실시함으로써, 제한 효소 절단 서열을 도입한다. 대 응하는 제한 효소로 그 영역을 절단한 후, 도너의 CDR 을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 합성하고, DNA 리가제에 의해 결합하여, 목적으로 하는 인간화 항 DC-STAMP 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA 를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명에서는, 바람직하게는 이하에 기술하는 오버랩?익스텐션?PCR 법 (호르톤 등, Gene, 77, 61-68, (1989) 참조) 에 따라, 목적으로 하는 인간화 항 DC-STAMP 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA 를 얻을 수 있다.
즉, 접속을 목적으로 하는 2 종의 아미노산 서열을 각각 코드하는 2 종의 DNA 를, 편의적으로 (A) 및 (B) 로 한다. (A) 의 5' 측에 어닐하는 20 내지 40 뉴클레오티드의 센스 프라이머 (이하, 이 프라이머를 (C) 로 한다.) 및 (B) 의 3' 측에 어닐하는 20 내지 40 뉴클레오티드의 안티센스 프라이머 (이하, 이 프라이머를 (D) 로 한다) 를 화학 합성한다. 또한, (A) 의 3' 측의 20 내지 30 뉴클레오티드와 (B) 의 5' 측 20 내지 30 뉴클레오티드를 연결한, 키메라형의 센스 프라이머 (이하, 이 프라이머를 (E) 라고 한다) 및 이것에 상보적인 안티센스 프라이머 (이하, 이 프라이머를 (F) 라고 한다) 를 합성한다. (A) 를 함유하는 적당한 벡터 DNA 를 기질로 하여, 센스 프라이머 (C) 및 키메라형 안티센스 프라이머 (F) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, (A) 의 3' 말단에 (B) 의 5' 말단측 20 내지 30 뉴클레오티드가 부가된 DNA 를 얻을 수 있다 (이 새롭게 얻어진 DNA 를 (G) 로 한다). 마찬가지로, (B) 를 함유하는 적당한 벡터 DNA 를 기질로 하여, 안티센스 프라이머 (D) 및 키메라형 센스 프라이머 (E) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, (B) 의 5' 말단에 (A) 의 3' 말단측 20 내지 30 뉴클레오티드가 부가된 DNA 를 얻을 수 있다 (이 새롭게 얻어진 DNA 를 (H) 로 한다). 이와 같이 하여 얻어진 (G) 와 (H) 는, (G) 의 3' 측 40 내지 60 뉴클레오티드와 (H) 의 5' 측 40 내지 60 뉴클레오티드에 있어서 상보적인 뉴클레오티드 서열을 유지하고 있다. 증폭된 (G) 및 (H) 를 혼합하여 PCR 을 실시한 경우, 1 회째의 변성 반응에서 (G) 와 (H) 는 1 본쇄가 되고, 그 후의 어닐링 반응에 의해 대부분의 DNA 는 원래대로 돌아가지만, 일부의 DNA 에 대해서는 상보적 뉴클레오티드 서열 영역에서 어닐링하는 헤테로 DNA 2 본쇄를 형성한다. 그 후의 신장 반응에 의해, 돌출된 1 본쇄 부분이 수복되어, (A) 와 (B) 가 연결된 키메라형의 DNA (이하, 이 DNA 를 (I) 로 한다.) 를 얻을 수 있다. 또한 이 (I) 을 기질로 하여, 센스 프라이머 (C) 와 안티센스 프라이머 (D) 를 사용하여 PCR 을 실시함으로써, (I) 을 증폭시킬 수 있다. 본 발명에서는, 항 인간 DC-STAMP 마우스 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 코드하는 DNA 및 인간 면역 글로블린 IgG 의 FR 영역을 코드하는 DNA, 또한, 인간 면역 글로블린 IgG 의 분비 시그널을 코드하는 DNA 를, 각각 케이스?바이?케이스에 의해 (A) 및 (B) 로 하여 상기 연결 반응을 실시할 수 있다.
또, 소망하는 아미노산에 대한 코돈은, 그 자체가 공지된 것이고, 그 선택도 임의적이며, 예를 들어 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도를 고려하여 통상적인 방법에 따라 결정할 수 있다. 이들 뉴클레오티드 서열 코돈의 일부 개변은, 통상적인 방법에 따라, 소망하는 개변을 코드하는 합성 올리고 뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머를 사용한 사이트스페시픽?뮤타제네시스 (site specific mutagenesis) (Mark, D. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1984) 81, 5662-5666) 등에 따를 수 있다. 따라서, 각 프라이머를 화학 합성할 때에, 미리 점 돌연변이를 도입하도록 각 프라이머를 설계함으로써, 소망하는 항 DC-STAMP 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코드하는 DNA 를 얻을 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 본 발명의 각 DNA 를 각각 발현 벡터에 삽입함으로써, 원핵 생물 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킬 수 있다. 또한 이들 벡터에 적당한 프로모터 및 형질 발현에 관련되는 서열을 도입함으로써, 각각의 숙주 세포에 있어서 각 유전자를 발현시킬 수 있다.
상기 방법에 의해, 용이하게 고수율, 고순도로 재조합 항 DC-STAMP 항체를 제조할 수 있다.
(4) 항 DC-STAMP 완전 인간 항체의 제작
완전 인간 항체란, 인간 염색체 유래의 항체의 유전자 서열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 DC-STAMP 완전 인간 항체, 인간 항체의 H 쇄와 L 쇄의 유전자를 함유하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 생성 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977) 16, 133-143 ; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res., (1998) 26, 3447-3448 ; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects, (1999) 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers ; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000) 97, 722-727) 이나, 인간 항체 라이브러리에서 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002) 43 (7), 2301-8 ; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2), 189-203 ; Siriwardena, D. et. al., Opthalmology, (2002) 109 (3), 427-431 등) 에 의해서 취득할 수 있다.
이와 같이 하여 제작되는 인간 항 DC-STAMP 항체가 DC-STAMP 와 특이적으로 결합하는 것을 확인하는 방법으로서는, 예를 들어, 마우스 면역시에 항체값의 평가를 실시하는 경우와 동일한 ELISA 법이 바람직하다.
7. 항 DC-STAMP 항체를 함유하는 의약
상기에서 설명한 「6. 항 DC-STAMP 항체의 제조」 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 항 DC-STAMP 항체 중에서, DC-STAMP 의 생물 활성을 중화하는 항체를 얻을 수 있다. 이들 DC-STAMP 의 생물 활성을 중화하는 항체는, 생체 내에서의 DC-STAMP 의 생물 활성, 즉, 파골 세포의 분화 및/또는 성숙화를 저해함으로써, 의약으로서, 파골 세포의 분화 이상에 기인하는 골 대사 이상증에 대한 치료제로서 사용할 수 있다.
in vitro 에서의 항 DC-STAMP 항체에 의한 DC-STAMP 의 생물 활성의 중화 활성은 예를 들어, DC-STAMP 를 과잉 발현하고 있는 세포에 있어서의 세포의 파골 세포에 대한 분화의 억제활성으로 측정할 수 있다. 예를 들어, DC-STAMP 를 과잉 발현하고 있는 마우스 단구 유래 세포주 RAW264.7 세포, RAW264 세포 또는 RAW-D 세포를 배양시켜, 배양계에 각 최종 농도로 항 DC-STAMP 항체를 첨가하여, RANKL 및 TNF-α 자극에 의한, 파골 세포에 대한 분화의 억제활성을 측정할 수 있다. 또한, 골수 유래의 초대 배양 세포에 각 최종 농도로 항 DC-STAMP 항체를 첨가하여, RANKL 및 TNF-α 자극에 의한, 파골 세포에 대한 분화의 억제활성을 측정할 수 있다. 또한 대퇴골 및/또는 경골 유래의 세포를 사용한 핏트 분석 (Takada et al., Bone and Mineral, (1992) 17, 347-359) 실험에 있어서, 대퇴골 및/또는 경골 유래의 세포에 각최종 농도로 항 DC-STAMP 항체를 첨가하여 상아 절편 상의 피트의 형성을 관찰함으로써 파골 세포의 골 흡수 활성의 억제활성을 측정할 수 있다. in vivo 에서의 실험 동물을 이용한 항 DC-STAMP 항체의 골 대사 이상에 대한 치료 효과는, 예를 들어, DC-STAMP 를 과잉으로 발현하고 있는 트랜스제닉 동물에 항 DC-STAMP 항체를 투여하여, 파골 세포의 변화를 측정함으로써 확인할 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 DC-STAMP 의 생물 활성을 중화하는 항체는, 의약으로서, 특히 골다공증, 관절 류머티즘, 암성 고칼슘 혈증 등의 골 대사 이상에 기인하여 일어나는 질환의 치료를 목적으로 한 의약 조성물로서, 혹은 이러한 질환의 면역학적 진단을 위한 항체로서 유용하다.
항 DC-STAMP 항체는, 하나의 예로서는, 골 대사 이상증의 치료에 대해서는 그 항체 단독으로, 혹은 적어도 하나의 뼈에 관한 질환의 치료제와 함께 투여할 수 있다. 또 하나의 예로서, 항 DC-STAMP 항체는 치료상 유효한 양의 항골 대사 이상 치료약제와 함께 투여할 수 있다. 항 DC-STAMP 항체와 함께 투여할 수 있는 치료제로서는, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D3, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬 제제, SERMs (Selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K2 (메나테트레논) 및 칼슘 제제등을 들 수가 있지만 이들에 한정되지 않는다. 골 대사 이상 상태나 어느 정도의 치료를 목표로 하는지에 따라서, 2, 3 혹은 그 이상의 종류의 약제를 투여할 수도 있고, 그들의 약제는 동일한 제제중에 봉입함으로써 함께 공급할 수 있다. 그들의 약제와 항 DC-STAMP 항체는 동일한 제제중에 봉입함으로써 함께 공급할 수도 있다. 또한, 그들의 약제는 치료용 키트로 하여 봉입함으로써 함께 공급할 수도 있다. 또한, 그들의 약제와 항 DC-STAMP 항체는 따로따로 공급할 수 있다. 유전자 치료에 의해서 투여하는 경우에는, 단백질성 골 질환 치료제의 유전자와 항 DC-STAMP 항체의 유전자는, 동시에 혹은 따로따로 동일한 프로모터 영역의 하류에 삽입할 수 있어, 각각의 혹은, 동일한 벡터에 도입할 수 있다.
항 DC-STAMP 항체, 혹은 그 프래그먼트에 대하여 골 질환 치료제를 결합시킴으로써, M. C. Garnet 「Targeted drug conjugates : principles and progress」, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216 기재의 표적형 약물 복합체를 제조할 수 있다. 이 목적에는, 항체 분자 이외에, 파골 세포의 인식성을 완전 소실되어 있지 않는 한, 어느 항체 프래그먼트도 적용할 수 있는데, 예를 들어, Fab, F (ab') 2, Fv 등의 프래그먼트를 예로서 들 수 있고, 본 발명에 있어서도 마찬가지로, 항체 및 그 프래그먼트를 사용할 수 있다. 항 DC-STAMP 항체 또는 그 항체의 프래그먼트와 골 질환 치료제의 결합 양식은, M. C. Garnet 「Targeted drug conjugates : principles and progress」, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G. T. Hermanson 「Bioconjugate Techniques」 Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」 Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 등에 기재되는 각종 형태가 있을 수 있다. 즉, 항 DC-STAMP 항체와 골 질환 치료제가 화학적으로 직접 혹은 올리고 펩티드 등의 스페이서가 개재하여 결합되는 양식이나, 적당한 약물 담체를 개재하여 결합되는 양식을 들 수 있다. 약물 담체의 예로서는, 리포솜이나 수용성 고분자를 들 수 있다. 이들 약물 담체가 개재되는 양식으로서는, 보다 구체적으로는, 항체와 골 질환 치료제가 리포솜에 포함되고, 그 리포솜과 항체가 결합한 양식, 및, 골 질환 치료제가 수용성 고분자 (분자량 1000 내지 10 만 정도의 화합물) 에 화학적으로 직접 혹은 올리고 펩티드 등의 스페이서를 개재시켜 결합되고, 그 수용성 고분자에 항체가 결합한 양식을 예로서 들 수 있다. 항체 (또는 그 프래그먼트) 와 골 질환 치료제, 리포솜 및 수용성 고분자 등의 약물 담체의 결합은, G. T. Hermanson 「Bioconjugate Techniques」 Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」 Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 에 기재된 방법 등의 당업자에게 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 골 질환 치료제의 리포솜에 대한 포함은, D. D. Lasic 「Liposomes : From Physics to Applications」, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1993) 등에 기재된 방법 등의 당업자에게 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 골 질환 치료제의 수용성 고분자에 대한 결합은, D. Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」 Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 기재된 방법 등의 당업자에게 주지된 방법에 의해, 실시할 수 있다. 항체 (또는 그 프래그먼트) 와 단백질성 골 질환 치료제(또는 그 프래그먼트) 의 복합체는, 상기 방법 이외에, 유전자 공학적으로, 당업자에게 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다.
본 발명은, 치료에 유효한 양의 항 DC-STAMP 항체와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 포함하는 의약 조성물도 제공한다.
본 발명은, 치료에 유효한 양의 항 DC-STAMP 항체와 치료에 유효한 양의 적어도 하나의 골 질환 치료제와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 포함하는 의약 조성물도 제공한다. 골 질환, 치료제로서는, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D3, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬 제제, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K2 (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone) 제제, 비스테로이드성 항염증제, 항 TNFα 항체, 항 PTHrP (parathyroid hormine-related protein) 항체, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 RANKL 항체 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 의약 조성물에 있어서 허용되는 제제에 사용하는 물질로서는 바람직하게는 투여량이나 투여 농도에 있어서, 의약 조성물이 투여되는 인간에 대해서 비독성인 것이 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물은, pH, 침투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 색, 무균성, 안정성, 용해율, 서방률, 흡수율, 침투율을 바꾸거나, 유지하거나, 보관 유지하거나 하기 위한 제제용 물질을 함유할 수 있다. 제제용 물질로서 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다 : 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소, 트리스-염산 (Tris-Hcl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 2 당류 등의 다른 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염형성 쌍이온, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로렉시딘, 소르브산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌?글리콜 또는 폴리에틸렌?글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알코올, 현탁제, 소르비탄에스테르, 폴리소르비테이트 20 이나 폴리소르비테이트 80 등 폴리소르비테이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨이나 만니톨?소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 희석제, 부형제, 및/또는 약학 상의 보조제. 이들의 제제용 물질의 첨가량은, 항 DC-STAMP 항체의 중량에 대하여 0.01 ～ 100 배, 특히 0.1 ～ 10 배 첨가하는 것이 바 람직하다. 제제중의 바람직한 의약 조성물의 조성은 당업자에 의해서, 적용 질환, 적용 투여 경로 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.
의약 조성물중의 부형제나 담체는 액체라도 되고, 고체라도 된다. 적당한 부형제나 담체는 주사용 물이나 생리 식염수, 인공 뇌척수액이나 비경구 투여에 통상 사용되고 있는 다른 물질이라도 된다. 중성의 생리 식염수나 혈청 알부민을 함유하는 생리 식염수를 담체에 사용할 수도 있다. 의약 조성물에는 pH7.0- 8.5 의 Tris 버퍼나 pH4.0-5.5 의 아세트산 버퍼나 그들에 소르비톨이나 다른 화합물을 함유할 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물에는 항 DC-STAMP 항체를 함유하는 의약 조성물 그리고, 항 DC-STAMP 항체 및 적어도 하나의 골 질환 치료제를 함유하는 의약 조성물을 들 수 있고, 본 발명의 의약 조성물은 선택된 조성에 의해 필요한 순도로 적당한 약제로서 동결 건조품 혹은 액체로서 준비된다. 항 DC-STAMP 항체를 함유하는 의약 조성물 그리고, 항 DC-STAMP 항체 및 적어도 하나의 항골 대사 이상 치료약제를 함유하는 의약 조성물은 수크로오스와 같은 적당한 부형제를 사용한 동결 건조품으로서 성형될 수도 있다.
본 발명의 의약 조성물은 비경구 투여용으로 조제할 수도 있고, 경구에 의한 소화관 흡수용으로 조제할 수도 있다. 제제의 조성 및 농도는 투여 방법에 의해서 결정할 수 있고, 본 발명의 의약 조성물에 함유되는, 항 DC-STAMP 항체의 DC-STAMP 에 대한 친화성, 즉, DC-STAMP 에 대한 해리 정수 (Kd 값) 에 대하여, 친화성이 높을 (Kd 값이 낮다) 수록, 인간에 대한 투여량을 적게 하여 약효를 발휘할 수 있기 때문에, 이 결과에 기초하여 본 발명의 의약 조성물의 인간에 대한 투여량 을 결정할 수도 있다. 투여량은, 인간형 항 DC-STAMP 항체를 인간에 대해서 투여할 때에는, 약 0.1 ～ 100㎎/㎏ 을 1 ～ 30 일 사이에 1 회 투여하면 된다.
본 발명의 의약 조성물의 형태로서는, 점적을 포함하는 주사제, 좌제, 경비제, 설하제, 경피 흡수제등을 들 수 있다.
8. 직접 상호 작용하는 물질의 탐색
본 발명의 다른 하나의 양태로서는, DC-STAMP 의 활동을 억제하는 것과 같은 물질을 얻는 것을 목적으로 한, 그 단백질의 입체 구조를 베이스로 한 드러그 디자인 수법을 포함한다. 이러한 수법은, 래셔널 드러그 디자인법으로서 알려져 있고, 효소 활성 등의 기능이나, 리간드, 코팩터, 또는 DNA 에 대한 결합 등을 효율적으로 저해 혹은 활성화시키는 것과 같은 화합물의 탐색에 이용되고 있다. 이 예로서 이미 출시되고 있는 항 HIV 제인 프로테아제의 저해제가 잘 알려져 있다. 본 발명의 DC-STAMP 의 3 차원 구조 해석에 있어서도, X 선 결정 해석이나 핵자기공명법이라고 하는 일반적으로 잘 알려져 있는 수법을 이용할 수 있다고 생각된다. 또한 DC-STAMP 의 기능을 억제하는 물질의 탐색에는, 컴퓨터 드러그 디자인 (CADD) 을 활용한 설계도 할 수 있다. 이 예로서는, 관절 류머티즘 치료의 새로운 게놈 신약으로서 기대되고 있는 AP-1 의 기능을 저해하는 저분자 화합물 (국제특허 출원 공개 W099/58515호) 등이 알려져 있다. 이러한 방법에 의해, DC-STAMP 에 직접 결합하거나, 혹은 DC-STAMP 와 다른 인자의 상호 작용을 저해함으로써, DC-STAMP 의 기능을 억제하는 것과 같은 물질을 얻을 수 있다.
또한, 다른 하나의 양태는, 본 발명의 DC-STAMP 가 회합하는 폴리펩티드, 즉 DC-STAMP 의 파트너 단백질에 관한 것이다. 즉, 본 발명은, DC-STAMP 의 활성을 조절하는 파트너 단백질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
이 스크리닝 방법 중 하나의 양태는, DC-STAMP 에 피험 단백질 시료를 접촉시켜, DC-STAMP 에 결합하는 단백질을 선택하는 공정을 포함한다. 이러한 방법으로서는, 예를 들어, 정제한 DC-STAMP 를 사용하여, 이것에 결합하는 단백질의 어피니티 정제를 실시하는 방법을 들 수 있다. 구체적인 방법의 일례를 나타내면, DC-STAMP 에 히스티딘 6 개로 이루어지는 서열을 어피니티 태그로서 융합한 것을 제작하여, 이것을 세포의 추출액 (미리 니켈-아가로스 칼럼에 차지하여, 이 칼럼을 통과한 획분) 과 4℃ 에서 12 시간 인큐베이트 하고, 이어서, 이 혼합물에 별도로 니켈-아가로스 담체를 첨가하여 4℃ 에서 1 시간 인큐베이트한다. 니켈-아가로스 담체를 세정 버퍼로 충분히 세정한 후, 100mM 이미다졸을 첨가함으로써, DC-STAMP 와 특이적으로 결합하는 세포 추출액 중의 단백질을 용출시켜 정제하여, 이 구조를 결정한다. 이와 같이 하여, DC-STAMP 와 직접 결합하는 단백질, 및 DC-STAMP 와의 결합 활성은 갖지 않지만, 서브 유닛으로서 DC-STAMP 에 직접 결합하는 단백질과 복합체를 형성함으로써 간접적으로 DC-STAMP 에 결합하는 단백질을 정제할 수 있다 (실험 의학 별책, 바이오 메뉴얼 시리즈 5 「전사 인자 연구법」 215-219 (요오도사 간행)).
다른 방법으로서는, 퍼웨스턴블롯법 (실험 의학 별책, 「신유전자 공학 핸드북」 76-81 (요오도사 간행)) 이나, 효모나 포유류 동물 세포를 사용한 투하이브리드 (hybrid) 시스템법 (실험 의학 별책, 「신유전자 공학 핸드북」 66-75 (요오도 사 간행), 「체크메이트?만마리안?투하이브리드 시스템」 (프로메가사 제조)) 에 의한 클로닝도 가능하지만, 이들의 방법에 한정되지 않는다.
이와 같이 하여, DC-STAMP 와 직접 혹은 간접적으로 상호 작용하는 파트너 단백질의 cDNA 가 얻어지면, DC-STAMP 와 그 파트너 단백질의 상호 작용을 저해하는 물질의 기능적 스크리닝에 이용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, DC-STAMP 와 글루타티온S-트랜스퍼라아제의 융합 단백질을 조제하여, 항글루타티온S-트랜스퍼라아제항체로 덮은 마이크로 플레이트에 결합시킨 후, 비오틴화한 그 파트너 단백질을 이 융합 단백질과 접촉시켜, 그 융합 단백질과의 결합을 스트렙토아비딘화 알칼리포스파타아제에 의해 검출한다. 비오틴화한 그 파트너 단백질 첨가시, 피험 물질도 첨가하여, 융합 단백질과 그 파트너 단백질의 결합을 촉진 혹은 저해하는 물질을 선택한다. 이 방법에서는, 융합 단백질에 직접 작용하는 물질 또는 그 파트너 단백질에 직접 작용하는 물질이 얻어진다.
융합 단백질과 그 파트너 단백질의 결합이 간접적이고, 어떠한 다른 인자를 개재하고 있는 것과 같은 경우에는, 예를 들어 그 인자를 함유하는 세포 추출액 존재 하에서, 동일하게 상기 어세이를 실시한다. 이 경우에는, 그 인자에 대해서 작용하는 것과 같은 물질도 선택될 가능성이 있다.
또한, 얻어진 파트너 단백질이, DC-STAMP 의 기능을 촉진시키는 활성을 갖고 있는 경우에는, 이미 기재한 DC-STAMP 유전자의 발현 벡터를 응용한 시험 방법에 따라, 골 대사 이상 치료제, 예를 들어, 골다공증의 치료제로서 유용한 후보 물질의 스크리닝을 실시할 수 있다. 또한, 얻어진 파트너 단백질이, DC-STAMP 의 기능을 억제하는 활성을 갖고 있는 경우에는, 이러한 억제인자를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드는, 골 대사 이상의 유전자 치료에 사용할 수 있다.
그러한 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 동정된 저해 인자의 아미노산 서열을 해석하여, 그 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 올리고 뉴클레오티드 프로브를 합성하여 cDNA 라이브러리이나 게놈 라이브러리의 스크리닝을 실시함으로써 취득할 수 있다. 또한, DC-STAMP 의 기능 저해 활성을 갖는 펩티드가, 랜덤하게 합성된 인공 펩티드 라이브러리 유래인 경우에는, 그 펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 DNA 를 화학 합성한다.
유전자 치료에 있어서는, 그와 같이 하여 얻어진 저해 인자를 코드하는 유전자를, 예를 들어 바이러스 벡터에 삽입하여, 그 재조합 바이러스 벡터를 갖는 바이러스 (무독화된 것) 를 환자에게 감염시킨다. 환자 체내에서는 항골 파괴 인자가 생성되어, 파골 세포의 분화 억제기능을 갖기 때문에, 골 대사 이상의 치료가 가능해진다.
유전자 치료제를 세포 내에 도입하는 방법으로서는, 바이러스 벡터를 사용한 유전자 도입 방법, 혹은 비바이러스성 유전자 도입 방법 (닛케이 사이언스, 1994년 4 월호, 20-45 페이지, 실험 의학 증간, 12 (15) (1994), 실험 의학 별책 「유전자 치료의 기초 기술」, 요오도사 (1996)) 중 어느 방법도 적용할 수 있다.
바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 방법으로서는, 예를 들어 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러 스, 폭스 바이러스, 폴리오 바이러스, 신피스 바이러스 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에, DC-STAMP 의 저해 인자 혹은 그 변이체를 코드하는 DNA 를 삽입하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 이 중, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아 바이러스를 사용한 방법이, 특히 바람직하다. 비바이러스성 유전자 도입 방법으로서는, 발현 플라스미드를 직접 근육 내에 투여하는 방법 (DNA 백신법), 리포솜법, 리포펙틴법, 마이크로인젝션법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션 등을 들 수 있고, 특히 DNA 백신법, 리포솜법이 바람직하다.
또한 유전자 치료제를 실제로 의약으로서 작용시키려면, DNA 를 직접 체내에 도입하는 인비보 (invivo) 법 및 인간으로부터 어느 종류의 세포를 꺼내어 체외에서 DNA 를 그 세포에 도입하고, 그 세포를 체내에 되돌리는 엑스 비보 (ex vivo) 법이 있다 (닛케이 사이언스, 1994 년 4 월호, 20-45 페이지, 월간 약사, 36 (1), 23-48 (1994), 실험 의학 증간, 12 (15) (1994)).
예를 들어, 그 유전자 치료제가 인비보법에 의해 투여되는 경우에는, 질환, 증상 등에 응해 정맥, 동맥, 피하, 피내, 근육 내 등, 적당한 투여 경로에 의해 투여된다. 또한 인 비보법에 의해 투여하는 경우에는, 그 유전자 치료제는 일반적으로는 주사제 등으로 할 수 있지만, 필요에 따라 관용의 담체를 첨가해도 된다. 또한, 리포솜 또는 막 융합 리포솜 (센다이 바이러스 리포솜 등) 의 형태로 한 경우에는, 현탁제, 동결제, 원심 분리 농축 동결제등의 리포솜 제제로할 수 있다.
서열표의 서열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 그 서열의 부분 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열은, 이른바 안티센스 치료에 사용할 수 있다. 안티센스 분자는, 서열표의 서열 번호 1, 3 및 5 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열에서 선택되는 뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적인, 통상 15 내지 30mer 로 이루어지는 DNA, 혹은 그 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 또는 모르폴리노 유도체 등의 안정된 DNA 유도체, 2'-O-알킬 RNA 등의 안정적인 RNA 유도체로서 사용할 수 있다. 그러한 안티센스 분자를, 미량 주입, 리포솜 캡슐화에 의해, 혹은 안티센스 서열을 갖는 벡터를 사용하여 발현시키는 등, 본 발명의 기술 분야에 있어서 주지의 방법에 의해, 세포에 도입할 수 있다. 이러한 안티센스 요법은, 서열표의 서열 번호 1 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열이 코드하는 단백질의 활성이 지나치게 증가함으로써 일어나는 병의 치료에 유용하다.
또한, 2 본 쇄의 단쇄 RNA (siRNA) 를 사용하는 방법도 들 수도 있다 (「진스?앤드?디벨럽먼트 (Genes and Developments)」), 2001 년 1 월 15 일, 제15 권, 제2 호, p.188-200). 예를 들어, DC-STAMP 유전자에 대한 siRNA 를 제작하고, 문헌 기재된 방법에 따라 도입함으로써, DC-STAMP 의 과잉 발현에 의해서 일어나는 골 대사 이상에 기인하는 질환의 치료제로 할 수 있다.
상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및/또는 siRNA 를 함유하는 의약으로서 유용한 조성물은, 의약으로서 허용할 수 있는 담체의 혼합 등의 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 함유하는 의약의 담체와 제조 방법의 예는, Applied Antisense Oligonucleotide Technology (1998 Wiley-Liss, Inc.) 에 기재되어 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및/또는 siRNA 를 함유하는 제제는, 그 자체 혹은 적절하게 약리학적으로 허용되는, 부형제, 희석제등과 혼합하여, 정제, 캡슐제, 과립제, 산제 혹은 시럽제 등에 의해 경구적으로, 또는, 주사제, 좌제, 첨부제, 혹은, 외용제등에 의해 비경구적으로 투여할 수 있다. 이들 제제는, 부형제(예를 들어, 젖당, 백설탕, 포도당, 만니톨, 소르비톨과 같은 당 유도체 ; 옥수수 전분, 감자 전분, α 전분, 덱스트린과 같은 전분 유도체 ; 결정 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체 ; 아라비안 검 ; 덱스트린 ; 풀루란과 같은 유기계 부형제; 및, 경질 무수규산, 합성 규산 알루미늄, 규산 칼슘, 메타 규산 알루민산 마그네슘과 같은 규산염 유도체 ; 인산 수소 칼슘과 같은 인산염 ; 탄산 칼슘과 같은 탄산염 ; 황산 칼슘과 같은 황산염 등의 무기계 부형제를 들 수 있다.), 활택제(예를 들어, 스테아르산, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘과 같은 스테아르산 금속염 ; 활석 ; 콜로이드 실리카 ; 비즈 왁스, 경랍과 같은 왁스류 ; 질산 ; 아디프산 ; 황산 나트륨과 같은 황산염 ; 글리콜 ; 푸마르산 ; 벤조산 나트륨 ; DL 류이신 ; 라우릴 황산 나트륨, 라우릴 황산 마그네슘과 같은 라우릴 황산염 ; 무수 규산, 규산 수화물과 같은 규산류 ; 및, 상기 전분 유도체를 들 수 있다.), 결합제(예를 들어, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 마크로골, 및, 상기 부형제와 같은 화합물을 들 수 있다.), 붕괴제(예를 들어, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘, 내부 가교 카르복시메틸셀룰로오스나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체 ; 카르복시메틸스타치, 카르복시메틸스타치나트륨, 가교 폴리비닐피롤리돈과 같은 화학 수식된 전분?셀룰로오스류를 들 수 있다.), 유화 제(예를 들어, 벤토나이트, 비검(bee gum)과 같은 콜로이드성 점토 ; 수산화 마그네슘, 수산화 알루미늄과 같은 금속 수산화물 ; 라우릴 황산 나트륨, 스테아르산 칼슘과 같은 음이온 계면활성제; 염화 벤즈알코늄과 같은 양이온 계면활성제; 및, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르와 같은 비이온 계면활성제를 들 수 있다.), 안정제(메틸파라벤, 프로필파라벤과 같은 파라옥시벤조산 에스테르류 ; 클로로부탄올, 벤질알코올, 페닐에틸알코올과 같은 알코올류 ; 염화 벤즈알코늄 ; 페놀, 크레졸과 같은 페놀류 ; 티메로살 ; 디히드로아세트산 ; 및, 소르브산을 들 수 있다.), 교미 교취제(예를 들어, 통상 사용되는, 감미료, 산미료, 향료 등을 들 수 있다.), 희석제등의 첨가제를 사용하여 주지의 방법에 의해 제조된다.
이들 의약을 환자에게 도입하는 방법에 대해서는, 상기에 더하여 콜로이드 분산계를 사용할 수 있다. 콜로이드 분산계는 화합물의 생체 내의 안정성을 높이는 효과나, 특정 장기, 조직 또는 세포에 화합물을 효율적으로 수송하는 효과가 기대된다. 콜로이드 분산계는, 통상 사용될 수 있는 것이면 한정되지 않지만, 고분자 복합체, 나노캡슐, 미크로스페어, 비즈, 및 수중 유계의 유화제, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질을 베이스로 하는 분산계를 들 수 있고, 바람직하게는, 특정 장기, 조직 또는 세포에 화합물을 효율적으로 수송하는 효과가 있는, 복수의 리포솜, 인공 막 소포인 (Mannino et al., Biotechniques, (1988) 6,682 ; Blume and Cevc, Biochem. et Biophys. Acta, (1990) 1029, 91 ; Lappalainen et al., Antiviral Res., (1994) 23, 119 ; Chonn and Cullis, Current Op. Biotech., (1995) 6, 698).
0.2-0.4㎛ 의 사이즈 범위를 취하는 단막 리포솜은, 거대 분자를 함유하는 수성 완충액의 상당한 비율을 피포화(被胞化)할 수 있고, 화합물은 이 수성 내막에 피포화 되어, 생물학적으로 활성인 형태로 뇌세포에 수송된다 (Fraley et al., Trends Biochem. Sci., (1981) 6, 77). 리포솜의 조성은, 통상, 지질, 특히 인 지질, 특히 상전이 온도가 높은 인 지질을 1 종 또는 그 이상의 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 통상 복합한 것이다. 리포솜 생산에 유용한 지질의 예는, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 스핑고 지질, 포스파티딜에탄올아민, 세레브로시드 및 갱글리오사이드와 같은 포스파디딜 화합물을 포함한다. 특히 유용한 것은 디아실포스파티딜글리세롤이며, 여기에서는 지질 부분이 14-18 의 탄소 원자, 특히 16-18 의 탄소 원자를 함유하고, 포화하고 있다 (14-18 의 탄소 원자쇄의 내부에 이중 결합이 결여되어 있다). 대표적인 인 지질은, 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디스테아로일포스파티딜콜린을 포함한다.
리포솜을 포함하는 콜로이드 분산계의 표적화는, 수동적 또는 능동적 중 어느 것이라도 된다. 수동적인 표적화는, 동양 모세 혈관을 포함하는 장기의 망내계 세포로 분포하려고 하는 리포솜 본래의 경향을 이용함으로써 달성된다. 한편, 능동적인 표적화는, 예를 들어, 바이러스의 단백질 코트 (Mori shita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1993) 90, 8474), 모노클로날 항체 (또는 그 적절한 결합 부분), 당, 당 지질 또는 단백질 (또는 그 적절한 올리고 펩티드 프래그먼트) 과 같은 특정의 리간드를 리포솜에 결합시키는 것, 또는 천연에 존재하는 국 재 부 위 이외의 장기 및 세포형에 대한 분포를 달성하기 위해서 리포솜의 조성을 바꿈으로써 리포솜을 수식하는 수법 등을 들 수 있다. 표적화된 콜로이드 분산계의 표면은 각종 방식으로 수식될 수 있다. 리포솜에 의해 표적된 딜리버리 시스템에서는, 지질 2 중 층과의 긴밀한 회합에 있어서 표적 리간드를 유지하기 위해서, 리포솜의 지질 2 중 층에 지질기가 삽입될 수 있다. 지질쇄를 표적 리간드와 연결시키기 위해서 여러 연결기가 사용될 수 있다. 본 발명의 올리고 뉴클레오티드의 딜리버리가 소망하는 세포 상에 지배적으로 발견되는 특정의 세포 표면 분자에 결합하는 표적 리간드는, 예를 들어, (1) 딜리버리가 소망하는 세포에 의해서 지배적으로 발현되는 특정 세포 수용체와 결합하고 있는, 호르몬, 성장 인자 또는 그 적절한 올리고 펩티드 프래그먼트, 또는 (2) 표적 세포 상에서 지배적으로 발견되는 항원성 에피토프와 특이적으로 결합하는, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 또는 그 적절한 프래그먼트 (예를 들어, Fab ; F (ab') 2) 일 수 있다. 2 종 또는 그 이상의 생물 활성제는, 단일한 리포솜 내부에서 복합하여, 투여할 수도 있다. 내용물의 세포 내 안정성 및/또는 표적화를 높이는 약제를 콜로이드 분산계에 추가할 수도 있다.
그 사용량은 증상, 연령 등에 따라 상이하지만, 경구 투여의 경우에는, 1 회당 하한 1㎎ (바람직하게는, 30㎎), 상한 2000㎎ (바람직하게는, 1500㎎) 을, 주사의 경우에는, 1 회당 하한 0.1㎎ (바람직하게는, 5㎎), 상한 1000㎎ (바람직하게는, 500㎎) 을 피하 주사, 근육 주사 또는 정맥 주사에 의해 투여할 수 있다.
이하, 실시예를 나타내어 이 발명을 상세하고 구체적으로 설명하지만, 본 발 명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」 (Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press 로부터 1989 년에 발간) 에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는, 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 사용하였다.
[참고예 1] RAW-D 세포 및 RAW-N 세포의 수립
a) 한계 희석 배양법에 의한 RAW-D 세포 및 RAW-N 세포의 취득
마우스 단구 유래 세포주 RAW264.7 을 가용성 RANKL 로 자극하면, 타르타르산 내성 산포스파타아제(이하 「TRAP」 이라고 한다) 나 카텝신 K 등의 파골 세포 분화 마커의 유전자 발현이 강하게 유도되는 것이 알려져 있다 (Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1999) 96, 3540-3545). 따라서, RAW264.7 세포는 RANKL 로 자극함으로써, 파골 세포로 분화 유도될 수 있다고 생각되고 있다. 그래서, RAW264.7 세포의 친주인 RAW264 세포로부터, RANKL 및 TNF-α 에 대한 감수성이 보다 강한, 즉 이들의 자극에 의해 파골 세포로 분화하기 쉬운 서브 클론 세포의 취득을 시도하였다 (Watanabe et al., J. Endocrinol., (2004) 180, 193-201). 또, RAW264 세포는 European Collection of Cell Culture 로부터 구입할 수 있다 (Catalog No.85062803). RAW264 세포를 10% 소태아 혈청을 함유하는α-MEM 배지를 사용하여, 통상적인 방법에 따라 한계 희석하여 96 웰 플레이트에 100㎕ 파종하였다. 10 ～ 14 일간 배양시켜, 형성된 콜로니를 채취하였다. 각 콜로니에 대하여 10% 소태아 혈청을 함유하는 α-MEM 배지에서 4.5 × 104세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트에 웰 당 150㎕ 씩 뿌려, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20ng/㎖ 및 인간 TNF-α (페프로테크사 제조) 를 최종 농도 1ng/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 3 일간 배양시킨 후, Leukocyte Acid Phosphatase kit (시그마사 제조) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 TRAP 염색을 실시하여, TRAP 양성 다핵 파골 세포 형성의 유무를 확인하였다. 이 일련의 한계 희석 배양법에 의한 클로닝 조작은, 각각의 콜로니에서 2 회 반복하였다.
그 결과, RANKL 및 TNF-α 자극에 의해 효율적으로 파골 세포에 분화하는 RAW-D 세포, 그리고 RANKL 및 TNF-α 자극에 의해 전혀 파골 세포에 분화하지 않는 RAW-N 세포를 취득하였다.
b) TRAP 염색에 의한 RAW-D 세포 및 RAW-N 세포의 파골 세포 분화 지향성의 검토
RAW-D 세포 및 RAW-N 세포가, RANKL 및 TNF-α 라고 하는 파골 세포 유도 작용을 갖는 물질로 자극했을 때에 어떻게 반응하는지를 조사하였다. RAW-D, RAW-N 및 RAW264 를, 10% 소태아 혈청을 함유하는α-MEM 배지에서 4.5 × 104세포/㎖ 로 조제한 후 96 웰 플레이트에 웰 당 150㎕ 씩 뿌려, 인간 TNF-α (페프로테크사 제조) 를 최종 농도 1ng/㎖, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 을 최종 농도 16, 20, 40, 80ng/㎖ 가 되도록 각각 첨가하였다. 3 일간 배양시킨 후, Leukocyte Acid Phosphatase kit (시그마사 제조) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 TRAP 염색을 실시하고, 형성된 TRAP 양성 다핵 파골 세포수를 계측하였다. 그 결과, RAW-D 에서는 첨가한 RANKL 의 농도 의존적으로 TRAP 양성 다핵 파골 세포가 형성되었다 (도 1). 한편, RAW-N 및 친주 세포인 RAW264 에 있어서는, RANKL 첨가에 의한 TRAP 양성 파골 세포 형성은 인정되지 않았다.
[실시예 1]
RAW-D 및 RAW-N 에 있어서의 마우스 DC-STAMP 의 mRNA 발현 (노던 블롯 해석)
a) 전체 RNA 의 추출
RAW-D 혹은 RAW-N 을 10% 소태아 혈청을 함유하는 α-MEM 배지에서 7 × 104세포/㎖ 로 조제한 것을 24 웰 플레이트에 웰 당 500㎕ 씩 뿌려, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20ng/㎖, 인간 TNF-α (페프로테크사 제조) 를 최종 농도 2ng/㎖ 및 마우스 MIP-1α (페프로테크사 제조) 를 최종 농도 1ng/㎖ 가 되도록 첨가하여 3 일간 배양시켰다. 또한 인간 RANKL (페프로테크사 제조), 인간 TNF-α 및 마우스 MIP-1α 미첨가된 배양도 동일하게 실시하였다.
배양 종료 후, 전체 RNA 추출용 시약 (TRIZol 시약 : 인비트로젠사 제조) 을 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, 각각의 조건으로 배양시킨 RAW-D 및 RAW-N로부터 전체 RNA 를 추출하였다. 회수한 전체 RNA 는 -80℃ 에 보존하였다.
b) 전체 RNA 의 전기 영동 및 블롯팅
회수한 전체 RNA 를 RNA 시료 완충액 (1 × MOPS 완충액 (1 × MOPS 완충액 은 20mM MOPS, 8mM 아세트산나트륨, 1mM EDTA 를 함유한다), 50% 포름아미드, 18㎍/㎖ 브로모페놀블루, 5.8% 포름알데히드, 5% 글리세롤) 에 의해 0.5㎍/㎕ 로 조제하여, 65℃, 15 분간 보온한 후, 빙상에서 5 분간 급냉하였다. 이 시료액 20㎕ 를, 포름알데히드를 함유하는 전기 영동용 1% 아가로스겔 (1 × MOPS 완충액, 1.2% 아가로스 (시그마사 제조), 6% 포름알데히드) 중 하나의 웰에 주입하여, 전기 영동하였다. 전기 영동은, 1 × MOPS 완충액이 들어간 서브 머린 전기 영동층 중, 100V 에서 약 3 시간 통전함으로써 실시하였다.
전기 영동 종료 후, 아가로스 겔 중의 RNA 를 캐필러리 트랜스퍼법 (Maniatis, T. et al., in "Molecular Cloning A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1982)) 에 따라 나일론 멤브레인 (하이본드 N+, 아마샴?파르마시아사 제조) 에 하룻밤에 걸쳐 전사하였다 (전사용 용액은 20 × SSC 를 사용하였다). 이 멤브레인을 2 × SSC 로 5 분간 세정하고, 풍건시켜, 크로스링크용 자외선 조사 장치 (Stratalinker 2400, 스트라타진사 제조) 로 자외선을 조사 (300mJ/㎠) 하여 RNA 를 고정시켰다.
c) 프로브의 조제
마우스 DC-STAMP ΔT7 cDNA (서열표의 서열 번호 : 5, GenBank 억세션 번호 : AB109561) 의 뉴클레오티드 번호 457 내지 1208 에 나타내어지는 뉴클레오티드 서열이, pGEM-T Easy 벡터 (프로메가사 제조) 의 TA 클로닝 부위에 삽입되어 있는 플라스미드 DNA 를, TA 클로닝 부위 근방에 존재하는 NcoI 부위를 이용하여 NcoI (타카라 주조) 소화에 의해 직쇄상 DNA 로 하였다. DIG RNA labeling mix (로 슈?다이아그노스틱스사 제조) 및 SP6 RNA polymerase (로슈?다이아그노스틱스사 제조) 를 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, DIG (디곡시게닌) 로 표지된 안티센스 RNA 프로브를 조제하였다. 이 프로브 조제액에 20 유닛 RNase-free DNase I (로슈?다이아그노스틱스사 제조) 를 첨가하여, 주형 DNA 를 분해하였다. 또, 조제한 RNA 프로브는, 서열표의 서열 번호 3 (마우스 DC-STAMP cDNA) 의 뉴클레오티드 번호 457 내지 1078 및 1247 내지 1376 의 서열에 상당하기 때문에, DC-STAMP 및 DC-STAMP ΔT7 의 양쪽의 mRNA 를 검출할 수 있다.
d) 하이브리다이제이션
b) 로 작성한 멤브레인을 6㎖ 의 하이브리다이제이션 용액 (DIG Easy Hyb Granules 를 첨부 프로토콜에 따라 재증류수에 용해한 것 : 로슈?다이아그노스틱스사 제조) 중에 넣어 65℃ 에서 15 분 인큐베이션 (프레하이브리다이제이션) 한 후 DIG 표지 RNA 프로브를 함유하는 6㎖ 의 하이브리다이제이션 용액 중에서 65℃, 16 시간 인큐베이트 하였다. 그 후, 멤브레인을 2 × SSC, 0.1% SDS 를 함유하는 용액 중, 실온에서 5 분간, 2 회 세정하고, 추가로 0.5 × SSC, 0.1% SDS 를 함유하는 용액 중, 65℃ 에서 30 분간, 2 회 세정하였다. 다음으로 멤브레인을 Blocking 용액 (Blocking reagent 를 첨부 프로토콜에 따라 말레인산 버퍼에 용해한 것 : 로슈?다이아그노스틱스사 제조) 으로 30 분 처리한 후, 알칼리 포스파타아제표지항 디곡시게닌 Fab 단편 (0.075 units/㎖) (로슈?다이아그노스틱스사 제조) 을 함유하는 Blocking 용액으로 30 분 처리하였다. 그 후, 세정 버퍼 (5mM 마레인산 버퍼 pH7.5, 150mM NaCl, 0.3% Tween 20) 로 15 분간, 3 회 세정하고, 발 광 기질인 CDP-Star (로슈?다이아그노스틱스사 제조) 를 첨가하고, 루미노?이미지 애널라이저 (후지 사진 필름사 제조, LAS-1000 plus) 에 의한 해석을 실시하였다.
그 결과, RAW-D 에서는, RANKL 및 TNF-α 를 첨가하지 않은 경우에는 마우스 DC-STAMP 는 거의 발현하지 않지만, RANKL 및 TNF-α 를 첨가하면, 마우스 DC-STAMP 의 발현양이 매우 분명하게 상승하는 것이 밝혀졌다 (도 2). 마우스 DC-STAMP 의 발현양은, 추가로 MIP-1α 를 첨가해도 증가하지 않았다.
한편, RAW-N 에서는, RANKL 및 TNF-α 의 첨가의 유무에 관계없이, DC-STAMP 의 발현은 거의 인정되지 않았다. 또, 컨트롤로서 마우스 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 의 발현양을 동일하게 구하였다.
[실시예 2] RAW-D 에 있어서의 마우스 DC-STAMP 의 mRNA 발현 (RT-PCR 해석)
RAW-D 를 10% 소태아 혈청을 함유하는 α-MEM 배지에서 7 × 104세포/㎖ 로 조제한 것을 24 웰 플레이트에 웰 당 500㎕ 씩 뿌려, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20ng/㎖, 인간 TNF-α (페프로테크사 제조) 를 최종 농도 2ng/㎖ 및 마우스 MIP-1α (페프로테크사 제조) 를 최종 농도 1ng/㎖ 가 되도록 첨가하여 0, 4, 8, 16, 32, 48, 72 시간 배양시켰다.
이어서, 전체 RNA 추출용 시약 (TRIZol 시약 : 인비트로젠사 제조) 을 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, 각각의 배양 시점에 있어서의 RAW-D 로부터 전체 RNA 를 추출하였다. 회수한 전체 RNA 는 사용시까지 -80℃ 에 보존하였다. 1㎍ 전체 RNA 및 1㎕ 0ligo (dT) 18 프라이머 (0.5㎍/㎕) 를 H20 에서 11㎕ 로 하여, 70℃ 에서 10 분간 가열한 후, 4℃ 에서 보온하였다. 이 용액에 4㎕ 5 × 1st Strand Buffer (인비트로젠사 제조), 1㎕ 10mM dNTPs, 2㎕ 0.1M dithiothreitol, 1㎕ Superscript Ⅱ 역전사 효소?(200U/㎕, 인비트로젠사 제조), 1㎕ H20 를 첨가하여, 전량을 20㎕ 로 하고, 42℃ 에서 1 시간 반응시킨 후, 70℃ 에서 10 분간 가열하여, 4℃ 에서 보온하였다.
이와 같이 하여 제작한 1 본 쇄 cDNA 를 이하의 프라이머의 조합으로 증폭하였다.
PCR 조건 :
마우스 DC-STAMP 및 마우스 DC-STAMP ΔT7 증폭용 프라이머 :
5'-aaaacccttg ggctgttctt-3' (mDC-STAMP-F : 서열표의 서열 번호 7)
및
5'-cttcgcatgc aggtattcaa-3' (mDC-STAMP-R : 서열표의 서열 번호 8),
마우스카텝신 K 증폭용 프라이머 :
5'-gagggccaac tcaagaagaa-3' (mcatK-F : 서열표의 서열 번호 9)
및
5'-gccgtggcgt tatacataca-3' (mcatK-R : 서열표의 서열 번호 10),
마우스 TRAP 증폭용 프라이머 :
5'-cagctgtcct ggctcaaaa-3' (mTRAP-F : 서열표의 서열 번호 11)
및
5'-acatagccca caccgttctc-3' (mTRAP-R : 서열표의 서열 번호 12),
마우스 GAPDH 증폭용 프라이머 :
5'-aaacccatca ccatcttcca-3' (mGAPDH-F : 서열표의 서열 번호 13)
및
5'-gtggttcaca cccatcacaa-3' (mGAPDH-R : 서열표의 서열 번호 14).
서멀사이클러 (진앰프 PCR 시스템 9700, 주식회사 파킨에르머재팬?아프라이드바이오시스템즈 사업부 제조) 를 사용하여 이하의 조건으로 PCR 을 실시하였다. 또, 반응에 있어서는, Platinum Taq DNA 폴리머라아제(인비트로젠사 제조) 를 사용하였다. 우선 각 8p㏖ 의 프라이머, 20ng 1 본 쇄 cDNA, 0.5㎕ 의 10 × Reaction 버퍼, 0.2㎕ 의 50mM MgCl2, 0.4㎕ 의 각 2.5mM dNTP, 0.05㎕ 의 5units/㎕ Taq DNA 폴리머라아제를 첨가하여, 증류수에서 5㎕ 로 하여 반응액을 조제하였다. 이 반응액을, 94℃ 2 분 가열하고, 94℃ 에서 0.5 분, 65℃ 에서 1 분, 72℃ 에서 1 분의 온도 사이클을 30 회 반복한 후 72℃ 10분 가열하여, 4℃ 에서 보온하였다. 또, 이 때의 반응액 전량을 2.0% 아가로스 겔로 전기 영동하였다.
DC-STAMP 유전자의 발현은 RANKL, TNF-α 및 MIP-1α 의 첨가에서, 8 시간 후부터 상승하기 시작하여, 발현양의 상승은 72 시간 후까지 지속되었다 (도 3). 제3 엑손이 짧은 스플라이싱 밸리언트인 DC-STAMP ΔT7 도, RANKL, TNF-α 및 MIP-1α 첨가에서 16 시간 후부터 발현 항진이 인정되었다. 또한, 파골 세포의 마 커 분자로서 알려져 있는 카텝신 K 및 TRAP 유전자도, 16 시간 후부터 발현 항진이 확인되었다. 도 3 에 있어서, 상측의 수치는, RANKL, TNF-α 및 MIP-1α 첨가 후의 경과 시간 수를, 또한, 우측에는 각각의 유전자에 대하여 PCR 반응에 의해 증폭된 산물의 사이즈를 염기 쌍으로 나타내고 있다.
[실시예 3] 마우스 골수 유래 초대 배양 세포에 있어서의 마우스 DC-STAMP 의 mRNA 발현 (RT-PCR 해석)
마우스 골수 유래 초대 배양 세포를, 활성형 비타민 D3 존재 하에서 배양시키면, TRAP 양성 다핵 파골 세포가 다수 출현한다 (Takahashi et al., Endocrinology, (1988) 122, 1373-1382).
6 주령 웅성 DDY 마우스를 에테르 마취 하 경추 탈구로 안락사 시켜, 대퇴골 및 경골을 적출하였다. 연조직을 제거한 후, 대퇴골 혹은 경골의 양단을 잘라내고, 25 게이지의 주사 바늘이 장착된 주사통을 사용하여 혈청을 함유하지 않는 α-MEM 배지를 골수 중에 주입하여, 골수 세포를 채취하였다. 세포수를 계측한 후, 15% 소태아 혈청을 함유하는 α-MEM 배지에서 2 × 106세포/㎖ 로 조제한 것을 24 웰 플레이트에 웰 당 500㎕ 씩 뿌려, 활성형 비타민 D3 (바이오몰사 제조) 을 최종 농도 1 × 10-8 M 이 되도록 첨가하여 1, 3, 5, 6 일간 배양시켰다.
이어서, 전체 RNA 추출용 시약 (TRIZol 시약 : 인비트로젠사 제조) 을 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, 각각의 배양 시점에 있어서의 세포로부터 전체 RNA 를 추출하였다. 회수한 전체 RNA 는 사용시까지 -80℃ 에 보존하였다.
RT-PCR 반응은, RNA LA PCR kit (AMV) Ver1. 1 (타카라바이오케미칼즈사 제조) 을 사용하여 실시하였다. 우선, 2㎕ 25mM MgCl2, 1㎕ 10 × RNA PCR Buffer, 1㎕ dNTP Mix (각 10mM), 0.25㎕ RNase Inhibitor (40U/㎕), 0.5㎕ 역전사 효소 (5U/㎕), 0.5㎕ 0ligo dT-Adaptor primer (2.5p㏖/㎕) 1㎍ 전체 RNA 를 첨가하여, RNase Free dH2O 에서 10㎕ 로 하여 반응액을 조제하였다. 이 반응액을, 50℃ 에서 25 분간 가열한 후, 99℃ 에서 5 분간 가열하여, 4℃ 에서 보온하였다. 이 1 본 쇄 cDNA 를 실시예 2 에 기재된 프라이머의 조합에 의해 증폭시켰다.
서멀사이클러 (진앰프 PCR 시스템 9700) 를 사용하여 이하의 조건으로 PCR 을 실시하였다. cDNA 를 함유하는 반응액 5㎕ 에, 1.5㎕ 25mM MgCl2, 2㎕ 10 × LA PCR Buffer Ⅱ (Mg2+ free), 0.125㎕ Takara LA Taq (5U/㎕), 프라이머 세트 (최종 농도 각 1㎛) 를 첨가하고, 재증류수에서 25㎕ 로 하여 반응액을 조제하였다. 이 반응액을 94℃ 에서 2 분간 가열한 후, 94℃ 에서 30 초, 60℃ 에서 30 초, 72℃ 에서 30 초의 온도 사이클을 25 회 반복하여, 4℃ 에서 보온하였다. 그 후, 반응액 9㎕ 분을 2.0% 아가로스 겔에 전기 영동하였다.
그 결과, DC-STAMP 유전자는, 활성형 비타민 D3 첨가 후 1 일째에서는 조금 발현하고 있을 뿐이었지만, 단핵의 파골 세포 전구 세포가 형성되는 3 일째에서는 현저하게 발현하고, 다핵화가 활발하게 일어나는 5, 6 일째에서도 현저한 발현이 유지되었다 (도 4).
또한, DC-STAMP ΔT7 은 DC-STAMP 보다도 발현양은 낮기는 하지만, 발현양의 변화는 DC-STAMP 와 동일한 시간 경과를 나타내었다. 도 4 에 있어서, 상측의 수치는, 활성형 비타민 D3 첨가 후의 경과 일수를 나타내고 있다.
[실시예 4] 토끼 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체의 제작
마우스 DC-STAMP 아미노산 서열 (서열표의 서열 번호 : 4, GenBank 억세션 번호 : AB109560) 에 있어서, 제 6 번째부터 제 7 번째의 막 관통 도메인의 사이에 위치하는, 아미노산 번호 330 내지 343 에 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드를 기초로, 마우스 DC-STAMP 단백질의 부분 펩티드의 제작을 시도하였다. 전술한 서열의 N 말단에 시스테인 잔기를 1 개 부가한 부분 펩티드 :
Cys Ser Leu Pro Gly Leu Glu Val His Leu Lys Leu Arg Gly Glu (서열표의 서열 번호 : 15)
를 합성하였다. 이 펩티드를 항원 자극성 캐리어 단백질인 KLH (Keyhole limpet hemocyanin) 에, MBS (말레이미드벤조일옥시숙신산이미드) 법에 의해 콘쥬게이트한 후 토끼에 면역시켜, 통상적인 방법에 따라 토끼 항혈청을 얻었다. 이 항혈청을, 면역에 사용한 부분 펩티드를 반죽한 펩티드 어피니티 칼럼을 사용하여 정제함으로써, 토끼 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체를 얻었다. 또, DC-STAMP ΔT7 (GenBank 억세션 번호 AB109561) 도 이 펩티드 서열을 갖기 위해, 본 항체는 DC-STAMP 및 DC-STAMP ΔT7 의 양쪽에 결합한다고 생각되었다. 또, 이 펩티드 서열을, 인간 DC-STAMP 아미노산 서열 (서열표의 서열 번호 : 2, GenBank 억세션 번호 : NM_030788) 에 있어서의 아미노산 번호 330 내지 343 에 나타내어지는 서열과 비교한 결과, 334 번째의 Leu (마우스) 가 Phe (인간) 에, 341 번째의 Arg (마우스) 가 His (인간) 에 변화하고 있을 뿐이었기 때문에, 본 항체가 인간 DC-STAMP 에도 결합할 가능성이 높다고 생각되었다.
[실시예 5] 신생자(新生子) 마우스 경골 유래 파골 세포에 있어서의 면역 염색
a) 신생자 마우스 경골 유래 파골 세포의 채취
1 일령 DDY 마우스로부터 경골을 적출하고, 연조직을 제거한 후, 15% 소태아 혈청을 함유하는 α-MEM 배양기 중에서 해부용 가위를 사용하여 잘게 썰었다. 그 후 약간 격하게 피펫팅함으로써 세포를 저어 현탁시켜, 챔버스라이드 (널제?눈크인터내셔널사 제조) 에 파종하였다. 1 시간 배양한 후, 슬라이드에 접착된 다핵 세포를 파골 세포로서 사용하였다.
b) 면역 염색에 의한 DC-STAMP 단백질의 발현
a) 에 의해 얻어진 파골 세포를, 4% 파라포름알데히드 용액을 사용하여, 실온에서 20 분간 고정 반응을 실시하고, 인산 완충액 (pH7.4) 에 의해 4 회 세정한 후, 3% 염소 혈청을 함유하는 인산 완충액 (pH7.4) 에 의해 실온에서 30 분간 블록킹 반응을 실시하였다. 블록킹액을 제외한 후, 실시예 4 에서 제작한 토끼 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체 10㎍/㎖ 를 함유하는 인산 완충액 (1% 말 혈청을 함유한다) 을 첨가하여, 실온에서 30 분간 반응시켰다. 또한, 면역되어 있지 않은 토끼 IgG 항체 (다코?재팬사 제조) 를 음성 대조로서 준비하여, 동일한 조작을 실시하였다. 1% 말 혈청을 함유하는 인산 완충액으로 4 회 세정하여, 비오틴화 염소 항토끼 IgG 항체 (벡터?라보라트리즈사 제조) 를 2 차 항체로서 사용하여, 실온에서 30 분간 세포와 반응시켰다. 인산 완충액으로 4 회 세정한 후, ABC-AP 키트 (벡터?라보라트리즈사 제조) 를 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, 발색 반응을 실시하였다. 이 결과, 항 DC-STAMP 항체로 반응시킨 파골 세포에 있어서 강한 염색이 인정된 점에서, 신생자 마우스 경골 유래 파골 세포에 있어서 DC-STAMP 가 발현하고 있는 것이 밝혀졌다. 또, 음성 대조의 컨트롤 항체를 사용한 경우에서는, 파골 세포는 전혀 염색되지 않았다.
[실시예 6] 신생자 마우스 하악골 조직에 있어서의 면역 염색
a) 신생자 마우스 하악골 조직 표본의 제작
1 일령 DDY 마우스를 에테르 마취하여, 4% 파라포름알데히드를 함유하는 인산 완충액 (pH 7.4) 을 좌심실로부터 주입하여 관류 고정시켰다. 하악골을 적출하고, 전술한 4% 파라포름알데히드를 함유하는 인산 완충액 (pH 7.4) 에 침지시키고, 4℃ 에서 추가로 12 시간 고정 반응을 실시하여, 인산 완충액에서 3 회 세정한 후, 추가로 인산 완충액에서 4℃ 에서 하룻밤 세정을 실시하였다. 그 후 10% EDTA (에틸렌 디아민 4 아세트산) 를 사용하여 4℃, 1 주일 탈회 반응을 실시하였다. 30% 수크로오스를 함유하는 인산 완충액 중 4℃ 에서 하룻밤 세정한 후, OCT 콤파운드 (사쿠라?파인테크사 제조) 를 사용하여 포매 (包埋) 하여, 드라이아이스 함유 이소펜탄에 침지 동결시켰다. 이렇게 해서 제작된 포매 블록을, 클리오 마이크로톰 (라이카사 제조) 을 사용하여 10㎛ 로 얇게 잘라, 하악골 조직 절편을 제작하였다.
b) 면역 염색에 의한 DC-STAMP 단백질의 발현
a) 에 의해 제작된 악골 조직 절편으로부터, 풍건에 의해 수분을 제거한 후, 0.3% 과산화수소를 함유하는 메탄올과 실온에서 30 분간 반응시켜 내인성 페르옥시다아제활성을 소실시켰다. 인산 완충액에서 3 회 세정한 후 (실온?각 5 분), 10% 당나귀 혈청을 함유하는 인산 완충액을 사용하여 실온에서 30 분간 반응시켜 블록킹을 실시하였다. 블록킹액을 제거하고, 실시예 4 에서 제작한 토끼 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체 10㎍/㎖ 를 함유하는 인산 완충액 (2% 당나귀 혈청을 함유한다) 을 첨가하여, 습윤 상자에 넣어 4℃ 에서 하룻밤 반응시켰다. 또한, 면역되어 있지 않은 토끼 IgG 항체 (다코?재팬사 제조) 를 음성 대조로서 준비하여, 동일한 조작을 실시하였다. 인산 완충액으로 3 회 세정한 후 (실온?각 5분), 비오틴화 당나귀 항토끼 IgG 항체 (잭슨?임뮤노리서치?라보라트리즈사 제조) 를 인산 완충액으로 200 배 희석한 것을 2 차 항체로서 사용하여 실온에서 1 시간 반응시키고, 인산 완충액으로 3 회 세정한 후 (실온?각 5 분), 페르옥시다아제표지 스트렙토아비딘 복합체 (다코?재팬사 제조) 를 증류수에서 300 배로 희석한 것과 실온에서 30 분간 반응시켰다. 인산 완충액으로 3 회 세정한 후 (실온?각 5 분), DAB substrate 키트 (벡터?라보라트리즈사 제조) 를 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, 발색 반응을 실시하였다. 그 결과, 항 DC-STAMP 항체로 반응시킨 하악골 조직 절편에서는, 파골 세포에서만 강한 염색이 인정되고, 신생자 마우스 하악골 유래 파골 세포에서 DC-STAMP 가 발현하고 있는 것이 밝혀졌다. 또, 음성 대조의 컨트롤 항체를 사용한 경우에서는, 어느 세포도 염색되지 않았다.
[실시예 7] RAW-D 세포의 siRNA 에 의한 파골 세포 분화 억제
a) 마우스 DC-STAMP 유전자에 대한 siRNA 의 제작
센스쇄, 안티센스쇄 각각의 3' 단에, 우리딘이 2 염기 (UU) 부가된 각 마우스 DC-STAMP siRNA 는, Silencer siRNA construction 키트 (안피온사 제조) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 전사에 의해 조제하였다. siRNA 조제에 필요한 템플릿 올리고 DNA 세트는 다음과 같다.
우선, 제3 엑손의 5' 측 (인간 DC-STAMP cDNA 서열로부터 추정된 아미노산 서열에 있어서, 제7 막 관통 영역에 상당) 에 대한 siRNA 및 변이를 주입한 siRNA 의 제작에는, 다음의 템플릿 올리고 DNA 의 조합을 사용하였다.
siRNA #135 템플릿 :
5'-aatactagga ttgttgtctt ccctgtctc-3' (mDC-STAMP-#135-AS : 서열표의 서열 번호 16)
및
5'-aagaagacaa caatcctagt acctgtctc-3' (mDC-STAMP-#135-S : 서열표의 서열번호 17),
변이 siRNA #135 템플릿 :
5'-aatactagga gcgttgtctt ccctgtctc-3' (mDC-STAMP-#135-Mut-AS : 서열표의 서열 번호 18, 뉴클레오티드 번호 11 은 t 를 g 로, 12 는 i 를 c 로 변이시키고 있다.)
및
5'-aagaagacaa cgctcctagt acctgtctc-3' (mDC-STAMP-#135-Mut-S : 서열표의 서열 번호 19, 뉴클레오티드 번호 12 에 나타내어지는 뉴클레오티드는 a 를 g 로, 13 에 나타내어지는 뉴클레오티드는 a 를 c 로 변이시키고 있다.).
또한, 제3 엑손에 있어서 상기 siRNA (#135) 의 부분으로부터 3' 측에 위치하는 마우스 DC-STAMP 에 특유의 cDNA 서열 부분에 대한 siRNA 및 변이 siRNA 의 제작에는, 다음의 템플릿 올리고 DNA 의 조합을 사용하였다.
siRNA *6 템플릿 :
5'-aattctcgtg tcagtctcct tcctgtctc-3' (mDC-STAMP-*6-AS : 서열표의 서열번호 20)
및
5'-aaaaggagac tgacacgaga acctgtctc-3' (mDC-STAMP-*6-S : 서열표의 서열 번호 21),
변이 siRNA *6 템플릿 :
5'-aattctcgta ccagtctcct tcctgtctc-3' (mDC-STAMP-*6-Mut-AS : 서열표의 서열 번호 22, 뉴클레오티드 번호 9 에 나타내어지는 뉴클레오티드는 g 를 a 로, 10 에 나타내어지는 뉴클레오티드는 t 를 c 로 변이시키고 있다.)
및
5'-aaaaggagac tggtacgaga acctgtctc-3' (mDC-STAMP-*6-Mut-S : 서열표의 서 열 번호 23, 뉴클레오티드 번호 13 에 나타내어지는 뉴클레오티드는 a 를 g 로, 뉴클레오티드 번호 14 에 나타내어지는 뉴클레오티드는 c 를 t 로 변이시키고 있다.)
b) RAW-D 세포의 siRNA 에 의한 파골 세포 분화 억제
RAW-D 를 10% 소태아 혈청을 함유하는 α-MEM 배지에서 4.5 × 104세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트에 80㎕/웰 파종하였다. 다음날, OPTI-MEM I 배지 (인비트로젠사 제조) 80㎕ 에 배지 교환하고, a) 에서 제작한 DC-STAMP siRNA 및 변이 siRNA 를 최종 농도 0.1, l, 5nM 이 되도록 조제하여, 트랜스펙션 시약인 siPORT Lipid (안피온사 제조) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 세포에 트랜스펙션 하였다 (20㎕ 첨가). 또한, siRNA 를 함유하지 않는, 트란스펙션 시약 만의 컨트롤 (목크) 도 준비하였다. CO2 인큐베이터 속에서 4 시간 트랜스펙션한 후, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 40ng/㎖, 인간 TNF-α (페프로테크사 제조) 2ng/㎖ 및 20% 소태아 혈청을 함유하는α-MEM 배지를 100㎕ 첨가하였다. 3 일간 배양한 후, Leukocyte Acid Phosphatase kit (시그마사 제조) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 TRAP 염색을 실시하여, 형성된 TRAP 양성 다핵 파골 세포수를 계측하였다. DC-STAMP siRNA #135 의 첨가 농도가, O.1, 1, 5nM 의 어느 농도에서도, 변이 siRNA #135 를 첨가한 경우와 달리 유의하게 파골 세포 형성을 억제하였다. 변이 siRNA 의 첨가 농도가 5nM 인 경우에는 약간의 파골 세포 형성 억제효과가 인정되었지만, 변이 siRNA 의 첨가 농도가 0.1, 1nM 에서는 파골 세포 형성 억제효과는 인정되지 않았다. 그 결과, 목크 콘트롤 (siRNA 농도 = 0nM) 및 네가티브 콘트롤인 변이 siRNA 에 비하여, 어느 DC-STAMP siRNA 도, RANKL 및 TNF-α 에 의해 유도되는 RAW-D 의 TRAP 양성 다핵 파골 세포 형성을 농도 의존적으로 억제하였다 (도 5A, 도 5B). 이와 같이, siRNA 에 의해 DC-STAMP 유전자의 발현을 억제하면, RAW-D 의 파골 세포에 대한 분화가 억제된 점에서, DC-STAMP 가 파골 세포 분화에 필수적인 인자인 것이 시사되었다.
[실시예 8] 마우스 DC-STAMP 오픈 리딩 프레임 (ORF) cDNA 클론의 취득
a) RAW-D 로부터의 전체 RNA 의 추출
RAW-D 를 10% 소태아 혈청을 함유하는 α-MEM 배지에서 7 × 104세포/㎖에 조제한 것을 24 웰 플레이트에 웰 당 500㎕ 씩 뿌려, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20ng/㎖, 인간 TNF-α (페프로테크사 제조) 를 최종 농도 2ng/㎖ 및 마우스 MIP-1α (페프로테크사 제조) 를 최종 농도 1ng/㎖ 가 되도록 첨가하여, 3 일간 배양시켰다.
이어서, 전체 RNA 추출용 시약 (TRIZol 시약 : 인비트로젠사 제조) 을 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써, RAW-D 로부터 전체 RNA 를 추출하였다. 또, 회수한 전체 RNA 는 -80℃ 에 보존하였다.
b) 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성
1㎍ 전체 RNA 및 1㎕ oligo (dT) 18 프라이머 (0.5㎍/㎕) 를 H20 에서 11㎕ 로 하고, 70℃ 에서 10 분간 가열한 후, 4℃ 에서 보온하였다. 이 용액에 4㎕ 5 × 1st Strand Buffer (인비트로젠사 제조), 1㎕?10mM dNTPs, 2㎕ 0.1M dithiothreitol, 1㎕ Superscript Ⅱ 역전사 효소 (200U/㎕, 인비트로젠사 제조), 1㎕ H20 를 첨가하여 전량을 20㎕ 로 하고, 42℃ 에서 1 시간 반응시킨 후, 70℃ 에서 10 분간 가열하여, 4℃ 에서 보온하였다.
c) PCR 반응
마우스 DC-n="525">b) 퍼스트 스트랜드 cDNA 합성
1㎍ 전체 RNA 및 1㎕ oligo (dT) 18 프라이머 (0.5㎍/㎕) 를 H20 에서 11㎕ 로 하고, 70℃ 에서 10 분간 가열한 후, 4℃ 에서 보온하였다. 이 용액에 4㎕ 5 × 1st Strand Buffer (인비트로젠사 제조), 1㎕?10mM dNTPs, 2㎕ 0.1M dithiothreitol, 1㎕ Superscript Ⅱ 역전사 효소 (200U/㎕, 인비트로젠사 제조), 1㎕ H20 를 첨가하여 전량을 20㎕ 로 하고, 42℃ 에서 1 시간 반응시킨 후, 70℃ 에서 10 분간 가열하여, 4℃ 에서 보온하였다.
c) PCR 반응
마우스 DC-STAMP 및 DC-STAMP ΔT7 의 ORF cDNA 를 PCR 에 의해 증폭시키기 위한 프라이머로서
5'-tttgtcgaca tgaggctctg gaccttgggc accagtattt t-3' (mDC-STAMP-cDNA-F : 서열표의 서열 번호 24)
및
5'-tttgcggccg ctcatagatc atcttcattt gcagggattg t-3' (mDC-STAMP-cDNA-R :서열표의 서열 번호 25),
의 서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드를 통상적인 방법에 따라 합성하였다. 이 프라이머의 조합을 사용하여 서멀사이클러 (진앰프 PCR 시스템 9700) 를 사용하여 이하의 조건으로 PCR 을 실시하였다. 프라이머 (최종 농도 각 1.0μM), 5㎕ 10 × Pyrobest PCR 버퍼 (타카라주조사 제조), 4㎕ 2.5mM dNTPs, 1㎕ cDNA (b) 로 제작), 재증류수에서 50㎕ 로 하였다. 또한 0.5㎕ 의 5U/㎕ Pyrobest DNA 폴리머라아제(타카라주조사 제조) 를 첨가하여, 반응액을 조제하였다. 이 반응액을, 먼저 94℃ 에서 2 분간 가열한 후, 94℃ 에서 0.5 분, 60℃ 에서 0.5 분, 72℃ 에서 5 분의 온도 사이클을 30 회 반복하고 나서, 72℃ 10 분 가열하여, 4℃ 에서 보온하였다.
d) pCI-neo 벡터에 대한 클로닝
c) 에서 얻어진 PCR 반응액의 전량을 QIAquick PCR Purification Kit (키아겐사 제조) 를 첨부된 프로토콜에 따라 사용함으로써 정제하였다. 얻어진 프래그먼트는, 제한 효소 Sal I 및 Not I 에 의해 소화한 후, 똑같이 Sal I 및 Not I 소화한 pCI-neo (프로메가사 제조) 와 DNA Ligation Kit Ver.1 (타카라주조사 제조) 을 사용하여 라이게이션 하여, 대장균 XL1-Blue MRF' (스트라타진사 제조) 에 트랜스포메이션 하였다. 이와 같이 하여 얻어진 대장균 콜로니로부터, 플라스미드 pCI-neo-마우스 DC-STAMP 를 보관 유지하는 형질 전환 대장균을 단리시켰다.
얻어진 플라스미드에 삽입되어 있는 ORF cDNA 의 전체 뉴클레오티드 서열을 DNA 시크엔서 (주식회사 파킨에르마 재팬?아프라이드 바이오 시스템즈 사업부 제조 ABI 프리즘 310 DNA 시크엔서) 를 사용하여 해석한 결과, 서열표의 서열 번호 26 에 나타내어지는 서열인 것이 판명되었다. 이 뉴클레오티드 서열은, NCBI GeneBank 데이터베이스에 「마우스 DC-STAMP」 (등록 번호 : AB109560) 로서 등록되어 있는 서열의 ORF 코드 영역과 동일하며, 또한, 그 뉴클레오티드 서열에 코드되는 아미노산 서열 (서열표의 서열 번호 27) 은, 마우스 DC-STAMP 의 아미노산 서열과 100% 일치하고 있었다.
[실시예 9] 마우스 DC-STAMP 단백 강제발현에 의한, RAW-D 세포의 파골 세포 분화에 대한 영향
실시예 8 에서 얻은 pCI-neo-마우스 DC-STAMP 의 플라스미드는, pCI-neo 유 래의 CMV 프로모터 지배하에, 마우스 DC-STAMP 의 오픈 리딩 프레임 서열이 연결되어 있으므로, 이 플라스미드를 숙주에 도입함으로써 마우스 DC-STAMP 단백질을 발현할 수 있다.
상기 발현 플라스미드의 RAW-D 에 대한 유전자 도입 (트랜젠트?트랜스펙션) 은, DEAE-덱스트란법에 의해 실시하였다.
pCI-neo-마우스 DC-STAMP 혹은 아무 것도 주입하지 않은 빈 pCI-neo 벡터 각각 3㎍ 에, 10㎎/㎖ DEAE-덱스트란 용액 (프로메가사 제조) 50㎕ 와 OPTI-MEMI (인비트로겐) 950㎕ 를 혼합한 것을 첨가하여, 트랜스펙션 용액을 조제하였다.
혈청을 함유하지 않는α-MEM (10㎖) 으로 2 회 세정 (200 × g, 5 분간 원심) 한 RAW-D (3.0 × 106 개) 를 상기 트랜스펙션 용액 (1㎖) 에 현탁시켰다. CO2 인큐베이터 속 (37℃) 에서 30 분간 보온한 후, 혈청을 함유하지 않는α-MEM (10㎖) 로 1 회 세정한 (200 × g, 5 분간 원심) 후, 추가로 5% 소태아 혈청을 함유하는 α-MEM (10㎖) 으로 1 회 세정을 실시하였다. 200 × g, 10 분간 원심 하여 세포를 침강시켜, 10% 소태아 혈청을 함유하는 α-MEM (2㎖) 에 재현탁시켰다. 세포 농도를 혈구 계산판으로 측정하고, 4.5 × 104개/㎖ 의 세포 농도로 조제하고, 96 웰 플레이트에 0.15㎖/웰 파종하여, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20ng/㎖, 인간 TNF-α (페프로테크사 제조) 를 최종 농도 1ng/㎖ 가 되도록 첨가하고, 혹은 첨가하지 않고 3 일간 배양한 후, Leukocyte Acid Phosphatase kit (시그마사 제조) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 TRAP 염색을 실시하여, 형 성된 TRAP 양성 다핵 파골 세포수를 계측하였다. 그 결과, RANKL, TNF-α 비존재 하에서는 마우스 DC-STAMP 단백질을 강제발현시켜도 TRAP 양성 다핵 파골 세포가 전혀 유도되지 않았지만, RANKL, TNF-α 존재 하에서는, 컨트롤인 빈 pCI-neo 벡터를 RAW-D 에 유전자 도입했을 때에 비하여, 마우스 DC-STAMP 단백질을 강제발현시킴으로써 TRAP 양성 다핵 파골 세포의 형성이 유의하게 촉진되었다 (도 6). 이 점에서, DC-STAMP 가, 파골 세포 분화를 촉진하는 인자인 것이 시사되었다.
[실시예 10] 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체 첨가에 의한 RAW-D 세포의 파골 세포 분화에 대한 영향
실시예 4 에서 제작한 토끼 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체를 사용하여 RAW-D 의 파골 세포 분화에 대한 영향을 검토하였다.
RAW-D 를 10% 소태아 혈청을 함유하는α-MEM 배지에서 4.5 × 104세포/㎖로 조제한 것을 96 웰 플레이트에 웰 당 150㎕ 씩 뿌려, 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20ng/㎖, 인간 TNF-α (페프로테크사 제조) 를 최종 농도 1ng/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 이 세포 배양 상청에, 실시예 4 에서 제작한 토끼 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체를 최종 농도 0, 5, 10, 20㎍/㎖ 가 되도록 첨가하여 3 일간 배양시킨 후, Leukocyte Acid Phosphatase kit (시그마사 제조) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 TRAP 염색을 실시하여, 형성된 TRAP 양성 다핵 파골 세포수를 계측하였다. 그 결과, 첨가한 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체의 용량 의존적으로 TRAP 양성 다핵 파골 세포의 형성이 억제되었다 (도 7). 또, 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체를 첨가하지 않은 경우에 비하여 항체를 10㎍/㎖ 이상 첨가하면 파골 세포 형성의 유의한 억제가 인정되었다.
이와 같이, DC-STAMP 및 DC-STAMP ΔT7 과 특이적으로 결합한다고 생각되는 항체에 의해 RAW-D 의 TRAP 양성 다핵 파골 세포 형성이 억제된 점에서, DC-STAMP 및 DC-STAMP ΔT7 이, 파골 세포 분화에 깊게 관여하고 있는 것이 시사되었다.
[실시예 11] 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체 첨가에 의한 마우스 골수 유래 초대 배양 세포의 파골 세포 분화에 대한 영향
6 주령 웅성 DDY 마우스를 에테르 마취 하 경추 탈구로 안락사시키고, 대퇴골 및 경골을 적출하였다. 연조직을 제거한 후, 대퇴골 혹은 경골의 양단을 잘라내고, 25 게이지의 주사 바늘이 붙은 주사 통을 사용하여 혈청을 함유하지 않는α-MEM 배지를 골수 중에 주입하여, 골수 세포를 채취하였다. 세포 수를 계측한 후, 15% 소태아 혈청을 함유하는 α-MEM 배지에서 2 × 106세포/㎖ 로 조제한 것을 24 웰 플레이트에 웰 당 500㎕ 씩 뿌려, 활성형 비타민 D3 (바이오몰사 제조) 을 최종 농도 1 × 10-8 M 이 되도록 첨가하였다. 이 세포 배양 상청에, 실시예 4 에서 제작한 토끼 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체를 최종 농도 0, 5, 10, 20㎍/㎖가 되도록 첨가하여 6 일간 배양시킨 후, Leukocyte Acid Phosphatase kit (시그마사 제조) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 TRAP 염색을 실시하여, 형성된 TRAP 양성 다핵 파골 세포수를 계측하였다. 그 결과, 첨가한 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체의 용량 의존적으로 TRAP 양성 다핵 파골 세포의 형성이 억 제되었다 (도 8). 또, 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체를 첨가하지 않았던 경우에 비해 항체를 5㎍/㎖ 및 20㎍/㎖ 의 농도로 첨가한 경우에 있어서 유의한 억제가 인정되었다. 이와 같이, DC-STAMP 및 DC-STAMP ΔT7 과 특이적으로 결합하는 항체에 의해, 마우스 골수 세포로부터의 TRAP 양성 다핵 파골 세포 형성이 억제된 점에서, DC-STAMP 및 DC-STAMP ΔT7 은, RAW-D 와 같은 세포주뿐만 아니라, 보다 생체에 가까운 초대 배양 세포의 파골 세포 분화에도 관여하고 있는 것이 밝혀졌다.
[실시예 12] 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체 첨가에 의한 골 흡수와 형성에 대한 영향
마우스 대퇴골 및 경골 유래의 세포를, 활성형 비타민 D3 존재 하 상아 절편상에서 배양시키면, 파골 세포에 의해 상아 표면이 침식되고, 벌레먹은 형상의 골 흡수와 (피트) 가 관찰된다 (Takada et al., Bone and Mineral 17, 347-359 (1992)).
14 일령 ICR 마우스 (자웅 불문) 를 에테르 마취 하 경추 탈구하여 안락사시켜, 대퇴골 및 경골을 적출하였다. 연조직을 제거한 후, 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지 1㎖ 가 들어간 직경 60㎜ 의 디쉬 중에서, 뼈를 죽 상태가 될 때까지 가위로 잘게 잘랐다. 15㎖ 원심 튜브에 옮기고, 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지 10㎖ 를 첨가하여 포르텍스믹서 (엠에스 기기) 로 30 초간 교반한 후, 2 분간 정치하였다. 상청을 회수하고, 세포 수를 계측한 후, 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지에서 1 × 107 세포/1㎖ 로 조제한 것을, 두께 150 ～ 200㎛, 직경 6㎜ 의 상아 절편 (쿠레아 화학 공업에서 제작) 을 깐 96 웰 플레이트에 웰 당 100㎕ 씩 뿌려, CO2 인큐베이터 속에서 4 시간 배양시켰다. 그 후 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지 200㎕ 로 교환하여, 활성형 비타민 D3 (시그마사 제조) 을 최종 농도 1 × 10-8M 이 되도록 첨가하였다 (비첨가군도 준비하였다). 이 세포 배양 상청에, 실시예 4 에서 제작한 토끼 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체를 최종 농도 0, 2, 6, 20㎍/㎖ 가 되도록 첨가하여 4 일간 배양시켰다. 배양 종료후, 상아가 들어온 플레이트로부터 배양 상청을 제거하고 증류수를 첨가하여 1 회 세정하고, 새롭게 증류수를 첨가하였다. 핸드 모터 (도쿄 나카이 주식회사 제조) 에 접속시킨 폴리싱 브러쉬 (타가타니 제작소 제조) 를 사용하여 상아 절편 상에 부착한 세포를 박리시켰다. 증류수로 2 회 세정한 후, 상아 표면 상에 형성된 피트를 산헤마톡실린액 (시그마사 제조) 으로 13 분간 염색하여, 증류수에서 2 회 세정하였다. 상아 절편을 뒤집어, 현미경 하에서 피트 면적을 계측하였다. 피트의 총면적을 측정하는 방법으로서, 현미경의 접안 렌즈에 장착시킨 마이크로미터 (10 × 10 매스) 를 사용하여, 피트가 존재하는 모든 눈금 (메시) 의 수를 세어, 피트 면적으로 하였다. 그 결과, 활성형 비타민 D3의 첨가에 의해 상아 절편 상에 다수의 피트가 형성되었지만, 동시에 첨가한 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체의 용량 의존적으로, 피트 형성이 억제되었다 (도 9). 이와 같 이, DC-STAMP 및 DC-STAMP ΔT7 과 특이적으로 결합한다고 생각되는 항체에 의해, 마우스 대퇴골?경골 유래 파골 세포에 의한 피트 형성이 억제된 점에서, DC-STAMP 및 DC-STAMP ΔT7 이, 파골 세포의 골 흡수 활성의 조절에도 관여하고 있는 것이 시사되었다.
[실시예 13] 거세포종 조직에 있어서의 인간 DC-STAMP 유전자의 발현
거세포종 (Giant cell tumor ; GCT) 은, 조직학적으로 파골형의 다핵 거세포가 다수 출현하는 골 종양이며, 임상적 소견으로서 골 용해성 골 파괴를 특징으로 한다 (Bullough et al., Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, 17.6-17.8, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992)). 인간 DC-STAMP 유전자와 부분적으로 중복되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 EST 프로브 (Affymetrix Genechip HG-U-133 probe 221266_s_at : 어피메트릭스사 제조) 에 대해서, GeneLogic 사 제조의 데이터베이스 (Genesis 2003 Release 2.0) 를 사용하여 GCT 조직에 있어서의 발현 프로파일 해석을 실시하였다. 또한, 파골 세포 분화에 중요한 역할을 하고 있는 RANK (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 207037_at : 어피메트릭스사 제조) 및 RANKL (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 210643_at : 어피메트릭스사 제조), 또한 파골 세포 분화 마커인 카텝신 K (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 202450_s_at : 어피메트릭스사 제조) 및 TRAP (Affymetrix Genechip HG-U133 probe 204638_at : 어피메트릭스사 제조) 의 EST 프로브에 대해서도, 동일하게 GCT 조직에 있어서의 발현 프로파일 해석을 실시하였다.
정상 골 조직 9 예, GCT 조직 14 예, GCT 이외의 골 종상 조직 10 예에 있어 서 발현양을 비교한 결과, 정상 조직에 비하여 GCT 조직에 있어서 RANK 및 RANKL 의 전사가 특이적으로 항진하고 있는 것이 밝혀졌다 (도 10A). 한편, 골 흡수의 항진이 반드시 일어나지는 않는다고 생각되는 GCT 이외의 골 종양 조직에서는, GCT 에 비하여 RANK 및 RANKL 의 전사가 유의하게 낮고, 정상 조직과 동등한 발현양이었던 점에서, GCT 에서는 파골 세포의 형성 및 활성화가 촉진되는 환경인 것이 시사되었다. 또한, 카텝신 K 및 TRAP 의 발현양을 비교한 결과, GCT 에 있어서 유의하게 높게 전사되어 있고 (도 10B), 골 흡수 활성을 갖는 파골 세포가 다수 출현하고 있는 것이 시사되었다. 마찬가지로 DC-STAMP 에 대하여 전사량을 비교한 결과, RANK, RANKL, 카텝신 K 및 TRAP 과 동일하도록 GCT 에서 특이적으로 높게 전사되어 있는 것이 밝혀졌다 (도 11). 이 점에서, GCT 와 같은 골 흡수가 항진되는 인간의 병태에 있어서도, DC-STAMP 가 관여하고 있는 것이 시사되었다.
[실시예 14] 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체 첨가에 의한 인간 파골 세포 형성에 대한 영향
인간 말초 혈단 핵구 (Human Peripheral Blood Mononuclear Cell ; HPBMC) 를 M-CSF 및 덱사메타존 존재 하 RANKL 로 자극하면, TRAP 양성 다핵 파골 세포가 형성된다 (Matsuzaki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., (1998) 246, 199-204). 타카라 바이오사로부터 구입한 HPBMC 를, 10% 소태아 혈청을 함유하는 α-MEM 배지에서 5 × 106세포/㎖ 로 조제한 후 96 웰 플레이트에 웰 당 100㎕ 씩 뿌려, 인간 M-CSF (아르?앤드?디시스템즈사 제조) 가 최종 농도 200ng/㎖, 덱사 메타존 (와코쥰야쿠 공업사 제조) 이 최종 농도 1 × 10-7M 및 인간 RANKL (페프로테크사 제조) 이 최종 농도 100ng/㎖ 가 되도록 조제한 배지를 첨가하여, 200㎕/웰으로 하였다 (RANKL 비첨가군도 준비하였다). 이 세포 배양 상청에, 실시예 4 에서 제작한 토끼 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체를 최종 농도 0, 2, 6㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. 배양 4, 7, 11 일 후에 배지 교환 및 검체의 첨가를 실시하고, 배양 13 일 후, Leukocyte Acid Phosphatase kit (시그마사 제조) 를 사용하여, 첨부된 프로토콜에 따라 TRAP 염색을 실시하여, 형성된 TRAP 양성 다핵 파골 세포수를 계측하였다. 그 결과, RANKL 자극에 의해 다수의 파골 세포가 형성되었지만, 항마우스 DC-STAMP 폴리클로날 항체의 용량 의존적으로 TRAP 양성 다핵 파골 세포의 형성이 억제되었다 (도 12). 이와 같이, 항마우스 DC-STAMP 항체에 의해, HPBMC 로부터의 TRAP 양성 다핵 파골 세포 형성이 억제된 점에서, DC-STAMP 는, 마우스뿐만 아니라, 인간의 파골 세포 분화에도 관여하고 있는 것이 강하게 시사되었다.
본 발명에 의하면, 파골 세포의 활동 저해를 작용 기서로 하는, 골 대사 이상의 예방제 및/또는 치료제를 얻을 수 있다.
서열표 프리 텍스트
서열 번호 15 - 인공 서열의 설명 : 마우스 DC-STAMP 의 합성 부분 펩티드
서열 번호 16 - 인공 서열의 설명 : 마우스 DC-STAMP 의 주형 DNA 1
서열 번호 17 - 인공 서열의 설명 : 마우스 DC-STAMP 의 주형 DNA 2
서열 번호 18 - 인공 서열의 설명 : 마우스 DC-STAMP 의 주형 DNA 3
서열 번호 19 - 인공 서열의 설명 : 마우스 DC-STAMP 의 주형 DNA 4
서열 번호 20 - 인공 서열의 설명 : 마우스 DC-STAMP 의 주형 DNA 5
서열 번호 21 - 인공 서열의 설명 : 마우스 DC-STAMP 의 주형 DNA 6
서열 번호 22 - 인공 서열의 설명 : 마우스 DC-STAMP 의 주형 DNA 7
서열 번호 23 - 인공 서열의 설명 : 마우스 DC-STAMP 의 주형 DNA 8
서열 번호 24 - 인공 서열의 설명 : 마우스 DC-STAMP 의 순방향 PCR 프라이머
서열 번호 25 - 인공 서열의 설명 : 마우스 DC-STAMP 의 역방향 PCR 프라이머
<110> SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Antibodies for the osteoclast related protein <130> FP0504 <150> JP2004-035216 <151> 2004-02-12 <160> 27 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1952 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (50)..(1459) <223> Inventor: Nomiyama, Hisayuki; Kukita, Toshio; Hiruma, Yoshiharu <400> 1 gcatttctgc attcgaagaa gaatctgaga gaaacctgac gcagggagc atg ggt atc 58 Met Gly Ile 1 tgg acc tca ggc act gat atc ttc cta agt ctt tgg gag att tac gtg 106 Trp Thr Ser Gly Thr Asp Ile Phe Leu Ser Leu Trp Glu Ile Tyr Val 5 10 15 tct cca aga agc ccc gga tgg atg gac ttt atc cag cat ttg gga gtt 154 Ser Pro Arg Ser Pro Gly Trp Met Asp Phe Ile Gln His Leu Gly Val 20 25 30 35 tgc tgt ttg gtt gct ctt att tca gtg ggc ctc ctg tct gtg gcc gcc 202 Cys Cys Leu Val Ala Leu Ile Ser Val Gly Leu Leu Ser Val Ala Ala 40 45 50 tgc tgg ttt ctg cca tca atc ata gcg gcc gct gcc tcc tgg att atc 250 Cys Trp Phe Leu Pro Ser Ile Ile Ala Ala Ala Ala Ser Trp Ile Ile 55 60 65 acg tgt gtt ctg ctg tgt tgc tcc aag cat gca cga tgt ttt att ctt 298 Thr Cys Val Leu Leu Cys Cys Ser Lys His Ala Arg Cys Phe Ile Leu 70 75 80 ctt gtc ttt ctc tct tgt ggc ctg cgt gaa ggc agg aat gct ttg att 346 Leu Val Phe Leu Ser Cys Gly Leu Arg Glu Gly Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 gca gct ggc aca ggg atc gtc atc ttg gga cac gta gaa aat att ttt 394 Ala Ala Gly Thr Gly Ile Val Ile Leu Gly His Val Glu Asn Ile Phe 100 105 110 115 cac aac ttt aaa ggt ctc cta gat ggt atg act tgc aac cta agg gca 442 His Asn Phe Lys Gly Leu Leu Asp Gly Met Thr Cys Asn Leu Arg Ala 120 125 130 aag agc ttt tcc ata cat ttt cca ctt ttg aaa aaa tat att gag gca 490 Lys Ser Phe Ser Ile His Phe Pro Leu Leu Lys Lys Tyr Ile Glu Ala 135 140 145 att cag tgg att tat ggc ctt gcc act cca cta agt gta ttt gat gac 538 Ile Gln Trp Ile Tyr Gly Leu Ala Thr Pro Leu Ser Val Phe Asp Asp 150 155 160 ctt gtt tct tgg aac cag acc ctg gca gtc tct ctt ttc agt ccc agc 586 Leu Val Ser Trp Asn Gln Thr Leu Ala Val Ser Leu Phe Ser Pro Ser 165 170 175 cat gtc ctg 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290 aac ctg ggg ctg ttt ttc ctc ccc ata ctt atc cat ctc tgc atc tgg 970 Asn Leu Gly Leu Phe Phe Leu Pro Ile Leu Ile His Leu Cys Ile Trp 295 300 305 gtg ctg ttt gca gct gta gat tat ctg ctg tat cgg ctc att ttc tca 1018 Val Leu Phe Ala Ala Val Asp Tyr Leu Leu Tyr Arg Leu Ile Phe Ser 310 315 320 gtg agc aag cag ttt caa agc ttg cca ggg ttt gag gtt cac ttg aaa 1066 Val Ser Lys Gln Phe Gln Ser Leu Pro Gly Phe Glu Val His Leu Lys 325 330 335 ctg cac gga gag aaa caa gga act caa gat att atc cat gat tct tcc 1114 Leu His Gly Glu Lys Gln Gly Thr Gln Asp Ile Ile His Asp Ser Ser 340 345 350 355 ttt aat ata tct gtg ttt gaa ccc aac tgt atc cca aaa cca aaa ttc 1162 Phe Asn Ile Ser Val Phe Glu Pro Asn Cys Ile Pro Lys Pro Lys Phe 360 365 370 ctt cta tct gag acc tgg gtt cct ctc agt gtt att ctt ttg ata tta 1210 Leu Leu Ser Glu Thr Trp Val Pro Leu Ser Val Ile Leu Leu Ile Leu 375 380 385 gtg atg ctg gga ctg ttg tcc tct atc ctt atg caa ctt aaa atc ctg 1258 Val Met Leu Gly Leu Leu Ser Ser Ile Leu Met Gln Leu 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Thr Pro Leu Ser Val 145 150 155 160 Phe Asp Asp Leu Val Ser Trp Asn Gln Thr Leu Ala Val Ser Leu Phe 165 170 175 Ser Pro Ser His Val Leu Glu Ala Gln Leu Asn Asp Ser Lys Gly Glu 180 185 190 Val Leu Ser Val Leu Tyr Gln Met Ala Thr Thr Thr Glu Val Leu Ser 195 200 205 Ser Leu Gly Gln Lys Leu Leu Ala Phe Ala Gly Leu Ser Leu Val Leu 210 215 220 Leu Gly Thr Gly Leu Phe Met Lys Arg Phe Leu Gly Pro Cys Gly Trp 225 230 235 240 Lys Tyr Glu Asn Ile Tyr Ile Thr Arg Gln Phe Val Gln Phe Asp Glu 245 250 255 Arg Glu Arg His Gln Gln Arg Pro Cys Val Leu Pro Leu Asn Lys Glu 260 265 270 Glu Arg Arg Lys Tyr Val Ile Ile Pro Thr Phe Trp Pro Thr Pro Lys 275 280 285 Glu Arg Lys Asn Leu Gly Leu Phe Phe Leu Pro Ile Leu Ile His Leu 290 295 300 Cys Ile Trp Val Leu Phe Ala Ala Val Asp Tyr Leu Leu Tyr Arg Leu 305 310 315 320 Ile Phe Ser Val Ser Lys Gln Phe Gln Ser Leu Pro Gly Phe Glu Val 325 330 335 His Leu Lys Leu His Gly Glu Lys Gln Gly Thr Gln Asp Ile Ile His 340 345 350 Asp Ser Ser Phe Asn Ile Ser Val Phe Glu Pro Asn Cys Ile Pro Lys 355 360 365 Pro Lys Phe Leu Leu Ser Glu Thr Trp Val Pro Leu Ser Val Ile Leu 370 375 380 Leu Ile Leu Val Met Leu Gly Leu Leu Ser Ser Ile Leu Met Gln Leu 385 390 395 400 Lys Ile Leu Val Ser Ala Ser Phe Tyr Pro Ser Val Glu Arg Lys Arg 405 410 415 Ile Gln Tyr Leu His Ala Lys Leu Leu Lys Lys Arg Ser Lys Gln Pro 420 425 430 Leu Gly Glu Val Lys Arg Arg Leu Ser Leu Tyr Leu Thr Lys Ile His 435 440 445 Phe Trp Leu Pro Val Leu Lys Met Ile Arg Lys Lys Gln Met Asp Met 450 455 460 Ala Ser Ala Asp Lys Ser 465 470 <210> 3 <211> 1993 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (50)..(1459) <400> 3 gtgctttgtg cttgtggagg aacctaagcg gaacttagac acagggaga atg agg ctc 58 Met Arg Leu 1 tgg acc ttg ggc acc agt att ttc ctg agg ctt tgg ggg act tat gtg 106 Trp Thr Leu Gly Thr Ser Ile Phe Leu Arg Leu Trp Gly Thr Tyr Val 5 10 15 ttt cca cga agc cct agc tgg ctg gac ttc atc cag cat ttg gga gtc 154 Phe Pro Arg Ser Pro Ser Trp Leu Asp Phe Ile Gln His Leu Gly Val 20 25 30 35 tgt tgc ttt gtg gcc ttc ctt tcg gtg agc ctc ttc tct gca gcc ttt 202 Cys Cys Phe Val Ala Phe Leu Ser Val Ser Leu Phe Ser Ala Ala Phe 40 45 50 tac tgg atc ctg cca ccc gtt gcc ctg ctc tct tct gtc tgg atg atc 250 Tyr Trp Ile Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Ser Ser Val Trp Met Ile 55 60 65 acc tgt gtt ttc cta tgc tgt tcc aag cgc gca cga tgc ttc att ctt 298 Thr Cys Val Phe Leu Cys Cys Ser Lys Arg Ala Arg Cys Phe Ile Leu 70 75 80 ctg gcc gtt ctg tcg tgt ggc ctc cgt gaa ggt agg aac gct ttg att 346 Leu Ala Val Leu Ser Cys Gly Leu Arg Glu Gly Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 gcg gct ggc act ggg gta gtg atc ttt gga cat gtg gaa aat att ttt 394 Ala Ala Gly Thr Gly Val Val Ile Phe Gly His Val Glu Asn Ile Phe 100 105 110 115 tat aac ttc aga ggt ctc cta gac agc atg act tgc aac cta agg gca 442 Tyr Asn Phe Arg Gly Leu Leu Asp Ser Met Thr Cys Asn Leu Arg Ala 120 125 130 aag agc ttt tca gta cat ttc cca ctt tta aaa cgg tat act gaa gcc 490 Lys Ser Phe Ser Val His Phe Pro Leu Leu Lys Arg Tyr Thr Glu Ala 135 140 145 atc cag tgg att tac ggc ctt gcc act ccg ctg aat cta ttt gat gac 538 Ile Gln Trp Ile Tyr Gly Leu Ala Thr Pro Leu Asn Leu Phe Asp Asp 150 155 160 ctt gtt tct tgg aac cag act ctg gtg gtc tct ctt ttt agt ccc agc 586 Leu Val Ser Trp Asn Gln Thr Leu Val Val Ser Leu Phe Ser Pro Ser 165 170 175 cat gcc ctg gag gct cat atg aat gac act aga gga gaa gtc ctg gga 634 His Ala Leu Glu Ala His Met Asn Asp Thr Arg Gly Glu Val Leu Gly 180 185 190 195 gtc ctg cac cat atg gtg gtc acg aca gag ctg ttg act tcc gtg ggc 682 Val Leu His His Met Val Val Thr Thr Glu Leu Leu Thr Ser Val Gly 200 205 210 cag aag ttg ctt gcc ctt gcc ggg ctt ctg ctc atc cta gtc agc act 730 Gln Lys Leu Leu Ala Leu Ala Gly Leu Leu Leu Ile Leu Val Ser Thr 215 220 225 ggc ctc ttc ctg aag cga ttc ctg ggc cct tgt ggc tgg aag tat gag 778 Gly Leu Phe Leu Lys Arg Phe Leu Gly Pro Cys Gly Trp Lys Tyr Glu 230 235 240 aat gtc tac atc acc aaa caa ttt gtt cgg ttt gat gaa aag gag agg 826 Asn Val Tyr Ile Thr Lys Gln Phe Val Arg Phe Asp Glu Lys Glu Arg 245 250 255 cac caa cag cgg ccc tgt gtc ctc ccg ctg aat aag aag gaa agg aag 874 His Gln Gln Arg Pro Cys Val Leu Pro Leu Asn Lys Lys Glu Arg Lys 260 265 270 275 aaa tat gtc atc gtc cca tct ttg cag ctg act cct aag gag aag aaa 922 Lys Tyr Val Ile Val Pro Ser Leu Gln Leu Thr Pro Lys Glu Lys Lys 280 285 290 acc ctt ggg ctg ttc ttc ctt cct gtc ctg acc tat ctc tac atg tgg 970 Thr Leu Gly Leu Phe Phe Leu Pro Val Leu Thr Tyr Leu Tyr Met Trp 295 300 305 gtg ctg ttt gcc gct gtg gac tat ctg ctg tat cgg ctc atc tcc tcc 1018 Val Leu Phe Ala Ala Val Asp Tyr Leu Leu Tyr Arg Leu Ile Ser Ser 310 315 320 atg aac aaa cag ttc caa agc ttg cca ggg ctg gaa gtt cac ttg aaa 1066 Met Asn Lys Gln Phe Gln Ser Leu Pro Gly Leu Glu Val His Leu Lys 325 330 335 cta cgt gga gag aag caa gga acc caa gga gtc gtc cat gat tct gcc 1114 Leu Arg Gly Glu Lys Gln Gly Thr Gln Gly Val Val His Asp Ser Ala 340 345 350 355 ttt aat ata tct atg ttt gaa ccg agc tgc att cct aaa cca cgt ctc 1162 Phe Asn Ile Ser Met Phe Glu Pro Ser Cys Ile Pro Lys Pro Arg Leu 360 365 370 agt gtg tct gag act tgg gtt cct ctc agt att att ctg tta aca cta 1210 Ser Val Ser Glu Thr Trp Val Pro Leu Ser Ile Ile Leu Leu Thr Leu 375 380 385 ata ata cta gga ttg ttg tct tct atg ctg atg cag ctt aaa att ctc 1258 Ile Ile Leu Gly Leu Leu Ser Ser Met Leu Met Gln Leu Lys Ile Leu 390 395 400 gtg tca gtc tcc ttc tac ccc aaa gtg gag agg gag aga att gaa tac 1306 Val Ser Val Ser Phe Tyr Pro Lys Val Glu Arg Glu Arg Ile Glu Tyr 405 410 415 ctg cat gcg aag ctc ctt gag aaa cga tca aag cag cca ttg aga gag 1354 Leu His Ala Lys Leu Leu Glu Lys Arg Ser Lys Gln Pro Leu Arg Glu 420 425 430 435 gct gac ggg aaa ccg agc ctg tac ttt aaa aag att cat ttc tgg ttt 1402 Ala Asp Gly Lys Pro Ser Leu Tyr Phe Lys Lys Ile His Phe Trp Phe 440 445 450 cca gtc ctg aaa atg att agg aag aag cag aca atc cct gca aat gaa 1450 Pro Val Leu Lys Met Ile Arg Lys Lys Gln Thr Ile Pro Ala Asn Glu 455 460 465 gat gat cta t gagcaacaca gtccctcttt ctgggccaac tgctgcttct 1500 Asp Asp Leu 470 gtctactcaa caagaggggg ctatctgaga aggtctacag atgtttgagt ttgcaaggct 1560 gcctttctct ttggtgatcc ttcaagatac atgtcgatca taatgccaaa tagcccctag 1620 gtaaatagtt tcagagtctg tcttccaaac aaaacacagt atctaaactg tgtcatagtt 1680 aaagctatgg tgatggctgg catggaaatg tcctccaaag gcttagatat ttgaaaactt 1740 ggtccccagt tagtgcatct tgggggaggc ttataaggtg tcatgttgct ggacaaagtg 1800 tgactccaga ggagtgtttt gcagttttaa aagtcatgtg ctactcctgt tcactctact 1860 cagcctgtgg ctggagatgt gggctctcag ctgtccctgc ctccatgtct gtctgtaata 1920 gagttcccaa ctgtgatatt gatggagtct tacctctctg aaaccttaag cccaaataaa 1980 tccttccttc tat 1993 <210> 4 <211> 470 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Arg Leu Trp Thr Leu Gly Thr Ser Ile Phe Leu Arg Leu Trp Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Val Phe Pro Arg Ser Pro Ser Trp Leu Asp Phe Ile Gln His 20 25 30 Leu Gly Val Cys Cys Phe Val Ala Phe Leu Ser Val Ser Leu Phe Ser 35 40 45 Ala Ala Phe Tyr Trp Ile Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Ser Ser Val 50 55 60 Trp Met Ile Thr Cys Val Phe Leu Cys Cys Ser Lys Arg Ala Arg Cys 65 70 75 80 Phe Ile Leu Leu Ala Val Leu Ser Cys Gly Leu Arg Glu Gly Arg Asn 85 90 95 Ala Leu Ile Ala Ala Gly Thr Gly Val Val Ile Phe Gly His Val Glu 100 105 110 Asn Ile Phe Tyr Asn Phe Arg Gly Leu Leu Asp Ser Met Thr Cys Asn 115 120 125 Leu Arg Ala Lys Ser Phe Ser Val His Phe Pro Leu Leu Lys Arg Tyr 130 135 140 Thr Glu Ala Ile Gln Trp Ile Tyr Gly Leu Ala Thr Pro Leu Asn Leu 145 150 155 160 Phe Asp Asp Leu Val Ser Trp Asn Gln Thr Leu Val Val Ser Leu Phe 165 170 175 Ser Pro Ser His Ala Leu Glu Ala His Met Asn Asp Thr Arg Gly Glu 180 185 190 Val Leu Gly Val Leu His His Met Val Val Thr Thr Glu Leu Leu Thr 195 200 205 Ser Val Gly Gln Lys Leu Leu Ala Leu Ala Gly Leu Leu Leu Ile Leu 210 215 220 Val Ser Thr Gly Leu Phe Leu Lys Arg Phe Leu Gly Pro Cys Gly Trp 225 230 235 240 Lys Tyr Glu Asn Val Tyr Ile Thr Lys Gln Phe Val Arg Phe Asp Glu 245 250 255 Lys Glu Arg His Gln Gln Arg Pro Cys Val Leu Pro Leu Asn Lys Lys 260 265 270 Glu Arg Lys Lys Tyr Val Ile Val Pro Ser Leu Gln Leu Thr Pro Lys 275 280 285 Glu Lys Lys Thr Leu Gly Leu Phe Phe Leu Pro Val Leu Thr Tyr Leu 290 295 300 Tyr Met Trp Val Leu Phe Ala Ala Val Asp Tyr Leu Leu Tyr Arg Leu 305 310 315 320 Ile Ser Ser Met Asn Lys Gln Phe Gln Ser Leu Pro Gly Leu Glu Val 325 330 335 His Leu Lys Leu Arg Gly Glu Lys Gln Gly Thr Gln Gly Val Val His 340 345 350 Asp Ser Ala Phe Asn Ile Ser Met Phe Glu Pro Ser Cys Ile Pro Lys 355 360 365 Pro Arg Leu Ser Val Ser Glu Thr Trp Val Pro Leu Ser Ile Ile Leu 370 375 380 Leu Thr Leu Ile Ile Leu Gly Leu Leu Ser Ser Met Leu Met Gln Leu 385 390 395 400 Lys Ile Leu Val Ser Val Ser Phe Tyr Pro Lys Val Glu Arg Glu Arg 405 410 415 Ile Glu Tyr Leu His Ala Lys Leu Leu Glu Lys Arg Ser Lys Gln Pro 420 425 430 Leu Arg Glu Ala Asp Gly Lys Pro Ser Leu Tyr Phe Lys Lys Ile His 435 440 445 Phe Trp Phe Pro Val Leu Lys Met Ile Arg Lys Lys Gln Thr Ile Pro 450 455 460 Ala Asn Glu Asp Asp Leu 465 470 <210> 5 <211> 1825 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (50)..(1291) <400> 5 gtgctttgtg cttgtggagg aacctaagcg gaacttagac acagggaga atg agg ctc 58 Met Arg Leu 1 tgg acc ttg ggc acc agt att ttc ctg agg ctt tgg ggg act tat gtg 106 Trp Thr Leu Gly Thr Ser Ile Phe Leu Arg Leu Trp Gly Thr Tyr Val 5 10 15 ttt cca cga agc cct agc tgg ctg gac ttc atc cag cat ttg gga gtc 154 Phe Pro Arg Ser Pro Ser Trp Leu Asp Phe Ile Gln His Leu Gly Val 20 25 30 35 tgt tgc ttt gtg gcc ttc ctt tcg gtg agc ctc ttc tct gca gcc ttt 202 Cys Cys Phe Val Ala Phe Leu Ser Val Ser Leu Phe Ser Ala Ala Phe 40 45 50 tac tgg atc ctg cca ccc gtt gcc ctg ctc tct tct gtc tgg atg atc 250 Tyr Trp Ile Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Ser Ser Val Trp Met Ile 55 60 65 acc tgt gtt ttc cta tgc tgt tcc aag cgc gca cga tgc ttc att ctt 298 Thr Cys Val Phe Leu Cys Cys Ser Lys Arg Ala Arg Cys Phe Ile Leu 70 75 80 ctg gcc gtt ctg tcg tgt ggc ctc cgt gaa ggt agg aac gct ttg att 346 Leu Ala Val Leu Ser Cys Gly Leu Arg Glu Gly Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 gcg gct ggc act ggg gta gtg atc ttt gga cat gtg gaa aat att ttt 394 Ala Ala Gly Thr Gly Val Val Ile Phe Gly His Val Glu Asn Ile Phe 100 105 110 115 tat aac ttc aga ggt ctc cta gac agc atg act tgc aac cta agg gca 442 Tyr Asn Phe Arg Gly Leu Leu Asp Ser Met Thr Cys Asn Leu Arg Ala 120 125 130 aag agc ttt tca gta cat ttc cca ctt tta aaa cgg tat act gaa gcc 490 Lys Ser Phe Ser Val His Phe Pro Leu Leu Lys Arg Tyr Thr Glu Ala 135 140 145 atc cag tgg att tac ggc ctt gcc act ccg ctg aat cta ttt gat gac 538 Ile Gln Trp Ile Tyr Gly Leu Ala Thr Pro Leu Asn Leu Phe Asp Asp 150 155 160 ctt gtt tct tgg aac cag act ctg gtg gtc tct ctt ttt agt ccc agc 586 Leu Val Ser Trp Asn Gln Thr Leu Val Val Ser Leu Phe Ser Pro Ser 165 170 175 cat gcc ctg gag gct cat atg aat gac act aga gga gaa gtc ctg gga 634 His Ala Leu Glu Ala His Met Asn Asp Thr Arg Gly Glu Val Leu Gly 180 185 190 195 gtc ctg cac cat atg gtg gtc acg aca gag ctg ttg act tcc gtg ggc 682 Val Leu His His Met Val Val Thr Thr Glu Leu Leu Thr Ser Val Gly 200 205 210 cag aag ttg ctt gcc ctt gcc ggg ctt ctg ctc atc cta gtc agc act 730 Gln Lys Leu Leu Ala Leu Ala Gly Leu Leu Leu Ile Leu Val Ser Thr 215 220 225 ggc ctc ttc ctg aag cga ttc ctg ggc cct tgt ggc tgg aag tat gag 778 Gly Leu Phe Leu Lys Arg Phe Leu Gly Pro Cys Gly Trp Lys Tyr Glu 230 235 240 aat gtc tac atc acc aaa caa ttt gtt cgg ttt gat gaa aag gag agg 826 Asn Val Tyr Ile Thr Lys Gln Phe Val Arg Phe Asp Glu Lys Glu Arg 245 250 255 cac caa cag cgg ccc tgt gtc ctc ccg ctg aat aag aag gaa agg aag 874 His Gln Gln Arg Pro Cys Val Leu Pro Leu Asn Lys Lys Glu Arg Lys 260 265 270 275 aaa tat gtc atc gtc cca tct ttg cag ctg act cct aag gag aag aaa 922 Lys Tyr Val Ile Val Pro Ser Leu Gln Leu Thr Pro Lys Glu Lys Lys 280 285 290 acc ctt ggg ctg ttc ttc ctt cct gtc ctg acc tat ctc tac atg tgg 970 Thr Leu Gly Leu Phe Phe Leu Pro Val Leu Thr Tyr Leu Tyr Met Trp 295 300 305 gtg ctg ttt gcc gct gtg gac tat ctg ctg tat cgg ctc atc tcc tcc 1018 Val Leu Phe Ala Ala Val Asp Tyr Leu Leu Tyr Arg Leu Ile Ser Ser 310 315 320 atg aac aaa cag ttc caa agc ttg cca ggg ctg gaa gtt cac ttg aaa 1066 Met Asn Lys Gln Phe Gln Ser Leu Pro Gly Leu Glu Val His Leu Lys 325 330 335 cta cgt gga gag ctt aaa att ctc gtg tca gtc tcc ttc tac ccc aaa 1114 Leu Arg Gly Glu Leu Lys Ile Leu Val Ser Val Ser Phe Tyr Pro Lys 340 345 350 355 gtg gag agg gag aga att gaa tac ctg cat gcg aag ctc ctt gag aaa 1162 Val Glu Arg Glu Arg Ile Glu Tyr Leu His Ala Lys Leu Leu Glu Lys 360 365 370 cga tca aag cag cca ttg aga gag gct gac ggg aaa ccg agc ctg tac 1210 Arg Ser Lys Gln Pro Leu Arg Glu Ala Asp Gly Lys Pro Ser Leu Tyr 375 380 385 ttt aaa aag att cat ttc tgg ttt cca gtc ctg aaa atg att agg aag 1258 Phe Lys Lys Ile His Phe Trp Phe Pro Val Leu Lys Met Ile Arg Lys 390 395 400 aag cag aca atc cct gca aat gaa gat gat cta tgagcaaca cagtccctct 1310 Lys Gln Thr Ile Pro Ala Asn Glu Asp Asp Leu 405 410 ttctgggcca actgctgctt ctgtctactc aacaagaggg ggctatctga gaaggtctac 1370 agatgtttga gtttgcaagg ctgcctttct ctttggtgat ccttcaagat acatgtcgat 1430 cataatgcca aatagcccct aggtaaatag tttcagagtc tgtcttccaa acaaaacaca 1490 gtatctaaac tgtgtcatag ttaaagctat ggtgatggct ggcatggaaa tgtcctccaa 1550 aggcttagat atttgaaaac ttggtcccca gttagtgcat cttgggggag gcttataagg 1610 tgtcatgttg ctggacaaag tgtgactcca gaggagtgtt ttgcagtttt aaaagtcatg 1670 tgctactcct gttcactcta ctcagcctgt ggctggagat gtgggctctc agctgtccct 1730 gcctccatgt ctgtctgtaa tagagttccc aactgtgata ttgatggagt cttacctctc 1790 tgaaacctta agcccaaata aatccttcct tctat 1825 <210> 6 <211> 414 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Met Arg Leu Trp Thr Leu Gly Thr Ser Ile Phe Leu Arg Leu Trp Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Val Phe Pro Arg Ser Pro Ser Trp Leu Asp Phe Ile Gln His 20 25 30 Leu Gly Val Cys Cys Phe Val Ala Phe Leu Ser Val Ser Leu Phe Ser 35 40 45 Ala Ala Phe Tyr Trp Ile Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Ser Ser Val 50 55 60 Trp Met Ile Thr Cys Val Phe Leu Cys Cys Ser Lys Arg Ala Arg Cys 65 70 75 80 Phe Ile Leu Leu Ala Val Leu Ser Cys Gly Leu Arg Glu Gly Arg Asn 85 90 95 Ala Leu Ile Ala Ala Gly Thr Gly Val Val Ile Phe Gly His Val Glu 100 105 110 Asn Ile Phe Tyr Asn Phe Arg Gly Leu Leu 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Leu Pro Gly Leu Glu Val 325 330 335 His Leu Lys Leu Arg Gly Glu Leu Lys Ile Leu Val Ser Val Ser Phe 340 345 350 Tyr Pro Lys Val Glu Arg Glu Arg Ile Glu Tyr Leu His Ala Lys Leu 355 360 365 Leu Glu Lys Arg Ser Lys Gln Pro Leu Arg Glu Ala Asp Gly Lys Pro 370 375 380 Ser Leu Tyr Phe Lys Lys Ile His Phe Trp Phe Pro Val Leu Lys Met 385 390 395 400 Ile Arg Lys Lys Gln Thr Ile Pro Ala Asn Glu Asp Asp Leu 405 410 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 aaaacccttg ggctgttctt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 cttcgcatgc aggtattcaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 gagggccaac tcaagaagaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 gccgtggcgt tatacataca 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 cagctgtcct ggctcaaaa 19 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 acatagccca caccgttctc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 aaacccatca ccatcttcca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 gtggttcaca cccatcacaa 20 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic partial peptide of mouse DC-STAMP <400> 15 Cys Ser Leu Pro Gly Leu Glu Val His Leu Lys Leu Arg Gly Glu 1 5 10 15 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template 1 for mouse DC-STAMP <400> 16 aatactagga ttgttgtctt ccctgtctc 29 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template 2 for mouse DC-STAMP <400> 17 aagaagacaa caatcctagt acctgtctc 29 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template 3 for mouse DC-STAMP <400> 18 aatactagga gcgttgtctt ccctgtctc 29 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template 4 for mouse DC-STAMP <400> 19 aagaagacaa cgctcctagt acctgtctc 29 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template 5 for mouse DC-STAMP <400> 20 aattctcgtg tcagtctcct tcctgtctc 29 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template 6 for mouse DC-STAMP <400> 21 aaaaggagac tgacacgaga acctgtctc 29 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template 7 for mouse DC-STAMP <400> 22 aattctcgta ccagtctcct tcctgtctc 29 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA template 8 for mouse DC-STAMP <400> 23 aaaaggagac tggtacgaga acctgtctc 29 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer for mouse DC-STAMP <400> 24 tttgtcgaca tgaggctctg gaccttgggc accagtattt t 41 <210> 25 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer for mouse DC-STAMP <400> 25 tttgcggccg ctcatagatc atcttcattt gcagggattg t 41 <210> 26 <211> 1413 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1410) <400> 26 atg agg ctc tgg acc ttg ggc acc agt att ttc ctg agg ctt tgg ggg 48 Met Arg Leu Trp Thr Leu Gly Thr Ser Ile Phe Leu Arg Leu Trp Gly 1 5 10 15 act tat gtg ttt cca cga agc cct agc tgg ctg gac ttc atc cag cat 96 Thr Tyr Val Phe Pro Arg Ser Pro Ser Trp Leu Asp Phe Ile Gln His 20 25 30 ttg gga gtc tgt tgc ttt gtg gcc ttc ctt tcg gtg agc ctc ttc tct 144 Leu Gly Val Cys Cys Phe Val Ala Phe Leu Ser Val Ser Leu Phe Ser 35 40 45 gca gcc ttt tac tgg atc ctg cca ccc gtt gcc ctg ctc tct tct gtc 192 Ala Ala Phe Tyr Trp Ile Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Ser Ser Val 50 55 60 tgg atg atc acc tgt gtt ttc cta tgc tgt tcc aag cgc gca cga tgc 240 Trp Met Ile Thr Cys Val Phe Leu Cys Cys Ser Lys Arg Ala Arg Cys 65 70 75 80 ttc att ctt ctg gcc gtt ctg tcg tgt ggc ctc cgt gaa ggt agg aac 288 Phe Ile Leu Leu Ala Val Leu Ser Cys Gly Leu Arg Glu Gly Arg Asn 85 90 95 gct ttg att gcg gct ggc act ggg gta gtg atc ttt gga cat gtg gaa 336 Ala Leu Ile Ala Ala Gly Thr Gly Val Val Ile Phe Gly His Val Glu 100 105 110 aat att ttt tat aac ttc aga ggt ctc cta gac agc atg act tgc aac 384 Asn Ile Phe Tyr Asn Phe Arg Gly Leu Leu Asp Ser Met Thr Cys Asn 115 120 125 cta agg gca aag agc ttt tca gta cat ttc cca ctt tta aaa cgg tat 432 Leu Arg Ala Lys Ser Phe Ser Val His Phe Pro Leu Leu Lys Arg Tyr 130 135 140 act gaa gcc atc cag tgg att tac ggc ctt gcc act ccg ctg aat cta 480 Thr Glu Ala Ile Gln Trp Ile Tyr Gly Leu Ala Thr Pro Leu Asn Leu 145 150 155 160 ttt gat gac ctt gtt tct tgg aac cag act ctg gtg gtc tct ctt ttt 528 Phe Asp Asp Leu Val Ser Trp Asn Gln Thr Leu Val Val Ser Leu Phe 165 170 175 agt ccc agc cat gcc ctg gag gct cat atg aat gac act aga gga gaa 576 Ser Pro Ser His Ala Leu Glu Ala His Met Asn Asp Thr Arg Gly Glu 180 185 190 gtc ctg gga gtc ctg cac cat atg gtg gtc acg aca gag ctg ttg act 624 Val Leu Gly Val Leu His His Met Val Val Thr Thr Glu Leu Leu Thr 195 200 205 tcc gtg ggc cag aag ttg ctt gcc ctt gcc ggg ctt ctg ctc atc cta 672 Ser Val Gly Gln Lys Leu Leu Ala Leu Ala Gly Leu Leu Leu Ile Leu 210 215 220 gtc agc act ggc ctc ttc ctg aag cga ttc ctg ggc cct tgt ggc tgg 720 Val Ser Thr Gly Leu Phe Leu Lys Arg Phe Leu Gly Pro Cys Gly Trp 225 230 235 240 aag tat gag aat gtc tac atc acc aaa caa ttt gtt cgg ttt gat gaa 768 Lys Tyr Glu Asn Val Tyr Ile Thr Lys Gln Phe Val Arg Phe Asp Glu 245 250 255 aag gag agg cac caa cag cgg ccc tgt gtc ctc ccg ctg aat aag aag 816 Lys Glu Arg His Gln Gln Arg Pro Cys Val Leu Pro Leu Asn Lys Lys 260 265 270 gaa agg aag aaa tat gtc atc gtc cca tct ttg cag ctg act cct aag 864 Glu Arg Lys Lys Tyr Val Ile Val Pro Ser Leu Gln Leu Thr Pro Lys 275 280 285 gag aag aaa acc ctt ggg ctg ttc ttc ctt cct gtc ctg acc tat ctc 912 Glu Lys Lys Thr Leu Gly Leu Phe Phe Leu Pro Val Leu Thr Tyr Leu 290 295 300 tac atg tgg gtg ctg ttt gcc gct gtg gac tat ctg ctg tat cgg ctc 960 Tyr Met Trp Val Leu Phe Ala Ala Val Asp Tyr Leu Leu Tyr Arg Leu 305 310 315 320 atc tcc tcc atg aac aaa cag ttc caa agc ttg cca ggg ctg gaa gtt 1008 Ile Ser Ser Met Asn Lys Gln Phe Gln Ser Leu Pro Gly Leu Glu Val 325 330 335 cac ttg aaa cta cgt gga gag aag caa gga acc caa gga gtc gtc cat 1056 His Leu Lys Leu Arg Gly Glu Lys Gln Gly Thr Gln Gly Val Val His 340 345 350 gat tct gcc ttt aat ata tct atg ttt gaa ccg agc tgc att cct aaa 1104 Asp Ser Ala Phe Asn Ile Ser Met Phe Glu Pro Ser Cys Ile Pro Lys 355 360 365 cca cgt ctc agt gtg tct gag act tgg gtt cct ctc agt att att ctg 1152 Pro Arg Leu Ser Val Ser Glu Thr Trp Val Pro Leu Ser Ile Ile Leu 370 375 380 tta aca cta ata ata cta gga ttg ttg tct tct atg ctg atg cag ctt 1200 Leu Thr Leu Ile Ile Leu Gly Leu Leu Ser Ser Met Leu Met Gln Leu 385 390 395 400 aaa att ctc gtg tca gtc tcc ttc tac ccc aaa gtg gag agg gag aga 1248 Lys Ile Leu Val Ser Val Ser Phe Tyr Pro Lys Val Glu Arg Glu Arg 405 410 415 att gaa tac ctg cat gcg aag ctc ctt gag aaa cga tca aag cag cca 1296 Ile Glu Tyr Leu His Ala Lys Leu Leu Glu Lys Arg Ser Lys Gln Pro 420 425 430 ttg aga gag gct gac ggg aaa ccg agc ctg tac ttt aaa aag att cat 1344 Leu Arg Glu Ala Asp Gly Lys Pro Ser Leu Tyr Phe Lys Lys Ile His 435 440 445 ttc tgg ttt cca gtc ctg aaa atg att agg aag aag cag aca atc cct 1392 Phe Trp Phe Pro Val Leu Lys Met Ile Arg Lys Lys Gln Thr Ile Pro 450 455 460 gca aat gaa gat gat cta tga 1413 Ala Asn Glu Asp Asp Leu 465 470 <210> 27 <211> 470 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Met Arg Leu Trp Thr Leu Gly Thr Ser Ile Phe Leu Arg Leu Trp Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Val Phe Pro Arg Ser Pro Ser Trp Leu Asp Phe Ile Gln His 20 25 30 Leu Gly Val Cys Cys Phe Val Ala Phe Leu Ser Val Ser Leu Phe Ser 35 40 45 Ala Ala Phe Tyr Trp Ile Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Ser Ser Val 50 55 60 Trp Met Ile Thr Cys Val Phe Leu Cys Cys Ser Lys Arg Ala Arg Cys 65 70 75 80 Phe Ile Leu Leu Ala Val Leu Ser Cys Gly Leu Arg Glu Gly Arg Asn 85 90 95 Ala Leu Ile Ala Ala Gly Thr Gly Val Val Ile Phe Gly His Val Glu 100 105 110 Asn Ile Phe Tyr Asn Phe Arg Gly Leu Leu Asp Ser Met Thr Cys Asn 115 120 125 Leu Arg Ala Lys Ser Phe Ser Val His Phe Pro Leu Leu Lys Arg Tyr 130 135 140 Thr Glu Ala Ile Gln Trp Ile Tyr Gly Leu Ala Thr Pro Leu Asn Leu 145 150 155 160 Phe Asp Asp Leu Val Ser Trp Asn Gln Thr Leu Val Val Ser Leu Phe 165 170 175 Ser Pro Ser His Ala Leu Glu Ala His Met Asn Asp Thr Arg Gly Glu 180 185 190 Val Leu Gly Val Leu His His Met Val Val Thr Thr Glu Leu Leu Thr 195 200 205 Ser Val Gly Gln Lys Leu Leu Ala Leu Ala Gly Leu Leu Leu Ile Leu 210 215 220 Val Ser Thr Gly Leu Phe Leu Lys Arg Phe Leu Gly Pro Cys Gly Trp 225 230 235 240 Lys Tyr Glu Asn Val Tyr Ile Thr Lys Gln Phe Val Arg Phe Asp Glu 245 250 255 Lys Glu Arg His Gln Gln Arg Pro Cys Val Leu Pro Leu Asn Lys Lys 260 265 270 Glu Arg Lys Lys Tyr Val Ile Val Pro Ser Leu Gln Leu Thr Pro Lys 275 280 285 Glu Lys Lys Thr Leu Gly Leu Phe Phe Leu Pro Val Leu Thr Tyr Leu 290 295 300 Tyr Met Trp Val Leu Phe Ala Ala Val Asp Tyr Leu Leu Tyr Arg Leu 305 310 315 320 Ile Ser Ser Met Asn Lys Gln Phe Gln Ser Leu Pro Gly Leu Glu Val 325 330 335 His Leu Lys Leu Arg Gly Glu Lys Gln Gly Thr Gln Gly Val Val His 340 345 350 Asp Ser Ala Phe Asn Ile Ser Met Phe Glu Pro Ser Cys Ile Pro Lys 355 360 365 Pro Arg Leu Ser Val Ser Glu Thr Trp Val Pro Leu Ser Ile Ile Leu 370 375 380 Leu Thr Leu Ile Ile Leu Gly Leu Leu Ser Ser Met Leu Met Gln Leu 385 390 395 400 Lys Ile Leu Val Ser Val Ser Phe Tyr Pro Lys Val Glu Arg Glu Arg 405 410 415 Ile Glu Tyr Leu His Ala Lys Leu Leu Glu Lys Arg Ser Lys Gln Pro 420 425 430 Leu Arg Glu Ala Asp Gly Lys Pro Ser Leu Tyr Phe Lys Lys Ile His 435 440 445 Phe Trp Phe Pro Val Leu Lys Met Ile Arg Lys Lys Gln Thr Ile Pro 450 455 460 Ala Asn Glu Asp Asp Leu 465 470

Claims (36)

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  2. 서열표의 서열 번호 2 의 330 내지 343 의 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열을 가지는 단백질 및 서열 번호 4 의 330 내지 343 의 아미노산 잔기들로 이루어진 아미노산 서열을 가지는 단백질로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 단백질과 특이적으로 결합하여 파골 세포의 형성을 억제할 수 있는 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 골 대사 이상의 치료용 의약 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    항체가 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서,
    항체가 인간화되어 있는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  5. 제 2 항에 있어서,
    항체가 완전 인간 항체인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  6. 제 2 항에 있어서,
    항체가 IgG 항체인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
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  24. 제 2 항에 있어서, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D3, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬 제제, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K2 (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone) 제제, 비스테로이드성 항염증제, 항 TNFα 항체, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 RANKL 항체 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 골 대사 이상의 치료용 의약 조성물.
  25. 삭제
  26. 제 2 항에 있어서,
    골 대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘 또는 암성 고칼슘 혈증인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  27. 제 2 항에 있어서,
    골 대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  28. 제 2 항에 있어서,
    골 대사 이상이 관절 류머티즘인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
  29. 제 2 항에 있어서,
    골 대사 이상이 암성 고칼슘 혈증인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
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