KR101130835B1

KR101130835B1 - 세포내 침투능 및 표적 핵산 염기서열 특이적 가수분해능을 지닌 핵산 가수분해 항체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR101130835B1
Application number: KR1020090108575A
Authority: KR
Inventors: 김용성; 권명희; 이우람
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2009-11-11
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2029-11-11
Also published as: WO2010056043A3; CN102209726A; WO2010056043A2; KR20100053466A; WO2010056043A9; US20110263829A1; EP2346899A2; EP2346899A4

Abstract

본 발명은 세포내 침투능 및 표적 핵산 염기서열 특이적 가수분해능을 지닌 핵산 가수분해 항체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체의 특정 부위를 변화시켜 핵산 가수분해 특성을 유지한 상태에서 서열 특이성을 갖도록 항체공학을 이용하여 개량함으로써, 특별한 외부 단백질 전달 시스템의 도움 없이 개량된 핵산 가수분해 항체가 스스로 세포내로 침투하여 세포질에 위치하거나 혹은 개량된 핵산 가수분해 항체를 세포 내부에서 발현시켰을 때 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해하는 능력을 가져 특정 유전자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

Description

세포내 침투능 및 표적 핵산 염기서열 특이적 가수분해능을 지닌 핵산 가수분해 항체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물{Cell-penetrating, sequence-specific and nucleic acid-hydrolyzing antibody, method for preparing the same and pharmaceutical composition comprising the same}

본 발명은 기존의 siRNA가 갖는 문제점을 극복할 차세대 유전자 침묵 기술로서, 스스로 세포내 침투능 및 표적 핵산 염기서열 특이적 가수분해능을 지닌 핵산 가수분해 항체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체의 특정 부위를 변화시켜 핵산 가수분해 특성을 유지한 상태에서 서열 특이성을 갖도록 항체공학을 이용하여 개량함으로써, 특별한 외부 단백질 전달 시스템의 도움 없이 개량된 핵산 가수분해 항체가 스스로 세포내로 침투하여 세포질에 위치하거나 혹은 개량된 핵산 가수분해 항체를 세포 내부에서 발현시켰을 때 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해하는 능력을 가져 특정 유전자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

생명 현상이 이루어지는 기본 원리인 센트럴 도그마(Central Dogma)에서 DNA, RNA, 단백질 각각의 역할은 매우 중요하다. DNA가 전사되어 RNA를 만들어 내려면 특정한 단백질들과 리보좀의 도움이 필요하다. 이 단백질들은 특정한 위치의 DNA와 결합한 후 전이를 시작하고, 만들어진 RNA에는 리보좀이 결합하여 단백질을 만들어 내게 된다. 이렇게 만들어진 단백질이 하는 일이 무엇인지 알아보기 위해 가장 널리 쓰이는 방법은, 생물체의 시스템에서 해당하는 단백질을 제거하는 것이다. 제거한 후 생명체가 어떻게 달라지는지를 연구하면 단백질의 역할을 규명할 수 있기 때문이다. 하지만 생명체에서 특정한 단백질의 발현 수준을 임의로 조절하는 일은 쉽지 않다. 그러나 단백질 대신에 특정 RNA(mRNA 포함)의 표적 핵산 염기서열을 특이적으로 인식하여 이의 단백질 발현을 저해하는 기술로 안티센스 올리고누클레오티드(antisense oligonucleotides), RNA 간섭(interference RNA, RNAi), 리보자임(ribozyme), DNAzymes 등이 개발되어져 특정 유전자 단백질 발현을 감소시키거나 없애는 방법이 편리해졌다(Scherer 등, Nature Biotechnology, 21:1457-1465, 2003; Tafech 등. Current Medical Chemistry, 13:863-881, 2006). 특히, 1998년 RNA 간섭의 기작이 알려지면서 RNA를 녹-다운(knock-down) 시키는 과정이 이전에 비해 매우 편리해졌다(Fire A 등, Nature, 391:806-811, 1998; Scherer 등, Nature Biotechnology, 21:1457-1465, 2003). RNA 간섭기술 중 가장 널리 쓰이는 방법은 소위 siRNA(small interfering RNA) 기술이다. siRNA 기술은 세포외부에서 전달하거나 세포내부에서 발생된 특정염기서열을 지닌 21-23 bp의 이중가닥이 세포내에서 특정 단백질을 코딩하는 mRNA을 인식하고 이를 가수분해하여 표적 단백질의 발현수준(소위 gene knock-down)을 낮추는 기술이다. siRNA 기술은 기본 원리가 밝혀진 지 10년이 채 안되었지만, 단백질 발현 수준을 낮추기 위해 식물/동물 세포에서 가장 많이 사용되는 기술로 자리를 잡았다. 하지만 RNAi 기술이 널리 사용되면서 그에 따른 문제점들이 발생하였다. 21-mer 가량의 RNA를 사용함에도 불구하고 RNA가 제자리를 못 찾아가서 발생하는 off-target 효과가 대표적인 예라고 할 수 있다. 또한 표적 기질과 1~2개의 염기쌍(base pair)이 맞지 않으면 siRNA에 의한 유전자 녹-다운 효과는 현저히 떨어지거나 아예 없다. 또 표적 유전자 중에 특정 영역은 RNAi가 효과적으로 작용하는 반면에 다른 영역에서는 RNAi 효과를 찾아보기 힘든 경우도 종종 발생한다. 이 외에도 의도하지 않은 면역반응의 야기, 표적세포로의 전달 미약, 누클레아제(nuclease)에 의한 불안전성 등의 문제점으로 인해 실제 치료제로의 응용에 제한이 있다(Scherer LJ 등, Nat Biotechnol, 21:1457-1465, 2003; Tafech A 등, Curr Med Chem, 13:863-881, 2006).

DNA 또는 RNA 핵산에 결합하는 핵산 결합 항체는 자가면역 질환을 가진 사람과 마우스에서 주로 발견되는 자가항체(autoantibody)로, 1957년 전신 홍반성 낭창(Systemic Lupus Erythematosus, SLE) 환자의 혈청에서 처음 발견되었다(Robbins W 등. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 96(3):575-9, 1957). 항 핵산 자가항체는 전신 홍반성 낭창 환자들과 다발성 경화증(multiple sclerosis) 환자들에게서 많이 발견되며, 일반적으로 이들은 염기서열의 특이성이 없이 핵산과 결합한다(Jang YJ 등, Cell.Mol.Life Sci., 60(2):309-20, 2003; Marion TN 등, Methods 11:3-11, 1997). 항 핵산 항체의 역가는 자가면역질환 SLE 환자와 SLE의 마우스 모델인 MRL-lpr/lpr 마우스의 혈청에서 높게 나타나는 것으로 보고되어 있고, 이에 관한 연구는 자가면 역 질환 환자를 대상으로 주로 이루어져 왔다(Dubrivskaya V 등, Biochemistry (Mosc), 68(10):1081-8, 2003).

1992년에 처음으로 핵산 가수분해능이 있는 핵산 결합 항체가 발견되면서 (Shuster A 등, Science, 256 (5057):665-7, 1992), 이에 대한 생화학적인 연구가 진행되기 시작하였다(Nevinsky G 등, J. Immunol. Methods, 269(1-2):235-49, 2002). 핵산 가수분해 항체에 대한 생화학적인 측면에서의 연구는 어느 정도 이루어져 있지만 항체의 다양한 응용을 위한 안정성 개량, 친화도 숙성, 기질 특이성 개량 등 최근 항체공학에서 많이 다루어지고 있는 연구의 진행상황은 아직 미미하다(Cerutti M 등, J.Biol.Chem., 276(16): 12769-73, 2001; Kim YR 등, J.Biol.Chem., 281(22): 15287-95, 2006).

항체와 핵산간의 결합연구, 항체 이외의 단백질과 핵산간의 연구는 몇 건이 진행되어 있는데, 첫 번째로 항체 이외의 단백질인 Zinc Finger는 Leucine zipper, Helix-turn-Helix와 더불어 자연계에 존재하는 대표적인 DNA binding motif이다 (Jamieson A등, Nat.Rev.Drug Discov., 2(5):361-8, 2003). 약 20~30개의 아미노산으로 이루어져 있는 작은 단백질인 zinc finger는, 2개의 시스테인과 2개의 히스티딘이 각각 서로 다른 4 방향에서 1개의 Zn²⁺이온을 코디네이트하는 형태로 되어있다. 실제로 DNA와 결합하는 부분은 zinc finger의 알파 나선 부분인데, 이 부분이 DNA 이중나선의 큰홈(major groove) 부분에 결합하면서 3개의 DNA 염기와 상호작용을 하게 된다. 이때 zinc finger의 단백질 서열에 따라 결합하는 DNA의 triplet이 달라진다. 따라서 zinc finger의 형태를 유지하면서 알파 나선 부분을 개량하면 서로 다른 염기서열을 인지하는 zinc finger를 만들 수 있다. 1999년 GNN의 16개 triplet에 대하여 성공적으로 개량된 것이 보고된 이래(Segal D 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 96(6):2758-63, 1999), 많은 연구를 거듭하여 현재는 기질 특이성 개량 방법이 이미 확립되어 있다(Caroll D 등, Nat. Protoc. 1(3):1329-41, 2006). 하지만 핵산에 결합하는 능력만이 있기 때문에 핵산을 가수분해 시키기 위해서는 zinc finger를 핵산 가수분해 효소와 결합시킨 형태로 추가 개량을 해야 한다(Mani M.등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 334(4):1191-7, 2005).

두 번째는 실험적(empirical) 방법으로 자연적으로 존재하는 단백질-DNA 복합체인 HPV(human papillomavirus) E2 protein [E2C]의 DNA 결합 도메인과 표적 DNA를 이용한 것으로(M. Laura 등, J.Bio.Chem.,276(16):12769-73, 2001), DNA-E2C 복합체를 마우스에 주입하여 마우스의 체세포성 과변이(somatic hypermutation)를 통한 항-DNA 항체를 생성하는 것이다. 우선 마우스가 DNA를 항원으로 인지하기 위하여 DNA-protein(E2C) 복합체를 형성시킨 후 마우스의 복강 내에 주입시킨 다음 면역반응을 유도시킨다. 그 후 면역반응 증폭을 위하여 기간을 두고 반복하여 주입하면 지속적으로 주입된 DNA-E2C 복합체에 의하여 DNA에 특이성을 갖고 있는 항체들이 체세포성 과변이에 의하여 생성되고 증식한다. 증폭이 끝난 후 생성된 항체를 마우스로부터 분리해낸다. 분리해 낸 항체들은 주입한 DNA와 특이적으로 결합하는 항체이므로, 이때 DNA와 반응시켜 가장 결합력이 높은 항체를 선별해 내어 DNA에 특이적으로 결합하는 항체를 얻을 수 있다.

세 번째는 합리적인(rational) 방법으로서, 인간 γ-B-crystallin의 β-sheet를 구조와 서열을 분석하여 용매-노출된(solvent-exposed) 아미노산 잔기를 정하고 무작위로 전반적인 결합 사이트를 만드는 것이다(Hilmar E.등, J.Mol.Biol., 372:172-85, 2007). 일반적으로 항체의 경우 견고하고 보존율이 높은 구조 (framework)와 유동성이 있고 서열변화가 큰 CDRs(Complementary Determining Regions)로 나뉘는데, 유동성 있는 CDRs의 영향으로 항원과 유도-적응(induced-fit) 형태의 결합을 이룬다. 그러나 높은 특이성과 결합력을 갖기 위한 대안적인 메커니즘은 자물쇠와 열쇠 모델(lock and key model)이다. 이 경우 기질에 대한 단백질이 높은 결합력을 갖기 위하여 이미 상보적인 구조를 형성하고 있으므로, 본질적인 항체의 안정성을 유지한 채 형태의 변화 없이 기질과 결합하므로 더 견고한 결합을 할 수 있다(Jackson R.등, Protein Sci.,8:603-13, 1999).

따라서, 최근 단백질 공학과 라이브러리 선별 방법은 CDRs에서 구조 쪽으로 확장되고 있다. 실 예로는 첫째, 합리적인 디자인(rational design)을 이용한 포유류 혈청 레티놀-결합 단백질의 β-barrel 표면에 기능적인 Zn-binding site 도입이 있다(Muller H.등, Biochemistry, 33: 14126-35,1994). 둘째, 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei) 균주로부터 얻어진 CBH(cellobiohydrolase) Cel7A로부터 파생된 셀루로오스-결합 도메인의 β-sheet에 돌연변이를 통한 결합 활성 부여가 있다(Lehtio J. 등, Proteins: Struct. Funct. Genet., 41:316-22, 2000). 셋째, 두 개의 역평행(antiparallel) α-helices와 하나의 β-turn으로 구성된 ankyrin repeat protein이다(Binz H.등, J.Mol.Biol., 332:489-503, 2003).

또한, 특정 단백질을 암호화(encoding)하는 mRNA의 전이를 저해하거나 가수분해하여 단백질 발현 수준을 낮추는, 이른바 유전자 침묵(gene-silencing) 기술은 유전자 기능 연구 뿐만 아니라, 암 및 바이러스 질병을 비롯한 다양한 질병에 매우 유용한 치료제의 개발 전략으로 알려져 있다. 기존의 유전자 침묵 기술은 주로 상보적인 단일 핵산가닥을 특이적으로 인지하여 mRNA 전이를 저해하는 핵산에 기초한 연구가 주를 이루었으며(Scherer LJ 등, Nat Biotechnol, 21:1457-65, 2003; Tafech A 등, Curr Med Chem, 13:863-81, 2006), 이 중에서 siRNA(small interfering RNA)가 대표적이다. 그러나, siRNA는 세포내 침투능이 없고, 누클레아제(RNase)에 가수분해 되어 안정성이 떨어지며, 비표적 유전자에도 작용하고, 면역원성을 유도할 수 있다는 단점이 있다.

상기한 바와 같이, 기존의 siRNA와 같은 유전자 침묵 기술들은 특정 유전자 발현 감소를 유도하였으나 세포내 전달이 매우 어렵고, 핵산을 가수분해하기 위해서는 핵산 가수분해 효소와 결합시킨 형태로 추가 개량을 해야하는 문제점이 있다.

한편, 현재 시판되는 약물 및 신약 개발은 소분자(small molecule), 단백질, 단일클론항체에 집중되어 있다. 하지만 이들 대부분은 모두 단백질에 결합하여 단백질의 활성을 조절하여 효과를 나타낸다. 특히, 단일클론항체 및 단백질은 대부분 세포막에 발현된 막 단백질 또는 세포외로 발현된 단백질만을 표적으로 한다. 따라서, 다양한 질병과 관련된 표적 유전자수는 매우 다양한데 비해, 지금까지는 단백질만을 표적화하여 치료제를 개발함으로써 매우 제한된 범위에서 치료제 개발이 이루어져 왔다. 따라서, 단백질 수준이 아니라 세포내 RNA 또는 DNA를 표적화함으로 써 좀더 광범위한 질병관련 유전자들을 표적화하고, 세포 침투능을 갖는 특정염기서열 인식 핵산 가수분해 항체의 개발은 차세대 유전자 침묵 및 항바이러스 제제로 개발될 가능성이 매우 크므로, 이에 대한 개발의 필요성은 매우 크다.

따라서, 상기와 같은 문제점을 극복하고 특별한 외부 단백질 전달 시스템 없이 그 자체로 세포내 침투능을 지니며 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해할 수 있는 항체의 개발의 필요성이 요구되고 있다.

본 발명자들은 기존의 유전자 침묵 기술의 문제점을 극복하고 특별한 외부 단백질 전달 시스템 없이 그 자체로 세포내 침투능을 지니며 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해할 수 있는 항체에 대해 연구하던 중, 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체의 특정 부위를 변화시켜 핵산 가수분해 특성을 유지한 상태에서 서열 특이성을 갖도록 개량한 핵산 가수분해 항체를 제조하였으며, 상기 개량된 핵산 가수분해 항체가 세포 침투능을 지녀 특별한 외부 단백질 전달 시스템의 도움 없이 스스로 세포내로 침투하여 세포질에 위치하거나 혹은 개량된 핵산 가수분해 항체를 세포 내부에서 발현시켰을 때 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해하는 능력을 가져 특정 유전자의 발현을 감소시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 세포내 침투능을 가지면서, 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해하는 능력을 지닌 핵산 가수분해 항체를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 가수분해 항체의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 가수분해 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 세포내 침투능을 가지면서, 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해하는 능력을 지닌 핵산 가수분해 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체를 주형으로 하여 라이브러리를 제작하는 단계,

2) 상기 1)단계에서 제작한 라이브러리 유전자를 표면 발현 벡터를 이용하여 세포 표면에 라이브러리를 제작하는 단계, 및

3) 특정염기서열을 갖는 표적 핵산을 기질로 사용하여 이에 특이적으로 결합하는 돌연변이체를, 상기 2)단계에서 제작한 라이브러리로부터 선별하는 단계를 포함하는, 세포내 침투능 및 표적 핵산 염기서열 특이적 가수분해능을 지닌 핵산 가수분해 항체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 가수분해 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 핵산 가수분해 항체는, 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체의 특정 부위를 변화시켜 핵산 가수분해 특성을 유지한 상태에서 서열 특이성을 갖도록 항체공학을 이용하여 개량함으로써, 특별한 외부 단백질 전달 시스템의 도움 없이 개량된 핵산 가수분해 항체가 스스로 세포내로 침 투하여 세포질에 위치하거나 혹은 개량된 핵산 가수분해 항체를 세포 내부에서 발현시켰을 때 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해하는 능력을 가져 특정 유전자의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

상기 개량된 핵산 가수분해 항체의 아미노산 서열은 서열번호 14 내지 서열번호 24로 나타내며, 특히 서열번호 16, 서열번호 18, 서열번호 21가 바람직하다. 또한, 상기 핵산 가수분해 항체의 염기서열은 각각 서열번호 25 내지 서열번호 35로 나타내며, 특히 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 32가 바람직하다.

상기 핵산 가수분해 항체는 전체 형태의 항체 또는 그의 기능적인 단편일 수 있다. 상기 전체 형태의 항체는 단량체 또는 2 이상의 전항체가 결합되어 있는 다량체의 형태일 수 있으며, 전체 IgG를 포함한다. 상기 항체의 기능적인 단편은 전항체의 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 갖는 항체로서, 실질적으로 전체 형태의 항체가 인식하는 것과 동일한 항원결합부위(epitope)를 인식하는 것을 의미한다. 상기 항체의 기능적인 단편에는 중쇄 가변영역의 단일 도메인, 경쇄 가변영역의 단일 도메인, 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)₂, Fab, Fab', F(ab')₂, diabody, dsFv(disulfide-stabilized variable fragment) 등이 포함되나 이에 한정되지 않으며, 본 발명에서는 경쇄 가변영역의 단일 도메인이 바람직하다.

본 발명의 핵산 가수분해 항체의 포맷(A)과 본 발명의 핵산 가수분해 항체가 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산을 가수분해하는 모식도(B)는 도 1에 나타내었다. 또한, 본 발명의 핵산 가수분해 항체가 특정염기서열을 인식하여 형질 전환된 세포에서 발현하여 세포내에 위치하거나 세포내로 침투하여 세포질에 위치한 후, 표적 핵산 서열을 지닌 외부 물질(예, 바이러스) 또는 세포내 mRNA를 가수분해하여 바이러스 증식이 억제되거나 mRNA에 의해 코딩된 단백질이 발현을 억제하는 과정을 나타낸 모식도는 도 2에 나타내었다.

본 발명에 따른 핵산 가수분해 항체의 제조방법에 대해 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

상기 1)단계는 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체를 주형으로 하여 라이브러리를 제작하는 단계로, 상기 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체는 3D8 VL 4M 또는 이의 변이체가 바람직하다. 즉, 3D8 VL 항체의 구조를 분석하여 3D8 VL의 c, c', f 베타-가닥 부분을 핵산 결합 부위로 예상하고 라이브러리를 디자인하여, c-(잔기 41-45), c'-(잔기 50-54), f-(잔기 90-94) 베타-가닥의 영역 모두를 NNB 코돈(N=A/T/C/G, B=C/G/T)을 이용하여 돌연변이시켜 효모세포 표면에 라이브러리를 제작한다.

상기 2)단계는 세포 표면에 라이브러리를 제작하는 단계로, 상기 라이브러리의 유전자와 표면 발현 벡터를 혼합하여 전기형질전환을 통해 세포 표면에 라이브러리를 제작한다. 상기 표면 발현 벡터는 파지 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 리보좀 디스플레이, RNA 디스플레이 및 효모 세포 표면 발현벡터 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 효모 표면 발현 벡터를 이용하여 라이브러리를 제작하였으며, 상기 제작된 라이브러리는 효모세포 표면에 정상적으로 발현되 어, 라이브러리가 효모세포 표면에 잘 제작되었음을 알 수 있다.

상기 3)단계는 특정염기서열을 갖는 표적 핵산을 기질로 사용하여 이에 특이적으로 결합하는 돌연변이체를 3D8 VL 4M 항체의 라이브러리로부터 선별하는 단계로, 5'-비오티닐화된-표적 핵산에 대한 결합력을 분석하여 표적 핵산에 대해 특이적으로 결합하는 돌연변이체들을 선별한다. 상기 표적 핵산은 세포내 핵산 또는 외부 핵산일 수 있으며, 세포내 핵산으로는 암세포에 특이적으로 과발현되는 단백질을 코딩하는 핵산이고, 외부 핵산으로는 바이러스 지놈 핵산 또는 바이러스 단백질을 코딩하는 핵산인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 2 종류의 5'-비오티닐화된-DNA(G₁₈, Her2₁₈)를 기질로 사용하여 MACS와 FACS로 표적 핵산(G₁₈, Her2₁₈)에 대한 결합력과 비표적 핵산에 대한 결합력을 분석한 후 표적 핵산(G₁₈, Her2₁₈)에 대해 특이적으로 결합하는 돌연변이체들을 선별한다. 즉, 단일가닥-DNA 기질(G₁₈)에 대하여는 4MG1, 4MG2, 4MG3, 4MG4, 4MG5, 4MG6의 6 종류의 돌연변이체가 선별되고, 단일가닥-DNA 기질(Her2₁₈)에 대하여는 4MH1, 4MH2, 4MH3, 4MH4, 4MH5의 5 종류의 돌연변이체가 선별되어, 총 11개의 돌연변이체들이 선별된다. 상기 11개의 돌연변이체들의 아미노산 서열은 각각 서열번호 14 내지 서열번호 24로 나타내며, 특히 서열번호 16(4MG3), 서열번호 18(4MG5), 서열번호 21(4MH2)이 바람직하다. 또한, 상기 11개의 돌연변이체들의 염기서열은 각각 서열번호 25 내지 서열번호 35로 나타내며, 특히 서열번호 27(4MG3), 서열번호 29(4MG5), 서열번호 32(4MH2)가 바람직하다.

상기 선별된 돌연변이체들은 모두 90% 이상의 순도로 정제되며, 정제된 돌연변이체들은 가용성 단량체로 존재하고, 항체의 2차 구조를 유지한다. 또한, 상기 돌연변이체들은 표적 기질인 Her2₁₈, G₁₈에 대한 친화도는 향상되고, 비표적 기질에 대한 친화도는 큰 변화가 없어, 둘 사이에 약 10~100배의 K_D 값의 차이를 보여준다. 또한, 상기 돌연변이체들의 기질 분해속도는 3D8 VL WT, 3D8 VL 4M 항체와는 다르게 각각의 표적 기질에서 보다 높은 Vmax 값을 보여주어 표적 핵산 서열을 인지하여 특이적으로 결합하고 보다 빠르게 가수분해 시킨다. 따라서, 본 발명에 따른 돌연변이체들은 원하는 표적 핵산에 서열 특이적으로 결합하도록 개량되어 DNA와 RNA에 대하여 가수분해 활성을 가짐을 알 수 있다.

본 발명에 따른 돌연변이체들은, G₁₈ 또는 Her2₁₈가 없는 기존 EGFP(enhanced green fluorescent protein)의 경우 3D8 VL wild type과 돌연변이체에 의한 발현의 차이는 별로 없지만, G₁₈와 Her2₁₈이 EGFP의 5'-말단 앞에 들어간 벡터의 경우 3D8 VL wild type보다 돌연변이체가 발현되는 세포에서 EGFP 형광신호가 매우 낮게 검출된다. 이는 상기 돌연변이체들이 세포내에서 발현되어 표적 염기서열을 지닌 G₁₈-EGFP mRNA 및 Her2₁₈-EGFP mRNA를 가수분해하여, GFP의 발현 수준을 낮춘 것으로 보인다. 즉, 이는 특정염기서열만을 인지하여 가수분해 활성을 지닌 돌연변이체를 세포내에 발현시켜 표적 염기서열을 지닌 mRNA를 가수분해하여 이에 의해서 코딩된 단백질의 발현 수준을 낮추는 것으로, 본 발명에 따른 돌연변이체들이 특정염기서 열만을 인지하여 가수분해 활성을 지니고 있음을 알 수 있다.

또한, 상기 돌연변이체들은 인간 자궁경부암 세포(HeLa)와 인간 유방암 세포 (SK-BR3)에서 3D8 VL wild type과 유사한 수준으로 세포내로 유입된다. 또한, 상기 돌연변이체들은 클라트린-의존 세포내 이입(clathrin-dependent endocytosis) 경로를 방해하는 클로르프로마진(chlorpromazine)과 대음세포작용(macropinocytosis) 경로를 방해하는 시토카라신 D(cytochalasin D)를 전처리 한 경우는 돌연변이체들의 세포내로의 유입되는 수준이 유사하여 아무런 영향을 받지 않으며, 세포 표면의 음전하를 띄는 프로테오글리칸(헤파란 설페이트)과 양전하를 띄는 돌연변이체와의 전기적 결합을 방해하는 헤파린과 카베올래/지질 래프트 세포내 이입 (caveolae/lipid raft endocytosis) 경로를 방해하는 메틸-β-시클로덱스트린 (methyl-β-cyclodextrin, MβCD)을 전처리 한 경우는 돌연변이체들의 유입이 현저히 감소된다. 이는 돌연변이체들의 유입 과정이 일차적으로 세포 표면에 많이 존재하는 프로테오글리칸과 같은 물질과의 전기적 결합을 거친 뒤, 카베올래/지질 래프트 세포내 이입 경로로 유입된다는 것을 보여준다.

또한, 본 발명에 따른 돌연변이체들은 인간 유방암 세포(SK-BR-3, MDA-MB-231) 또는 인간 자궁경부암 세포(HeLa)에서 낮은 수준의 독성을 나타내며, 특히 Her2 유전자를 과발현하는 SK-BR-3와 MDA-MB-231의 경우 Her2 염기 서열 특이적인 가수분해 활성을 갖는 4MH2에 의해 강한 독성이 관찰되어 세포 생존율이 낮아지며, 이는 기존에 보고된 Her2 과발현 세포의 경우 Her2의 발현 수준이 감소하면 세포 생존율이 낮아진다는 결과와 일치하는 결과로, 4MH2에 의해 Her2 발현이 감소하여 세포 생존율이 낮아진다. 이때 세포 죽음의 형태는 세포사멸(apoptosis: Annexin V 양성)이다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 핵산 가수분해 항체는 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체의 특정 부위를 변화시켜 핵산 가수분해 특성을 유지한 상태에서 서열 특이성을 갖도록 항체공학을 이용하여 개량함으로써, 특별한 외부 단백질 전달 시스템의 도움 없이 개량된 핵산 가수분해 항체가 스스로 세포내로 침투하여 세포질에 위치하거나 혹은 개량된 핵산 가수분해 항체를 세포 내부에서 발현시켰을 때 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해하는 능력을 가져 특정 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산 가수분해 항체는 기존의 siRNA와 같은 유전자 침묵 기술을 대체 및 보완할 수 있으며, 특히 단백질이 아닌 이를 코딩하고 있는 RNA 또는 DNA에 특이적으로 결합하고 가수분해하여 궁극적으로는 표적 단백질의 발현을 감소시키거나 지놈 증식을 억제할 수 있어, 여러 가지 질환의 원인이 되는 병원성 단백질 발현 또는 바이러스 유전자 증식 억제에 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 항암 치료제 또는 항바이러스 치료제로 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산 가수분해 항체는 기존의 항암 치료제 또는 항바이러스 치료제 시장을 대체할 수 있거나 신규한 항암 치료제 또는 항바이러스 치료제로 개발될 수 있다.

본 발명의 조성물은 핵산 가수분해 항체와 함께 항암 효과 또는 항바이러스 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 핵산 가수분해 항체의 일일 투여량은 약 0.01~10㎎/㎏, 바람직하게는 약 1~5㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물은 여러 가지 질환의 원인이 되는 병원성 단백질 발현 또는 바이러스 유전자 증식 억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 3D8 VL 4M 항체의 디자인

1. 3D8 VL 4M 항체의 효모세포 표면 발현

3D8 VL 항체를 효모 표면 발현 기술을 사용하여 염기서열 특이적으로 핵산에 결합하고 핵산을 가수분해 시키는 항체로 개량하기 위한 첫 단계로 항체를 효모 표면에 발현시켰다. 이때 사용한 3D8 VL 항체는 WT(wild type)보다 DNA/RNA 가수분해 활성이 증가한 돌연변이체인 3D8 VL 4M을 사용하였다. 3D8 VL 4M은 3D8 VL wild type의 돌연변이체로 Q52R, Y55H, W56R, H100A mutation이 들어가 있는 클론이다. 3D8 VL 4M 항체를 효모세포의 표면에 발현하기 위하여, E.coli 발현 벡터인 pET23M 3D8 VL 4M 벡터에 들어있던 유전자를 효모 표면 발현 벡터인 pCTCON에 서브 클로닝 하였다. 이때, 3D8 VL 4M의 유전자 증폭을 위하여 NheI/BamHI 제한효소 인식부위가 있는 프라이머를 제작하여 사용하였다. 염기서열 분석을 통하여 3D8 VL 4M 유전자가 pCTCON 벡터에 정확하게 삽입되었는지 확인한 후 Saccharomyces cerevisiae EBY100 효모 균주에 형질전환 하였다. 형질 전환된 콜로니를 선별배지인 SD-CAA 배지(20g/L glucose, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 5.4g/L Na₂HPO₄, 8.6g/L NaH₂PO₄?H₂O, 5g/L casamino acids)에서 30℃에서 20시간 동안 진탕 배양기로 배양하였고, 단백질 발현을 위해 SG-CAA 배지(20g/L galactose, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 5.4g/L Na₂HPO₄, 8.6g/L NaH₂PO₄?H₂O, 5g/L casamino acids)에서 30℃에서 20시간 동안 배양하였다. 배양 후 효모 세포의 표면에 원하는 단백질이 잘 발현되었는지 확인하기 위하여 FACS로 시료를 분석하였다. 3D8 VL 4M의 유전자가 효모 표면에서 정상적으로 발현이 될 경우 3D8의 C-말단 부위에 myc-tag가 같이 발현된다. 이렇게 발현되는 myc를 인지할 수 있는 anti-myc 9E10 antibody(Sigma, USA)를 일차 항체로 사용하고 일차 항체의 불변부위를 인지하는 FITC conjugated-goat anti-mouse IgG(Sigma, USA)를 이차 항체로 사용하면 발현의 유무와 정도를 분석할 수 있다. 항체의 효모 표면 발현과 발현된 항체의 DNA 결합도를 동시에 확인하기 위하여, 비오틴이 표지된 핵산과 약 2×10⁶개의 효모 세포를 50㎕의 트리스완충용액(25mM Tris, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 0.1% BSA)에서 반응시킨 후 항-myc 항체를 첨가하고 반응시켰다. 이를 트리스완충용액으로 세척한 후 FITC conjugated-goat anti-mouse IgG로 표지하고, BD FACS Calibur (Becton Dickinson, USA)를 사용하여 분석하였다. 분석 결과, 3D8 VL 4M의 유전자가 효모 세포 표면에서 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.

2. 모델 서열 선정

3D8 VL 4M 항체가 핵산 서열을 특이적으로 인식할 수 있도록 개량하기 위하여 모델 서열을 선정하였다. 즉, 상기 1에서 사용한 비오틴이 표지된 핵산을 모델 서열로 선정하였으며, 해당 서열은 유방암 세포에 과발현되어 암세포의 성장과 전이에 관계하는 유전자로 알려진 Human Epidermal Growth Factor-2(Her2/ErbB2)이 다. Her2의 전체 서열 중 항체 개량을 위해 사용하는 부분은 2391번부터 2408번까지로, 그 서열은 5'-AAT TCC AGT GGC CAT CAA-3'이고, 이를 Her2₁₈ 이라고 하였다. Her2₁₈과 함께 1종류의 모델 서열을 추가하였는데, 이는 G₁₈로서 그 서열은 5'-GGG GGG GGG GGG GGG GGG-3'이다.

3D8 VL WT과 3D8 VL 4M의 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 2로 나타내었으며, 3D8 VL WT과 3D8 VL 4M의 염기서열은 각각 서열번호 3 및 4로 나타내었다.

실시예 2 : 3D8 VL 4M 항체의 라이브러리 제작

효모세포의 표면에서 3D8 VL 4M 항체가 높은 수준으로 발현되는 것을 확인한 후, 3D8 VL 4M 라이브러리를 제작하였다. 즉, 특정염기서열을 갖는 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해시키는 돌연변이체를 제조하기 위하여, 3D8 VL 4M을 주형으로 하여 라이브러리를 제작하였다. 먼저, 3D8 VL 항체의 구조를 분석하여 3D8 VL의 c, c', f 베타-가닥 부분을 핵산 결합 부위로 예상하고 라이브러리를 디자인하여, c-(잔기 41-45), c'-(잔기 50-54), f-(잔기 90-94) 베타-가닥의 영역 모두를 NNB 코돈(N=A/T/C/G, B=C/G/T)을 이용하여 돌연변이시켜 효모세포 표면에 라이브러리를 제작하였다. 이러한 라이브러리는 3D8 VL의 유전자 전체를 돌연변이시키는 것이 아니기 때문에, 특정 부분에만 돌연변이 서열을 가지는 프라이머를 제작한 후 overlapping PCR 기법을 이용하여 라이브러리 유전자를 제작하였다. 상기 라이브러리 제작에 사용된 프라이머(1F, 2R, 3R, 4F, 5R, 6F, 7R)의 염기서열은 각각 서열번호 5 내지 11로 나타내었다. NNB 코돈에서 N은 A,T,C,G가 각각 25%씩, B는 C,G,T가 각각 33%씩 들어있는 누클레오티드 혼합물이며, NNB 코돈은 20개의 아미노산을 모두 포함하면서 종결코돈의 비율을 2.1%로 낮춘 코돈의 조합이다.

상기 제작된 라이브러리를 효모 표면 발현 벡터와 상동성 재조합 (homologous recombination) 기작에 의해 효모에 형질 전환되도록 하기 위하여, 증폭된 라이브러리 유전자(10㎍/㎖)와 효모 표면 발현 벡터(pCTCON, Colby 등, Methods enzymol, 388:248-258) (1㎍/㎖)를 혼합하여 동시에 전기형질전환 (electroporation)을 통해 효모세포 표면에 라이브러리를 제작하였다(Lee HW 등, Biochem Biophys Res Commun, 343:896-903, 2006; Kim YS 등, Proteins: structure, function, and bioinformatics, 62:1026-1035, 2006). 이때 준비한 라이브러리 유전자는 총 300㎍, 벡터 30㎍이었다. 3D8 VL 4M 라이브러리의 크기는 계단식 희석을 한 후 선택 배지에 자란 콜로니의 수를 측정하여 2×10⁸임을 확인하였다.

상기 제작된 라이브러리의 발현 수준을 확인하기 위하여 FACS로 분석하였다. 제작 과정에서 라이브러리 유전자에 문제가 생길 경우 정상적으로 발현이 되지 않기 때문에 이 과정을 통해 라이브러리가 잘 이루어졌는지를 알아볼 수 있다.

3D8 VL 항체의 3차 구조(A), 및 3D8 VL WT 항체의 DNA/RNA 인식부위인 c-(잔기 41-45), c'-(잔기 50-54), f-(잔기 90-94) 베타-가닥의 아미노산 서열, 염기서열 및 돌연변이 시 사용된 NNB 코돈(B)은 도 3에 나타내었다.

또한, 3D8 VL 4M 항체를 주형으로 핵산가수분해 항체 라이브러리를 제작한 모식도(A), 제작된 라이브러리를 효모발현 벡터(pCTCON)와 함께 효모에 전기형질전환을 통해 효모세포 표면에 라이브러리를 제작한 모식도(B), 및 제작된 라이브러리의 발현 수준을 FACS로 분석한 결과(C)는 도 4에 나타내었다.

상기 제작된 라이브러리의 돌연변이 출현 빈도는 표 1에 나타내었다.

라이브러리(NNB 코돈)
아미노산	출현 빈도	백분율(%)
Phe	2	4.2%
Leu	4	8.3%
Ile	2	4.2%
Met	1	2.1%
Val	3	6.3%
Ser	5	10.4%
Pro	3	6.3%
Thr	3	6.3%
Ala	3	6.3%
Tyr	2	4.2%
His	2	4.2%
Gln	1	2.1%
Asn	2	4.2%
Lys	1	2.1%
Asp	2	4.2%
Glu	1	2.1%
Cys	2	4.2%
Trp	1	2.1%
Arg	4	8.3%
Gly	3	6.3%
Stop(종결)	1	2.1%
합계	48	-

도 4에 나타난 바와 같이, 3D8 VL 4M 항체를 주형으로 제작된 라이브러리는 효모세포 표면에 정상적으로 발현됨을 확인하였다. 따라서, 라이브러리가 효모세포 표면에 잘 제작되었음을 알 수 있다.

실시예 3 : 제작된 3D8 VL 4M 항체의 라이브러리에서 특정염기서열에 특이적으로 결합하는 돌연변이체의 선별

1. competitor를 사용하여 3D8 VL 4M 항체의 라이브러리의 선별 과정

상기 제작된 라이브러리를 2 종류의 5'-비오티닐화된-DNA들에 대하여 MACS와 FACS를 사용하여 선별하였다. 핵산의 back bone과의 비특이적 이온결합을 방지하기 위하여, 높은 농도의 염(0.3M) 조건 하에서 선별을 진행하였다. 원하는 표적 염기 서열에만 결합하는 클론을 찾아내기 위하여, competitor를 사용하였다. 이때, competitor들은 비오틴화가 되어 있지 않은 DNA를 사용하였으며, Her2₁₈의 경우 N₁₈ DNA를 competitor로 사용하였고, G₁₈의 경우 4종류(A,T,C,G)의 핵산 중 표적 핵산을 제외한 다른 3종류를 competitor로 사용하였다. 즉, G₁₈에 선택적으로 결합하는 클론을 찾기 위하여, 0.3M의 NaCl 조건 하에 A₁₈, T₁₈, C₁₈의 3가지 DNA를 competitor로 사용하여 선별하였다. 라이브러리에서 특정염기서열에 특이적으로 결합하는 돌연변이체를 선별하기 위해 사용된 5'-비오티닐화된 기질(G₁₈, Her2₁₈)의 염기서열은 각각 서열번호 12 및 13으로 나타내었다.

3D8 VL 4M 항체의 라이브러리로부터 표적핵산인 단일가닥-DNA 기질(G₁₈, Her2₁₈)의 염기서열에 특이적으로 결합하는 돌연변이체들을 MACS와 FACS를 사용하여 선별하는 과정은 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 선별 차수가 높아져 갈수록 표적 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 돌연변이체들이 부유화(enrichment)되는 것을 볼 수 있다. 또한, 각 선별 단계에서 부유화된 라이브러리 돌연변이체들은 표적 핵산에 대한 친화도가 높고 다른 염기서열에는 친화도가 낮음을 보여주었다.

2. 각 기질에 대해 친화도가 높은 돌연변이체의 결합 특이성 분석

돌연변이체들은 FACS 분석을 통하여 표적 핵산(G₁₈, Her2₁₈)에 대한 결합력과 비표적 핵산에 대한 결합력을 분석한 후 선별하여, 단일가닥-DNA 기질(G₁₈)에 대하여는 4MG1, 4MG2, 4MG3, 4MG4, 4MG5, 4MG6의 6 종류의 돌연변이체가 선별되었고, 단일가닥-DNA 기질(Her2₁₈)에 대하여는 4MH1, 4MH2, 4MH3, 4MH4, 4MH5의 5 종류의 돌연변이체가 선별되었다. 즉, 각각의 단일가닥-DNA 기질(G₁₈, Her2₁₈)에 대하여 11개의 돌연변이체들(4MG1, 4MG2, 4MG3, 4MG4, 4MG5, 4MG6, 4MH1, 4MH2, 4MH3, 4MH4, 4MH5)이 선별되었다. 상기 11개의 돌연변이체들의 아미노산 서열은 각각 서열번호 14 내지 서열번호 24로 나타내었으며, 상기 11개의 돌연변이체들의 염기서열은 각각 서열번호 25 내지 서열번호 35로 나타내었다.

상기 선별된 11개의 돌연변이체들의 결합 특이성을 FACS 분석을 통하여 표적 핵산(G₁₈, Her2₁₈)에 대한 결합력과 비표적 핵산에 대한 결합력을 분석하였다. 분석 결과, 라이브러리 선별 단계에서 나타난 것과 마찬가지로 각각의 단일가닥-DNA 기질(G₁₈, Her2₁₈)에 대하여 결합 특이성을 갖고 있음을 확인하였다. 반면 비표적 기질에 대한 친화도는 상대적으로 낮음을 확인하였다.

또한, 상기 11개의 돌연변이체들이 어떠한 서열을 갖고 있는지 확인하기 위하여, 돌연변이체의 플라스미드를 정제하여 증폭한 후 염기서열을 분석하였다. 분석된 11개의 돌연변이체들의 c-(잔기 41-45), c'-(잔기 50-54), f-(잔기 90-94) 베타-가닥의 아미노산 서열을 도 6에 나타내었다.

실시예 4 : 선별된 돌연변이체들의 발현 및 정제, HPLC 분석, CD 분석

상기 실시예 3에서 선별된 돌연변이체들을 가용성 단백질로 정제하기 위하여, 효모와 E.coli의 발현 벡터에서 발현여부를 확인하였다. 효모세포의 표면에 발현을 시켰을 때 발현 정도가 매우 높았기 때문에 우선 효모 발현 벡터에 서브클로닝한 후 Saccharomyces cerevisiae 2805 strain에 형질 전환하여 발현을 시도하였다. 하지만 표면 발현 때와는 다르게 효모세포의 가용성 단백질은 발현이 잘 되지 않았다. 따라서 E.coli BL21(DE3) strain으로 발현 시스템을 바꾸었다. E.coli에서는 단백질의 발현 수준이 매우 높았다. 하지만 가용성 분획은 거의 정제되지 않았고, 대부분의 단백질이 봉입체(inclusion body)의 형태로 발현되는 것을 알 수 있었다. 그래서 E.coli BL21(DE3) strain에서 봉입체로 발현된 단백질을 정제하였고, 얻어진 단백질을 다시 리폴딩(refolding)하였다 (Lee SH 등, Protein Science, 15:304-313, 2006).

정제된 11개의 돌연변이체들의 순도를 확인하기 위하여 SDS-PAGE로 분석하였으며, 돌연변이체들이 봉입체로부터 정제된 후 가용성 상태에서 단량체(monomer)로 존재하는지를 확인하기 위하여 HPLC를 이용하여 분석하였다. 또한, 3D8 VL 4M 항체 라이브러리를 디자인할 때 돌연변이를 주었던 부분은 일반적으로 항체 라이브러리를 만들 때와 같이 CDR이 아니라 구조(framework) 부분이었다. 따라서 선별된 돌연변이체들이 항체의 2차 구조를 유지하고 있는지 알아보기 위하여 Far-UV CD (circular dichroism) 분광계를 이용하여 분석하였다.

정제된 11개의 돌연변이체들의 SDS-PAGE 분석 결과(A), 및 대표적 변이체 (4MG3, 4MG5 및 4MH2)의 크기배제 HPLC 분석 결과(B)와 Far-UV CD(circular dichroism) 분광계로 측정한 결과(C)는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, (A) SDS-PAGE 분석 결과 11개의 돌연변이체들은 모두 90% 이상의 순도로 정제되었고, (B) HPLC 분석 결과 돌연변이체들(4MG3, 4MG5, 4MH2)이 3D8 VL WT, 3D8 VL 4M 항체와 같은 위치에서 주요 피크를 나타내었으며 이를 통하여 정제된 후에 대부분의 단백질들이 가용성 단량체로 존재함을 알 수 있었다. (C) Far-UV CD 분광계 분석 결과 돌연변이체들(4MG3, 4MG5, 4MH2)은 3D8 VL WT과 유사한 2차 구조를 갖고 있음을 확인하였다.

실시예 5 : 선별된 돌연변이체들의 핵산 결합력 및 핵산 가수분해 활성 검증

1. 돌연변이체들의 핵산 결합력

정제된 돌연변이체들을 Biacore2000 기기를 사용하여 SPR 분석을 수행하였다. 3D8 VL WT과 돌연변이체들을 각각 표적 기질인 G₁₈과 비표적 기질에 결합시킨 후 각각의 친화도를 측정하였다.

결과는 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타난 바와 같이, 여러 종류의 핵산 서열에 대한 친화도를 살펴보면 WT, 4M의 경우 서열에 따른 친화도의 차이가 크지 않음을 알 수 있다. 하지만 돌연변이체들의 경우 표적 서열과 비표적 서열에 대한 결합 친화도가 다름을 알 수 있다. 3D8 VL 4M을 주형으로 하여 제조된 라이브러리에서 선별한 돌연변이체들은 표적 기질인 Her2₁₈, G₁₈에 대한 친화도는 향상되었고, 비표적 기질에 대한 친화도는 큰 변화가 없어, 둘 사이에 약 10~100배의 K_D 값의 차이를 보여주었다. 따라서, 본 발명에 따른 돌연변이체들이 원하는 표적 핵산에 서열 특이적으로 결합하도록 개량되었음을 알 수 있다.

2. 돌연변이체들의 핵산 가수분해 활성

정제된 돌연변이체들의 핵산 가수분해 활성을 분석하기 위하여, 아가로오스 겔에서 전기영동을 수행하였다. 기질로는 pUC19 플라스미드를 사용하였다. pUC19 플라스미드 정제는 인트론 사의 miniprep 키트(Intron Inc., Korea)를 사용하였다. 정제된 pUC19 플라스미드는 0.7% 아가로오스 겔 상에서 분석하였을 때 95% 이상이 초 나선 형태(supercoiled plasmid)로 존재하였다. 핵산 가수분해 반응은 2mM MgCl₂ 또는 50mM EDTA가 녹아있는 트리스 완충용액(Tris Buffered Saline)에서 돌연변이체와 플라스미드 기질을 반응시켜 수행하였다. 모든 반응 조건에서 이온력은 TBS 완충용액의 NaCl을 사용하여 150mM로 고정하였다. 항체와 핵산은 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 3D8 항체가 핵산에 결합하여 아가로오스 겔 분석 시 겔의 상단부에 남아있는 현상을 제거하기 위하여, 트립신 프로테아제(20㎍/㎖) (Sigma, USA)를 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 반응이 완료된 샘플들은 0.7% 아가로오스 겔에서 전기영동한 후 ethidium bromide로 염색하여 관찰하였다.

또한, 돌연변이체들 중 일부에 대하여 RNA 가수분해활성을 알아보았다. 3D8 VL WT, 3D8 VL 4M 항체와 3종류의 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)에 대하여 RNA 가수분해 실험을 수행하였다. 이 돌연변이체들은 뒤에서 나오는 서열 특이적 가수분해 실험에서 좋은 결과를 보여주었던 돌연변이체들이다. RNase A와 HW1 단백질을 대조군으로 하여 실험을 수행하였다. RNA 가수분해 반응은 2mM MgCl₂ 또는 50mM EDTA가 녹아있는 트리스 완충용액에서 HeLa 세포에서 정제한 총 RNA 기질을 반응시켜 수행하였다.

11개의 돌연변이체들의 DNA 가수분해 활성(A), 및 돌연변이체들 중 4MG3, 4MG5, 4MH2의 RNA 가수분해 활성(B)을 아가로오스 겔에서 전기영동으로 분석한 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, (A) 11개의 돌연변이체들 중 4MG2, 4MG3, 4MG5, 4MH1, 4MH2, 4MH3, 4MH5의 7개 돌연변이체가 DNA 가수분해 활성이 있는 것으로 나타났다. 나머지 4개의 돌연변이체들(4MG1, 4MG4, 4MG6, 4MH4)은 3D8 VL 4M에 비하여 현저하게 낮은 활성을 나타내었다. 또한, (B) RNase A는 거의 대부분의 RNA를 가수분해하였고, HW1의 경우 완충용액 대조군과 비슷하게 RNA를 분해하지 못하였다. 반면 돌연변이체들은 WT, 4M, RNase A와 마찬가지로 EDTA 존재 하에서도 RNA 가수분해 활성을 나타내었다.

따라서, 본 발명에 따른 돌연변이체들은 in vitro에서 DNA와 RNA에 대하여 가수분해 활성을 가짐을 알 수 있다.

실시예 6 : 선별된 돌연변이체들의 염기서열 특이적 핵산 가수분해 활성 검증

핵산 가수분해 활성이 검증된 돌연변이체들이 초기 의도와 같이 서열 특이적으로 핵산을 가수분해하는지를 검증하였다. 정제된 돌연변이체들을 형광 표지된 프라이머들과 반응시킨 후 FRET(Fluorescence resonance energy transfer)를 이용하여 형광 신호를 분석하는 방법을 사용하였다. 이때, 프라이머들은 5' 부분에 녹색 형광물질인 6-FAM을 표지하였고, 3' 부분에는 6-FAM에서 발생되는 녹색 형광을 흡수하는 BHQ-1을 표지하였다. 따라서 프라이머가 가수분해되지 않고 존재할 경우 6-FAM이 형광을 발현하여도 가까이 있는 BHQ-1에 의하여 형광 신호가 차단된다. 하지만 핵산 가수분해 활성이 있는 돌연변이체에 의하여 5' 말단과 3' 말단 사이의 핵산이 가수분해 되면 6-FAM과 BHQ-1의 거리는 서로 멀어지게 되고, 따라서 6-FAM의 형광 신호를 읽을 수 있게 된다. 이를 위하여 라이브러리 선별 시에 사용한 A₁₈, T₁₈, C₁₈, Her2₁₈, N₁₈ 핵산의 양 말단에 6-FAM과 BHQ-1을 표지한 프라이머를 디자인 하였다. 다만 G₁₈의 경우 제조상의 어려움으로 인해 구아닌 4개와 티민 1개를 반복하여 배열한 (G₄T)₃G₃프라이머로 대체하였다. 서열 특이적 핵산 가수분해 활성 검증에 사용한 FRET 기질(A₁₈, T₁₈, C₁₈, (G₄T)₃G₃, Her2₁₈, N₁₈)의 염기서열은 각각 서열번호 36 내지 서열번호 41로 나타내었다.

FRET 실험 결과 4MG3, 4MG5, 4MH2의 3가지 돌연변이체가 다른 돌연변이체에 비해 높은 서열 특이적인 핵산 가수분해 활성을 나타내었다. 이들 3종의 돌연변이체들과 WT, 4M에 대하여 보다 정확한 Enzyme Kientics 수치를 구하기 위하여 100nM 로 항체 농도를 고정시키고, 16nM ~ 2μM까지 기질의 농도를 변화시키면서 각각의 기질 농도에서 항체의 기질분해속도를 측정하였다. 일반적으로 다른 반응 조건을 고정시킨 상태에서 기질의 농도가 늘어나게 되면 효소의 반응 속도는 증가하게 되고, 반응 속도가 Vmax에 가까워지게 되면 기질의 농도를 높여도 속도는 크게 증가하지 않게 된다.

FRET 기질(A₁₈, T₁₈, C₁₈, (G₄T)₃G₃, Her2₁₈, N₁₈)의 농도를 16nM ~ 2μM까지 변화시키면서 각각의 기질의 농도에서 3D8 VL WT, 3D8 VL 4M 항체와 3종류의 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)의 기질분해속도를 측정한 결과는 도 9에 나타내었으며, 상기 도 9에서 측정한 FRET 실험 결과를 계산하여 나타낸 항체들의 Km, Kcat, Kcat/Km 값은 표 3에 나타내었다.

도 9 및 표 3에 나타난 바와 같이, 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)의 기질 분해속도는 3D8 VL WT, 3D8 VL 4M 항체와는 다르게 각각의 표적 기질에서 보다 높은 Vmax 값을 보여주었는데, 이는 돌연변이체들이 기질 농도가 충분히 높을 때 다른 기질보다 표적 기질을 상대적으로 빠르게 분해시킨다는 것을 알 수 있다. 반면, 3D8 VL WT와 3D8 VL 4M의 경우 반응 속도가 기질의 서열에 큰 영향을 받지 않음을 알 수 있다. 측정한 결과를 계산하여 항체들의 Km, Kcat, Kcat/Km 값을 얻을 수 있었다. 3 종류의 돌연변이체 중 4MG3와 4MG5의 경우 비표적 기질보다 표적 기질인 G₁₈에 대한 Vmax 값이 높게 나타나 G₁₈ 핵산서열을 특이적으로 가수분해 하였으며, 4MH2 돌연변이체의 경우 비표적 기질보다 표적 기질인 Her2₁₈에 대한 Vmax 값이 높게 나타나 Her2₁₈핵산서열을 특이적으로 인식하여 가수분해 하였다. 이들 돌연변이체들은 표적 기질에 대해 다른 기질보다 낮은 Km 값과 높은 Kcat/Km 값을 보여준다. Km 값이 의미하는 것은 항체가 Vmax에 도달하는 기질 농도의 1/2 지점인데, 이 값이 낮을수록 항체와 기질의 친화도가 높게 나타나는 경향이 있다. 4MG3, 4MG5, 4MH2의 돌연변이체들은 각각의 표적 기질에 대해 다른 기질보다 더 낮은 Km 값을 나타내고 있다. 앞에서 Biacore 2000을 사용하여 측정한 Kd 값과는 차이가 있지만, 이는 Km 값이 단순히 친화도만을 나타내는 값이 아니기 때문에 보이는 현상으로 생각된다. Kcat/Km 값의 경우 돌연변이체들은 다른 기질보다 표적 기질에서 2~5배 높은 값을 나타내었다. 보다 높은 Kcat/Km 값이 의미하는 것은 기질에 대한 가수분해 활성이 다른 기질에 비해 상대적으로 높다는 것을 뜻한다.

따라서, 4MG3, 4MG5, 4MH2의 돌연변이체들은 각각의 표적 핵산 서열을 인지하여 특이적으로 결합하고 보다 빠르게 가수분해 시킴을 알 수 있다.

실시예 7 : 발현벡터를 이용한 돌연변이체들의 세포내 염기서열 특이적 핵산 가수분해 활성 검증

돌연변이체들의 세포내 염기서열 특이적 핵산 가수분해 활성을 검증하기 위하여 리포터 유전자 시스템을 사용하였다. 리포터로서는 녹색 형광을 발현하는 EGFP 유전자를 사용하였다. EGFP가 들어있는 pEGFP-N1 벡터의 EGFP 유전자 앞부분에 18개의 구아닌 유전자와 Her2₁₈ 유전자를 합성하여 pEGFP-N1-G₁₈와 pEGFP-N1-Her2₁₈ 벡터를 클로닝 하였으며, 돌연변이체들을 동물세포에 형질전환 시키기 위하여 pcDNA3.1(+) 발현벡터에 3D8 VL WT, 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)를 각각 서브 클로닝 하였다. 구체적으로는, 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁵개의 인간 자궁경부암 세포(HeLa)와 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖를 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화되면, 배지를 제거하고 각 웰을 인산완충용액(PBS) 1㎖를 이용하여 세척하였다. 이 후, 형질전환의 효율을 최대화하기 위하여 TOM media(Transfection optimized medium, WelGENE Inc., Korea) 800㎕를 각 웰에 첨가하였다. 형질전환 할 500ng의 pEGFP-N1 단독; 500ng의 pEGFP-N1-G₁₈ 단독; 500ng의 pEGFP-N1-Her₁₈ 단독; pEGFP-N1 500ng과 pcDNA3.1(+)-wild type, pcDNA3.1(+)-4MG3, pcDNA3.1(+)-4MG5, pcDNA3.1(+)-4MH2 를 각각 500ng씩 혼합한 것; pEGFP-G₁₈ 500ng과 pcDNA3.1(+)-wild type, pcDNA3.1(+)-4MG3, pcDNA3.1(+)-4MG5를 각각 500ng씩 혼합한 것; 또한 pEGFP-Her2₁₈500ng과 pcDNA3.1(+)-wild type, pcDNA3.1(+)-4MH2를 각각 500ng씩 혼합한 것을 튜브 상에서 200㎕의 TOM media와 Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA) 5㎕와 함께 20분 동안 상온에서 반응시킨 후 각 웰에 첨가하였다. 6시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖로 교환한 후, 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고, 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 얻고, 인산완충용액으로 세척한 후, 각 샘플을 FACS Calibur(Fluorescent Activated Cell Sortor, FACS)를 사용하여 GFP의 파장을 검출하였다.

또한, 상기 실험 과정을 거친 각 샘플을 토끼 항-3D8 다클론 항체 및 TRITC-결합된 항-토끼 항체로 처리한 후 3D8 VL wild type과 4MG3, 4MG5, 4MH2 단백질을 염색하고, DAPI를 이용해서 핵을 염색한 뒤 공초점 현미경(confocal microscopy)을 사용하여 EGFP(녹색), 3D8 VL wild type과 4MG3, 4MG5, 4MH2 단백질(적색) 발현정도를 검출하였다.

또한, 상기 실험 과정을 거친 각 샘플에서 단백질 또는 총 RNAs를 추출하여 웨스턴-블롯과 RT-PCR을 실시하여 3D8 VL wild-type, 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)에 의한 EGFP의 감소를 단백질 수준과 mRNAs 수준에서 확인하였다.

3D8 VL wild type, 돌연변이체(4MG3, 4MG5)를 세포의 세포질에 발현시키기 위해 pcDNA3.1 벡터에 클로닝한 모식도(A), 세포의 세포질에 GFP를 발현하는 pEGFP-N1 발현벡터의 모식도(B), EGFP를 발현하는 pEGFP-N1 벡터의 EGFP N-말단 앞쪽에 G₁₈ 서열을 추가하여 제작된 pG₁₈-EGFP 발현벡터의 모식도(C), 및 EGFP를 발현하는 pEGFP-N1 벡터의 EGFP N-말단 앞쪽에 Her2₁₈ 서열을 추가하여 제작된 pHer2₁₈-EGFP 발현벡터의 모식도(D)는 도 10에 나타내었다.

또한, 도 10에 나타낸 발현벡터를 이용하여 인간 자궁경부암 세포(HeLa)에 3D8 VL WT 또는 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)와 다양한 EGFP 리포터 유전자 (EGFP, G₁₈-EGFP, Her2₁₈-EGFP)를 형질전환 하였을 때, 3D8 VL 변이체에 의해서 표적 염기서열을 지닌 리포터 EGFP의 형광 발현 정도를 FACS로 분석한 결과(A), 세포내 단백질 발현 정도를 공초점 현미경으로 관찰한 결과(B)와 웨스턴-블롯으로 분석한 결과(C,D), 및 mRNA 양을 RT-PCR로 분석한 결과(E,F)는 도 11에 나타내었다.

도 11A에 나타난 바와 같이, G₁₈ 또는 Her2₁₈가 없는 기존 EGFP의 경우 3D8 VL wild type과 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)에 의한 발현의 차이는 별로 없었지만, G₁₈이 EGFP의 5'-말단 앞에 들어간 벡터의 경우 3D8 VL wild type보다 돌연변이체(4MG3, 4MG5)가 발현되는 세포에서 EGFP 형광신호가 매우 낮게 검출되었으며, Her2₁₈이 EGFP의 5'-말단 앞에 들어간 벡터의 경우에도 3D8 VL wild type보다 4MH2가 발현되는 세포에서 EGFP 형광신호가 매우 낮게 검출되었다. 따라서 4MG3와 4MG5 돌연변이체는 세포내에서 발현되어 표적 염기서열을 지닌 G₁₈-EGFP mRNA를 가수분해하며, 4MH2 돌연변이체는 세포내에서 발현되어 표적 염기서열을 지닌 Her2₁₈-EGFP mRNA를 가수분해하여, GFP의 발현 수준을 낮춘 것으로 보인다. 이는 특정염기 서열만을 인지하여 가수분해 활성을 지닌 항체를 세포내에 발현시켜, 표적 염기서열을 지닌 mRNA를 가수분해하여 이에 의해서 코딩된 단백질의 발현 수준을 낮출 수 있다는 개념을 보여주는 것이다.

또한 도 11B에 나타난 바와 같이, 형질전환된 샘플들을 공초점 현미경으로 관찰한 결과는 도 11A의 결과와 동일하게 G₁₈ 또는 Her2₁₈가 없는 기존 EGFP의 경우 3D8 VL wild type과 4MG3, 4MG5, 4MH2의 차이는 별로 없었지만, G₁₈이 EGFP의 5'-말단 앞에 들어간 벡터의 경우 3D8 VL wild type보다 4MG3, 4MG5가 발현되는 세포에서 EGFP 형광신호가 매우 낮게 검출되었으며 Her2₁₈이 EGFP의 5'-말단 앞에 들어간 벡터의 경우에도 VL wild type보다 4MH2가 발현되는 세포에서 EGFP 형광신호가 매우 낮게 검출되었다. 이는 도 11A의 결과를 이미지로 재확인한 결과로 4MG3, 4MG5, 4MH2 항체가 특정염기서열만을 인지하여 가수분해 활성을 지니고 있음을 보여주는 것이다.

또한 도 11C~11F에 나타난 바와 같이, 세포내에서 발현된 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)는 단백질 수준과 mRNAs 수준에서 GFP가 감소함을 확인하였다. 따라서, 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)는 특정염기서열만을 인지하여 가수분해 활성을 지니고 있음을 알 수 있다.

실시예 8 : Her2 염기서열 특이적 핵산 가수분해 활성을 가진 돌연변이체 (발현벡터)의 Her2 유전자 발현 감소 효과 검증

Her2 염기서열 특이적 핵산 가수분해 활성을 가진 돌연변이체인 4MH2에 의한 Her2 유전자 발현 감소 효과를 검증하기 위하여, Her2를 발현하지 않는 인간 자궁경부암 세포(HeLa)에 Her2 유전자 발현벡터를 이용하여 형질전환하는 시스템을 사용하였다. Her2 mRNAs의 발현을 감소시키는 양성대조군으로는 Her2 siRNA를 사용하였다. 구체적으로는, 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁵개의 HeLa 세포와 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖를 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화되면, 각 웰을 PBS 1㎖를 이용하여 세척하였다. 이 후, TOM media(Transfection optimized medium, WelGENE Inc., Korea) 800㎕를 각 웰에 첨가하였다. 형질전환 할 500ng의 pcDNA3.1(+)-Her2 단독을 튜브 상에서 200㎕의 TOM media와 Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA) 5㎕와 함께 20분 동안 상온에서 반응시킨 후, 각 웰에 첨가하였다. 6시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖로 교환한 후, 24시간 동안 배양한 후, 각 웰을 PBS 1㎖를 이용하여 세척하였다. 이 후, TOM media(Transfection optimized medium, WelGENE Inc., Korea) 800㎕를 각 웰에 첨가하였다. 형질전환 할 500ng pcDNA3.1(+)-wild type, Her2 siRNA, pcDNA3.1(+)-4MH2를 튜브 상에서 200㎕의 TOM media와 Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA) 5㎕와 함께 20분 동안 상온에서 반응시킨 후 각 웰에 첨가하였다. 6시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖로 교환한 후, 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고, 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 얻고 PBS로 세척한 후, 각 샘플에서 RNAs 또는 단백질을 추출하여 RT-PCR과 웨스턴-블롯을 실시하여 wild-type, Her2 siRNA, 4MH2가 Her2 발현에 미치는 영향을 mRNAs와 단백질 수준에서 확인하였다.

Her2 염기서열(Her2₁₈) 특이적 핵산 가수분해 활성을 가진 3D8 VL의 돌연변이체인 4MH2를 인간 자궁경부암 세포(HeLa)에 형질전환한 후, Her2 유전자 발현 정도를 각각 mRNA 수준 및 단백질 수준에서 RT-PCR(A) 및 웨스턴-블롯(B)으로 분석한 결과는 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타난 바와 같이, 3D8 VL wild-type에 의해서는 별다른 변화가 관찰되지 않는 반면, 4MH2의 경우 Her2 발현 수준을 현저히 감소시켰다. 특히, 24시간대에서는 Her2 siRNA보다 4MH2에 의한 감소가 보다 강하게 나타남을 관찰하였다. 따라서, 4MH2는 Her2 특정염기서열만을 인지하여 가수분해 활성을 지니고 있음을 알 수 있다. 또한, 4MH2에 의한 Her2 유전자의 mRNA와 단백질의 감소 정도는 Her2 siRNA와 유사한 수준으로 관찰되었으며, 특히 24시간대에서는 Her2 siRNA보다 4MH2에 의한 감소가 보다 강하게 나타남을 관찰하였다.

실시예 9 : 돌연변이체들(단백질)의 세포내로의 유입능과 경로 규명

1. 돌연변이체들(단백질)의 세포내로의 유입능

3D8 scFV의 경우 세포내로의 유입능이 있다고 이미 보고된 바 있으며, 3D8 VL wild-type과 이들의 돌연변이체들도 세포내로의 유입능을 가지고 있는지 확인하기 위하여 FACS와 공초점 현미경으로 관찰하였다. 구체적으로는, 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁵개의 인간 자궁경부암 세포(HeLa)와 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖를 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화되면, 각 웰을 PBS 1㎖를 이용하여 세척하였다. 이 후, TOM media (Transfection optimized medium, WelGENE Inc., Korea) 800㎕를 각 웰에 첨가하였다. 각 돌연변이체들(10μM)을 처리한 후, 2시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 배지를 제거하고, 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 얻고, PBS로 세척한 후, 각 샘플을 3D8 scFv와 결합하는 1차 항체와 이에 결합하는 TRITC라는 적색 형광물질이 결합되어 있는 이차 항체를 이용하여 3D8 VL wild type과 4MG3, 4MG5, 4MH2 단백질을 염색하고 FACS Calibur(Fluorescent Activated Cell Sortor, FACS)를 사용하여 TRITC의 파장을 검출하였다. 이때 세포내로 유입되지 않고 세포 표면에 붙어 있는 단백질들이 검출되는 것을 방지하기 위하여 세포 얻는 과정에서 트립신을 이용하여 세포 표면에 붙어 있는 단백질을 제거하였다.

또한, 상기 인간 자궁경부암 세포(HeLa) 내의 단백질들의 위치를 형광을 이용하여 공초점현미경으로 확인하였다. 즉, 상기 실험 과정을 거친 각 샘플을 3D8 scFv와 결합하는 1차 항체와 이에 결합하는 TRITC 라는 적색 형광물질이 결합되어 있는 이차 항체를 이용하여 3D8 VL wild type과 4MG3, 4MG5, 4MH2 단백질을 염색하고, DAPI를 이용해서 핵을 염색한 후 공초점 현미경(confocal microscopy)을 사용하여 세포의 핵(청색형광), 3D8 VL wild type과 4MG3, 4MG5, 4MH2 단백질(적색형광) 발현정도를 검출하였다.

3D8 VL wild type과 돌연변이체들(4MG3, 4MG5, 4MH2)의 세포내로의 유입능을 인간 자궁경부암 세포(HeLa)와 인간 유방암 세포(SK-BR3)에서 FACS를 통해 분석한 결과(A)와 상기 인간 자궁경부암 세포(HeLa)를 공초점현미경으로 분석한 결과(B)는 각각 도 13A 및 13B에 나타내었다.

도 13A에 나타난 바와 같이, 인간 자궁경부암 세포(HeLa)와 인간 유방암 세포(SK-BR3)에서 3D8 VL wild type과 돌연변이체들(4MG3, 4MG5, 4MH2)이 유사한 수준으로 세포내로 유입된다는 것을 확인하였다. 즉, 돌연변이체들이 세포내로의 유입능이 유사하다는 것을 보여주며, 이는 앞으로 돌연변이체들(단백질)을 이용하여 진행되는 실험에서 돌연변이체 간에 유입능의 차이는 고려하지 않아도 된다는 것을 의미한다.

도 13B에 나타난 바와 같이, 적색 형광은 3D8 VL wild type과 돌연변이체들 (4MG3, 4MG5, 4MH2)을 나타내고, 청색 형광은 세포의 핵을 나타낸다. 따라서, 대부분의 단백질들이 핵막을 침투하지 못하고, 세포질에 위치하고 있음을 알 수 있다.

2. 돌연변이체들(단백질)의 세포내로의 유입 시 경로 규명

돌연변이체들의 세포내로의 유입될 때 그 경로를 규명하고자, 보고된 대표적인 세 가지 유입경로를 방해하는 약제들을 이용하였다. 사용된 약제로는 세포 표면의 음전하를 띄는 프로테오글리칸(헤파란 설페이트)과 양전하를 띄는 돌연변이체와의 전기적 결합을 방해하는 헤파린(100 IU/㎖); 클라트린-의존 세포내 이입 (clathrin-dependent endocytosis) 경로를 방해하는 클로르프로마진 (chlorpromazine); 카베올래/지질 래프트 세포내 이입(caveolae/lipid raft endocytosis) 경로를 방해하는 메틸-β-시클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin, MβCD), 및 대음세포작용(macropinocytosis) 경로를 방해하는 시토카라신 D (cytochalasin D)를 사용하였다. 구체적으로는, 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁵개의 인간 자궁경부암 세포(HeLa)와 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖를 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화되면, 각 웰을 PBS 1㎖를 이용하여 세척하였다. 이 후, TOM media(Transfection optimized medium, WelGENE Inc., Korea) 800㎕를 각 웰에 첨가하였다. 헤파린(5mM), MβCD (5mM), 클로르프로마진(10㎍/㎖), 또는 시토카라신 D(1㎍/㎖)를 30분간 전처리 한 다음, 각 돌연변이체들(10μM)을 처리한 후, 2시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 배지를 제거하고, 인산완충용액으로 세척한 후, 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 얻고, 각 샘플을 3D8 scFv와 결합하는 1차 항체와 이에 결합하는 TRITC라는 적색 형광물질이 결합되어 있는 이차 항체를 이용하여 3D8 VL wild type과 4MG3, 4MG5, 4MH2 단백질을 염색하고 FACS Calibur(Fluorescent Activated Cell Sortor, FACS)를 사용하여 TRITC의 파장을 검출하였다. 음성대조군으로는 인간 자궁경부암 세포(HeLa)에 세포내로의 유입 경로를 방해하는 약제를 처리하지 않고 세포내 유입 실험을 수행하였다. 3D8 VL들은 토끼 항-3D8 항체 및 TRITC-표지 항-토끼 항체로 표지한 후 분석하였다.

3D8 VL wild type과 돌연변이체들(4MG3, 4MG5, 4MH2)의 세포내로의 유입경로를 분석하기 위해 세포내 유입을 방해하는 약제들을 전처리 한 후 FACS를 통해 분석한 결과는 도 13C에 나타내었다.

도 13C에 나타난 바와 같이, 클로르프로마진 또는 시토카라신 D를 전처리 한 경우는 돌연변이체들의 세포내로의 유입되는 수준이 유사하여 아무런 영향을 받지 않았으며, 헤파린과 MβCD를 전처리 한 경우는 돌연변이체들의 유입이 현저히 감소되는 것을 관찰하였다. 이는 돌연변이체들의 유입 과정이 일차적으로 세포표면에 많이 존재하는 프로테오글리칸과 같은 물질과의 전기적 결합을 거친 뒤, 카베올래/지질 래프트 세포내 이입 경로로 유입된다는 것을 보여준다.

실시예 10 : 돌연변이체들(단백질)의 세포내 서열 특이적 핵산 가수분해 활성 검증

돌연변이체(단백질)들의 세포내 서열 특이적 핵산 가수분해 활성을 확인하기 위하여, 리포터 유전자 시스템을 사용하였다. 사용한 벡터로는 EGFP(녹색형광)를 발현하는 pEGFP-N1 벡터, EGFP 유전자 N-말단 앞부분에 18개의 구아닌 유전자와 Her2₁₈ 유전자를 가지는 발현벡터를 사용하였다. 구체적으로는, 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁵개의 인간 자궁경부암 세포(HeLa)와 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖를 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화되면, 각 웰을 인산완충용액 1㎖를 이용하여 세척하였다. 이 후, TOM media(Transfection optimized medium, WelGENE Inc., Korea) 800㎕를 각 웰에 첨가하였다. 형질전환 할 500ng의 pEGFP-N1 단독 또는 500ng의 pEGFP-N1-G₁₈ 단독을 튜브 상에서 200㎕의 TOM media와 Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA) 5㎕와 함께 20분 동안 상온에서 반응시킨 후 각 웰에 첨가하였다. 6시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖로 교환한 후, 24시간 동안 배양하였다. 각 웰을 인산완충용액 1㎖를 이용하여 세척하였다. 이 후, TOM media(Transfection optimized medium, WelGENE Inc., Korea) 800㎕를 각 웰에 첨가한 후, 각 돌연변이체들(10μM)을 처리한 후, 2시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 배지를 제거하고, 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 얻고, PBS로 세척한 후, 각 샘플을 FACS Calibur(Fluorescent Activated Cell Sortor, FACS)를 사용하여 EGFP의 파장을 측정하였다.

또한, 상기 실험 과정을 거친 각 샘플에서 총 RNAs 또는 단백질을 추출하여 RT-PCR과 웨스턴-블롯을 실시하여 3D8 VL wild-type, 돌연변이체(4MG3, 4MG5)에 의한 EGFP의 감소를 mRNAs 수준과 단백질 수준에서 확인하였다.

또한, 돌연변이체 4MH2의 경우는 하기와 같은 방법으로 RT-PCR과 웨스턴-블롯을 실시하였다. 구체적으로는, 6 웰 플레이트에 각 웰 당 2×10⁵개의 인간 자궁경부암 세포(HeLa)와 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖를 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화되면, 각 웰을 PBS 1㎖를 이용하여 세척하였다. 이 후, TOM media(Transfection optimized medium, WelGENE Inc., Korea) 800㎕를 각 웰에 첨가하였다. 형질전환 할 Her2 단독 또는 siRNA (500nM)와 혼합한 것을 튜브 상에서 200㎕의 TOM media와 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) 5㎕와 함께 20분 동안 상온에서 반응시킨 후 각 웰에 첨가하였다. 6시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양한 후, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖로 교환한 후, 24시간 동안 배양하였다. 각 웰을 PBS 1㎖를 이용하여 세척하였다. 이 후, TOM media (Transfection optimized medium, WelGENE Inc., Korea) 800㎕를 각 웰에 첨가한 후, 3D8 VL WT와 4MH2(10μM)를 처리 후, 2시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 배지를 제거하고, PBS로 세척한 후, 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 얻고, 각 샘플에서 RNAs 또는 단백질을 추출하여 RT-PCR과 웨스턴-블롯을 실시하였다.

인간 자궁경부암 세포(HeLa)의 세포질내로 침투한 3D8 VL wild type과 돌연변이체들(4MG3, 4MG5, 4MH2)이 표적 염기서열을 지닌 유전자(G₁₈-EGFP, Her2₁₈-EGFP)의 mRNA를 선택적으로 가수분해하여 표적 유전자(4MG3 및 4MG5는 G₁₈-EGFP, 4MH2는 Her2₁₈-EGFP)의 발현을 낮추어 EGFP의 형광이 감소된 정도를 FACS로 분석한 결과(A), 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)가 표적 유전자(G₁₈-EGFP, Her2₁₈-EGFP)의 mRNA와 단백질의 양을 선택적으로 감소시키는 것을 각각 RT-PCR(B, D)과 웨스턴-블롯 (C, E)으로 분석한 결과는 도 14에 나타내었다.

도 14A에 나타난 바와 같이, EGFP의 경우 3D8 VL wild type과 4MG3, 4MG5의 차이는 별로 없었지만, G₁₈이 EGFP의 5'-말단 앞에 들어간 벡터의 경우 3D8 VL wild type보다 4MG3, 4MG5가 발현되는 세포에서 EGFP 형광신호가 매우 낮게 검출되었다. 따라서, 4MG3와 4MG5 돌연변이체는 세포내에서 발현되어 표적 염기서열을 지닌 G₁₈-EGFP mRNA를 가수분해하여 EGFP의 발현 수준을 낮춘 것으로 보인다.

또한 도 14B~14E에 나타난 바와 같이, 세포내에서 발현된 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)는 단백질 수준과 mRNAs 수준에서 EGFP가 감소함을 확인하였다. 따라서, 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)는 특정염기서열만을 인지하여 가수분해 활성을 지니고 있음을 알 수 있다.

실시예 11 : 돌연변이체들(단백질)의 세포에 나타나는 독성 수준 확인

돌연변이체(단백질)들의 세포에 나타나는 독성 정도를 확인하기 위하여, 돌연변이체를 세포에 일정시간 처리 후 MTT 분석법을 통해 세포의 생존율을 확인하였다. 96 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁴개의 인간 유방암 세포(SK-BR-3, MDA-MB-231) 또는 인간 자궁경부암 세포(HeLa)와 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 200㎕를 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 되면, 각 웰을 PBS 200㎕를 이용하여 세척하였다. 이 후, TOM media(Transfection optimized medium, WelGENE Inc., Korea) 80㎕를 각 웰에 첨가한 후, 각 돌연변이체들(10μM)을 처리한 후, 24시간, 48시간, 또는 72시간 동안 세포 생존율을 확인하였다.

또한, 돌연변이체에 의한 세포사멸의 유형을 확인하기 위하여, 상기와 동일한 실험과정을 거친 각 샘플을 FITC-annexin V와 PI 염색을 한 후 세포 생존율을 FACS Calibur(Fluorescent Activated Cell Sortor, FACS)를 사용하여 측정하였다.

인간 유방암 세포(SK-BR-3, MDA-MB-231) 또는 인간 자궁경부암 세포(HeLa)에 Her2₁₈ 특이적인 돌연변이체(4MH2)를 처리한 후 MTT 분석법(A) 및 FACS(B)를 통해 세포의 생존율을 확인한 결과는 도 15에 나타내었다.

도 15A에 나타난 바와 같이, 각 항체들이 낮은 수준의 독성을 나타내고 있었으며, 특히 Her2 유전자를 과발현하는 SK-BR-3와 MDA-MB-231의 경우 Her2 염기 서열 특이적인 가수분해 활성을 갖는 4MH2에 의한 강한 독성이 관찰되었다. 이는 기존에 보고된 Her2 과발현 세포의 경우 Her2의 발현 수준이 감소하면 세포 생존율이 낮아진다는 결과와 일치하는 결과로 4MH2에 의해 Her2 발현이 감소하여 세포 생존율이 감소하였다고 생각되어진다.

도 15B에 나타난 바와 같이, 도 15A의 결과와 일치하게 각 항체들이 어느 정도 독성을 나타내었으며, Her2 유전자를 과발현하고 있는 SK-BR-3와 MDA-MB-231의 경우 Her2 염기서열 특이적인 가수분해 활성을 갖는 4MH2와 Her2 siRNA에 의한 독성을 관찰할 수 있었고, 이때 세포 죽음의 형태가 세포사멸(apoptosis: Annexin V 양성)이라는 것을 확인하였다.

실시예 12 : Her2 염기서열 특이적 핵산 가수분해 활성을 가진 돌연변이체들 (단백질)의 Her2 유전자 발현 감소 효과 및 우수성 검증

Her2 염기서열 특이적 핵산 가수분해 활성을 가진 돌연변이체인 Her2 유전자 발현 감소 효과를 검증하기 위하여, Her2가 과발현하는 세포주인 SK-BR-3를 사용하였다. 구체적으로는, 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁵개의 SK-BR-3 세포와 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 2㎖를 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화되면, 각 웰을 PBS 1㎖를 이용하여 세척하였다. 이 후, TOM media(Transfection optimized medium, WelGENE Inc., Korea) 800㎕를 각 웰에 첨가한 후, 각 돌연변이체들(10μM)을 처리한 후, 2시간, 12시간, 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고, 트립신-EDTA를 이용하여 세포를 얻고 PBS로 세척한 후, 세포 표면의 Her2 단백질을 염색하여 FACS Calibur(Fluorescent Activated Cell Sortor, FACS)를 사용하여 검출하였다.

또한, 각 샘플에서 RNAs 또는 단백질을 추출하여 RT-PCR과 웨스턴-블롯을 실시하여 4MH2 항체가 특정염기서열만을 인지하여 가수분해 활성을 지니고 있음을 재확인하였다.

Her2₁₈ 염기서열 특이적인 돌연변이체(4MH2)가 Her2를 과발현하는 인간 유방암 세포(SK-BR-3)의 세포질 내로 침입하여 세포 표면에서 Her2의 발현 정도를 FACS로 분석한 결과(A), 및 Her2의 mRNA와 단백질의 양을 각각 RT-PCR(B)과 웨스턴-블롯(C)으로 분석한 결과는 도 16에 나타내었다.

도 16A에 나타난 바와 같이, 4MH2에 의해 선택적으로 세포 표면의 Her2 발현 수준을 감소시켰으며, 특히 돌연변이체 단백질이 충분히 세포 내로 유입되는 2시간부터 Her2 mRNA의 감소효과가 나타나기 시작해서 48시간에 가장 뚜렷한 감소 효과를 관찰하였다. 또한 양성 대조군인 Her2 siRNA와 그 효과를 비교하였을 때 더 빠른 시간대부터 더 강한 감소 효과를 나타내는 것을 관찰하였다. 이는 4MH2 항체가 Her2 siRNA에 비해 더 빠른 시간 내에 표적 염기서열을 지닌 mRNA를 가수분해하여 이에 의해서 코딩된 단백질의 발현을 낮춘다는 4MH2의 장점을 보여주는 것이다. 또한, 음성 대조군으로 사용한 3D8 wild type, G₁₈-특이적인 4MG3 및 4MG5는 Her2 유전자 발현 감소효과를 보이지 않았다.

또한 도 16B 및 16C에 나타난 바와 같이, 상기 도 16A의 결과와 동일하게 4MH2에 의해 선택적으로 세포 표면의 Her2 발현 수준을 감소시켰으며, Her2 siRNA에서 보다 빠르고 강하게 효과가 나타나는 결과를 반복적으로 관찰하였다.

본 발명에 따른 핵산 가수분해 항체는 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체의 특정 부위를 변화시켜 핵산 가수분해 특성을 유지한 상태에서 서열 특이성을 갖도록 항체공학을 이용하여 개량함으로써, 특별한 외부 단백질 전달 시스템 도움 없이 개량된 핵산 가수분해 항체가 스스로 세포내로 침투하여 세포질에 위치하거나 혹은 개량된 핵산 가수분해 항체를 세포 내부에서 발현시켰을 때 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해하는 능력을 가져 특정 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산 가수분해 항체는 기존의 siRNA와 같은 유전자 침묵 기술을 대체 및 보완할 수 있으며, 특히 단백질이 아닌 이를 코딩하고 있는 RNA 또는 DNA에 특이적으로 결합하고 가수분해하여 궁극적으로는 표적 단백질의 발현을 감소시키거나 지놈 증식을 억제할 수 있어, 여러 가지 질환의 원인이 되는 병원성 단백질 발현 또는 바이러스 유전자 증식 억제에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 핵산 가수분해 항체의 포맷(A)과, 본 발명의 핵산 가수분해 항체가 특정염기서열을 지닌 단일가닥/이중가닥의 표적 핵산을 가수분해하는 모식도(B)를 나타낸 도이다.

도 2는 본 발명의 핵산 가수분해 항체가 특정염기서열을 인식하여 형질 전환된 세포에서 발현하여 세포내에 위치하거나 세포내로 침투하여 세포질에 위치한 후, 표적 핵산 서열을 지닌 외부 물질(예, 바이러스) 또는 세포내 mRNA를 가수분해하여 바이러스 증식이 억제되거나 mRNA에 의해 코딩된 단백질이 발현을 억제하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 3은 3D8 VL 항체의 3차 구조(A), 및 3D8 VL WT 항체의 DNA/RNA 인식부위인 c-(잔기 41-45), c'-(잔기 50-54), f-(잔기 90-94) 베타-가닥의 아미노산 서열, 염기서열 및 돌연변이 시 사용된 NNB 코돈(B)을 나타낸 도이다.

도 4는 3D8 VL 4M 항체를 주형으로 핵산가수분해 항체 라이브러리를 제작한 모식도(A), 제작된 라이브러리를 효모발현 벡터(pCTCON)와 함께 효모에 전기형질전환을 통해 효모세포 표면에 라이브러리를 제작한 모식도(B), 및 제작된 라이브러리의 발현 수준을 FACS로 분석한 결과(C)를 나타낸 도이다.

도 5는 3D8 VL 4M 항체의 라이브러리로부터 표적 핵산인 단일가닥-DNA 기질 (G₁₈, Her2₁₈)의 염기서열에 특이적으로 결합하는 돌연변이체들을 MACS와 FACS를 사용하여 선별하는 과정을 나타낸 도이다.

도 6은 3D8 VL 4M 항체의 라이브러리로부터 단일가닥 G₁₈ 기질(4MG1~4MG6) 및 Her2₁₈ 기질(4MH1~4MH5)에 대해서 선별된 11개의 돌연변이체들의 c-(잔기 41-45), c'-(잔기 50-54), f-(잔기 90-94) 베타-가닥의 아미노산 서열을 나타낸 도이다.

도 7은 정제된 11개의 돌연변이체들의 SDS-PAGE 분석 결과(A), 및 대표적 변이체(4MG3, 4MG5 및 4MH2)의 크기배제 HPLC 분석 결과(B)와 Far-UV CD(circular dichroism) 분광계로 측정한 결과(C)를 나타낸 도이다.

도 8은 11개의 돌연변이체들의 DNA 가수분해 활성(A), 및 돌연변이체들 중 4MG3, 4MG5, 4MH2의 RNA 가수분해 활성(B)을 아가로오스 겔에서 전기영동으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.

도 9는 FRET 기질(A₁₈, T₁₈, C₁₈, (G₄T)₃G₃, Her2₁₈, N₁₈)의 농도를 16nM ~ 2μM까지 변화시키면서 각각의 기질의 농도에서 3D8 VL WT, 3D8 VL 4M 항체와 3종류의 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)의 기질분해속도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

도 10은 3D8 VL wild type, 돌연변이체(4MG3, 4MG5)를 세포의 세포질에 발현시키기 위해 pcDNA3.1 벡터에 클로닝한 모식도(A), 세포의 세포질에 GFP를 발현하는 pEGFP-N1 발현벡터의 모식도(B), EGFP를 발현하는 pEGFP-N1 벡터의 EGFP N-말단 앞쪽에 G₁₈ 서열을 추가하여 제작된 pG₁₈-EGFP 발현벡터의 모식도(C), 및 EGFP를 발현하는 pEGFP-N1 벡터의 EGFP N-말단 앞쪽에 Her2₁₈ 서열을 추가하여 제작된 pHer2₁₈-EGFP 발현벡터의 모식도(D)를 나타낸 도이다.

도 11은 도 10에 나타낸 발현벡터를 이용하여 인간 자궁경부암 세포(HeLa)에 3D8 VL WT 또는 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)와 다양한 EGFP 리포터 유전자 (EGFP, G₁₈-EGFP, Her2₁₈-EGFP)를 형질전환 하였을 때, 3D8 VL 변이체에 의해서 표적 염기서열을 지닌 리포터 EGFP의 형광 발현 정도를 FACS로 분석한 결과(A), 세포내 단백질 발현 정도를 공초점 현미경으로 관찰한 결과(B)와 웨스턴-블롯으로 분석한 결과(C,D), 및 mRNA 양을 RT-PCR로 분석한 결과(E,F)를 나타낸 도이다.

도 12는 Her2 염기서열(Her2₁₈) 특이적 핵산 가수분해 활성을 가진 3D8 VL의 돌연변이체인 4MH2를 인간 자궁경부암 세포(HeLa)에 형질전환한 후, Her2 유전자 발현 정도를 각각 mRNA 수준 및 단백질 수준에서 RT-PCR(A) 및 웨스턴-블롯(B)으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.

도 13은 3D8 VL wild type과 돌연변이체들(4MG3, 4MG5, 4MH2)의 세포내로의 유입능을 인간 자궁경부암 세포(HeLa)와 인간 유방암 세포(SK-BR3)에서 FACS를 통해 분석한 결과(A)와 상기 인간 자궁경부암 세포(HeLa)를 공초점현미경으로 분석한 결과(B), 및 3D8 VL wild type과 돌연변이체들(4MG3, 4MG5, 4MH2)의 세포내로의 유입경로를 분석하기 위해 세포내 유입을 방해하는 약제들을 전처리 한 후 FACS를 통해 분석한 결과(C)를 나타낸 도이다.

도 14는 인간 자궁경부암 세포(HeLa)의 세포질내로 침투한 3D8 VL wild type과 돌연변이체들(4MG3, 4MG5, 4MH2)이 표적 염기서열을 지닌 유전자(G₁₈-EGFP, Her2₁₈-EGFP)의 mRNA를 선택적으로 가수분해하여 표적 유전자(4MG3 및 4MG5는 G₁₈-EGFP, 4MH2는 Her2₁₈-EGFP)의 발현을 낮추어 EGFP의 형광이 감소된 정도를 FACS로 분석한 결과(A), 돌연변이체(4MG3, 4MG5, 4MH2)가 표적 유전자(G₁₈-EGFP, Her2₁₈-EGFP)의 mRNA와 단백질의 양을 선택적으로 감소시키는 것을 각각 RT-PCR(B, D)과 웨스턴-블롯(C, E)으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.

도 15는 인간 유방암 세포(SK-BR-3, MDA-MB-231) 또는 인간 자궁경부암 세포 (HeLa)에 Her2₁₈ 특이적인 돌연변이체(4MH2)를 처리한 후 MTT 분석법(A) 및 FACS(B)를 통해 세포의 생존율을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

도 16는 Her2₁₈ 염기서열 특이적인 돌연변이체(4MH2)가 Her2를 과발현하는 인간 유방암 세포(SK-BR-3)의 세포질 내로 침입하여 세포 표면에서 Her2의 발현 정도를 FACS로 분석한 결과(A), 및 Her2의 mRNA와 단백질의 양을 각각 RT-PCR(B)과 웨스턴-블롯(C)으로 분석한 결과를 나타낸 도이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Cell-penetrating, sequence-specific and nucleic acid-hydrolyzing antibody, method for preparing the same and pharmaceutical composition comprising the same <130> P09-07246 <150> KR10-2008-0111712 <151> 2008-11-11 <160> 41 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL WT <400> 1 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL 4M <400> 2 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 3 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL WT <400> 3 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttattatcac 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 4 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL 4M <400> 4 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcggtctcct aaactgctga tccaccgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer 1F <400> 5 caggctagtg gtggtggtgg ttct 24 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer 2R <400> 6 cagcagttta ggagaccgcc ctggvnnvnn vnnvnnvnna gccaagtagt tctttcgggt 60 60 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer 3R <400> 7 agattcccta gtggatgccc ggtgvnnvnn vnnvnnvnna gaccgccctg g 51 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer 4F <400> 8 caccgggcat ccactaggga atct 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer 5R <400> 9 caggtcttca gcctgcacac tgct 24 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer 6F <400> 10 agcagtgtgc aggctgaaga cctgnnbnnb nnbnnbnnba agcaatctta ttatgccatg 60 60 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of primer 7R <400> 11 gatctcgcgc tattacaagt cctcttcaga 30 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 5'-biotinylated substrate(G(18)) <400> 12 gggggggggg gggggggg 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 5'-biotinylated substrate(Her2(18)) <400> 13 aattccagtg gccatcaa 18 <210> 14 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG1) <400> 14 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Asn Gln Arg Lys Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Arg Lys Ser Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Pro Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Glu Pro Glu Glu Leu Ala Gly Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Cys Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 15 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG2) <400> 15 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Gln Gln Arg Lys Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Arg Lys Arg Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Glu Val Gly Arg Gly Gly Asp Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 16 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG3) <400> 16 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Ala Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Arg Gln Lys Lys Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Arg Lys Gln Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Glu Leu Arg Glu Glu Asn Arg Lys Glu 85 90 95 Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 17 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG4) <400> 17 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Asn Asn Arg Arg Arg Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Arg Asn Lys His Glu His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Gly Glu Glu Leu Pro Glu Asp Pro His Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 18 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG5) <400> 18 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Lys Asn Gln Gly Gln Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Arg Lys Asn Asn Arg His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Gly Arg Tyr Asn Ser Asn Gln 85 90 95 Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 19 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MG6) <400> 19 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Ser Arg Lys Arg Gly Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Gly Lys Asn His Arg His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Glu Gly Glu Asp Leu Gly Glu Tyr Trp Cys Lys Glu 85 90 95 Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 20 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MH1) <400> 20 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Lys His Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Asn Gly Ser Arg Gln His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Glu Leu Ala Tyr Tyr Asn Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 21 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MH2) <400> 21 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Asn Gln Cys Lys Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Glu Lys Asn Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Asp Ile Gln Gln Ala Lys Gln 85 90 95 Cys Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 22 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MH3) <400> 22 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Ser Glu Arg Lys Arg Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Glu Asn Asn Arg Arg His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Gln Asp Leu Gly Asp Gln Gln Gly Lys Glu 85 90 95 Cys Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 23 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MH4) <400> 23 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Gly Lys Ser Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Gly Asn Tyr Gly Cys Lys Glu 85 90 95 Cys Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 24 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of 3D8 VL mutant(4MH5) <400> 24 Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg 35 40 45 Ser Ser Lys Gly Leu Ile His Arg Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Glu Leu Arg Gly Lys Arg Gly Lys Gln 85 90 95 Cys Tyr Tyr Ala Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 25 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG1) <400> 25 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggaaccagc gcaaaccagg gcggtctcgc aaaagcctga tccaccgggc atccaccagg 180 gaacctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tggagcctga agagctggca gggtattact gcaagcaatg ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 26 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG2) <400> 26 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggcagcagc gtaaaccagg gcggtctcgc aaacgcctga tccaccgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agaggtgggt cggggtgggg acaagcaatc ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 27 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG3) <400> 27 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagag cccgaaagaa ctacttggct 120 tggaggcaga agaaaccagg gcggtctcgc aaacagctga tccaccgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agagctgagg gaagaaaacc ggaaggaatc ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 28 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG4) <400> 28 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 aataacaggc gtaggccagg gcggtctcgg aataaacatg aacaccgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcagggtga agagctgccg gaggatcctc acaagcaatc ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 29 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG5) <400> 29 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 aaaaatcaag gacaaccagg gcggtctaga aaaaacaaca ggcaccgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggga cgttataatt ccaaccaatc ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 30 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MG6) <400> 30 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 agtagaaagc gaggaccagg gcggtctggt aagaaccaca gacaccgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tggagggtga agacctggga gagtattggt gcaaggaatc ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 31 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MH1) <400> 31 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 agtaaggaaa aacacccagg gcggtctaac ggcagccgac agcaccgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agagctggca tattataact gcaagcaatc ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 32 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MH2) <400> 32 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggaaccagt gcaaaccagg gcggtctgag aaaaatctga tccaccgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggat attcagcaag cgaagcaatg ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 33 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MH3) <400> 33 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 agtgagcgaa agcgaccagg gcggtctgag aataacaggc ggcaccgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctca agacctgggt gatcagcaag ggaaggaatg ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 34 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MH4) <400> 34 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc ataaaccagg gcggtctggc aaaagtctga tccaccgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggga aactatggtt gcaaggaatg ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 35 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of 3D8 VL mutant(4MH5) <400> 35 gatcttgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgttc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcggtctagc aaagggctga tccaccgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agagctgagg gggaagcggg gcaagcaatg ttattatgcc 300 atgtatacgt tcggatcggg gaccaagctg gaaataaaa 339 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of FRET substrate(A18) which was labeled with 6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus <400> 36 aaaaaaaaaa aaaaaaaa 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of FRET substrate(T18) which was labeled with 6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus <400> 37 tttttttttt tttttttt 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of FRET substrate(C18) which was labeled with 6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus <400> 38 cccccccccc cccccccc 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of FRET substrate((G4T)3G3) which was labeled with 6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus <400> 39 ggggtggggt ggggtggg 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of FRET substrate(Her2(18)) which was labeled with 6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus <400> 40 aattccagtg gccatcaa 18 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of FRET substrate(N18) which was labeled with 6-FAM at 5'-terminus and BHQ-1 at 3'-terminus <400> 41 actgactgac tgactgac 18

Claims

세포내 침투능을 가지면서, 단일가닥 또는 이중가닥의 표적 핵산에 특이적으로 결합하고 이를 가수분해하는 능력을 지닌 핵산 가수분해 항체로서, 서열번호 21로 기재된 아미노산 서열을 갖는 핵산 가수분해 항체.
제 1항에 있어서, 상기 표적 핵산은 서열번호 13의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 가수분해 항체.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 32의 염기서열을 갖는 DNA 유전자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는, 핵산 가수분해 항체.
제 1항에 있어서, 상기 항체는 전체 IgG, 중쇄 가변영역의 단일 도메인, 경쇄 가변영역의 단일 도메인, 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)₂, Fab, Fab', F(ab')₂, diabody 및 dsFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 핵산 가수분해 항체.
1) 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체를 주형으로 하여 라이브러리를 제작하는 단계,

2) 상기 1)단계에서 제작한 라이브러리 유전자를 표면 발현 벡터를 이용하여 세포 표면에 라이브러리를 제작하는 단계, 및

3) 특정염기서열을 갖는 표적 핵산을 기질로 사용하여 이에 특이적으로 결합하는 돌연변이체를, 상기 2)단계에서 제작한 라이브러리로부터 선별하는 단계를 포함하는, 핵산 가수분해 항체의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 1)단계에서 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체는 전체 IgG, 중쇄 가변영역의 단일 도메인, 경쇄 가변영역의 단일 도메인, 단일쇄 가변영역 단편 (scFv), (scFv)₂, Fab, Fab', F(ab')₂, diabody 및 dsFv로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 핵산 가수분해 항체의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 1)단계에서 세포 침투능을 가지면서 기질 특이성이 없는 핵산 가수분해 항체는 3D8 VL 4M 또는 이의 변이체인 것을 특징으로 하는, 핵산 가수분해 항체의 제조방법.
제 10항에 있어서, 상기 3D8 VL 4M은 3D8 VL의 DNA/RNA 인식부위인 c-(잔기 41-45), c'-(잔기 50-54), f-(잔기 90-94) 베타-가닥의 영역을 NNB 코돈 (N=A/T/C/G, B=C/G/T)을 이용하여 돌연변이시킨 것을 특징으로 하는, 핵산 가수분해 항체의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 2)단계에서 표면 발현 벡터는 파지 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 리보좀 디스플레이, RNA 디스플레이 및 효모 세포 표면 발현벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는, 핵산 가수분해 항체의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 3)단계에서 표적 핵산은 세포내 핵산 또는 외부 핵산인 것을 특징으로 하는, 핵산 가수분해 항체의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 세포내 핵산은 암세포에 특이적으로 과발현되는 단백질을 코딩하는 핵산인 것을 특징으로 하는, 핵산 가수분해 항체의 제조방법.
제 13항에 있어서, 상기 외부 핵산은 바이러스 지놈 핵산 또는 바이러스 단백질을 코딩하는 핵산인 것을 특징으로 하는, 핵산 가수분해 항체의 제조방법.
제 1항의 핵산 가수분해 항체를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
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