KR101130784B1 - 유전자 합성방법, 건조 유전자 합성용 조성물 및 이의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 합성방법, 건조 유전자 합성용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인산화(kination)와 LCR(ligase chain reaction)을 동시에 실시하는 유전자 합성방법, 유전자 합성을 위한 올리고뉴클레오티드, 효소류, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 건조 유전자 합성용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 합성방법 및 조성물은 종래기술의 단점을 최소화하고 간편성 및 안전성을 증가시킴으로써 다양한 합성생물학 분야에 널리 이용될 수 있다.

유전자 합성, 안정화 물질, 건조

Description

유전자 합성방법, 건조 유전자 합성용 조성물 및 이의 제조방법{Method of gene synthesis and dry composition for gene synthesis and method of producing the same}

본 발명은 유전자 합성방법, 건조 유전자 합성용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인산화(kination)와 LCR(ligase chain reaction)을 동시에 실시하는 유전자 합성방법, 유전자 합성을 위한 올리고뉴클레오티드, 효소류, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 혼합하고 건조시켜 제조되는 건조 유전자 합성용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

유전자 클로닝의 기술에 기반한 생명공학의 초기기술발전은 2000년 들어 유전체 해독기술의 획기적인 발전으로 방대한 신규 신약 타겟, 바이오자원 정보, 생체시스템 운영정보 등을 창출하게 되어 바이오시스템의 활용성이 극대화 되었다. 한편으로는 최근 1-2년 사이 올리고뉴클레오티드 합성기술과 단위유전자 합성기술의 획기적인 발전으로 초고속에 저가로 유전자를 재디자인/합성하여 실험에 활용할 수 있는 단계로 진입할 것이다. 즉, 자연계의 유전자를 분리하여 그대로 사용하던 1세대 바이오시대로부터 디자인해서 쓰는 2세대 바이오시대인 Life2.0(Newweek, 2007.06.) 시대로 진입한다고 비유할 수 있다. 이렇게 유전자 정보를 읽고(sequencing) 쓰는(redesgin & synthesis) 기술이 초고속/저가로 가능해지면서 바이오부품을 표준화하고 시스템 차원에서 엔지니어링 원리에 의하여 재구성하는 '합성생물학(synthetic biology)'이 바이오 전면에 부상하면서 바이오 기술의 새로운 발전을 가져오게 되었다(Bio-era report 2006). 이러한 기술은 말라리아 치료제인 알테미시닌(artemisinin), 바이오폴리머, 특수 바이오센서 개발 분야에서 예시적 활용성이 입증되어 가면서 그 신빙성을 더하게 되었다.

유전자 합성 기술은 제노믹스, 프로테오믹스, 기술의 발전으로 나타난 새로운 기술로 유용 유전자를 디자인하여 새로운 유전자로 만들어 내는 기술이다. 유전자 합성 기술은 2004년 MIT에서 선정한 미래 10대 신기술 중 바이오 분야의 기술로 현재의 유용 유전자 합성에서 차후에는 유용 생명체 합성으로 발전해 나갈 것으로 기대된다. 유전자 재조합 기술을 이용하여 목적 단백질을 발현, 조제하기 위해서 목적유전자를 분리하여 발현 벡터를 구축할 필요가 있다. 기존의 유전공학 방법으로는 유전자 라이브러리나 게놈 라이브러리에서 유전자를 스크리닝하였으나, 유전자에 따라서 분리가 힘들거나, 생물종, 조직에 따라 라이브러리의 제작이 힘든 경우가 있었다. 또한 이렇게 유전자를 분리하는 과정에서 유전자의 변이가 발생하는 경우가 종종 있었다. 유전자 합성은 연구자가 제공한 염기서열 정보만으로 재조합 단백질을 얻을 수 있도록 유전공학적 기법을 이용하여 유전자를 합성하는 기술이다.

현재의 유전자 합성 기술은 유용 유전자를 클로닝하여 생산하는 기술에 많이 치우쳐져 있지만 향후 10년 내에는 유용 자원을 생산해내는 새로운 생명체를 만들어 나가는 단계까지 진보할 것으로 예상된다. 예를 들어, 자원들을 생산해내는 바이오 에너지 생산형 생명체, 항암제를 만들어내는 박테리아 등이 개발될 것이며, 이와 같은 기술을 선점하여 사용하는 국가가 미래 바이오 강국으로 될 가능성이 매우 높다고 할 수 있다. 그러므로 가격절감과 정확한 올리고뉴클레오티드 합성을 가능하게 하는 대량 올리고뉴클레오티드 합성 기술, 시퀀싱 기술, 기존의 메뉴얼 방식의 유전자 합성을 단계별 최적조건화, 하이스루풋(hiigh-throughput) 합성을 위한 PCR(polymerase chain reaction)의 96웰 합성을 통해 생산력과 질을 높인다면 엄청난 효과를 얻을 수 있다.

다양한 유전자 합성방법이 사용되어 왔으나, 최근에는 첫째 오버랩된 뉴클레오티드 올리고뉴클레오티드(overlapping oligonucleotides)를 조립하고 둘째 전체 길이 절편을 증폭하는 2 단계 방법으로 많은 생성물을 얻고 있다.

유전자 합성 반응을 위해서는 적정한 농도의 카이네이즈와 라이게이즈, 최적화된 반응용 완충용액 및 동일 농도의 합성 올리고뉴클레오티드들을 최종 반응 부피까지 첨가 및 희석한 후 카이네이즈와 라이게이즈 활성에 최적화된 온도에서 일정시간 동안 반응시킨다. 이때, 반응용 완충용액은 특정 pH의 완충용액(Tris-HCl), KCl, MgCl₂, ATP 또는 NAD, DTT, BSA 등을 포함하며, 카이네이즈와 라이게이즈 농도 및 부피는 합성할 유전자의 크기 및 올리고뉴클레오티드의 수와 양에 따라 결정하여 첨가한다.

이와 같은 인공유전자 합성방법은 첫 단계로 합성 올리고의 5'말단의 인산화(phosphorylation)를 위한 인산화 과정을 거친 후 각 올리고를 상동성 있는 부위끼리 혼성화시키고 라이게이션 시키는 LCR(ligase chanin reaction) 과정을 실행한다. 그런데 인산화 과정시 인산화에 의해 5'말단이 인산화 되지 않은 올리고뉴클레오티드는 라이게이션을 방해하는 저해제로 작용한다. 본 발명은 이러한 문제를 해결하는 것으로서 종래의 인공유전자 합성의 돌연변이를 최소화하고 낮은 합성률을 개선할 수 있다. 한편, 카이네이즈와 라이게이즈를 비롯한 효소, 항원 및 항체 같이 생물학적 기능을 나타내는 거대분자인 단백질의 활성은 주로 3차원 구조에 의해 결정된다. 이런 3차원 구조가 임의의 인자에 의해 변형되면 단백질의 생물학적 활성 또는 기능성이 감소되거나 소멸될 수 있다. 수분은 단백질 주변에서 소수성/친수성 상호작용을 통해 단백질의 3차원 구조를 안정화시키고, 또한 단백질 표면에서 발견될 수 있는 반응성 화학적 작용기를 차단하는 역할을 한다. 단백질을 건조하는 과정 동안 발생하는 이런 수분의 보호적 상호작용이 제거되면, 단백질의 3차원 구조에 뒤틀림이 일어나 변화가 유발될 수 있고, 이 변화가 단백질의 표면에 있는 반응성 화학적 작용기(아민, 인산염, 카르복실기 등)로 하여금 단백질 내부의 작용기 사이에서 또는 다른 인접한 단백질의 반응성 작용기와 자유롭게 반응하여 초기 3차 구조의 상실 및 서로 유사하거나 상이한 다양한 단백질 간의 응집체 형성을 초래할 수 있다. 이는 단백질의 3차 구조 변화뿐만 아니라 생물학적 활성이나 기능성이 감소 또는 소멸되는 것을 의미한다. 이러한 인접한 반응성 화학적 작용기 간의 상호작용은 단백질들을 감싸고 있는 매체의 탄력성으로 인해 이들 분자들 이 적절하게 건조된 이후에도 발생할 수 있는데, 이로 인해 시간이 경과함에 따라 건조된 단백질의 생물학적 활성 또는 기능성이 감소하게 된다. 결과적으로, 건조하는 과정에서 단백질의 안정성을 잘 유지하기 위해서는 단백질에 대한 보호 작용을 하는 다른 물질로 수분을 대체하는 것이 매우 중요한데, 이러한 작용을 하는 것을 안정화제라 한다. 안정화제는 단백질의 3차원 구조를 유지하는 기능 및 표면 반응성 작용기를 안정화시키고 보호하는 기능면에서 수분(물분자)을 대체한다.

일반적으로 단백질을 장기 보관시에는 이를 안정화시키기 위해 여러 가지 방식의 건조과정이 이용되는데, 이러한 방법들 중 동결건조방식에 의해 단백질, 특히 제한효소나 DNA 중합효소, 카이네이즈, 라이게이즈 같은 효소를 보관하는 경우에는 효소 중 일부가 동결과 해동과정에서 그 활성을 잃게 되는 문제점이 있다. 또한, 동결건조되는 물질의 유형에 따라 다양한 온도와 속도로 완전히 동결시켜야만 한다. 여기에 필요한 동결건조 장치는 가격이 비싸고, 동결건조 과정은 상대적으로 속도가 매우 느린데, 이런 경제적 요인 및 작업의 번거로움은 이의 활용을 어렵게 한다.

단백질을 보관하기 위한 다른 방법으로는, 현재 상업적으로 가장 많이 이용되는 방식으로 -20℃ 이하의 온도에서 보관하기 위해 상당량의 글리세롤을 넣은 보존용 완충용액을 사용하는 방식이 있다. 카이네이즈와 라이게이즈 경우 통상 50% 글리세롤 상태의 보존용 완충용액이 이용되며, 첨가된 글리세롤은 용액의 빙점을 낮추어 효소의 동결을 방지해 주는 역할을 한다(미국특허 제5,250,429호 참조). 이런 방법은 보존 온도가 -20℃ 이상으로 상승하지 않으면 활성의 손실 없이 수 개 월동안 효소 활성을 보존할 수 있으나, 저온 상태를 유지하는 것이 매우 중요하고, 이런 저온 상태가 수 시간 동안 교란되면 효소 활성의 손실이 초래되는 문제점이 있다. 이런 이유로, 단백질, 특히 각종 효소 등을 이용한 제품들은 이동하는 과정에서의 일정한 저온 상태를 유지하는 것이 무엇보다 중요하다고 볼 수 있다. 또, 글리세롤을 이용한 -20℃에서의 보관 방법은 효소 반응에 필요한 모든 반응 성분(반응 완충용액 등)을 단일 용기 또는 튜브 내에 보관하여 수송하는 것이 바람직하지 않은데, 그 이유는 반응 성분 간의 바람직하지 않은 화학적 또는 생화학적 반응이 일어나 반응 성분들의 불활성화 또는 실험 결과의 해석을 방해하는 전혀 다른 결과를 초래할 수 있기 때문이다. 이런 이유들로 인하여, 실온에서 효소를 보존하고 수송하는 것이 가능하고, 효소 반응에 필요한 모든 요소(효소, 보조인자, 반응 완충 용액, 이외 첨가제 등)들을 단일 용기에 모두 포함시켜 운송할 수 있는 보존 시스템을 확립하는 것이 요구되고 있다.

본 발명은 편리하고 정확한 유전자 합성방법을 제공하고, 유전자 합성에 필요한 조성물의 보관, 수송 및 사용상의 문제점들을 해결하고 사용시 편의성을 도모하는 건조 유전자 합성용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인산화(kination)와 LCR(ligase chain reaction)을 동시에 실시하는 것을 특징으로 하는 유전자 합성방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 카이네이즈, 라이게이즈, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 건조 유전자 합성용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 건조 유전자 합성용 조성물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 건조 유전자 합성용 조성물을 포함하는 유전자 합성용 키트를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 유전자 합성을 위한 올리고뉴클레오티드들에 인산화(Kination)와 LCR(Ligase chain reaction)을 동시에 실시하는 단계를 포함하는 유전자 합성방법을 제공한다.

올리고뉴클레오티드들을 연결하는 라이게이션 반응은 접합효소인 라이게이즈에 의해 촉매되는데 기질인 올리고뉴클레오티드는 5'말단이 인산화가 되어 있어야 한다. 그러나 일반적으로 인산화 반응시 100%가 아닌 90-95% 정도의 합성 올리고뉴클레오티드만이 5'말단의 인산화 반응이 일어나는데 이것은 이미 인산화된 올리고뉴클레오티드의 5'말단이 생성물 저해(product inhibition)를 일으키기 때문이다. 이렇게 5 ~ 10% 정도의 인산화가 안된 올리고뉴클레오티드들은 특히 많은 수의 올리고뉴클레오티드를 사용해야만 하는 길이가 긴 유전자 합성을 할 때에는 큰 문제가 된다. 즉 인산화가 되지 않은 올리고뉴클레오티드들이 혼성화(anneal) 과정에서 반드시 끼어들어 갈 수밖에 없기 때문에 길이가 긴 유전자는 합성이 되지 않는다. 이 때 인산화 과정과 LCR 과정을 동시에 실시하면 인산화가 안된 올리고뉴클레오티드들은 라이게이션이 안되므로 온도가 상승하면 올리고뉴클레오티드들이 서로 분리되는 반면 인산화된 올리고뉴클레오티드들은 라이게이션되어 5'말단의 인산화 부위가 지속적으로 없어지고 온도를 올려도 서로 분리되지 않는다. 인산화 반응이 안 된 올리고뉴클레오티드들은 서로 분리된 후 인산화가 되어 전체적인 라이게이션 수율을 올릴 수 있다. 더 뛰어난 효과로는 틈(nick)이 생긴 부분에 인산화되고 이어서 라이게이션되는 과정이 곧바로 진행되어 유전자 합성의 완성도도 높아진다는 것이다. 또한 두 반응의 단일화로 실험자의 편리성과 실험시간의 단축이라는 효과도 얻을 수 있다.

인위적으로 합성된 올리고뉴클레오티드는 1%의 결실과 0.25%의 치환을 가지고 있는 것이 일반적인데, 이들을 유전자 합성에 사용시 생기는 돌연변이를 최소화하기 위해서 본 발명에서 사용하는 올리고뉴클레오티드는 카이네이즈 및 라이게이즈의 최적 활성온도 이하에서는 혼성화되지 않게 디자인되어야 한다. 그와 같이 올리고뉴클레오티드가 디자인된 경우 돌연변이된 합성 올리고뉴클레오티드가 유전자 합성시 끼어들 여지가 없게 된다.

또한 인산화와 LCR 의 동시반응에 의해 얻은 생성물 중에 혼성화와 라이게이션이 되지 않고 남은 올리고뉴클레오티드는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드를 특이적으로 분해하는 엔도뉴클레이즈로 제거하는 것이 바람직하다. 즉 단일가닥 뉴클레아제를 처리하여 미츠매치(mismatch)된 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 그 결과 목적 유전자 증폭시 다른 올리고뉴클레오티드의 저해를 받지 않아 일반적으로 나타나는 비특이적 유전자를 다량 제거할 수 있었고, 원하는 목적 유전자를 확보할 수 있다. 상기 단일가닥 뉴클레아제로는 예컨대 S1 nuclease 또는 Mung bean nuclease를 들 수 있다.

또한, 본 발명은 카이네이즈, 라이게이즈, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 용액 조성물을 건조하여 얻어진 건조 유전자 합성용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 사용할 수 있는 카이네이즈는 특별히 한정되는 것은 아니며, 시판되는 임의의 카이네이즈, 바람직하게는 T4 폴리뉴클레오티드 카이네이즈를 모두 사용할 수 있다. 라이게이즈는 내열성이 있는 라이게이즈로서 LCR 반응시 고열에 견딜 수 있는 것이면 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 카이네이즈와 라이게이즈의 함량은 특별히 한정되지 않으며, 유전자 합성 조건에 따라 당해 분야에서 사용되고 있는 적절한 함량으로 당업자가 조정하여 사용할 수 있다.

상기 반응용 완충용액은 카이네이즈, 라이게이즈에 따라 최적화된 완충용액이 알려져 있는데 인산화, LCR 반응인 두 반응을 한 반응용기 내에서 반응시키기 위해, 두 효소 모두 활성을 가질 수 있는 농도로 제조하는 것이 바람직하다.

또한, 카이네이즈와 라이게이즈의 안정화를 위해 사용되는 안정화 물질로는 탄수화물, 계면활성제, 수용성 합성중합체, 환원제 및 메틸아민으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있는데 상기 안정화 물질은 유전자 합성용 조성물의 건조시 물분자의 제거에 따라 효소의 3차원 구조가 파괴되는 것을 방지하는 역할을 한다.

상기에서, 탄수화물은 단당류, 이당류, 다당류 및 이들의 유도체의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 아라비노스(arabinose), 자일로스(xylose), 라이속스(lysoxe), 라이보스(ribose), 자일룰로스(xylulose), 리그로스(ligrose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 만노스(mannose), 소르보스(sorbose), 프럭토스(fructose), 아라비톨(arabitol), 자일리톨(xylitol), 갈락티톨(galactitol), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 메틸글루코피라노시드(methyl glucopyranoside), 트레할로스(trehalose), 자일로비오스(xylobiose), 말토스(maltose), 이소말토스(isomaltose), 라미나리비오스(laminaribiose), 셀로비오스(cellobiose), 젠티오비오스(gentiobiose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose), 피콜(Ficoll), 셀룰로오스(cellulose), 녹말(starch), 글리코겐(glycogen), 키틴(chitin), 펙틴(pectin), 카로닌황산, 콘드로이틴황산 A(chondroitin sulfate A), 히알루론산(hyaluronic acid), 갈락탄(galactan), 알긴 산(alginic acid), 이노시톨(inositol), 글리세롤(glycerol), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol) 및 트레이톨 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 수용성 합성중합체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl-pyrrolidone), 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)), 폴리포스페이트(polyphosphate), FICOLL(수크로스로부터 합성된 비-이온성 중합체) 등이 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

유전자 합성 반응용 혼합물은 건조 후 단기 또는 장기보관 후 사용되는데, 사용 시에는 최종반응 부피가 되도록 대상 합성유전자용 올리고뉴클레오티드 용액 및 멸균된 3차 증류수를 가하여 용해한 후 반응시킨다. 상기 탄수화물은 카이네이즈, 라이게이즈, 반응용 완충용액 및 안정화 물질을 포함하는 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 내지 50 중량부의 함량(w/v)으로 첨가한 후 건조시키는 것이 바람직하고, 0.5 내지 20 중량부의 함량으로 첨가한 후 건조시키는 것이 보다 바람직하다. 상기 탄수화물이 용액 조성물 총 100 부피에 대해 0.1 중량부 이하의 함량으로 첨가되는 경우에는 건조시 카이네이즈와 라이게이즈의 표면 물분자를 충분히 코팅하여 보호할 수 없기 때문에 효율적인 효소의 안정화 효과를 기대하기 어렵다. 또한, 건조시 음압에 의해 용액의 끓는 효과가 나타나는데, 특히 탄수화물의 함량이 너무 낮은 경우나 용액의 점도가 너무 낮은 경우에는, 튜브 바닥면 전체에 넓게 퍼지면서 건조되는 문제점과 효소가 충분히 보호되지 못하는 문제점이 발생할 수 있다. 상기 탄수화물이 용액 조성물 총 100 부피에 대해 50 중량부 이상의 함량으 로 첨가되는 경우에는 탄수화물 자체의 용해도로 인해 수용액으로 용해되기 어렵고, 높은 점도로 인해 충분한 혼합이 이루어지기 어려우며, 건조후 형성되는 건조물이 부피가 필요 이상으로 커지게 되고, 유전자 합성 반응을 위해 올리고뉴클레오티드 용액과 멸균된 증류수로 용해시 용해가 쉽게 되지 않는다. 또한, 유전자 합성 반응시 고농도의 탄수화물이 반응 저해제로 작용할 수 있다는 문제점도 있다. 본 명세서에 있어서, 함량비는 용질의 중량/총 용액의 부피, 즉 w/v으로 표기시의 수치이다.

본 발명의 건조 유전자 합성용 조성물은 유전자 합성 반응에 필요한 성분들을 미리 혼합하여 건조시켜 놓음으로써, 종래의 유전자 합성방법에 비해 다음과 같은 이점을 갖는다 :

1.유전자 합성 반응용 혼합물을 사용에 편리한 일정한 단위의 양으로 분리하여 분주하고, 미리 혼합하여 안정적으로 보존 및 보관함으로써 사용시의 편의성과 더불어 신속한 반응준비를 가능하게 한다.

2.반응용 완충용액을 미리 혼합해 놓음으로써, 반응용 완충용액 선택시의 오류를 원칙적으로 차단할 수 있다.

3.건조 상태로 보관되므로 냉동 보관된 경우와 비교하여 완충용액의 해동에 소모되는 시간도 필요치 않으며, 사용시 유전자 합성 반응을 저해할 수 있는 보존용 완충용액 성분이 함유되어 있지 않다.

4.액체 상태로 보관되는 카이네이즈, 라이게이즈 용액과 시료를 혼합하는 과정에서의 오염 및 온도에 따른 활성저하를 방지한다.

5.카이네이즈와 라이게이즈 활성의 안정성을 높여, 장기간의 용이한 보관이 가능하다.

6.유전자 합성용 혼합물의 대량 생산이 가능하므로, 각 혼합물간의 편차를 최소화하여 반응용 혼합물의 재현성을 높일 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 유전자 합성을 위한 올리고뉴클레오티드, 카이네이즈, 라이게이즈 및 반응용 완충용액을 혼합하는 단계;

2) 상기 혼합물에 안정화 물질을 첨가하는 단계; 및

3) 상기 결과물을 건조시키는 단계를 포함하는 건조 유전자 합성용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 유전자 합성용 조성물은 상기 카이네이즈, 라이게이즈를 포함하고 있는 반응용 완충용액을 예컨대 합성수지 용기에 소정량으로 분주한 후 각 용기에 1종 이상의 안정화 물질을 첨가하고, 이어서 각 용기를 건조시키는 단계를 거쳐 제조될 수 있으며, 다른 한편으로는 카이네이즈, 라이게이즈를 포함하고 있는 반응용 완충용액에 1종 이상의 안정화 물질을 첨가한 혼합 용액을 먼저 제조한 후 이를 합성수지 용기에 분주한 후 건조시키는 단계를 거쳐도 무방하다. 상기에서, 합성수지 용기는 플레이트, 튜브 또는 병과 같은 다양한 형태일 수 있으며, 특별한 형태에 한정되는 것은 아니다.

건조시의 조건은 특별히 한정되는 것은 아니지만, -70℃ 내지 50℃, 바람직하게는 15 내지 30℃의 온도에서, 감압건조기를 이용하여 -500 ㎜Hg 내지 -760 ㎜ Hg, 바람직하게는 -700 ㎜Hg 내지 -750 ㎜Hg의 감압 하에 40 내지 120분, 바람직하게는 70 내지 110분간 수행된다. 상기 건조조건은 안정화 물질의 종류에 관계없이 공통적으로 적용될 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 번거롭고 사용비용이 비싼 동결건조 방식이 아닌 감압건조기를 사용하여 실온에서 건조를 수행하는 방식이 바람직하다. 상기 감압건조기를 이용한 건조방법에서는 건조 시간, 즉 건조 단백질 조성물에 남아 있는 수분의 양이 단백질의 안정성을 높이는데 중요한 요인으로 작용하는데, 본 발명의 건조 유전자 합성용 조성물의 경우 남아 있는 수분의 양이 1 내지 10%, 바람직하게는 2% 내지 5%일 때 장기 보관시의 안정성과 건조된 반응 조성물을 재수화에 최적의 조건이 된다.

또한, 본 발명은 상기 건조 유전자 합성용 조성물을 포함하는 유전자 합성용 키트를 제공한다.

상기 키트는 건조 유전자 합성용 조성물 및 건조 유전자 합성용 조성물 제조 후 시판을 위하여 이를 담고 있는 용기를 의미하는 것으로, 폴리프로필렌 등의 합성수지 용기인 것이 바람직하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 키트는, 예를 들면 유전자 클로닝 키트 등의 구성품으로 사용이 가능하다. PCR 수행을 위한 PCR 키트, PCR 산물을 아가로즈 젤에서 확인 후 아가로즈 젤로부터 정제하는 아가로즈 젤 정제 키트, PCR 산물을 직접 정제할 수 있는 PCR 정제 키트, 구축한 유전자 산물과 벡터를 라이게이션하는 건조 라이게이즈 조성물 키트 등을 조합하여 PCR 클로닝 키트와 같이 종합적인 키트의 구성품으로 사용할 수 있다. 건조 유전자 합성용 조성물을 키트의 구성품으로 사용할 경우 제품의 수송 동안의 실온 보관이 용이하여 수송 비용의 절감을 기대할 수 있다.

상기 키트는 합성생물학과 관련된 다양한 분야, 예를 들면

첫째, 클로닝이나 기존 유전공학기법으로 유전자 확보가 어려운 경우

둘째, 변이 유전자나 키메라 유전자 제작(인공적으로 합성하기 때문에 특정부위 에 정확하게 변이된 유전자를 제작할 수 있음)

셋째, 특정 제한효소 부위의 도입/제거(클로닝이나 다른 실험을 진행할 때 필요한 제한효소 부위를 삽입하거나 제거할 수 있음)

넷째, 도메인 셔플링(Domain shuffling)이나 항체의약에 응용 등의 용도에 광범위하게 제한 없이 사용될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 유전자 합성방법, 건조 유전자 합성용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 합성방법은 유전자 합성의 돌연변이를 최소화하고 합성률을 증대시키며, 상기 합성조성물은 유전자 합성 반응을 위해 각 구성성분을 혼합해야 하는 다단계 조작을 간편하게 하고, 반응 혼합물의 안정성을 증가시키며, 실험의 재현성에 있어서의 신뢰도를 증가시킨다. 또한, 각 성분 간의 교차오염의 가능성을 제거시킴으로써 PCR 클로닝으로 확보가 어려운 경우, 데이터베이스로부터의 클로닝, 발현율 향상을 위해 발현계에 적합한 코돈으로 변환, 특정 제한효소 사이트 도입ㆍ소실, 변이 유전자나 키메릭 유전자의 제작, 프로모터 서열 등의 최적화, 도메인의 셔플링(shuffling)이나 항체의약 등 다양한 합 성생물학 분야에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 유전자 합성

HIV-1 일부 유전자(763bp)를 합성하기 위해 유전자 합성용 올리고뉴클레오티드 디자인 소프트웨어인 jinap(한국, 바이오니아, http://10.10.99.5/jinap/index.pl)을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 이 때, 올리고뉴클레오티드 혼성화 평균 온도가 40-69℃, 올리고뉴클레오티드 길이가 40-50mer, 염 농도가 50-200mM이 되도록 하였다(도 1). 상기의 디자인 된 올리고뉴클레오티드는 각 올리고뉴클레오티드 당 100pmole의 농도로 주문하여 합성하였다(한국, 바이오니아).

상기 올리고뉴클레오티드를 멸균된 증류수로 녹여 반응용기에 5pmole 씩 섞은 다음 종래의 유전자 합성방법인 합성 올리고뉴클레오티드의 5'말단의 인산화 반응을 위한 인산화 과정 후 LCR 반응을 순서대로 하는 방법(대조군)과 인산화와 LCR 반응을 동시수행하는 방법을 행하였다. 종래의 유전자 합성방법의 인산화는 수식되지 않은 일반 합성 올리고뉴클레오티드에 카이네이즈와 반응용 완충용액을 37℃에서 3분 반응 후 반응종결을 위해 80℃에서 10분 처리하였다. LCR 반응은 인산화 된 합성 올리고뉴클레오티드에 라이게이즈와 반응용 완충용액을 40℃, 30초와 60℃, 4분으로 40 사이클 조건으로 반응하였다. 그런 다음 상기 합성된 유전자에 동일한 조성물[프라이머 (CCATAGTAATCATAGAATATAGGAAAATATTAAGACAAAG, CCATCTTCCTGGCAAACTCATTTC; 한국, 바이오니아), 중합효소(TLA DNA polymerase, Top DNA polymerase, 한국, 바이오니아), dNTP, MgCl₂ 등]을 첨가하고 동일한 PCR 조건으로 PCR(MyGenie, 한국, 바이오니아)을 실시한 결과, 대조군(C, control)의 타겟 유전자 밴드보다 동시실행한 타겟 유전자 밴드(레인 1~12)가 뚜렷함을 확인하였다(도 2). 타겟 유전자는 DNA size marker(M, 한국, 바이오니아)를 이용하여 예상되는 크기인 763bp로 확인되었다.

아가로즈 젤 상의 유전자 생성물을 칼로 잘라서 AccuPrep ^? Gel Extraction Kit(한국, 바이오니아)를 이용하여 TA cloning vector kit(미국, Promega)로 라이게이션 후 대장균 세포에 형질전환하여 100개 이상의 콜로니를 확보하였다. 두 가지 방법에 의해 얻은 콜로니를 100개씩 5ml 액체 배지에 배양하고 AccuPrep ^? Plasmid Extraction Kit(한국, 바이오니아)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 3730XL Capillary DNA sequencer(미국, Applied biosystem)를 이용하여 염기서열 분석 후 유전자의 결실과 치환 돌연변이 정도를 비교하였다. 그 결과, 종래 방법의 총 돌연변이 정도는 0.946%, 본 발명의 합성방법은 0.623%으로, 본 발명의 방법이 더 낮은 유전자의 결실과 치환을 나타내었다(도 3)

인산화와 LCR 동시반응한 생성물 100pmole을 단일가닥 뉴클레아제(single stranded nuclease)인 S1 nuclease(일본, Takara) 10유닛(unit)을 37℃, 3분 처리하여 미스매치(mismatch)된 올리고뉴클레오티드를 제거하고 최적의 반응종결 온도 알아보기 위해 PCR 기기에서 65℃, 70℃, 75℃, 80℃ 및 85℃(레인 1-5)로 열처리하였다. 그 결과, S1 nuclease를 처리하지 않은 대조군보다 S1 nuclease를 처리한 경우, 타겟 유전자 밴드가 뚜렷함과 동시에 타겟 유전자 밴드가 아닌 밴드는 없어짐을 확인하였다. 또한, 반응종결을 위한 최적 온도는 70℃였다(도 4).

<실시예 2> 유전자 합성용 조성물에 대한 각종 안정화제의 활성 측정

유전자 합성용 조성물을 안정화시키는 안정화제를 선별하기 위하여, 탄수화물, 다가 알코올, 수용성 합성중합체, 계면활성제 및 메틸아민에 속하는 10 종류의 안정화제를 이용하여 유전자 합성 반응용 조성물을 제조하였다(표 1). 이때, 안정화제가 첨가되지 않은 조성물을 음성 대조군으로 사용하였고 반응용 완충용액은 하기 표 2의 조성으로 제조하였다.

안정화제명	안정화제의 분류	원액 농도	사용 농도 /반응(2X)	사용 용량 /10 ㎕(2X)
트레할로스	이당류 및 그 유도체 ; 이당류	1 M	50 mM	0.5 ㎕
			100 mM	1 ㎕
			150 mM	1.5 ㎕
폴리비닐피롤리돈 40000	수용성 합성중합체	20%	5%	2.5 ㎕
			7.5%	3.75 ㎕
			10%	5 ㎕
폴리비닐피롤리돈 360000	수용성 합성중합체	12.5%	5%	4 ㎕
			7.5%	6 ㎕
			10%	8 ㎕
D-솔비톨	단당류의 유도체 ; 육가 당알코올	98%	5%	0.51 ㎕
			10%	1.02 ㎕
			15%	1.53 ㎕
메틸-α-D-글루코피라노시드	단당류의 유도체	2 M	50 mM	0.25 ㎕
			100 mM	0.5 ㎕
			150 mM	0.75 ㎕
피콜 400	탄수화물 중합체	25%	5%	2 ㎕
			10%	4 ㎕
			15%	6 ㎕
트윈 20	계면활성제	100%	5%	0.5 ㎕
			10%	1 ㎕
			15%	1.5 ㎕
트리톤 X-100	계면활성제	100%	5%	0.5 ㎕
			10%	1 ㎕
			15%	1.5 ㎕
미오-이노시톨	다가알코올 ; 육가 알코올	12.5%	5%	4 ㎕
			7.5%	6 ㎕
			10%	8 ㎕
베타인(betaine)	메틸 아민	3 M	100 mM	0.33 ㎕
			200 mM	0.67 ㎕
			300 mM	1 ㎕

반응용 완충용액 조성 성분명	원액 농도	사용 농도/반응(2X)
Tris-HCl(pH 7.6) 용액	1 M	200 mM
MgCl2 용액	1 M	100 mM
KCl 용액	2 M	250 mM
ATP 용액	100 mM	100 mM
NAD 용액	10 mM	10 mM

상기에서, 2X란 반응에 필요한 농도를 1X 라고 할 때, 건조시 1X 농도로 건조하는 것이 2X 일 때보다 전체 부피가 늘어나기 때문에 더욱 힘들게 되므로, 2배의 농도가 되게 건조한 후 최종 부피를 1X 때의 부피, 즉 50 ㎕로 맞추어 1X의 반응 농도가 되도록 하기 위한 것이다. 라이게이즈는 재조합 대장균으로부터 분리, 정제한 Tfi DNA 라이게이즈(바이오니아, 한국)를 사용하였는데 정제 이후, 상기 효소는 20 mM Tris-HCl(pH7.6), 2 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 % Tween-20, 0.5 % IGEPAL CA-630, 50 % 글리세롤을 함유하는 저장 완충용액에서 -20℃로 저장하여 보관하였으며, 이하 모든 실시예에서 사용한 Tfi DNA 라이게이즈는 동일한 시간에 분리, 정제한 것을 사용하였다. 본 실시예에서 건조한 각각의 건조 유전자 합성용 조성물에는 200 유닛의 라이게이즈가 첨가되어 있다. 또한 카이네이즈는 T4 폴리뉴클레오티드 카이네이즈로서 시브엔자임사(러시아, sibenzyme)에서 구입하였고 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 7 mM 2-머캅토에탄올, 50% 글리세롤을 함유하는 저장 완충용액에 -20℃로 저장하여 보관하였다. 본 실시예에서 건조한 각각의 건조 유전자 조성물에는 40 유닛의 카이네이즈가 첨가되어 있다.

LCR 반응을 통해 구축한 유전자를 대량 증폭 확보하기 사용한 AccuPrep ^? HF PCR premix에는 재조합 대장균으로부터 분리, 정제한 HF DNA 중합효소(바이오니아, 한국)가 함유되어있다. 상기 프리믹스는 HF DNA 중합효소, 반응 완충용액, dNTP 및 안정화제 등을 함유하는 프리믹스 형으로 -20℃로 저장하여 보관하였으며, 이하 모든 실시예에서 사용한 AccuPrep ^? HF PCR premix는 동일한 시간에 분리, 정제, 제품화한 것을 사용하였다.

상기 표 1 조성의 안정화제와 표 2 조성의 반응 완충용액을 이용하여 제조된 각각의 유전자 조성물에 증류수를 넣어 최종 부피가 12.6 ㎕가 되도록 한 후, 0.2 ㎖ 튜브에 분주하였다. 이를 감압건조기(한국, 바이오니아)를 사용하여 -740 ㎜Hg 내지 -755 ㎜Hg의 압력 하에 실온에서 90분간 건조시킴으로써 튜브 밑면에 건조 유전자 합성용 조성물을 얻었다.

상기 건조 라이게이즈 조성물을 50℃에서 5일간 보관한 후, 실시예 1에서 유전자 합성용으로 디자인된 각 올리고뉴클레오티드가 10 pmole씩 포함된 50 ㎕의 3차 증류수를 가하여 건조 유전자 합성용 조성물을 용해시켰다. 용해된 조성물을 MyGenie^? 96 Gradient Thermal Block(한국, 바이오니아)에서 40℃ 30초, 55℃ 4분, 40 사이클의 조건으로 유전자를 구축하고 AccuPrep ^? HF PCR premix로 MyGenie^? Thermal Block(한국, 바이오니아)에서 유전자를 증폭한 후 전기영동하였다.

그 결과, 10 종류의 안정화제 중에서 유전자가 증폭되는 것은 트레할로스, 디-솔비톨, 메틸글루코피라노시드, 베타인이었고, 그 중 메틸글루코피라노시드가 넓은 범위의 농도에서 가장 안정적이고 많은 생성물을 나타냈고 메틸글루코피라노시드가 최종 농도 100mM일 때, 가장 우수한 결과를 나타내었다(도 5).

<실시예 3> 건조 유전자 합성용 조성물 내 최적의 카이네이즈 및 라이게이즈 함량 결정

본 실시예에서는 실시예 2에서 확인한 결과를 기반으로 메틸글루코피라노시드 안정화제를 이용하여 표 3의 조성에 따라 실시예 2의 표 2에서 기술한 반응 완충용액과 함께 유전자 반응용 혼합물을 제조하였다.

조성물 번호	카이네이즈, 라이게이즈 농도/조성물	안정화제 조성
		100mM 메틸글루코피라노시드
1	80, 400 유닛	안정화제가 포함
2	40, 200 유닛	〃
3	20, 100 유닛	〃
4	10, 50 유닛	〃
5	5, 25 유닛	〃
6	1, 5 유닛	〃
7	80, 400 유닛	안정화제 불포함
8	40, 200 유닛	〃
9	20, 100 유닛	〃
10	10, 50 유닛	〃
11	5, 25 유닛	〃
12	1, 5 유닛	〃

건조 유전자 합성용 조성물에 필요한 최적의 카이네이즈, 라이게이즈의 양을 결정하기 위하여 각각의 건조 유전자 합성용 조성물에 카이네이즈의 양이 80 유닛, 40 유닛, 20 유닛, 10 유닛, 5 유닛, 1 유닛 그리고 라이게이즈의 양이 400 유닛, 200 유닛, 100 유닛, 50 유닛, 25 유닛, 1 유닛이 포함되도록 유전자 합성 반응용 조성물을 제조하였다. 제조된 각각의 건조 유전자 조성물은 증류수를 첨가하여 부피가 12.6 ㎕가 되도록 한 후, 0.2 ㎖ 튜브에 분주하였다. 이를 상기 실시예 2와 같은 방법으로 건조 조성물을 제작한 후 유전자 증폭하였다.

그 결과, 최종 농도 100mM의 메틸글루코피라노시드를 포함하는 건조 유전자 합성용 조성물에서 카이네이즈 40 유닛과 라이게이즈 200 유닛일 때, 유전자 합성이 가장 우수함을 확인할 수 있었다(도 6).

<실시예 4> 건조 유전자 합성용 조성물의 안정성 테스트

장기 보관시 안정화제의 첨가가 안정성에 영향을 미치는 것을 확인하기 위해, 안정화제로 메틸글루코피라노시드 100 mM, 실시예 2의 표 2에 기술되어 있는 반응 완충용액, 40 유닛의 카이네이즈 및 200 유닛의 라이게이즈를 포함하는 유전자 합성 반응용 조성물과 안정화제를 첨가하지 않고 반응 완충용액, 40 유닛의 카이네이즈, 200 유닛의 라이게이즈 만을 포함하는 음성대조군을 제조하였다. 이를 상기 실시예 2와 같은 방법으로 건조 조성물을 제작한 후, -20℃에서 1일에서 7일까지, 50℃에서 1일에서 7일까지 보관한 후에 다시 실시예 2와 같은 방법으로 증폭시켰다.

그 결과, -20℃에서 7일 보관한 경우에는 둘 다 안정성이 있었지만, 안정화제를 포함하지 않은 대조군은 50℃에서 1일부터 2일까지는 합성 정도가 약하게 나타나다가 3일부터는 유전자 합성 정도가 보이지 않았고, 안정화제를 포함한 조성물은 50℃에서 6일까지 보관한 경우에도 유전자 합성 정도가 나타나는 것을 확인하였다(도 7의 A 및 도 7의 B). 카이네이즈, 라이게이즈의 장기 보관 시 안정성과 활성에 있어서 안정화제의 첨가와 함께 건조된 형태가 큰 영향을 미친다는 것을 확인하였다.

<실시예 5> 건조 유전자 합성용 조성물의 최적의 합성 조건 테스트

안정화제로 메틸글루코피라노시드 100 mM, 실시예 2의 표 2에 기술되어 있는 반응 완충용액, 40 유닛의 카이네이즈 및 200 유닛의 라이게이즈를 포함하는 유전자 합성 반응용 조성물을 제조하여 이를 상기 실시예 2와 같은 방법으로 건조하였다. 여기에 인공유전자 합성용 올리고 디자인 소프트웨어(jinap, http://10.10.99.5/jinap/index.pl)에 의해 측정된 혼성화 온도를 기준으로 12구간에 1.6℃씩 차이가 나게 MyGenie^?96 Gradient Thermal Block(한국, 바이오니아)에 설정 후(표 4) 각 올리고 10 pmole씩 포함된 50 ㎕의 3차 증류수를 가한 후, 충분히 용해하여 Thermal Block을 실행하였다.

40℃			30초	40 cycle
Gradient Temp. (12구간, 약 1.7℃씩 차이)	레인 1	48℃	4분
	레인 2	49.8℃
	레인 3	51.6℃
	레인 4	53.4℃
	레인 5	55.2℃
	레인 6	57.0℃
	레인 7	58.8℃
	레인 8	60.6℃
	레인 9	62.4℃
	레인 10	64.2℃
	레인 11	66.0℃
	레인 12	68.0℃
보관(8℃)

Thermal Block을 실행하여 합성한 유전자를 실시예 2와 같은 방법으로 증폭한 결과, 유전자 합성 Thermal block의 온도 조건에서 64℃까지 합성됨을 확인할 수 있었다(도 8).

도 1은 유전자 합성용 올리고뉴클레오티드 디자인 소프트웨어를 이용해 원하는 유전자 서열을 디자인한 도면이다.

도 2는 인산화 과정 후 LCR 반응을 수행하는 종래의 유전자 합성방법과 인산화와 LCR 반응 동시수행하는 본 발명의 방법을 통해 얻은 생성물을 비교한 전기영동 사진이다.

도 3은 인산화 과정 후 LCR 반응을 수행하는 종래의 유전자 합성방법과 인산화와 LCR 반응 동시수행하는 본 발명의 방법을 통한 돌연변이 정도를 비교한 도표이다.

도 4는 종래의 유전자 합성방법에 고온의 조건에서 단일가닥 뉴클레아제를 처리하여 미스매치(mismatch)된 올리고뉴클레오티드를 제거한 후 생성물을 비교한 사진이다.

C: 단일가닥 뉴클레아제를 처리하지 않은 대조군

레인 1: 단일가닥 뉴클레아제 10유닛, 37℃, 3분 처리 후 반응 종결을 위해 65℃, 10분 처리

레인 2 내지 5: 레인 1과 동일하나 반응 종결을 위해 각각 70℃, 75℃, 80℃, 85℃에서 10분 처리

도 5는 건조 유전자 합성용 조성물에 대한 각종 안정화제의 활성을 나타낸 사진이다.

도 6은 건조 유전자 합성용 조성물의 다양한 카이네이즈와 라이게이즈 농도 에 따른 안정성 테스트 결과를 나타낸 사진이다(레인 1, 2, 3, 4, 5, 및 6; 안정화제 포함, 레인 7, 8, 9, 10, 11 및 12; 안정화제 불포함)

레인 1과 7: 80 유닛(카이네이즈)과 400 유닛(라이게이즈)

레인 2와 8: 40 유닛과 200 유닛

레인 3과 9: 20 유닛과 100 유닛

레인 4와 10: 10 유닛과 50 유닛

레인 5와 11: 5 유닛과 25 유닛

레인 6과 12: 1 유닛과 5 유닛

도 7은 건조 유전자 합성용 조성물의 장기 보관시 안정성 테스트 결과를 나타낸 사진이다.

레인 1 내지 7; -20℃에서 각각 1 내지 7일 보관, 안정화제 포함

레인 8 내지 14; 레인 1 내지 7과 동일, 안정화제 불포함

레인 15 내지 21; 50℃에서 각각 1 내지 7일 보관, 안정화제를 포함

레인 22 내지 28; 레인 15 내지 21과 동일, 안정화제 불포함

도 8은 건조 유전자 합성용 조성물의 올리고뉴클레오티드 혼성화 최적 온도 조건 테스트 결과를 나타낸 전기영동 사진이다.

레인 1; 48.0℃, 레인 2; 49.8℃, 레인 3; 51.6℃

레인 4; 53.4℃, 레인 5; 55.2℃, 레인 6; 57.0℃

레인 7; 58.8℃, 레인 8; 60.6℃, 레인 9; 62.4℃

레인 10; 64.2℃, 레인 11; 66.0℃, 레인 12; 68.0℃

Claims (13)

1. 유전자 합성을 위한 올리고뉴클레오티드들에 카이네이즈와 라이게이즈를 가하여 인산화(kination)와 LCR(ligase chain reaction)을 동시에 실시하는 단계를 포함하는 유전자 합성방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 올리고뉴클레오티드는 카이네이즈와 라이게이즈의 최적 활성온도 이하에서는 혼성화되지 않게 디자인된 것을 특징으로 하는 합성방법.
3. 제1항에 있어서,

   단일가닥 뉴클레아제를 처리하여 미스매치(mismatch)된 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계를 더 포함하는 유전자 합성방법.
4. 제3항에 있어서,

   상기 단일가닥 뉴클레아제는 S1 nuclease 또는 Mung bean nuclease인 것을 특징으로 하는 합성방법.
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