KR101120879B1

KR101120879B1 - 액체 성장 호르몬 제제

Info

Publication number: KR101120879B1
Application number: KR1020067018952A
Authority: KR
Inventors: 투도르 알빈테; 카린 루에트 클레이베르
Original assignee: 아레스 트레이딩 에스.아.
Priority date: 2004-04-07
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2012-02-27
Anticipated expiration: 2025-03-30
Also published as: ES2383994T3; BRPI0508798A; NO337249B1; EP1740213B9; DK1740213T3; AU2005237775A1; WO2005105148A8; RS52310B; AU2005237775B2; PT1740213E; EA200601874A1; CY1113834T1; CN1946427A; WO2005105148A3; US7662393B2; ATE547121T1; EP1740213A2; WO2005105148A2; HK1098708A1; EP1740213B1

Abstract

본 발명은 내인성 hGH의 방출을 촉진하거나 이의 활성을 증진하는 성장 호르몬, 또는 물질; 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜; 구연산염/인산염 완충제; 알칼리 금속 염(alkaline metal salt) 및 알칼리 토류 금속 염(alkaline earth metal salt) 또는 유사 알칼리 토류 금속 염(pseudo alkaline earth metal salt)을 함유하는 액체 제제; 및 이의 제조 공정에 관계한다.

액체 성장 호르몬 제제

Description

액체 성장 호르몬 제제{LIQUID GROWTH HORMONE FORMULATION}

본 발명은 액체 성장 호르몬(GH) 제제, 특히 향상된 화학적, 물리적 안정성을 보유하는 인간 성장 호르몬(hGH)의 액체 제제에 관계한다. 본 발명의 액체 성장 호르몬(GH) 제제는 실온에서 연장된 기간동안 보관될 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 이런 액체 GH 제제의 제조 공정 및 이의 제공 형태에 관계한다.

소마트로핀(somatropin)(INN) 또는 소마토트로핀(somatotropin)으로 알려져 있는 인간 성장 호르몬(hGH)은 뇌하수체 전엽(anterior pituitary)의 성장 호르몬 분비 세포(somatotropic cell)에 의해 생산되고 분비되는 단백질 호르몬이다. 인간 성장 호르몬은 단백질, 탄수화물, 지질의 대사에 대한 효과를 통하여, 유년기 신체 성장 및 성년기 대사에서 중요한 역할을 수행한다.

인간 성장 호르몬은 2개의 이황화 결합: 분자에서 대형 루프를 형성하는 Cys-53과 Cys-165 사이의 이황화 결합 및 C-말단 근처에 소형 루프를 형성하는 Cys-182와 Cys-189 사이의 다른 이황화 결합을 보유하는 191개 아미노산의 단일 폴리펩티드이다(Bewly et al, 1972). 아미노산 서열을 확증하는 DNA이 Martial et al.,(1979)에 의해 보고되었다. 정제된 hGH는 냉동 건조된 형태에서 백색 무정형 분말이다. 이는 6.5 내지 8.5 범위의 pH에서 수성 완충제에 쉽게 용해된다(농도 >10 ㎎/ℓ).

용액에서, hGH는 주로 단량체로서 존재하고, 일부가 이량체 및 더욱 높은 분자량 올리고머로서 존재한다. 특정 조건하에, hGH는 더욱 많은 양의 이량체, 삼량체, 더욱 높은 올리고머를 형성하도록 유도될 수 있다.

자연-발생 유도체, 변이체, 대사산물을 비롯한 여러 유도체가 공지되어 있는데, 주로 생합성 hGH의 분해 산물 및 hGH의 가공된 유도체는 유전학 방법으로 생산된다. hGH의 자연-발생 유도체의 한가지 실례는 태반에서 발견되는 성장 호르몬의 변이체인 GH-V이다. 유전자 좌위의 다른 구성원은 Chen et al(1989)에서 기술한다.

메티오닐 hGH는 재조합 DNA 기술을 통하여 생산된 최초 형태의 hGH이다. 상기 화합물은 실제로, N-말단에서 하나의 추가적인 메티오닌 잔기를 보유하는 hGH의 유도체이다(Goeddel et al, 1979).

20-K-hGH라고 하는 hGH의 자연-발생 변이체가 뇌하수체와 혈류에서 발생하는 것으로 보고되었다(Lewis et al, 1978; Lewis et al, 1980). Glu-32에서 Gln-46까지 15개 아미노산 잔기가 부재하는 상기 화합물은 메신저 리보핵산의 대안적 절단접합에 기인한다(DeNoto et al, 1981). 상기 화합물은 hGH의 생물학적 특성을 상당 부분 공유한다.

20-K-hGH는 뇌하수체에서 만들어지고 혈액으로 분비된다. 이는 성인에서 성장 호르몬 생산의 대략 5%를 차지하고, 어린이에서 성장 호르몬 생산의 대략 20%를 차지한다. 이는 22 kD 성장 호르몬과 동일한 성장 촉진 활성을 보유하고, 22 kD 형태와 동등한 또는 이보다 높은 지질분해 능력을 보유하는 것으로 보고되었다. 이는 22 kD 성장 호르몬과 동등한 친화성으로 성장 호르몬 수용체에 결합하고, 22 kD 호르몬에 비하여 1/10의 최유성(lactogenic)(프롤락틴-유사) 생활성을 보유한다. 22 kD와 달리, 20-k-hGH는 약한-인슐린 활성을 보유한다.

다수의 hGH 유도체는 상기 분자의 단백분해 변형으로부터 생성된다. hGH의 대사를 위한 일차 경로는 단백분해를 수반한다. 잔기 130-150 주변의 hGH 영역은 단백분해에 극히 취약한데, 상기 영역에 새김눈(nick) 또는 결실을 보유하는 hGH의 여러 유도체가 보고되었다(Thorlacius-Ussing, 1987). 상기 영역은 hGH의 대형 루프에 존재하는데, 여기서 펩티드 결합의 절단은 Cys-53과 Cys-165에서 이황화 결합을 통하여 연결된 2개의 사슬을 발생시킨다. 이들 두-사슬 형태의 대부분은 증가된 생물 활성을 보유하는 것으로 보고되었다(Singh et al, 1974). 인간 성장 호르몬의 여러 유도체가 효소의 이용을 통하여 인공적으로 생산되고 있다. 효소 트립신(trypsin)과 서브틸리신(subtilisin) 등이 분자 전체의 다양한 지점에서 hGH를 변형시키는데 이용되고 있다(Lewis et al, 1977; Graff et al, 1982). 두-사슬 동화작용 단백질(anabolic protein)이라고 하는 한가지 이와 같은 유도체(2-CAP)는 트립신을 이용한 hGH의 제어된 단백분해를 통하여 형성되었다(Becker et al, 1989). 2-CAP는 hGH의 성장-촉진 활성이 거의 유지되지만 탄수화물 대사에 대한 효과가 대부분 소멸된다는 점에서, 본래의 hGH의 생물학적 특성과 극히 구별되는 생물학적 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다.

단백질에서 아스파라긴과 글루타민 잔기는 적절한 조건하에 탈아미드화 반응(deamidation reaction)에 취약하다. 뇌하수체 hGH는 이런 유형의 반응이 진행되 어, Asn-152의 아스파라긴산으로의 전환 및 정도가 덜하긴 하지만 Gln-137의 글루타민산의 전환을 유도하는 것으로 밝혀졌다(Lewis et al, 1981). 탈아미드화된 hGH는 효소 서브틸리신에 의한 가수분해에 변화된 감수성(susceptibility)을 보유하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 탈아미드화가 hGH의 단백분해 절단을 유도하는데 있어 생리학으로 중요한 의미를 가질 수도 있음을 암시한다. 생합성 hGH는 특정한 보관 조건하에 분해되어 상이한 아스파라긴(Asn-149)에서 탈아미드화되는 것으로 알려져 있다. 이는 탈아미드화의 일차적인 부위이지만, Asn-152에서도 탈아미드화가 관찰된다(Becker et al, 1988). Gln-137에서 탈아미드화는 생합성 hGH에서 보고되지 않았다.

단백질에서 메티오닌 잔기는 산화, 특히 설폭시드(sulfoxide)에 취약하다. 뇌하수체-유래된 hGH와 생합성 hGH 모두 Met-14와 Met-125에서 유황산화(sulfoxidation)가 진행된다(Becker et al, 1988). Met-170에서 산화는 뇌하수체 hGH에서는 보고되었지만 생합성 hGH에서는 보고되지 않았다. 탈아미드 hGH와 Met-14 설폭시드 hGH 모두 완전한 생물 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(Becker et al, 1988).

절두된 형태의 hGH는 효소의 작용을 통하여, 또는 유전학 방법으로 생산된다. 트립신의 제어된 작용으로 산출된 2-CAP는 제거되는 hGH의 N-말단에서 첫 8개 잔기를 보유한다. hGH의 다른 절두된 이형은 적절한 숙주에서 발현에 앞서 유전자를 변형함으로써 생산된다. 첫 13개 잔기를 제거하면 상기 폴리펩티드 사슬이 절단되지 않은 경우의 생물학적 활성과 명백하게 구별되는 생물학적 활성을 보유하는 유도체가 산출된다(Gertler et al, 1986).

인간 성장 호르몬이 시체의 뇌하수체 선으로부터 처음 획득되었지만, 이들 제조물은 전기영동에서 균질하지 않고, 50% 순도의 제조물로 처리된 환자의 혈청에서 항체가 나타났는데, 이런 면역원성은 비활성 성분에 기인한다. 재조합 DNA 기술로 여러 상이한 시스템에서 hGH를 무제한적으로 생산할 수 있게 되었다. 배양 배지로부터 hGH의 정제는 적은 양의 오염 단백질의 존재에 의해 조장된다. 실제로, hGH는 역상 HPLC 칼럼에서 단일 정제 단계로 실험실 규모로 정제될 수 있는 것으로 밝혀졌다(Hsiung et al(1989)).

재조합 인간 성장 호르몬, rhGH는 Serono International S.A.에 의해 SEROSTIM로서 생산되고 있는데, 상기 제품은 AIDS 환자에서 체중 감소와 체력 소모를 치료하기 위한 FDA 가속 승인을 받았다. SAIZEN은 어린이에서 GH 결핍, 여자 어린이에서 터너 증후군, 어린이에서 만성 신부전에 처방되는 재조합 인간 성장 호르몬이다. Genentech, Inc.(South San Francisco, CA)에 의해 생산되는 PROTROPIN은 구조 측면에서 자연 서열 hGH과 약간 상이한데, N-말단에서 추가의 메티오닌 잔기를 보유한다. 일반적으로, 재조합 hGH는 냉동 건조된 형태로 hGH + 추가의 부형제, 예를 들면, 글리신과 만니톨을 함유하는 바이알로서 시판된다. 투약에 앞서 환자가 제품을 원하는 농도로 재구성할 수 있는 희석용 바이알이 제공된다. 재조합 hGH는 미리-충전된 주사기와 같은 다른 공지된 방식으로 시판될 수도 있다.

hGH가 치료제로서 상업적으로 이용되려면, 안정적인 제제가 제조되어야 한다. 이들 제제는 적절한 보관 시간동안 활성을 유지하고, 환자에 의한 투여가 가능 해야 한다.

인간 GH는 다양한 방식으로 조제되고 있다. 예로써, US 5,096,885에서는 hGH 이외에, 글리신, 만니톨, 완충제, 선택적으로 비이온 계면활성제를 함유하는 hGH의 안정적이고 제약학적으로 허용되는 제제를 기술하는데, hGH : 글리신의 몰 비율은 1:50이다.

WO 93/19776에서는 완충제 물질로서 구연산염 및 선택적으로 인슐린-유사 성장 인자 또는 상피 성장 인자와 같은 성장 인자; 글리신 또는 알라닌과 같은 아미노산; 만니톨 또는 다른 당 알코올; 글리세롤 및/또는 벤질 알코올과 같은 보존제를 함유하는 GH의 주사가능 제제를 기술한다.

WO 94/101398에서는 hGH, 완충제, 비이온 계면활성제 및 선택적으로 만니톨, 중성 염(neutral salt) 및/또는 보존제를 함유하는 GH 제제를 기술한다.

EP-0131864에서는 8500 달톤(dalton) 초과의 분자량을 보유하는 단백질의 수용액을 기술하는데, 이들 단백질은 안정화제로서 선형 폴리옥시알킬렌 사슬-보유 표면-활성제의 첨가에 의해 계면에서 흡수, 변성, 침전으로부터 보호된다.

EP-0211601에서는 성장 촉진 호르몬 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 단위를 포함하고 대략 1,100 내지 40,000의 평균 분자량을 보유하는 블록 공중합체의 수성 혼합물을 함유하는 성장 촉진 제제를 기술하는데, 상기 블록 공중합체는 성장 촉진 호르몬의 유동성(fluidity)과 투여이후 생물학적 활성을 유지시킨다.

WO 97/29767에서는 성장 호르몬, 구연산삼나트륨이수화물(trisodium citrate dihydrate), 염화나트륨, 수산화나트륨, 벤질 알코올, Pluronic F-68을 함유하는 액체 제제를 기술하는데, 상기 제제는 5.6의 pH를 보유한다.

US-5,567,677에서는 인간 성장 호르몬, 구연산나트륨, 인산나트륨, 글리신, 만니톨, 선택적으로 벤질 알코올을 함유하는 액체 제제를 기술한다.

hGH의 제약학적 제조물은 특히 용액에서 불안정하다. hGH의 탈아미드화된 형태 또는 유황산화된 형태와 같은 화학적으로 분해된 종류가 생성되고, 이량체가 또는 더욱 높은 분자량 집합된 종류가 물리적 불안정으로부터 생성될 수 있다(Becker et al(1988); Becker et al., 1987; Pearlman and Nguyen(1989)).

용액에서 hGH의 불안정성의 결과로써, hGH의 제약학적 제조물은 일반적으로 냉동 건조된 형태로 존재하고, 이로 인하여 사용 직전에 재구성되어야 한다. 일반적으로, 재구성은 제약학적으로 허용되는 희석제, 예를 들면, 주사용 무균수, 무균 생리 염수 또는 적절한 무균의 생리학적으로 허용되는 희석제의 첨가에 의해 수행된다.

적절하게는, hGH의 재구성된 용액은 화학적, 물리적 분해 반응을 최소화시키기 위하여 4℃에서 보관되지만, 최대 14일간의 보관 기간동안 일부 분해가 진행된다.

액체 형태, 특히 연장된 기간동안 침전이나 응집 또는 임의의 다른 미립자 물질의 형성 없이 hGH의 안정성을 유지하는 액체 형태로 제공되는 hGH의 제약학적 제조물이 특히 유익하다.

이런 이유로, 본 발명의 목적은 원치않는 미립자 물질의 형성을 유발하지 않고 연장된 보관 기간을 보유하는 성장 호르몬의 액체 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 요약

본 발명의 첫 번째 측면은

a) 내인성 hGH의 방출을 촉진하거나 이의 활성을 증진하는 성장 호르몬 또는 물질;

b) 알칼리 금속 염(alkaline metal salt);

c) 알칼리 토류 금속 염(alkaline earth metal salt) 또는 유사 알칼리 토류 금속 염(pseudo alkaline earth metal salt);

d) 구연산염/인산염 완충제를 함유하는 액체 제제(liquid formulation)에 관계한다.

본 발명의 두 번째 측면은 본 발명에 따른 액체 제제를 제조하는 공정에 관계한다.

세 번째 측면에서, 본 발명은 상기한 새로운 액체 제제를 제공하는 방식으로 재구성되는 냉동-건조된 제제에 관계한다.

네 번째 측면에서, 본 발명은 성장 호르몬의 일회 투여 또는 다회 투여를 위한 본 발명에 따른 제제의 용도에 관계한다.

본 발명의 다섯 번째 측면은 본 발명에 따른 액체 제제의 제공 형태에 관계한다.

본 발명에서, 액체 제제에서 성장 호르몬의 화학적, 물리적 안정성이 무기염(mineral salt)의 특정한 선택에 의해 증가될 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 이렇게 획득된 용액은 가급적 실온에서 연장된 기간, 예를 들면, 대략 1 내지 52주, 또는 1 내지 16주, 또는 1 내지 4주동안 보관될 수 있다.

또한, 연장된 기간동안 액체 제제에서 성장 호르몬의 향상된 안정성이 본 발명에 따른 조성물로 달성될 수 있음이 밝혀졌다.

이런 이유로, 본 발명은

b) 알칼리 금속 염(alkaline metal salt);

d) 구연산염/인산염 완충제를 함유하는 액체 제제에 관계한다.

한 구체예에서, 본 발명의 액체 제제는 다회 투여용으로 이용될 수 있는데, 여기서 상기 제제는 실온에서 1주 또는 그 이상동안 보관될 수 있다.

본 발명에 따라 조제될 수 있는 성장 호르몬은 제제의 의도된 용도에 따라, 임의의 종, 예를 들면, 소, 돼지, 개 또는 고양이로부터 유래될 수 있다. 내인성 hGH의 방출을 촉진하거나 이의 활성을 증진하는 물질은 예로써 성장 호르몬 방출 호르몬이다.

적절하게는, 아래의 물질이 본 발명에 따라 조제될 수 있다:

a) 인간 성장 호르몬;

b) hGH 수용체에 대한 작동 활성(agonistic activity)을 보유하는 (a)의 단편;

c) (a) 또는 (b)에 적어도 70% 서열 동일성을 보유하고 hGH 수용체에 대한 작동 활성을 보유하는 (a) 또는 (b)의 변이체;

d) 중간 정도로 엄밀한 조건하에 (a) 또는 (b)를 인코딩하는 고유 DNA 서열의 보체에 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코딩되고 hGH 수용체에 대한 작동 활성을 보유하는 (a) 또는 (b)의 변이체; 또는

e) hGH 수용체에 대한 작동 활성을 보유하는 (a),(b),(c) 또는 (d)의 염 또는 기능적 유도체.

본 발명에는 인간 성장 호르몬을 함유하는 제제가 선호된다.

본 명세서에서, “인간 성장 호르몬” 또는 “hGH”는 제한 없이, “배경 기술”에서 상세하게 기술된 20 kD와 22 kD 인간 성장 호르몬, GH-V, 성장 호르몬 유전자 좌위의 다른 구성원을 비롯한 상기한 자연-발생 유도체와 합성 유도체를 포괄한다.

hGH는 자연-발생 인간 성장 호르몬이거나, 또는 바람직하게는 재조합 hGH이다. 재조합 GH는 임의의 적절한 원핵이나 진핵 숙주에서 발현될 수 있다. hGH의 발현에 특히 적합한 숙주는 예로써 대장균(E. coli)이다. 효모, 곤충, 또는 포유동물 세포 역시 재조합 성장 호르몬의 발현에 적합하다. 적절하게는, hGH는 인간이나 동물 세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 발현된다.

본 명세서에서, “hGH” 또는 “성장 호르몬”은 성장 호르몬의 생물학적 활성을 보유하는, 다시 말하면 성장 호르몬 수용체에 대한 작용제로서 작용하는 기능적 유도체, 단편, 변이체, 유사체(analog), 또는 염 역시 포괄한다. 한편, 이들은 수용체의 신호전달 활성(signaling activity)을 개시하는 성장호르몬 수용체에 결합할 수 있다.

본 명세서에서, “기능적 유도체” 또는 “화학적 유도체”는 당분야에 공지된 수단으로 N- 또는 C- 말단기의 잔기에서 측쇄로 생성되는 기능기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 허용되고 본 명세서에 기술된 바와 같이 hGH의 생물학적 활성, 다시 말하면 hGH 수용체와 결합하고 수용체 신호전달을 개시하는 능력을 파괴하지 않고, 이를 함유하는 조성물에 독성을 공여하지 않는다면 본원 발명에 포함된다. 유도체들은 이러한 유도체들이 hGH의 생물학적 활성을 보유하고 제약학적으로 허용된다면, 탄수화물 또는 인산염 잔기와 같은 화학적 부분(moiety)을 보유할 수 있다.

가령, 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 1차 또는 2차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아미드, 아실 부분(가령, 알카노일 또는 탄소환 아로일 기)로 형성된 아미노산 잔기의 N-아실 유도체 또는 유리 아미노기, 또는 아실 부분으로 형성된 유리 히드록실기(가령, 세릴(seryl) 또는 트레오닐 잔기)의 O-아실 유도체가 포함될 수 있다. 이들 유도체들은 또한 예로써, 폴리에틸렌 글리콜 측쇄을 포함할 수 있는데, 이는 항원 부위를 가리고 체액에서 분자의 체류를 연장할 수 있다.

복합제(complexing agent)로 유도되거나 이와 결합된 성장 호르몬은 오랫동안 지속될 수 있다. 이런 이유로, 본 발명의 바람직한 구체예는 인간 성장 호르몬의 PEG화된 이형(PEGylated version)에 관계한다. 체내에서 오랫동안 지속되는 활성을 나타내도록 유전적으로 조작된 성장 호르몬 역시 본 발명의 범위 내에서 hGH 유도체의 실례이다.

N-말단에서 아세틸화된 hGH가 분리되고 동정되었다(Lewis et al., 1979). 아실화가 조절 역할을 수행하는지 또는 단순히 정제의 인공물(artifact)인지는 분명하지 않다. 하지만, 상기 분자는 다른 hGH 유도체에서와 유사한 형태로 GH 활성을 나타내는 것으로 기대된다. 이런 이유로, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 N-말단에서 아세틸화된 인간 성장 호르몬에 관계한다.

적절하게는, 본 발명에 따른 제제는 사슬간 이황화 결합(interchain disulfide bond)을 통해 연결된 이황화 이량체(disulfide dimer), 공유적 비가역적 비-이황화 이량체(covalent irreversible non-disulfide dimer), 비공유적 이량체(non-covalent dimer), 이들의 혼합물에서 선택되는 인간 성장 호르몬의 이량체를 함유한다.

본 명세서에서, “염”은 카르복실기의 염 및 hGH 분자 또는 이의 유사체의 아미노기의 산부가염(acid addition salt)에 관계한다. 카르복실기의 염은 당분야에 공지된 수단으로 생성될 수 있는데, 여기에는 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철, 아연 등과 같은 무기염 및 아민, 예를 들면 트리에탄올아민, 아르기닌이나 리신, 피페리딘, 프로케인 등과 같은 유기 염기로 형성된 염이 포함된다. 산부가염에는 예로써 무기산, 예를 들면 염산이나 황산과의 염 및 유기산, 예를 들면 아세트산이나 옥살산과의 염이 포함된다. 물론, 이들 염은 본 발명과 관련된 hGH의 생물학적 활성, 다시 말하면 hGH 수용체와 결합하여 수용체 신호전달을 개시할 수 있는 능력을 보유해야 한다.

더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 성장 호르몬의 단편에 관계한다.

본 발명에 따른 성장 호르몬의 “단편”은 상기 분자의 하위집단(subset), 다시 말하면 원하는 생물학적 활성을 보유하는 더욱 짧은 펩티드를 의미한다. 단편은 hGH 분자의 한쪽 말단으로부터 아미노산을 제거하고 생성물에서 hGH 수용체 작용제로서의 성질을 검사함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단으로부터 한 번에 하나의 아미노산을 제거하는 프로테아제(protease)가 알려져 있기 때문에, 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단편을 결정하는 과정은 통상의 실험으로 가능하다.

적절하게는, 본 발명에 따른 hGH 단편은 결실(deletion)이 hGH의 생물학적 활성, 다시 말하면 hGH 수용체에 결합하고 이를 통하여 신호전달을 개시하는 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 한, 내부 결실(internal deletion)을 보유할 수도 있다. 본 발명에서 선호되는 단편은 글루탐산(Glu) 32에서 글루탐산 46까지 15개의 아미노산이 결핍된다.

hGH 단편은 C- 또는 N- 말단에서 추가로 절두될 수 있다. 인간 성장 호르몬의 첫 8개 N-말단 잔기 또는 첫 13개 N-말단 잔기가 결손되는 절두된 hGH 역시 본 발명에서 선호된다.

짧은 C-말단 hGH 단편은 hGH의 생물학적 활성을 보유하는 것으로 보고되었다(참조: US 5,869,452). 이런 이유로, hGH의 C-말단 단편의 이용이 본 발명에서 선호된다. hGH의 적어도 아미노산 잔기 177 내지 191(LRIVQCRSVEGSCGF)을 포함하는 단편 hGH177-191은 본 발명에서 특히 선호된다. US 6,335,319호 또는 WO 99/12969호에 기술된 펩티드 변이체, 예를 들면, 환형 펩티드와 같은, 상기 펩티드의 유도체가 더욱 선호된다.

부가적으로, 이러한 hGH 수용체 작용 활성을 갖는 상기 폴리펩티드, 예를 들면, hGH, 이의 유사체 또는 변이체, 염, 기능적 유도체 또는 단편은 hGH 폴리펩티드 측면에 위치하는 추가의 아미노산 잔기를 또한 포함할 수 있다. 생성된 분자가 핵심 폴리펩티드의 hGH 수용체 작용 능력을 보유하는 한, 임의의 측면 잔기가 핵심 펩티드의 기초적이고 새로운 특성, 다시 말하면 이의 수용체 작용제 특성에 영향을 주는가를 통상의 실험으로 결정할 수 있다.

본 발명에서 선호되는 이러한 GH 변이체의 실례는 메티오닐 인간 성장 호르몬(Met-hGH)인데, 이는 인간 성장 호르몬의 N-말단에서 추가의 메티오닌 잔기를 보유한다.

본 발명에서 선호되는 GH 변이체는 메티오닐 hGH을 포함하는데, 이는 N-말단에 추가의 메티오닌 잔기를 보유하는 인간 성장 호르몬이다. 더욱 선호되는 변이체는 Glu 32에서 Glu 46까지 15개의 아미노산 잔기가 결핍되는 인간 성장 호르몬이다.

본 발명에 따른 인간 성장 호르몬의 “변이체”는 전체 단백질 또는 이의 단편에 실질적으로 유사한 분자를 의미한다. 변이체는 또한 “뮤테인(mutein)”으로도 불린다. 변이체는 예로써 선택적 절단접합(alternative splicing)에 의해 생성된 변이체와 같은, hGH의 동종형(isoform)일 수도 있다. 변이체 (폴리)펩티드는 당분야에서 널리 알려진 방법을 이용하여 변이체 펩티드의 직접적인 화학적 합성으로 편의하게 제조될 수도 있다. 물론, 변이체 인간 성장 호르몬은 hGH로서 적어도 유사한 hGH 수용체 결합 및 신호 개시 활성을 보유하고, 따라서 hGH와 유사한 활성을 가질 것으로 기대된다.

인간 성장 호르몬의 아미노산 서열 변이체는 DNA의 돌연변이에 의해 제조될 수 있는데, 이들 돌연변이는 합성된 인간 성장 호르몬 유도체를 인코딩한다. 이들 변이체는, 예로써 아미노산 서열 내에서 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 최종 구조체가 원하는 활성을 갖는다면, 결실, 삽입 및 치환을 임으로 조합하여 최종 구조에 도달할 수도 있다. 명백하게, 변이체 펩티드를 인코딩하는 DNA에서 돌연변이는 해독틀(reading frame)을 변경하지 않아야 한다.

유전적 수준에서, 이들 변이체는 펩티드 분자를 인코딩하는 DNA에서 뉴클레오티드의 특정부위 돌연변이유발(site directed mutagenesis)(Adelman et al., 1983에 예시됨), 변이체를 인코딩하는 DNA 생산, 이후 재조합 세포 배양에서 DNA 발현으로 제조할 수 있다. 이들 변이체는 전형적으로, 비-변이 펩티드와 적어도 동일한 정성적 생물학적 활성을 나타낸다.

본 발명에 따른 인간 성장 호르몬의 “유사체”는 전체 분자 또는 이의 활성 단편과 실질적으로 유사한 비-고유 분자를 의미한다. 본 발명에 유용한 인간 성장 호르몬의 유사체는 GH 활성을 나타낸다.

본 발명에 따른 인간 성장 호르몬에서 수행될 수 있는 치환(substitution)의 유형은 상이한 종들의 상동한 단백질 사이의 아미노산 변화의 빈도 분석을 기초로 한다. 이러한 분석에 기초하여, 보존성 치환(conservative substitution)은 아래의 5가지 집단중 하나에서 교환으로 정의된다:

I. 소형, 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly

II. 극성, 음전하 잔기 및 이들의 아미드:

Asp, Asn, Glu, Gln

III. 극성, 양전하 잔기:

His, Arg, Lys

IV. 대형, 지방족, 비극성 잔기:

Met, Leu, Ile, Val, Cys

V. 대형, 방향족 잔기

Phe, Try, Trp

전술한 집단 내에서, 아래의 치환이 “높은 보존성”으로 간주된다:

Asp/Glu

His/Arg/Lys

Phe/Tyr/Trp

Met/Leu/Ile/Val

반-보존성 치환은 집단 (I)-(IV) 중에서 두 집단 사이의 교환으로 정의되며, 이런 교환은 (I), (II) 및 (III)를 포함하는 초집단(supergroup)(A) 및 (IV) 및 (V)를 포함하는 초집단(B)로 제한된다. 치환은 유전학적으로 인코딩되거나 자연 발생되는 아미노산에 한정되지 않는다. 에피토프(epitope)를 펩티드 합성으로 제조하는 경우에, 원하는 아미노산을 직접적으로 이용할 수 있다. 대안으로, 유전적으로 인코딩된 아미노산은 선택된 측쇄 또는 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제(organic derivatizing agent)와 이를 반응시켜 변형할 수 있다.

시스테닐(cysteinyl) 잔기는 가장 공통적으로, 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은 알파-할로아세테이트(및 상응하는 아민)와 반응하여 카르복실메틸(carboxylmethyl) 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 제공한다. 또한, 시스테닐 잔기는 브로모트리플루오로아세톤, 알파-브로모-베타-(5-이미다졸)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드(N-alkylmaleimide), 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸-2-피리딜 디설파이드, ρ-클로로머리큐리벤조에이트(p-chloromercuribenzoate), 2-클로로머큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥소-1,3-디아졸과의 반응으로 유도된다.

히스티딜(histidyl) 잔기는 pH 5.5-7.0에서 디에틸프로카보네이트와의 반응으로 유도되는데, 그 이유는 상기 약물이 히스티딜 측쇄에 상대적으로 특이적이기 때문이다. 파라브로모펜아실 브로마이드(parabromophenacyl bromide) 역시 유용하다; 반응은 가급적, pH 6.0에서 0.1M 카코딜산나트륨(sodium cacodylate)에서 수행된다.

리시닐(lysinyl)과 아미노 말단 잔기는 숙신산 또는 다른 카르복실산 무수물과 반응한다. 이들 약물에 의한 유도체화 반응은 리시닐 잔기의 전하(charge)를 반전시키는 효과가 있다. 알파-아미노산-포함 잔기를 유도하는데 적합한 다른 약물은 메틸 피콜린이미데이트(methyl picolinimidate)와 같은 이미도에스테르(imidoester); 피리독살 포스페이트(pyridoxal posphate); 피리독살; 클로로보로하이드리드(chloroborohydride); 트리니트로벤젠술폰산; O-메틸리오스우레아(O-methyliosurea); 2,4-펜탄디온(2,4-pentanedion); 트랜스아미나제(transaminase)-촉매된 글리옥시레이트(glyoxylate)와의 반응을 포함한다.

아르기닐(arginyl) 잔기는 하나이상의 통상적인 시약, 특히 페닐글리옥살(phenylglyoxal); 2,3-부탄디온; 니히드린(ninhydrin)과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 기능기의 높은 pKa로 인하여, 반응을 알칼리 조건하에서 수행할 것을 요구한다. 더 나아가, 이들 시약은 아르기닌 엡실론(arginine epsilon)-아미노 기 뿐만 아니라 리신 기와 반응할 수 있다.

티로실(tyrosyl) 잔기 자체의 특이적인 변형은 특히, 방향족 디아조늄(diazonium) 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의해 스펙트럼 표지(spectral label)를 티로실 잔기로 도입하는 과정과 관련하여 집중적으로 연구되고 있다. 가장 일반적으로, N-아세틸이미다졸과 테트라니트로메탄은 각각 O-아세틸 티로실(O-acetyl tyrosyl) 종류 및 ε-니트로 유도체를 형성하는데 이용된다.

카르복시 측쇄(아스파틸(aspartyl) 또는 글루타밀(glutamy))는 1-시클로헥실-3-[2-모르폴리닐-(4-에틸)]카보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸)카보디이미드와 같은 카보디이미드(R'N-C-N-R')와의 반응에 의해 선택적으로 변형된다. 게다가, 아스파틸과 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐과 글루타미닐 잔기로 전환된다.

글루타미닐과 아스파리기닐 잔기는 상응하는 글루타밀과 아스파틸 잔기로 종종 탈아미드화된다. 대안으로, 이들 잔기는 약한 산성 조건하에서 탈아미드화된다. 이들 잔기의 모든 형태가 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명에 사용되는 hGH의 유사체를 획득하기 위하여 이용될 수 있는 단백질에서 아미노산 치환체의 생산 방법의 실례에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 예로써 미국 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,); 4,965,195(Namen et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)(리신 치환된 단백질의 경우)에서 제시한다. 또 다른 성장 호르몬 변이체는 예를 들면 US 6,143,523(Cunningham et al.)에서 기술한다.

본 발명에 따라 이용될 수 있는 인간 성장 호르몬 수용체에 결합하고 이의 신호전달을 개시하는 물질에는 기존 문헌, 예를 들면, 미국 특허 5,851,992; 5,849,704; 5,849,700; 5,849,535; 5,843,453; 5,834,598; 5,688,666; 5,654,010; 5,635,604; 5,633,352; 5,597,709; 제5,534,617에 이미 공지된 이들 성장 호르몬 유사체와 유사물(mimetic)이 모두 포함된다.

적절하게는, 상기 hGH 변이체 또는 유사체는 핵심 서열을 보유하는데, 이는 고유 서열 또는 이의 생물학적으로 활성 단편의 핵심 서열과 동일하고, 상기 단편은 고유 아미노산 서열에 적어도 70%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 보유하고 이의 생물학적 활성을 유지한다. 더욱 적절하게는, 이러한 서열은 고유 서열에 대하여 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 동일성을 갖는다.

“동일성”은 서열을 비교하여 확정된 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열간의 상관관계를 반영한다. 일반적으로, 동일성은 비교되는 서열 범위에서 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 각각 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 대응, 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 의미한다.

정확하게 일치하지 않는 서열에서, “동일성 %”를 측정할 수 있다. 일반적으로, 비교되는 두 서열은 정렬시켜 서열간의 최대 상관을 제공한다. 정렬의 정도를 향상시키기 위하여 한 서열이나 양 서열에 “틈새(gap)”를 삽입할 수도 있다. 동일성 %는 비교되는 각 서열의 전체 범위(소위, 전역 정렬)(동일하거나 매우 유사한 길이의 서열에 적합), 또는 더욱 짧고 한정된 범위(소위, 국부 정렬)(동등하지 않은 길이의 서열에 적합)에서 측정할 수 있다.

2개 이상의 서열의 동일성과 상동성을 비교하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 가령, Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1(Devereux J et al., 1984)에서 가용한 프로그램, 예를 들면, BESTFIT와 GAP 프로그램을 이용하여 두 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 % 및 두 폴리펩티드 서열 사이의 동일성 %와 상동성 %를 측정할 수 있다. BESTFIT에서는 Smith와 Waterman의“국부 상동성(local homology)” 알고리즘(1981)을 이용하여 두 서열간 가장 유사한 단일 영역을 찾는다. 서열간 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 다른 프로그램 역시 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들면, BLAST 계통의 프로그램(Altschul S F et al., 1990, Altschul S F et al., 1997, NCBI 홈페이지: www. ncbi.nlm.nih.gov에서 입수가능)과 FASTA(Pearson W R, 1990; Pearson 1988)이다.

본원 발명에 따른 변이체 또는 뮤테인에 대한 바람직한 변화는“보존성”치환이다. 성장 호르몬 폴리펩티드 또는 단백질의 보존성 아미노산 치환에는 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 충분히 유사한 물리화학적 성질을 갖는 일군의 동질성 아미노산간 치환이 포함된다(Grantham, 1974). 또한, 기능의 변화없는 아미노산의 삽입 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 수행될 수 있는데, 특히 30개 이하, 바람하게는 10개 이하의 아미노산이 삽입 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산(가령, 시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에, 기능의 변화없는 아미노산의 삽입 또는 결실이 가능하다. 이런 결실/삽입에 의해 만들어지는 단백질 및 뮤테인은 본원 발명의 목적에 포함된다.

본 발명에 따른 유사체 또는 변이체는 아래의 절차에 따라 또한 결정될 수 있다. 고유 DNA 서열은 선행 기술에 알려져 있고 기존 문헌에서 확인된다(Martial et al, 1979). 매우 엄밀한 또는 중간 정도로 엄밀한 조건하에서 고유 DNA 또는 RNA의 보체에 혼성화되는, DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드 역시 고유 서열의 생물학적 활성을 유지하는 한, 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주된다.

엄밀도 조건(stringency condition)은 혼성화 실험(hybridization experiment)에 이용된 온도, 일가 양이온의 몰농도(molarity), 혼성화 용액에서 포름아미드 비율의 함수이다. 임의의 정해진 조건과 관련된 엄밀도를 결정하기 위하여, 먼저 Meinkoth et al., (1984)의 방정식을 이용하여 DNA-DNA 하이브리드(hybrid)의 용융 온도(melting temperature: Tm)로서 표시되는, 100% 동일성의 하이브리드의 안정성을 결정한다:

Tm = 81.5℃ + 16.6(LogM) + 0.41(%GC) - 0.61(%form)-500/L

여기서, M은 일가 양이온의 몰농도, %GC는 DNA에서 G와 C 뉴클레오티드의 비율, %form은 혼성화 용액에서 포름아미드의 비율, L은 염기쌍으로 하이브리드의 길이다.

상기 Tm이 100% 동일성 하이브리드에 대해 계산된 Tm으로부터 감소되는 각 1℃에 대하여, 허용되는 불일치(mismatch) 양은 약 1%씩 증가한다. 이런 이유로, 특정 염 및 포름아미드 농도에서 임의의 주어진 혼성화 실험에 이용된 Tm이 Meinkoth 방정식에 따라 100% 하이브리드에 대해 계산된 Tm보다 10℃ 낮으면, 혼성화는 최대 10%의 불일치가 존재하더라도 진행된다.

본 명세서에서, 매우 엄밀한 조건은 최대 15% 서열 일탈까지 관용되는 조건인 반면, 중간 정도로 엄밀한 조건은 최대 20% 서열 일탈까지 관용되는 조건이다. 제한없이, 매우 엄밀한 조건(하이브리드의 계산된 Tm보다 12~15℃ 낮은 온도) 및 중간 정도 엄밀한 조건(하이브리드의 계산된 Tm보다 15~20℃ 낮은 온도)은 2X SSC(표준 시트르산 식염: standard saline citrate)의 세척 용액 및 하이브리드의 계산된 Tm보다 낮은 적절한 온도에서 0.5% SDS을 이용한다. 특히, 이용된 혼성화 조건이 덜 안정한 하이브리드가 안정한 하이브리드와 함께 형성되는 조건인 경우, 이들 조건의 최종적인 엄밀도는 일차적으로 세척 조건에 기인한다. 더욱 높은 엄밀도에서 세척 조건은 덜 안정한 하이브리드를 제거한다. 앞서 기술된 매우 엄밀한 내지 중간 정도로 엄밀한 세척 조건에 이용될 수 있는 통상의 혼성화 조건은 Tm보다 대략 20 내지 25℃ 낮은 온도에서, 6 X SSC(또는 6 X SSPE), 5X Denhardt 시약, 0.5% SDS, 100 ㎍/㎖ 변성되고 단편화된 연어 정자 DNA의 용액에서 혼성화이다. 혼성 프로브(probe)가 이용되는 경우, SSC 대신에 테트라메틸 암모늄 클로라이드(TMAC)를 이용하는 것이 바람직하다(Ausubel, 1987-1998).

본 발명이 인간 성장 호르몬 유도체를 제조하기 위한 재조합 방법을 제공하긴 하지만, 이들 유도체는 당업자에게 널리 공지된 통상의 단백질 합성 방법으로 제조될 수도 있다.

본 발명의 제제는 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜을 함유한다. 상기 중합체는 비이온성 계면활성제이다. 계면활성제는 “장력작용제(tensioactive agent)”로도 불린다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 제제는 0.5 내지 5 ㎎/㎖, 또는 1 내지 2 ㎎/㎖, 또는 1.5 ㎎/㎖의 농도로 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜을 함유한다.

바람직한 제제에서, 계면활성제는 플루로닉 폴리올(pluronic polyol), 예를 들면, Pluronic F68이다. Pluronic F68은 본 발명에서 특히 선호된다.

계면활성제 PluronicF68(BASF, Poloxamer 188)로 GH를 조제함으로써, 임의의 미립자 물질의 침전, 응집 또는 발생의 문제를 피하는 안정적인 제제가 획득되었다.

Pluronic F68은 산화에틸렌(EO)과 산화프로필렌(PO)의 블록 공중합체이다. 산화프로필렌(PO) 블록은 2개의 산화에틸렌(EO) 블록 사이에 끼워진다.

Pluronic 계면활성제는 2-단계로 합성된다:

1. 산화프로필렌의 프로필렌 글리콜의 2개의 하이드록실 기로의 제어된 첨가로 원하는 분자량의 소수물질(hydrophobe)을 만든다.

2. 산화에틸렌을 첨가하여 친수성 기 사이에 소수물질을 끼워 넣는다.

Pluronic F68에서, 폴리옥시에틸렌(친수성 기)의 비율은 80%이고, 소수물질(폴리옥시프로필렌)의 분자량은 대략 1967 Da이다.

Pluronic F68의 전형적인 특성은 아래와 같다:

평균 분자량: 8400;

융점(melting point)/유동점(pour point): 52℃;

물리적 형태 @ 20℃: 고체;

점도(Brookfield) cps: 1000 [25℃에서 액체, 60℃에서 페이스트, 77℃에서 고체];

25℃에서 표면 장력, dynes/cm;

0.1% Conc.: 50.3

0.01% Conc.: 51.2

0.001% Conc.: 53.6

25℃ vs Nujol에서 계면장력(interfacial tension), dynes/cm;

0.1% Conc.: 19.8

0.01% Conc.: 24.0

0.01% Conc.: 26.0

드라베스 웨팅(Draves Wetting), Seconds 25℃

1.0% Conc.: > 360

0.1% Conc.: > 360

거품 높이(foam height)

Ross Miles, 50℃에서 0.1%, mm: 35

Ross Miles, 26℃에서 0.1%, mm: 40

Dynamic, 400 ㎖/min에서 0.1%, mm: > 600

수용액에서 담점(cloud point), ℃

1% Conc.: >100

10% Conc.: >100

HLB(친수성-친유성 비, hydrophile-lipophile balance): 29

Pluronic F68과 유사한 특성을 보유하는 다른 중합체가 본 발명의 제제에 이용될 수도 있다.

폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜은 0.5 to 5 ㎎/㎖, 또는 1 내지 2 ㎎/㎖, 또는 1.5 ㎎/㎖의 농도로 이용될 수 있다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 이외에 하나이상의 계면활성제가 추가로 이용될 수 있다.

본 발명의 제제는 안정화제(stabilizing agent)를 추가로 함유할 수 있다. 안정화제는 등장제(isotonicity agent)로서 기능할 수도 있다.

“등장제”는 생리학적으로 관용되고, 제제에 적절한 등장성(tonicity)을 제공함으로써 제조와 접촉하는 세포 막을 통한 물의 알짜 흐름(net flow)을 예방하는 화합물이다. 일반적으로, 글리신과 같은 화합물이 공지된 농도에서 이런 목적으로 이용된다. 다른 적절한 안정화제에는 아미노산이나 단백질(가령, 글리신 또는 알부민), 염(가령, 염화나트륨), 당(가령, 덱스트로스, 수크로오스, 락토오스)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명에 선호적으로 이용될 수 있는 안정화제 또는 등장제는 수크로오스, 트레할로스, 소르보스(sorbose), 멜레지토스(melezitose), 라피노오스(raffinose)를 비롯한 비-환원당이다. 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨(erythritol), 트레이톨(threitol), 솔비톨, 글리세롤.

바람직한 구체예에서, 안정제 또는 등장제는 수크로오스이다.

다른 바람직한 구체예에서, 제제는 10 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖, 또는 20 ㎎/㎖ 내지 80 ㎎/㎖, 또는 대략 60 ㎎/㎖의 농도로 수크로오스를 함유한다.

본 발명에 따른 제제는 NaCl, KCl, Na₂SO₄, Na₂CO₃을 비롯한 알칼리 금속 염을 함유한다. 바람직한 구체예에서, 알칼리 금속 염은 NaCl 또는 Na₂SO₄이다.

본 발명에 따른 제제는 CaCl₂, MgCl₂, MgSO₄, NH₄CO₃을 비롯한 알칼리 토류 금속 염을 추가로 함유한다. 바람직한 구체예에서, 토류 알칼리 염은 MgCl₂이다.

본 발명의 제제는 구연산염/인산염 완충제를 추가로 함유한다. 본 발명에 이용될 수 있는 구연산염/인산염 완충제는 예로써, 구연산나트륨/인산나트륨 완충제이다.

“완충제” 또는 “생리학적으로 허용되는 완충제”는 제제에서 제약학적 또는 수의학적 용도에 안전하고, 제제의 pH를 제제에서 요구되는 pH 범위로 유지하거나 제어하는 효과를 갖는 것으로 알려져 있는 화합물의 용액을 의미한다.

적절하게는, 본 발명의 제제는 1 내지 100 mM, 또는 5 내지 50 mM, 또는 10 내지 20 mM 범위의 농도로 구연산염/인산염을 함유한다.

적절하게는, 본 발명에서 제제의 pH는 5 내지 7, 또는 5.5 내지 6.5, 또는 대략 6이다. 더욱 적절하게는, pH는 5.5 내지 5.9이다.

본 발명의 제제는 액체이고, 따라서 수성 희석제를 함유한다.

“수성 희석제”는 물을 함유하는 액체 용매를 의미한다. 수성 용매 시스템은 물로만 구성되거나, 또는 물과 하나이상의 혼화성 용매로 구성되고, 당과 같은 용해된 용질, 완충제, 염 또는 다른 부형제를 함유할 수 있다.

제제는 또한, 하나이상의 비-수성 용매를 함유할 수도 있다. 통상적으로 이용되는 비-수성 용매는 단쇄 유기 알코올, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올; 단쇄 케톤, 예를 들면, 아세톤; 폴리 알코올, 예를 들면, 글리세롤이다.

적절하게는, 본 발명의 제제는 보존제를 추가로 함유한다. 보존제의 첨가는 성장 호르몬이 다회 투여용인 경우에 특히 선호된다.

“보존제”는 제제에서 박테리아 작용을 실질적으로 감소시키고, 따라서 예로써 다회 투여용 제제의 생산을 용이하게 하기 위하여 제제에 포함되는 화합물이다. 잠재적 보존제의 실례는 옥타데실디메틸-벤질 암모늄 클로라이드(octadecyldimethyl-benzyl ammonium chloride), 헥사메소늄 클로라이드(hexamethonium chloride), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride)(알킬 기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물), 벤제소늄 클로라이드(benzethonium chloride) 등이다. 다른 유형의 보존제는 방향족 알코올, 예를 들면, 페놀, 부틸, 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들면, 메틸이나 프로필 파라벤; 카테콜(catechol), 레조르시놀(resorcinol), 시클로헥산올(cyclohexanol), 3-펜탄올(3-pentanol), m-크레졸(m-cresol) 등이다.

보존제는 본 발명에서 제균제(bacteriostatic)로서 기능할 수도 있다. “제균제”는 항생제로서 제제에 첨가되는 화합물이나 조성물을 의미한다. 적절하게는, 본 발명의 보존된 GH 함유 제제는 상업적으로 실용되는 다회-투여 산물에서 보존제 효능에 대한 규정을 충족한다. 제균제의 실례는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸(chlorocresol), 벤질 알코올, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤잘코늄 클로라이드, 벤제소늄 클로라이드, 나트륨 디하이드로아세테이트(sodium dehydroacetate), 티메로살(thimerosal) 등이다.

적절하게는, 보존제는 1 내지 10 ㎎/㎖, 또는 2 내지 5 ㎎/㎖, 또는 3 ㎎/㎖의 농도로 존재한다.

본 발명에서 선호되는 보존제는 페놀이다.

두 번째 측면에서, 본 발명은 액체 제제를 생산하는 공정에 관계하는데, 상기 공정은 본 발명에 따른 제제의 구성요소의 수용액을 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한, 액체 제제를 생산하는 공정에 관계하는데, 상기 공정은 무균 용기에 미리 결정된 양의 제제를 집어넣는 단계를 포함한다.

치료 투여를 위한 hGH의 액체 제제는 생리학적으로 허용되는 부형제, 완충제 또는 보존제와 함께 hGH 및 원하는 수준의 순도를 보유하는 안정화제를 혼합함으로써 제조될 수도 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Osoll A. Ed(1980)). 허용가능 부형제는 이용되는 농도와 용량에서 환자에 비독성인 물질인데, 여기에는 완충제, 보존제, 항산화제, pH와 등장 조절제 등이 포함된다.

성장 호르몬의 액체 제제는 필요한 경우에 하나이상의 다른 안정화제를 함유할 수도 있다. 추가의 안정화 부형제는 예로써, 글리신이나 알라닌과 같은 아미노산, 만니톨이나 다른 당 알코올, 또는 글리세롤이다. 이에 더하여, 액체 제제는 인슐린-유사 성장 인자 또는 IGF-결합 단백질과 같은 다른 성장 인자를 함유할 수도 있다.

본 발명에서 제조된 제제에 의해 제공되는 hGH의 증가된 안정성은 상기 hGH 제제가 현재 통상적으로 이용되는 제제보다 더욱 농축되고 더욱 폭넓게 이용될 수 있도록 한다.

“안정성”은 본 발명에 따른 성장 호르몬 제제의 물리적, 화학적, 입체적 안정성(생물학적 효능의 유지 포함)을 의미한다. 단백질 제제의 불안정은 본 발명에 포함되는 GH 폴리펩티드의 적어도 한가지 생물학적 활성을 감소시키는 탈당화(deglycosylation), 당화(glycosylation)의 변형, 탈아미드화(deamidation), 산화, 또는 임의의 다른 구조적 변형에 의해, 더욱 고차 구조를 형성하는 단백질 분자의 화학적 분해 또는 응집에 의해 유발된다.

자동 주입기(auto-injector)는 당분야에 공지되어 있는데, 이의 실례는 Easyject이며 hGH의 투입에 특히 유용하다. 본 발명과 관련하여 당분야에 공지된 특정 장치를 이용하여 주사-없는 투여를 달성할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 제제를 함유하는 제약학적 조성물에 관계한다. 본 발명의 범위에 속하는 조성물은 의도된 목적을 달성하는 효과량으로 적어도 하나의 인간 성장 호르몬, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 변이체를 함유하는 본 발명에 따른 모든 조성물을 포괄한다. 개별 필요에 따라 달라지긴 하지만, 각 성분의 효과량의 최적 범위 결정은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 전형적인 용량은 대략 0.001 내지 0.1 ㎎/체중 ㎏/일을 포함한다. 환자에 투여될 때, hGH 치료제는 이런 질병에 처방되는 다른 치료제과 동시에 투여될 수도 있다.

본 발명의 액체 제제는 제제가 상기한 부형제를 함유하도록 하는 방식으로 성장 호르몬의 냉동 건조된 샘플의 적절한 희석제(가령, 주사용 물)에서 재구성이후 획득될 수 있다.

“투여”는 질병이나 이상을 치료하기 위하여 환자의 체내로 본 발명의 제제를 도입하는 것을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, hGH는 일일 대략 0.1 내지 10 ㎎, 또는 대략 0.5 내지 6 ㎎의 용량으로 투여된다. 한 구체예에서, 일일 용량은 가급적 피하 주사에 의한 대략 0.15-0.3 ㎎ hGH/day이다. 다른 구체예에서, 일일 대략 1 ㎎ 용량의 인간 성장 호르몬이 환자에게 투여된다.

다른 구체예에서, hGH는 변화되는 용량으로 투여되는데, 첫 번째 용량이 두 번째 용량보다 많다. 적절하게는, 첫 번째 용량은 대략 1 ㎎이고, 두 번째 용량은 대략 0.5 ㎎이다. 주간 용량은 환자의 요구에 따라, 대략 6 ㎎, 또는 대략 5 ㎎, 또는 대략 4.5 ㎎이 바람직하다.

“환자”는 질병이나 이상을 치료받는 포유동물을 의미한다. 환자에는 아래의 기원, 인간, 양, 돼지, 말, 소, 토끼 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명의 제제는 여러 다양한 투여 방법에 적합하다. 가령, 경구 경로, 또는 피하(subcutaneous), 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 복강내(intraperitoneal), 에어로졸, 경피(transdermal), 초내(intrathecal), 또는 직장과 같은 비경구 경로로 투여될 수 있다. 투여량은 복용자의 연령, 건강 및 체중, 이전이나 동시 치료의 유형, 치료 빈도, 원하는 효과의 성격에 좌우된다.

본 발명에서 선호되는 투여 경로는 피하와 근육내 경로이다.

본 발명에 따른 조성물이나 제제의 적당한 용량은 복용자의 연령, 건강 및 체중, 동시 치료의 종류, 치료 빈도, 원하는 효과의 성격에 따라 달라진다. 하지만, 가장 선호되는 용량은 개별 개체에 맞춤될 수 있고, 과도한 실험없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 이는 전형적으로, 표준 용량의 조정, 예를 들면, 환자의 체중이 적은 경우에 용량의 감소와 관련한다.

각 치료를 위해 요구되는 총량은 다회 용량(multi-dose) 또는 일회 용량(mono-dose)으로 투여될 수 있다.

“다회 투여”는 1회 이상, 예를 들면, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 또는 그 이상의 주사를 위한 GH 제제의 단일 바이알, 앰플 또는 카트리지의 이용을 의미한다. 이들 주사는 일정 시간, 예를 들면, 6, 12, 24, 48 또는 72 시간 간격으로 이격된다.

본 발명은 또한, 일회 투여를 위한 본 발명에 따른 제제의 용도에 관계한다. 대안적 측면에서, 본 발명은 다회 투여를 위한 본 발명에 따른 제제의 용도에 관계한다.

Serono의 전형적인 hGH 다회 투여 제제(Saizen)는 1.33, 3.33 또는 8 ㎎의 hGH를 함유한다.

Lilly의 전형적인 hGH 다회 투여 제제(Humatrope)는 6, 12 또는 24 ㎎의 hGH를 함유한다.

Pfizer의 전형적인 hGH 다회 투여 제제(Genotropin)는 5 또는 12 ㎎의 hGH를 함유한다.

Novo Nordisk의 전형적인 hGH 다회 투여 제제(Genotropin)는 5, 10 또는 15 ㎎의 hGH를 함유한다.

따라서, 전형적인 제제에서, 바이알에 제공되는 hGH 양은 1.33, 3.33, 5, 6, 8, 10, 12, 15 또는 24 ㎎이다.

이들 조성물은 단독으로, 또는 질병 또는 이의 다른 증상과 관련된 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 hGH 제제는 바이알로 분배될 수 있다.

“바이알”은 밀봉된 무균 상태에서 GH를 고체 또는 액체 형태로 유지하는데 적합한 저장소를 폭넓게 의미한다. 본 명세서에서 바이알의 실례는 앰플, 카트리지, 블리스터 패키지(blister package), 또는 주사기, 펌프(삼투압 펌프 포함), 카테터, 경피 패치, 폐 또는 경점막 스프레이를 통한 GH의 환자로의 전달에 적합한 다른 임의의 저장소이다. 비경구, 폐, 경점막, 또는 경피 투여를 위하여 산물을 포장하는데 적합한 바이알은 당분야에 널리 공지되어 있다.

hGH 제제의 증가된 안정성은 적당한 온도, 예를 들면, 빙점 이하(가령, -20℃), 또는 빙점 이상, 바람직하게는 2-8℃, 가장 바람직하게는 +5℃, 또는 실온, 예를 들면, +25℃에서 장기간 보관을 가능하게 한다.

생체내 투여에 이용되는 hGH 제제는 무균이어야 한다. 이는 예로써, 무균 여과 막을 통한 여과로 용이하게 달성될 수 있다.

일반적으로, 치료 hGH 액체 제제는 무균 접근 포트(sterile access port), 예를 들면, 정맥내 용액 백(intravenous solution bag)을 보유하는 용기, 또는 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개가 달린 바이알에 넣어진다.

이런 이유로, 본 발명의 또 다른 측면은 사용 이전에 보관에 적합한 용기 내에서 무균 상태로 밀봉되는 본 발명의 액체 제제의 제공 형태에 관계한다.

본 발명의 제제는 어린이에서 GH 결핍, AIDS 환자에서 체중 감소와 체력 소모, 여자 어린이에서 터너 증후군, 어린이에서 만성 신부전의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명이 특정 구체예와 관련하여 기술되긴 했지만, 추가적인 변형이 가능하다. 본 출원은 전체적으로 본 발명의 원리를 추종하고 당해 기술분야에서 공지되거나 관례적인 실시 범위 내에서 본 명세서로부터 벗어나는 임의의 변형, 이용 또는 개조를 포섭하며, 이는 아래에 첨부된 특허청구범위에 기재된 필수적인 특징에도 적용된다.

논문이나 초록, 공개되거나 공개되지 않은 특허 출원, 허여된 특허, 또는 임의 다른 자료를 비롯한 본원에 언급된 모든 자료, 예를 들면, 모든 데이터, 표, 도면 및 언급된 자료에 제시된 원문은 여기에 순전히 참고로 한다.

전형적인 임상 연구 개요에 관한 아래의 실시예를 참고하면 본원 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있지만, 이들 실시예는 본원 발명을 제한하지 않는다.

실시예

아래의 2가지 제제는 안정성 관점에서 평가하였다:

제제 A :

성분	제제 A
r-hGH(㎎/㎖)	8.0
구연산인산나트륨 pH 5.8(mM)	5.0
황산나트륨(mM)	100.0
염화마그네슘(mM)	50
페놀(㎎/㎖)	3.0
Pluronic F68(㎎/㎖)	1.5

제제 B :

성분	제제 B
r-hGH(㎎/㎖)	8.0
구연산인산나트륨 pH 5.57(mM)	5.0
염화나트륨(mM)	171.0
염화마그네슘(mM)	5
페놀(㎎/㎖)	3.0
Pluronic F68(㎎/㎖)	0.2

제제 A & B의 화학적 안정성은 연장된 기간, 즉 3주동안 40℃ 온도에서 샘플의 보관이후 평가하였다.

hGH의 안정성은 RP-HPLC(역상 HPLC)로 결정하였다. 이후, 인간 성장 호르몬의 주요 피크의 변화 정도로부터 변화되지 않은 본래의 성장 호르몬의 양을 추론하였다. 다시 말하면, 인간 성장 호르몬의 주요 피크의 변화로부터 변화 정도를 추론하고, 변화되지 않은 r-hGH vs. 0시에서 상응하는 피크의 비율로서 산정하였다.

결과:

제제 A :

- 40℃에서 1개월동안 샘플을 보관한 이후, r-hGH에 대하여 측정된 주요 피크는 0시에서 상응하는 피크의 62%이다(즉, 40℃에서 1개월 보관이후, 62%의 변화되지 않은 r-hGH가 관찰된다).

- 실온(25℃)에서 1개월 보관이후, r-hGH에 대하여 측정된 주요 피크는 0시에서 상응하는 피크의 91%이다(즉, 25℃에서 1개월 보관이후, 91%의 변화되지 않은 r-hGH가 관찰된다).

제제 B :

40℃에서 3주간 보관 이후, r-hGH에 대하여 측정된 주요 피크는 0시에서 상응하는 피크의 69%이다(즉, 40℃에서 3주 보관이후, 69%의 변화되지 않은 r-hGH가 관찰된다).

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29. EP-0131864

30. EP-0211601

31. WO 97/29767

32. US-5,567,677

Claims

a) 성장 호르몬, 또는 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH);

b) 알칼리 금속 염(alkaline metal salt);

c) 알칼리 토류 금속 염(alkaline earth metal salt); 그리고

d) 구연산염/인산염 완충제를 함유하고,

이 제제의 pH는 5.5 내지 5.8인, 액체 제제.
제 1항에 있어서, 성장 호르몬은 인간 성장 호르몬인 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 1항에 있어서, 알칼리 금속 염은 NaCl, KCl, Na₂SO₄, 또는 Na₂CO₃에서 선택되는 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 3항에 있어서, 알칼리 금속 염은 NaCl 또는 Na₂SO₄인 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 1항에 있어서, 알칼리 토류 금속 염은 CaCl₂, MgCl₂, MgSO₄, 또는 (NH₄)₂CO₃에서 선택되는 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 5항에 있어서, 토류 알칼리 염은 MgCl₂인 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 1항에 있어서, 완충제는 구연산나트륨/인산나트륨 완충제인 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 7항에 있어서, 완충제는 1 내지 100 mM범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 1항에 있어서, 계면활성제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 9항에 있어서, 계면활성제는 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜인 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 10항에 있어서, 계면활성제는 플루로닉(Pluronic) F68인 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 9항 또는 10항에 있어서, 0.5 내지 5 ㎎/㎖의 농도로 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜을 함유하는 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 1항에 있어서, 안정화제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 13항에 있어서, 안정화제는 수크로오스인 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 14항에 있어서, 10 ㎎/㎖ 내지 100 ㎎/㎖의 농도로 수크로오스를 함유하는 것을 특징으로 하는 액체 제제.
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제 1항에 있어서, 보존제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 18항에 있어서, 1 내지 10 ㎎/㎖의 농도로 보존제를 함유하는 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 18항 또는 19항에 있어서, 보존제는 페놀인 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 1항에 있어서, 5.8의 pH를 보유하고, r-hGH, 구연산나트륨/인산나트륨, Na₂SO₄, MgCl₂, 페놀, 플루로닉(Pluronic) F68, 그리고 선택적으로 주사용 물로 구성되는 것을 특징으로 하는 액체 제제.
제 1항에 있어서, 5.8의 pH를 보유하고, r-hGH, 구연산나트륨/인산나트륨, NaCl, MgCl₂, 페놀, 플루로닉(Pluronic) F68, 그리고 선택적으로 주사용 물로 구성되는 것을 특징으로 하는 액체 제제.
어린이에서 GH 결핍, AIDS 환자에서 체중 감소와 체력 소모, 여자 어린이에서 터너 증후군, 또는 어린이에서 만성 신부전의 치료를 위한, 제 1항에 따른 액체 제제를 함유하는 제약학적 조성물.
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