KR101127402B1

KR101127402B1 - 페길화된 양친성 고분자 나노 입자 및 이를 이용한 암의 진단 및 치료

Info

Publication number: KR101127402B1
Application number: KR1020090038549A
Authority: KR
Inventors: 최기영; 김광명; 박재형; 권익찬; 최귀원
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2009-04-30
Publication date: 2012-06-12
Anticipated expiration: 2029-04-30
Also published as: KR20100119441A

Abstract

본 발명은 형광체가 결합된 양친성 고분자 나노 입자를 포함하는 암 진단용 조영제에 관한 것으로서, 상기 양친성 고분자 나노 입자는 폴리에틸렌 글리콜로 페길화(PEGylation)된 것을 특징으로 하는 암 진단용 조영제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 형광체가 결합된 양친성 고분자 나노 입자를 포함하는 약물 전달체 조성물에 관한 것으로서, 상기 양친성 고분자 나노 입자는 폴리에틸렌 글리콜로 페길화되고, 항암제 등의 약물이 봉입된 것을 특징으로 하는 약물 전달체 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 의한 암 진단용 조영제 또는 약물 전달체 조성물은 폴리에틸렌 글리콜로 페길화된 양친성 고분자 나노 입자를 포함하므로, 높은 암 축적 효율, 낮은 간 축적성, 높은 혈중 체류시간을 나타내어 각종 암의 진단 및/또는 치료를 위해 광범위하게 사용될 수 있다.

나노 입자, 페길화, 조영제, 분자영상, 암 진단, 암 치료

Description

페길화된 양친성 고분자 나노 입자 및 이를 이용한 암의 진단 및 치료{PEGYLATED AMPHIPHILIC POLYMERIC NANOPARTICLES ABD USES THEREOF}

최근 암 진단 및 치료 분야에 있어서 광학 분자 영상 기술의 중요성이 대두되고 있으며, 근적외선 투시에 의한 암 조직 영상법은 기존의 양전자 방출 단층 촬영(position emission tomography : PET)/컴퓨터 단층 촬영(computed tomography : CT) 또는 PET/단일 광자 방출 단층 촬영(single photon emission computed tomography : SPECT) 진단기술과 비교하여, 방사성 동위원소의 불필요성, 고해상도의 영상, 저렴한 비용 등의 장점을 가지고 있다.

그러나 근적외선 투시에 의한 암 조직 영상법을 사용하기 위해서는 근적외선 파장(650nm-900nm)의 스펙트럼 범위 내에서 흡수 및 형광 최대치를 갖고, 물에 대한 용해도가 높고 생체 적합성이 우수한 근적외선 형광체의 개발과 더불어, 이러한 근적외선 형광체가 암 조직에 선택적으로 전달?축적될 수 있게 하는 조영제의 개발이 요구된다.

한편, 파크리탁셀, 도세탁셀, 시스플라틴, 캄토세신 등 약리학적으로 효과적인 항암제는 실제 임상적용에 있어서 세포내 유전인자의 본체인 핵산의 합성을 억제하거나 핵산에 직접 결합하여 그 기능을 손상시킴으로서 효과를 나타낸다. 그러나 이들 항암제는 암 세포뿐만 아니라 정상 세포, 특히 세포분열이 활발한 정상 조직세포에도 손상을 입히기 때문에 골수 기능 저하, 위 장관 점막손상, 탈모 등의 부작용을 보이며 약물의 심각한 독성 및 낮은 용해도로 인하여 기대와는 달리 획기적인 성과를 보여주지 못하였다. 따라서 질병 치료에 사용되는 약물의 부작용을 최소화하기 위한 새로운 약물제형의 개발이 활발히 진행되어져 왔다. 그 예로서, 약물의 독성을 최소화하면서 약물의 치료효능을 향상시킬 수 있는 나노 입자, 마이셀, 미립구 등의 약물전달체가 개발되어져 왔다.

특히, 암을 효과적으로 표적화하기 위하여 암세포를 특이적으로 인식하는 항체, 펩티드, 폴산, 히알루론산등의 리간드로 나노 입자의 표면을 개질한 표적 지향형 약물 전달체가 활발히 개발되어져 왔다. 그러나 상기한 표적 지향 리간드는 생체 조건 안에서 암 세포 뿐 아니라 간, 신장 등의 정상 세포 표면의 수용체와도 강하게 결합하여, 질병 치료에 사용되는 약물의 부작용을 최소화하기 위해서는 항암 제를 암 조직에 선택적으로 투여할 수 있는 새로운 약물 제형의 개발이 요구되고 있다(Pharmacol Rev 2001;53(2);283-318, Bioorgan Med Chem 2005;13:5043-54, Nat Rev Drug Discov 2005;4(2);145-160).

그 중에서도 히알루론산은 인체 내에 존재하는 생체 고분자로서, D-글루크론산과 N-아세틸글루코사민으로 구성되는 고분자로서, 1934년, K. Meyer 에 의하여 소의 눈의 유리체로부터 분리된 이당류이다. 이는 세포 외 매트릭스의 주성분으로서, 체내에서 면역 반응을 일으키지 않으며 독성이 거의 없다는 점에서 매우 안전한 생체 재료로 알려져 있다.

특히, 난소, 결정, 위장 및 유방암 등 다양한 종양세포는 히알루론산 결합 수용체인 CD44 및 RHAMM을 과발현하는 것으로 알려져 있어, 종양과 관련된 다양한 분야에서 활발하게 연구되고 있다(Drug Deliv 2005. 12. p. 327-342).

하지만, 대부분의 히알루론산은 간에 존재하는 HARE 등의 세포막 수용체를 통하여 히알루론산과 특이적으로 결합하기 때문에 정맥 주사를 통하여 주사된 대부분의 나노 입자가 간에 축적되는 것으로 알려져 있으며, 간장 및 림프선에 존재하는 HARE, LYVE-1등의 수용체를 통한 세포내로의 도입 및 히알루로니다아제에 의한 분해 작용에 의해서 빠르게 분해되므로, 암 진단용 조영제 또는 약물 전달 체 조성물로 사용하기에는 혈중 체류 시간이 매우 짧다는 문제점이 있다.

본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 높은 암 축적 효율, 낮은 간 축적성, 높은 혈중 체류 시간을 가질 뿐 아니라 뛰어난 생체 적합성, 생분해성을 가지는 양친성 고분자 나노 입자를 포함하는 암 진단용 조영제 또는 약물 전달체 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

본 발명자는 상기 목적을 달성하기 위해 유의 연구한 결과, 폴리에틸렌 글리콜로 페길화(PEGylation)된 양친성 고분자 나노 입자는 종래의 암 진단용 조영제 또는 약물 전달체로 사용되던 나노 입자에 비해 체내에서의 높은 혈중 체류시간을 보이며, 감소된 간 축적량을 나타낸다는 것을 발견하였다.

따라서 본 발명은, 폴리에틸렌 글리콜로 페길화(PEGylation)된 양친성 고분자 나노 입자를 포함하는 암 진단용 조영제를 제공한다.

또한, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜로 페길화(PEGylation)된 양친성 고분자 나노 입자에 항암제가 봉입된 것을 특징으로 하는 약물 전달체 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 폴리에틸렌 글리콜로 페길화(PEGylation)된 양친성 고분자 나노 입자는 생체적합성이 있을 뿐 아니라, 향상된 체내 순환 거동을 보이며 암 조직에 선택적으로 축적되므로, 상기 나노 입자에 형광체를 결합하여 암 진단용 조영제로 이용할 수 있다. 또한, 상기 나노 입자에 항암제 등을 봉입하여 약물 전달체 로 사용할 수 있어 유용하다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 형광체가 결합된 양친성 고분자 나노 입자를 포함하는 암 진단용 조영제를 제공하되, 상기 암 진단용 조영제에 포함되는 양친성 고분자 나노 입자는 폴리에틸렌 글리콜로 페길화된 것이 특징이다.

상기 양친성 고분자는 친수성 고분자 물질에 소수성 물질이 결합된 것임을 의미한다. 본 발명에서는 친수성인 고분자 물질에 소수성의 물질을 결합하여 양친성 고분자를 나노 입자로 제공함으로써, 상기 나노 입자는 수용액 상태에서도 안정한 구조를 가질 수 있으며, 고분자 나노 입자의 특성에 따라서 암 조직 주변의 축적 효율을 나타낼 수 있다. 암 조직은 비정상적인 빠른 성장 때문에 혈관 조직이 느슨하게 형성되고 높은 투과성을 보이므로, 고분자 나노 입자 등은 암 조직에 선택적으로 축적될 수 있다(enhanced permeability and retention (EPR) 효과). 따라서 본 발명에서는, 고분자로 이루어진 나노 입자를 사용함으로써 생체 내 체류시간을 향상시켰다.

상기 고분자 물질로는 생체적합성을 갖는 모든 고분자가 사용될 수 있으며, 특히 암 조직 축적 효율이 높은 고분자를 사용할 수 있다. 생체적합성과 생분해성이 우수해야 생체 내에서의 안정성이 우수하여 혈액 내에서의 생체 분포도가 높아서, 충분한 시간 동안 암 조직에 계속적으로 축적될 수 있기 때문이다. 가능한 예로서, 덱스트란(dextran), 키토산(chitosan), 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리아스파르트산(poly-aspartic acid) 등의 생체 고분자와 폴리(N-2-(하이드록시프로필)메타아크릴아마이드)(poly(N-2-(hydroxypropyl)methacrylamide), 폴리(디비닐 에테르-코-말레익 언하이드라이드)(poly(divinyl ehter-comaleic anhydride)), 폴리(스틸렌-코-말레익 언하이드라이드)(poly(styrene-co-maleic anhydride)), 폴리(에틸렌 글라이콜)(poly(ethylene glycol))등의 합성 고분자가 있다.

상기 고분자 중에서도 좋기로는, 생체적합성 및 생분해성이 우수하며, 암 세포에 대한 높은 친화력을 가지는 히알루론산을 사용할 수 있다. 히알루론산은 인체 내 면역반응을 일으키지 않을 뿐 아니라 독성이 거의 없어 생체 재료로 적합할 뿐만 아니라, 암 세포 및 조직에 특이적으로 발현되는 CD44 수용체(receptor)와 친화력이 높아 나노 입자 제조시 암 조직 축적 효율이 매우 높으며, 히알루론산의 카르복실기는 소수성 물질 또는 근적외선 형광체의 화학적 개질을 유도할 수 있으므로 좋다.

상기 친수성 고분자에 도입되는 소수성 물질로는 디옥시콜린산 (deoxycholic acid), 타우로디옥시콜린산(taurodeoxycholic acid), 타우로콜린산 (taurocholic acid), 글리코케노디옥시콜린산(glycochenodeoxyhoclic acid) 등의 담즙산 유도체; 스테아린산(steric acid), 올레인산(olelic acid) 등의 지방산 유도체가 있다. 본 발명에 의한 양친성 고분자 나노 입자는 친수성 고분자에 소수성 물질이 결합되어 구성되므로 소수성과 친수성의 균형을 통하여 나노 크기의 자기조립체(self-assemblｙ) 또는 자기조립체(self-aggregate)가 형성될 수 있다. 또한, 고분자 나 노 입자에 근적외선 등의 투시가 가능한 형광체의 화학적 개질이 용이하다. 예를 들면, 근적외선 투시에 의해 암 조직의 선택적인 강한 근적외선 형광을 나타낼 수 있다.

상기 친수성 고분자와 소수성 물질이 결합되어 구성된 양친성 고분자 복합체에 폴리에틸렌 글리콜을 도입함으로써, 간 축적이 감소되고 혈중 체류시간이 향상된 양친성 고분자 나노 입자를 제조할 수 있다. 즉, 폴리에틸렌 글리콜로 고분자 나노 입자를 페길화하는 것에 의해, 나노 입자의 표면의 친수성이 증가되며 병원균, 노폐물 및 외부 유입 물질을 포식하고 소화시키는 인체 내의 탐식세포(macrophage) 등을 포함하는 면역 기능으로부터의 인식을 방지하는 소위 스텔스 효과(stealth effect)를 통한 신체 내에서의 빠른 분해가 방지될 수 있다. 따라서 상기 페길화에 의하여 고분자 나노 입자의 혈중 체류 시간이 향상될 수 있다. 또한, 상기와 같이 폴리에틸렌 글리콜로 페길화된 고분자 나노 입자의 경우, 기존의 폴리에틸렌 글리콜로 페길화되지 않은 나노 입자와는 달리 간으로의 축적이 감소된다는 이점이 있어(도 5 참조), 항암제 등을 봉입하여 약물 전달 조성물로 사용할 수 있다는 장점이 있다. 본 발명에서 사용되는 페길화는 히알루론산의 카르복실 그룹과 폴리에틸렌 글리콜의 아민 그룹의 결합에 의해 아미드 그룹을 형성하는 방법으로 형성될 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 아니하며 다양한 방법으로 페길화를 수행할 수 있다. 사용되는 폴리에틸렌 글리콜은 좋기로는 100 내지 1,000사이의 분자량을 가지며, 선형 혹은 가지형 등의 다양한 구조를 가질 수 있다.

한편, 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 보다피 등과 같은 형광체의 화학적 도입에 의해, 고분자 나노 입자의 생체 내 광학 투시가 가능하다.

따라서, 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜로 페길화(PEGylation)된 양친성 고분자에 형광체가 결합된 나노 입자를 포함하는 암 진단용 조영제를 제공한다.

상기 사용될 수 있는 형광체로 방사선 동위원소, 양자점(quantumdot), MRI 조영제 등이 있다. 좋기로는 근적외선 형광체를 사용할 수 있다. 근적외선 형광체로는 시아닌, 플루오레신(fluorescein), 테트라메틸로드아민(tetramethylrhodamine), 보디피(BODIPY), 알렉사(Alexa) 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도 시아닌계는 근적외선 빛을 방출 및 흡수하므로 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭 또는 흡수가 최소화되므로 사용하기에 좋다. 또한, 좋기로는, 히알루론산과 소수성 물질의 복합체에 근적외선 형광체인 Cy5.5을 화학적으로 결합시킨 나노 입자의 경우, 근적외선 투시시 생체 내에서의 나노 입자의 위치 및 정량적 분석이 가능하므로 이를 암 진단에 사용할 수 있다. 이때, 근적외선 투시가 암 조직 표적성을 갖는 높은 근적외선 형광세기를 나타내는 것이 바람직하다. 상기 근적외선 형광체가 결합된 양친성 고분자 나노 입자에 추가로 방사선 동위원소 등을 동시에 결합하여 사용하는 복합 분자영상이 가능하다.

상기와 같이 본 발명은, 친수성 고분자 물질에 소수성 물질이 결합된 양친성 고분자를 폴리에테르로 페길화하고, 상기 페길화된 양친성 고분자에 형광체를 결합한 고분자 나노 입자를 암 진단 조영제로 사용할 수 있다.

그 중에서도 좋기로는, 히알루론산 고분자 물질과 담즙산 소수성 물질을 결 합한 양친성 고분자를 폴리에틸렌글리콜로 페길화하고, Cy5.5와 같은 형광체를 결합한 고분자 나노 입자를 포함하는 암 진단용 조영제를 제공할 수 있다. 이와 같은 고분자 나노 입자를 형성하는 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 복합체는 하기의 일반식 (Ⅰ)로 나타낼 수 있다.

<일반식 (Ⅰ)>

상기 일반식 (Ⅰ)에서 A와 B는 히알루론산 고분자의 반복구조인 N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine) 과 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid) 유도체를 의미하며, C는 친수성 히알루론산에 소수성기를 도입하기 위하여 D-글루쿠론산 유도체 카르복실기에 소수성 담즙산, 지방산 등의 소수성 물질이 화학적으로 결합된 것을 의미하며, D는 D-글루쿠론산 유도체 카르복실기에 폴리에틸렌 글리콜이 화학적으로 결합된 것을 의미하고, E는 나노 입자의 생체 내 영상을 위하여 D-글루쿠론산 유도체 카르복실기에 근적외선 형광체, 방사성 동위원소 등이 화학적으로 결합되는 것을 의미한다. 상기 식에서, a는 히알루론산의 분자량에 따라서 100 내지 10,000의 값을 가지며, b는 히알루론산의 나노 입자를 제조하기 위하여 5 내지 10,000의 값을 가지며, c는 5 내지 10,000, d는 1 내지 100이다.

상기의 일반식 (Ⅰ)을 기초로 친수성 고분자는 히알루론산으로, 소수성 물질은 담즙산이고, 상기 히알루론산과 답즙산가 결합된 양친성 고분자는 폴리에틸렌글리콜로 개질(페길화)되고, 근적외선 형광체는 Cy5.5으로 하여 제조된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 복합체는 자기 조립형 또는 자기 응집된 형태의 나노 입자로 제조되며, 그 크기는 수 십에서 수 백 나노미터일 수 있다. 상기와 같이 제조된 본 발명에 의한 고분자 나노 입자의 복합체는 일반 저분자량의 조영제보다, 암 조직 주변의 느슨한 신생혈관의 높은 투과성 때문에 나타나는 암 조직의 EPR (Enhanced Permeation and Retention) 효과에 의하여 암 조직에 대한 선택성이 높아서 효과적으로 암 조직에 축적되고 동시에, 암 세포에 특이적으로 발현되는 CD44, RHAMM 등의 수용체(receptor)와 히알루론산 등의 고분자의 친화성에 의해서 암 조직에 효과적으로 전달될 수 있다. 또한, 간, 비장, 신장 등 정상조직에 대한 축적량은 감소되면서, 생체 적합성이 우수하고 생체 내의 체류 기간이 저분자량의 조영제 보다 크게 증가되어, 근적외선, PET/SPECT, 및 CCD 카메라에 의해서 생체 내에서 영상이 가능하다.

상기 본 발명에 의한 양친성 고분자 나노 입자의 분자량은 10³ 내지 10⁶인 것이 좋으며, 크기는 10 내지 80nm인 것이 좋다.

한편, 본 발명에 의한 폴리에틸렌글리콜로 페길화된 양친성 고분자 나노 입 자 내에는 소수성 항암제의 약물 봉입이 가능하므로, 상기 나노 입자는 암 치료를 위하여 사용할 수도 있다.

따라서, 본 발명은 양친성 고분자 나노 입자에 물리/화학적으로 항암제 등의 약물이 봉입된 것을 특징으로 하는 약물 전달체 조성물을 제공한다.

상기 나노 입자에 봉입될 수 있는 항암제로는 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라틴(cis-platin), 캠토세신(camptothecin), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(Anasterozole), 글리벡(Gleevec), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드(Leuprolide), 플로타미드(Flutamide), 졸레드로네이트(Zoledronate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈(Gemcitabine), 스트렙토조토신(Streptozocin), 카보플라틴(Carboplatin), 토포테칸(Topotecan), 벨로테칸(Belotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 히도록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 레티노익산(retinoic acid) 계열, 메소트렉세이트(Methotrexate), 메클로레타민(Meclorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 부술판(Busulfan), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 마이토마이신(Mitomycin), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantron), 아스피린(aspirin), 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone), 코르티코스테로이드(corticosteroid) 등이 있다. 상기 약물 전달체 조성물은, 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암 중에서 선택되는 암 치료용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 약물 전달체 조성물에 함유되는 항암제는 조성물 전체에 대하여 1 내지 60 중량%로 포함될 수 있다.

한편, 상기의 약물 전달체로 사용될 수 있는 고분자 나노 입자에 근적외선 형광체 등의 형광체를 결합함으로써 상기 나노 입자가 암 등의 질병의 진단과 치료를 동시에 수행할 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 양친성 고분자 나노 입자는 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질 및 점안제 등의 의료 및 의료 용구, 화장품, 수술 후의 유착 방지제, 주름살 개선제, 성형 보조물, 관절 기능 개선제, 세포 배양 지지체(Scaffold) 등의 용도로도 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리에틸렌 글리콜로 페길화된 양친성 고분자 나노 입자는, 히알루론산에 비해 인체 내에서의 분해 속도가 느리므로, 인체 내에서 오랜 시간 체류 할 것을 요구하는 주름살 개선제 등의 재료로 유용하게 사용될 수 있다는 장점이 있다.

비침투적 영상을 위해서는, 근적외선(near-infrared, NR) 투시가 가능한 근적외선 형광체(Cy5.5 등)를 화학적으로 결합시킨 나노 입자를 제조할 수 있다. 상기 나노 입자에 다양한 항암제를 봉입하여 암 조직에 선택적으로 전달하여, 암을 진단하는 동시에 암을 치료할 수 있는 신규 약물 전달체를 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 폴리에틸렌 글리콜( PEG )-히알루론산( HA )- 담즙산 (5-β- cholanic acid;CA)-Cy5.5 복합체의 제조

600 mg의 히알루론산을 120 ml의 포름아미드(formamide)에 녹이고 200 ml의 디메틸 포름아미드(dimethylformamide)에 Aminoethyl-5-β-cholanoamide 199 mg을 녹여 글리콜 히알루론산 용액에 천천히 적하하였고, 364 mg의 1-에틸-3-(3-디메틸-아미노프로필) 카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide; EDC)와 219 mg의 N-하이드로숙시니미드(N-hydrosuccinimide;NHS)를 40 ml의 디메틸 포름아미드에 녹여 반응액에 가한 다음 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 이후 상기 반응액을 2일간 투석하여 미반응 물질을 제거한 후, 동결건조하여 담즙산-히알루론산 복합체를 제조하였다. 상기 제조된 담즙산-히알루론산 복합체 600 mg을 120 ml의 증류수에 녹이고 374 mg의 PEG-NH₂ _,57.3 mg의 EDC, 40.4 mg의 NHS를 첨가하여 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 이후 상기 반응액을 2일간 투석하여 미반응 물질을 제거한 후, 동결건조하여 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산 복합체를 제조하였다. 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산 복합체 400mg을 100ml의 증류수 에 녹이고 24 mg의 Cy5.5-NH₂ _, 16mg의 EDC와 12mg의 하이드록시 벤조 트리아졸 (N-Hydroxybenzotriazole; HOBt)을 메탄올에 녹여 첨가한 후, 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 이후 상기 반응액을 2일간 투석하여 미반응 물질을 제거한 후 동결건조하여, 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 복합체를 제조하였다.

상기 반응은 하기의 반응식 1과 같이 나타낼 수 있다.

<반응식 1>

실시예 2. 합성된 폴리에틸렌글리콜 -히알루론산- 담즙산 - Cy5 .5의 나노 입자 형성

실시예 1에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 복합체를 1mL의 PBS 용액에 녹인 후, 0.45마이크로 필터로 여과하여 동적광산란장치 (dynamic laser scattering; DLS) 및 전자투과현미경(TEM)으로 입자의 크기를 관찰하였다.

폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 복합체에 대한 분석 결과(DLS 및 TEM), 약 200 ~ 400 나노미터의 평균입자를 갖는다는 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조).

실시예 3. 캠토세신이 함유된 폴리에틸렌글리콜 -히알루론산- 담즙산 - Cy5 .5 나노 입자의 제조

캠토세신이 봉입된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자의 제조는 다음과 같이 제조하였다. 40 mg의 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산 고분자를 8 ml의 DMSO:증류수 (2:1, v/v) 공용매에 녹이고, 캠토세신 16 mg를 4 ml의 DMSO에 녹였다. 두 개의 용액을 서로 섞어 1시간 동안 교반하였다. 이후, 상기 반응액을 2일간 투석하여 미반응 물질을 제거한 후 동결건조하여, 캠토세신이 함유된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 복합체를 제조하였다.

실시예 4. 캠토세신(항암제)가 함유된 폴리에틸렌글리콜 -히알루론산- 담즙산 - Cy5 .5 나노 입자의 신제형 항암제의 특성 분석

폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산 고분자에 캠토세신을 실시예 3과 같은 방법으로 봉입한 후, 상기 약물이 봉입된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산 나 노 입자의 크기를 동적 광산란 장치로 분석하였으며, 약물의 봉입 효율은 HPLC 및 UV spectroscopy를 통하여 분석하였다. 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산 고분자 나노 입자의 약물의 봉입 효율, 나노 입자의 크기를 하기의 표 1에 나타냈다.

항암제가 봉입된 폴리에틸렌글리콜 -히알루론산- 담즙산 나노 입자( CPT - HNP -P) 신제형 항암제의 특성 분석

Samples	CPT - HNP -P ( mg )	Drug ( mg )	Loading Efficiency (%)	Loading Content ( wt %)	size ( nm )
CPT-HNP-P	40	4	90	9	300
CPT-HNP-P	40	8	65	13	322
CPT-HNP-P	40	16	65	26	351

실시예 5. 제조된 나노 입자의 체내 분포 거동 및 암 조직 축적 효과 평가

실시예 3에서 제조한 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5의 나노 입자 용액 100㎕를 피부암 세포가 주입된 쥐에 정맥 주사 한 후, 근적외선 조사를 실시하였다. 피부암 세포가 주입된 쥐에 나노 입자를 주입하여 일정 시간이 경과한 후, 근적외선 조사를 실시하여 실시간 영상을 획득하였다.

도 3에서 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5의 나노 입자를 이용한 암조직의 근적외선 투시 영상과 형광량의 정량적 분석 결과를 나타냈다. 쥐 실험결과, 본 발명에 의해 제조된 나노 입자는 히알루론산 나노 입자에 비해 체내 순환 시간이 향상되었음을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 의한 나노 입자를 사용하면 보다 효과적으로 암 조직의 영상이 가능하다는 것을 알 수 있다.

도 4는 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5의 나노 입자를 이용하여 적출된 장기, 근육조직 및 암조직에 대한 근적외선 투시 영상과 형광량의 정량적 분석 결과를 나타낸 것이다. 실험 결과, 발명에 의해 제조된 나노 입자는 암 축적 효율이 높고, 다른 장기 또는 근육조직에서의 축적률은 낮다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 의한 나노 입자를 사용하면 보다 효과적으로 암 조직의 영상이 가능하다는 것을 알 수 있다.

실험예 6. 캠토세신이 함유된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산 나노 입자 항암제의 항암효과 및 생존률

편평상피세포 암(SCC7)이 이식된 C3H/HeN 마우스의 꼬리 혈관을 통하여 반복 투여함으로써 캠토세신 및 캠토세신이 봉입된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자의 항암효능을 평가하였다. 도 7과 같이, 캠토세신이 봉입된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자는 캠토세신이 봉입된 히알루론산 나노 입자나 캠토세신만 투여한 그룹에 비하여 암 성장 억제 효과가 뛰어난 것을 확인하였다. 또한, 캠토세신이 봉입된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자를 투여한 동물의 경우 캠토세신만을 투여한 동물에 비하여 생존률이 향상되었다는 것을 확인하였다. 캠토세신이 봉입된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자의 경우 히알루론산 나노 입자에 캠토세신을 봉입하여 투여한 그룹이나 캠토세신만을 투여한 그룹에 비하여 생존률 및 항암 효과가 크게 향상되었다.

도 1의 (A)는 실시예 1에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자의 평균 직경을 동적 광산란 장치(dynamic laser scattering; DLS)로 측정한 결과이고, 도 1의 (B)는 실시예 1에서 제조된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자를 전자 투과 현미경(TEM)으로 촬영한 사진이다.

도 2의 (A)는 간에 축적된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자 및 히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자의 근적외선 이미지를 나타낸 것이고, 도 2의 (B)는 간에 축적된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자 및 히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자의 시간에 따른 형광 세기를 그래프로 나타낸 것이다 (HNP: 양친성 히알루론산 나노입자, HNP-P1: 히알루론산 나노입자 표면의 카르복실 그룹을 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 1%로 페길화한 것, HNP-P5: 히알루론산 나노입자 표면의 카르복실 그룹을 폴리에틸렌 글리콜 5%로 페길화한 것, HNP-P6: 히알루론산 나노입자 표면의 카르복실 그룹을 폴리에틸렌 글리콜 6%로 페길화한 것, control: 약물을 주입하지 않은 쥐의 간(liver)).

도 3은 종양이 있는 마우스에 히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자 및 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자를 주사하여 얻은 근적외선 이미지를 나타낸 것이다.

도 4의 (A)는 몸 전체의 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자 및 히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자의 시간에 따른 형광 세기를 그래프로 나타낸 것이고, 도 4의 (B)는 종양 부위의 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산- Cy5.5 나노 입자 및 히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자의 시간에 따른 형광 세기를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5의 (A)는 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자 및 히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자가 장기, 정상 조직 및 암 조직에 축적되는 정도를 영상화한 것이고, 도 5의 (B)는 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자 및 히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자가 간에 축적되는 정도를 영상화한 것이고, 도 5의 (C)는 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자 및 히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자가 암 조직에 축적되는 정도를 영상화한 것이다.

도 6은 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자 및 히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자의 장기, 정상 조직 및 암 조직에 축적되는 정도를 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 7의 (A)는 실험예 4에서 제조된 캠토세신이 함유된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자 및 히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자의 항암효과를 그래프로 나타낸 것이다 (Free CPT: CPT약물을 유기용매 DMSO에 녹여서 주입한 동물 군, CPT-HNP: CPT를 봉입한 히알루론산 나노입자(HNP)를 포함하는 약물을 주입한 군, CPT-HNP-P: CPT를 봉입한 페길화된 히알루론산 나노입자(HNP-P)를 포함하는 약물을 주입한 군, Control: 약물을 주입하지 않은 군).

도 7의 (B)는 실험예 4에서 제조된 캠토세신이 함유된 폴리에틸렌글리콜-히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자 및 히알루론산-담즙산-Cy5.5 나노 입자를 피부암 세포가 주입된 쥐에 투여한 후, 쥐의 생존률을 나타낸 것이다.

Claims

형광체가 결합된 양친성 고분자 나노 입자를 포함하는 암 진단용 조영제로서, 상기 양친성 고분자는 히알루론산과 소수성 물질이 결합된 것이며 폴리에틸렌 글리콜로 페길화된 것을 특징으로 하고,

상기 형광체는 시아닌, 풀루오레신(fluorescein), 테트라메틸로드아민(tetramethylrhodamine), 보디피(BODIPY), 알렉사(Alexa), 방사선 동위원소 및 MRI 조영제로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상이고,

상기 소수성 물질은 디옥시콜산(deoxycholic acid), 타우로디옥시콜산(taurodeoxycholic acid), 타우로콜산(taurocholic acid), 글리코케노디옥시콜산(glycochenodeoxycholic acid), 타우로케노디옥시콜산(taurochenodeoxycholic acid) 스테아르산(stearic acid) 및 올레산(oleic acid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 암 진단용 조영제.
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제1항에 따른 형광체가 결합된 양친성 고분자 나노 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달체 조성물.
제1항에 따른 형광체가 결합된 양친성 고분자 나노 입자에 항암제가 봉입된 것을 특징으로 하는 약물 전달체 조성물.
제9항에 있어서, 상기 내부에 포함되는 항암제는 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라틴 (cis-platin), 캠토세신 (camptothecin), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(Tamoxifen), 아나스테로졸(Anasterozole), 글리벡(Gleevec), 5-플루오로우라실(5-FU), 플록슈리딘(Floxuridine), 류프로리드(Leuprolide), 플로타미드(Flutamide), 졸레드로네이트(Zoledronate), 독소루비신(Doxorubicin), 빈크리스틴(Vincristine), 젬시타빈(Gemcitabine), 스트렙토조토신(Streptozocin), 카보플라틴(Carboplatin), 토포테칸(Topotecan), 벨로테칸(Belotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 비노렐빈(Vinorelbine), 히도록시우레아(hydroxyurea), 발루비신(Valrubicin), 레티노익산 (retinoic acid) 계열, 메소트렉세이트(Methotrexate), 메클로레타민(Meclorethamine), 클로람부실(Chlorambucil), 부술판(Busulfan), 독시플루리딘(Doxifluridine), 빈블라스틴(Vinblastin), 마이토마이신(Mitomycin), 프레드니손(Prednisone), 테스토스테론(Testosterone), 미토산트론(Mitoxantron), 아스피린 (aspirin) 및 살리실레이트 (salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 및 코르티코스테로이드(corticosteroid) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체 조성물.
제9항에 있어서, 항암제는 조성물 전체에 대하여 1 내지 60 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체 조성물.
제9항에 있어서, 상기 나노 입자의 분자량은 10³ 내지 10⁶인 것을 특징으로 하는 약물 전달체 조성물.
제9항에 있어서, 상기 나노 입자의 크기는 10 내지 800 nm인 것을 특징을 갖는 약물 전달체 조성물.
제9항의 약물 전달체 조성물은 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암 중에서 선택되는 암 치료용인 것을 특징으로 하는 암 치료제 조성물.