KR101126645B1

KR101126645B1 - 말초신경재생을 위한 신경성장인자 전달용 신경도관의 개발

Info

Publication number: KR101126645B1
Application number: KR1020090063096A
Authority: KR
Inventors: 황순정; 김인숙; 김성준; 이태형
Original assignee: 서울대학교치과병원
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2009-07-10
Publication date: 2012-03-29
Anticipated expiration: 2029-07-10
Also published as: WO2011004971A2; WO2011004971A3; KR20110005501A

Abstract

본 발명은 고분자물질로 제조된 도관으로서 내부 표면에 콜라겐 및 신경성장인자 (NGF)가 코팅된, 말초신경재생을 위한 신경성장인자 전달용 신경도관에 관한 것으로, 상기 신경도관은 세포부착력이 뛰어나고, 신경성장인자를 서방형으로 방출하며, 동물실험에서도 뛰어난 신경회복 효과를 나타내므로, 말초신경재생에 유용하게 이용될 수 있다.

신경도관, 콜라겐, 신경성장인자, 말초신경재생, 코팅

Description

말초신경재생을 위한 신경성장인자 전달용 신경도관의 개발 {Nerve conduit for the delivery of nerve growth factor in peripheral nerve regeneration}

본 발명은 말초신경재생을 위한 신경성장인자 전달용 신경도관에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고분자물질로 제조된 도관으로서 내부 표면에 콜라겐 및 신경성장인자 (Nerve growth factor; NGF)가 코팅된 신경도관에 관한 것이다.

신경계 (nerve system)는 형태학적으로 뇌와 척수로 구성된 중추 (central) 신경계 및 신경절과 신경섬유로 구성된 말초 (peripheral) 신경계로 나눌 수 있다. 이 중에서 말초신경계는 외부의 자극을 감지하여 중추신경계로 전달하고, 또한 중추신경계에서 오는 반응을 기관에 전달하는 역할을 한다. 말초신경의 손상은 다음과 같은 3가지 유형으로 나타나는데, 신경차단 (neuropraxia)은 일시적인 신경 차단으로 인한 일시적인 기능장해를 말하며, 축삭절단 (axonotmesis)은 축삭 (axon)이 단절되었으나 슈반신경초 (Schwann's sheath)는 보존되어, 보존된 슈반신경관 (Schwann's tube)을 따라 축삭의 재생이 가능한 상태를 말하며, 신경절단 (neurotmesis)은 신경줄기 (nerve trunk)가 완전히 절단되어 자연 회복이 불가능한 상태를 말한다.

교통사고, 산업재해, 스포츠 및 수술을 통한 조직절제로 인한 신경 손상의 경우는 신경절단에 해당되는 것으로서, 말초신경은 타 조직과는 달리 자생적인 재생 능력 및 자가 조직이식에 한계가 있어 상기와 같은 절단시 신경 손상 회복이 어려운 실정이다.

현재 말초신경 재생방법으로 자가 신경이식, 조직 공학적 접근 및 인공신경 등의 방법이 시도되고 있다. 자가 신경이식은 인체의 다른 부위에서 신경을 채취하여 외과적 문합술로 연결하지만, 자가 신경을 채취한 곳에서의 기능 손상이 있을 뿐 아니라, 이식된 신경의 기능 회복은 20-50% 정도에 불과하다. 또한, 조직공학적인 접근법으로서, 생체적합성이 좋은 폴리머를 도관으로 만들어 결손된 신경을 연결하고, 체외에서 배양된 신경세포나 줄기세포를 도관에 넣고 신경세포의 성장을 촉진하는 신경성장인자 (NGF)나 뇌유래신경영양인자 (BDNF)를 첨가하는 시도가 있었으나, 지금까지의 동물실험의 결과는 기존의 자가 신경이식의 방법보다 좋지 않은 결과를 보이고 있다. 또 다른 방법으로서, 인공신경이 많이 연구되어 왔지만, 인접 잔존 신경으로부터의 신경세포의 재생과 신경신호 전달이 원활하지 못하고 기능적으로 연관시키지 못하는 난제를 가지고 있으며, 세포치료 혹은 유전자치료와의 혼용이 없는 생체재료만을 이용한 시도는 현재 한계점에 도달한 상태이다.

그럼에도 불구하고, 자가 신경 대체물질로서 최근 인조신경을 이용한 신경재건이 시도되고 있다. 신경도관은 결손된 신경조직을 연결하고 신경섬유를 재생하는 통로역할을 하는 것으로서, 신경도관을 이용할 경우 절단된 신경의 양쪽 끝을 이 도관에 연결하면 도관 내에서 신경의 양끝에서 신경섬유가 자라나 신경이 재생되게 되는 원리이다. 현재 다양한 도관이 개발되고 있으며, 그 예로 대한민국 특허공개 제10-2003-0087196호에는 생체흡수성 폴리머, 콜라겐, 알지네이트 및 생체흡수성 세라믹 중 어느 하나를 재질로 하는 도관으로서, 내부에 키토산 코팅층을 갖는 도관을 개시하고 있고, 미국특허 제4,877,029호는 아크릴 공중합체, 폴리우레탄 이소시아네이트 및 기타 생체적합성 반투과성 폴리머를 주성분으로 하는 도관을 개시하고 있다. 또한, 미국특허 제5,026,381호는 콜라겐을 구성성분으로 하는 도관을 개시하고 있고, 미국특허 제5,019,087호는 콜라겐 및 라미닌 함유물질을 구성성분으로 하는 도관을 개시하고 있다.

그러나 도관 또는 생체재료만을 이용한 조직공학적인 방법으로는 말초신경의 기능적 재생이 불가능하여, 슈반세포의 주입이 필수적이지만, 자가 및 동종 슈반세포를 사람에서 얻기 어렵고, 가능하더라도 배양이 어려워, 줄기세포를 슈반세포로 분화시키는 기술의 개발이 필요한 상황이다. 성체줄기세포를 슈반세포로 분화시키기 위한 기술의 일환으로 전기자극을 통한 분화가 시도되고 있다.

이에, 본 발명자들은 전기자극이 가능한 신경도관이 신경재생에 보다 유리할 것으로 판단하여, 전기자극 칩의 내장이 가능한 폴리머를 주성분으로 하는 도관에 콜라겐 및 신경성장인자 (NGF)를 코팅한 신경도관을 제조하였으며, 상기 신경도관이 세포부착이 뛰어나며, 신경성장인자를 서방형으로 방출함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신경성장인자를 서방형으로 방출할 수 있는 말초신경 재생을 위한 신경도관을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고분자 물질로 제조된 도관으로서, 도관의 내부 표면에 콜라겐 및 신경성장인자 (NGF)가 코팅된 신경도관을 제공한다.

본 발명에 따른 말초신경재생을 위한 신경도관은 고분자 물질을 그 재질로 가지며, 세포부착력이 뛰어나고, 신경성장인자를 서방형으로 방출하며, 동물실험에서도 뛰어난 신경회복 효과를 나타내므로, 말초신경재생에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고분자 물질로 이루어진 도관으로서, 도관의 내부 표면에 콜라겐 및 신경성장인자 (NGF)가 코팅된 신경도관을 제공한다.

상기에서 고분자물질은 조직거부반응이나, 염증 등의 합병증을 유발하지 않는 것이 바람직하며, 신경재생의 효과를 높이기 위해 전기자극 장치를 내장할 수 있는 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 상기의 예로는 파라렌 (paralene), SU-8, 폴리노보넨 (polynorbornene) 또는 폴리이미드 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

생체 비흡수성 고분자를 사용하는 경우, 신경재생 후 간단한 수술로 이를 제거할 수 있으나, 본 발명의 고분자 물질은 조직거부반응이나 염증 등을 일으키지 않으므로 제거하지 않아도 무방하다. 생체흡수성 고분자를 사용하는 경우, 자연적으로 생체 내에서 분해되므로 시술 후 따로 제거하지 않아도 된다.

한편, 본 발명의 신경도관은 신경재생의 효율을 높이기 위해 상기 고분자물질에 전기자극장치를 추가로 포함할 수 있다. 상기 전기자극장치를 통해 이상성 전기자극 (biphasic electrical stimulation)을 가하는 것이 바람직하다. 전기자극의 여러 형태 중 이상성 전기자극(biphasic electrical stimulation)은 인체 내에 흐르는 전기자극의 형태이면서, 전하가 안정화되어 전하를 띄는 단백질이 전극에 부착되지 않아 일정한 전류를 지속적으로 줄 수 있고, 그로 인한 pH 변화가 없어 세포와 조직에 독성을 야기하기 않는 장점이 있다. 임상적으로는 인공와우 시스템(청각장애)과 뇌심부 자극기 (deep brain stimulator; 파킨슨병 치료), 심장박동회복기 (cardioverter difibrillators)에 사용되고 있다.

나아가, 본 발명에 따른 신경도관은 콜라겐 및 신경성장인자의 코팅층을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 신경도관은 주위 환경과의 영양물질의 교환을 위해, 다공성 공극을 갖는 것이 바람직하다. 상기 공극은 100 mm²의 도관 크기 당 1 내지 1000개의 개수를 갖는 것이 바람직하며, 1 내지 500μm의 직경을 갖는 것이 바람직하다.

한편, 상기 콜라겐은 신경세포의 부착을 돕는 역할을 수행하는 것으로서, 도관 100 mm²의 크기 당 0.1 내지 1000 ng의 양으로 코팅되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 신경성장인자는 부착된 신경세포의 성장을 도와 신경재생 시간을 단축시키는 역할을 수행하는 것으로서, 도관 100 mm²의 크기 당 10 내지 1000 ng의 양으로 코팅되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 신경도관은 콜라겐 및 신경성장인자의 이중층을 갖는 것으로서, 콜라겐 및 신경성장인자의 코팅 순서에 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 콜라겐 코팅 후 신경성장인자를 코팅하는 것이 바람직하다.

본 발명자들은 폴리이미드를 재질로 하고, 그 위에 콜라겐 및/또는 신경성장인자를 코팅한 in - vitro용 신경재생용 필름을 제작한 후, 상기 필름의 세포부착도를 검사한 결과, 콜라겐 코팅에 의하여 세포 부착력이 증가하고, 신경성장인자에 의하여 신경돌기의 성장이 증가함을 확인할 수 있었다 (도 2 내지 4 참조). 또한, 콜라겐 코팅 또는 세포 배양이 신경성장인자의 방출에 미치는 영향을 살펴본 결과, 콜라겐의 코팅으로 인해 더 많은 신경성장인자가 서방형으로 방출됨을 확인하였고, 신경재생용 필름을 PC12 신경세포와 함께 배양하는 경우, 더 많은 신경성장인자의 방출을 확인하였다 (도 5 및 도 6 참조). 신경재생용 필름에 콜라겐 코팅한 경우, 신경성장인자가 더 많이 방출되었고, 세포와 함께 배양시 더 많은 신경성장인자가 방출되었으므로, 본 발명에 따른 신경도관은 콜라겐 및 신경성장인자를 코팅한 후, 세포와 같이 배양하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명자들은 in - vitro용 신경재생용 필름을 말은 후, 실리콘 링을 끼워 in - vivo용 신경도관을 제작하고, 이를 랫트의 절단된 신경에 연결하여 신경회복을 나타내는 수치를 평가하였다. 좌골신경 기능지수 (SFI), 정지 좌골 지수 (SSI) 및 좌골신경유발 활동전위 수치에서 나타난 바와 같이, 콜라겐 및 신경성장인자로 코팅된 폴리이미드 도관을 사용하는 경우, 신경재생이 효과적임을 알 수 있었다 (도 8, 11 및 표 1 참조). 또한, 조직학적 검사 결과, 콜라겐 및 신경성장인자를 코팅한 그룹에서 정상신경에서 보이는 수초가 현저하게 많이 관찰되었다 (도 14 참조). 상기 결과로부터, 본 발명에 따른 신경도관은 콜라겐 및 신경성장인자의 코팅에 의한 신경재생이 매우 뛰어나므로, 말초신경재생에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 들어 상세히 설명하지만, 본 발명이 이 들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: in - vitro 용 신경재생용 필름 제작

<1-1> 폴리이미드 필름 제작

액상 폴리이미드를 반도체 공정의 스핀 코팅 방법을 이용하여 15mm x 10mm 크기의 필름을 제작하고, 레이저 가공을 통해 상기 필름의 표면에 1mm 간격으로 300μm의 구멍을 형성시켰다. 그리고 나서, 상기 필름을 100% 에탄올에 담근 후 클린벤치에 UV 램프를 켜놓은 상태에서 24시간 소독시켜 폴리이미드 필름을 제작하였다.

<1-2> 콜라겐 코팅 필름 제작

상기 실시예 1-1에서 제조된 폴리이미드 필름 표면에, 콜라겐 (3 mg/mL, 콜라겐 타입 I, 일본 Nitta gelatin) 및 70% 에탄올을 1:1 (v/v) 비율로 섞은 혼합액 400 μL을 뿌려준 다음, 하루 동안 클린벤치에서 건조시켜 콜라겐이 코팅된 필름을 제작하였다.

<1-3> 신경성장인자 ( NGF ) 코팅 필름 제작

상기 실시예 1-1에서 제조된 폴리이미드 필름 표면에, 20μL의 신경성장인자 (10μg/mL; R&D systems) 및 10μL의 PBS가 혼합된 용액 30μL를 뿌려준 다음, 하 루 동안 클린벤치에서 건조시켜 신경성장인자가 코팅된 필름을 제작하였다.

<1-4> 콜라겐 및 신경성장인자 ( NGF ) 코팅 필름 제작

상기 실시예 1-2에서 제조된 콜라겐 코팅 필름 표면에, 20μL의 신경성장인자 (10μg/mL; R&D systems) 및 10μL의 PBS가 혼합된 용액 30μL를 뿌려준 다음, 하루 동안 클린벤치에서 건조시켜 콜라겐 및 신경성장인자가 순차적으로 코팅된 필름을 제작하였다. 상기 신경재생용 필름을 도 1에 예시하였다.

실험예 1: 세포 부착도 검사

본 발명에 따른 신경재생용 필름의 세포부착능을 살펴보기 위하여, RPMI 배지 (10% 우태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 배양한 PC12 세포 (한국세포주은행 KCLB 21721)를 Dil I (1,1′-디옥타데실-3,3,3′,3′-테트라메틸인도카보시아닌 퍼클로레이트)으로 라벨링한 후 1×10⁶ 세포/필름의 농도로 실시예 1-1 및 1-2에서 제조된 신경재생용 필름 각각에 접종하였다. 접종 24시간 후, 신경성장인자 (20 ng)를 투여하여 7일간 배양하였으며, 배지는 3일 간격으로 교체하였다. 상기 배양 후, 현미경 (올림푸스 BX51)을 이용하여, ×40, ×100, ×200 및 ×400 배율에서 신경도관의 표면을 관찰한 결과, 콜라겐을 코팅하지 않은 필름 (실시예 1-1)의 표면에는 세포가 부착되지 않았지만 (도 2, A) 참조), 콜라겐을 코팅한 필름 (실시예 1-2)의 표면에는 세포가 부착되었음을 알 수 있었다 (도 2, B) 참조).

한편, 세포의 부착 여부를 확인하기 위해, 핵을 염색시키는 헤마토실린 (hematoxylin) 염색을 수행한 후, ×40, ×100, ×200 및 ×400 배율에서 필름의 표면을 관찰한 결과, 콜라겐을 코팅한 필름 (실시예 1-2)에 상당한 수의 세포가 부착되었음을 확인할 수 있었다 (도 3 참조).

또한, 부착된 세포의 형태를 관찰한 결과, 신경돌기 (neurite)를 뻗는 특성을 가진 PC12 세포가 신경성장인자의 처리로 인하여 직경 10μm의 동그란 형태에서 신경돌기를 뻗는 형태로 성장한 것으로 나타났다 (도 4 참조).

상기 결과로부터, 콜라겐 코팅에 의해 세포 부착이 증가하며, 신경성장인자의 처리로 인하여 신경세포의 성장을 유도할 수 있음을 확인하였다.

실험예 2: 콜라겐 코팅 및 세포 배양 유무에 따른 신경성장인자의 방출 정도 측정

<2-1> 콜라겐 코팅에 따른 신경성장인자의 방출 정도

콜라겐 코팅이 신경성장인자의 방출에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 대조군으로서 신경성장인자 (500 ng)를 단독으로 코팅한 필름과 실험군으로서 콜라겐 및 신경성장인자를 코팅한 필름을 제조하였다.

상기 필름들을 100% 에탄올로 충분히 적셔준 뒤 자외선 램프로 하루 동안 멸균한 후, RPMI 배양액에 넣어 배양하면서, 2~3일에 한번 씩 배양액을 수거하여 효소면역법 (ELISA)으로 신경성장인자의 방출량을 측정하였다. 측정결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 콜라겐 및 신경성장인자를 코팅한 필름 (col+NGF)이 신경성장인자만을 코팅한 필름 (NGF)보다 날짜별로 1.5 내지 2.5배 정도 더 많은 신경성장인자를 서방형으로 방출하는 것으로 나타났다. 따라서, 콜라겐 코팅이 신경성장인자의 서방형 방출에 상당한 영향을 미침을 알 수 있었다.

<2-2> 세포 유무에 따른 신경성장인자의 방출 정도

세포 유무가 신경성장인자의 방출에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 대조군으로서 신경성장인자 (500 ng)를 단독으로 코팅한 후 PC12 세포를 함께 배양한 그룹과 실험군으로서 콜라겐 및 신경성장인자를 코팅하고 PC12 세포를 함께 배양한 그룹을 대상으로 실험예 2-1에 기재된 방법에 따라 신경성장인자의 방출량을 측정하였다. 구체적으로, 각 필름을 멸균한 후, 2× 10⁵ 농도의 PC12 세포가 부착되어있는 플레이트(배양판)에 상기 필름을 넣고 배양하였다. 2~3일에 한번 씩 배양액을 수거하여 ELISA로 신경성자인자의 방출량을 측정하였다. 측정결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 세포와 함께 배양했을 경우에도 콜라겐 및 신경성장인자로 코팅한 필름 (col+NGF)에서 더 많은 신경성장인자가 방출되는 것으로 나타났다. 또한, 도 5의 세포와 함께 배양하지 않은 필름과 비교했을 때에도 각 날짜마다 약 2배 정도 더 많은 신경성장인자가 방출되는 것으로 나타났다.

상기 도 5 및 6의 결과를 종합하여 볼 때, 콜라겐 및 신경성장인자를 코팅한 후, 세포와 같이 배양한 필름이 신경재생용으로 가장 적합함을 알 수 있다.

실시예 2 : in - vivo 용 신경재생용 도관 제작

실시예 1-2의 콜라겐 코팅 필름 및 실시예 1-4의 콜라겐 및 신경성장인자 (단, 신경성장인자의 농도를 300 ng으로 조정함) 코팅 필름을 각각 둥글게 말은 후, 내경 3mm인 실리콘 링을 끼워 동물실험을 위한 in - vivo 용 신경도관을 제작하였다. 상기 도관을 도 7에 예시하였다.

실험예 3: 동물실험

<3-1> 신경도관을 이용한 랫트의 절단된 신경 연결

7주령 SD계 랫트 (220-250 g)를 3마리씩 총 2 그룹으로 나누었다. 각각의 랫트를 복강 내 마취시킨 후, 우측 좌골신경을 노출시키고, 신경을 잘라서 10mm 간격을 유지하게 하였다. 이후, 대조군은 실시예 2에서 제작한 콜라겐이 코팅된 신경재생용 도관을 절단된 신경 끝과 연결한 후 봉합하였고, 실험군은 콜라겐 및 신경성장인자가 코팅된 신경재생용 도관으로 연결하여 봉합하고 2주째에 SFI, SSI, 활동전위를 관찰하였고, 염색은 4주째에 수행하였다. 랫트 신경 해부 과정은 도 8에 예시하였다.

<3-2> 좌골신경 기능 지수 ( SFI )의 측정

수술 후 2주째에 좌골신경의 기능 정도를 파악하기 위하여, 좌골신경 기능 지수 (sciatic function index; SFI)를 이용하여 운동기능을 평가하였다 (Bain JR et al., Plast. Reconstr. Surg., 1989, Jan. 83(1):129-138). 구체적으로, 랫트의 양측 뒷다리 발바닥에 잉크를 바른 뒤 암실로 된 직선의 주행로를 여러 차례 지나가게 하여 풋 프린팅을 평가하였다. 실험결과를 하기 수학식 1에 대입하여 좌골신경 기능 지수를 계산하였다.

SFI =-38.3× ( EPL - NPL )/ NPL +109.5× ( ETS - NTS )/ NTS +13.3× ( EIT - NIT )/ NIT -8.8

EPL: 실험동물의 발의 길이 (experimental paw length);

NPL: 정상동물의 발의 길이 (unoperated normal paw length);

ETS: 실험동물의 첫 번째와 다섯 번째 발가락 사이의 거리 (distance between the first and fifth toes of operated experimental foot);

NTS: 정상동물의 첫 번째와 다섯 번째 발가락 사이의 거리 (distance between the first and fifth toes of unoperated experimental foot);

EIT: 실험동물의 두 번째와 네 번째 발가락 사이의 거리 (distance between the second and forth toes of operated experimental foot);

NIT: 정상동물의 두 번째와 네 번째 발가락 사이의 거리(distance between the second and forth toes of unoperated experimental foot);

SFI 지수 0은 완전 정상을 나타내며, -100의 지수는 좌골신경이 완전 절단 된 상태를 나타낸다.

풋 프린팅(foot printing) 결과는 도 9에 나타내었고, 풋 프린팅 후 측정한 신경기능지수(SFI) 결과는 도 10에 나타내었다. 측정결과, 콜라겐만 코팅한 도관보다 신경성장인자를 같이 코팅한 도관을 사용한 경우, 좌골신경 기능지수가 더 높음을 알 수 있었다. 따라서, 콜라겐 뿐만 아니라 신경성장인자를 함께 코팅하는 경우 신경손상의 회복에 보다 효과적임을 알 수 있다.

<3-3> 정지 좌골 지수 ( SSI )의 측정

수술 후 2주째에 좌골신경의 회복 정도를 파악하기 위하여, 정지 좌골 지수 (static sciatic index; SSI; Bain et al, 1989)를 조사하였다. 랫트의 양측 뒷다리를 카메라로 촬영하여 각각의 수치를 구한 후, 하기 수학식 2에 대입하여 SSI를 계산하였다.

SSI =108.44×( OTS - NTS )/ NTS +31.85×( OITS - NITS )/ NITS -5.49

OTS: 실험동물의 측면 발가락 뻗음 (operated side toe spread);

NTS: 정상동물의 측면 발가락 뻗음 (non-operated side toe spread);

OITS: 실험동물의 측면 중간 발가락 뻗음 (operated side intermediate toe spread);

NITS: 정상동물의 측면 중간 발가락 뻗음 (nonoperated side intermediate toe spread).

측정결과는 도 11에 나타내었다. 도 11에서 보는 바와 같이, 정지상태에서 구하는 신경회복지수인 SSI 값을 2주까지의 결과를 비교해 보았을 때 콜라겐만 코팅한 것보다 신경성장인자를 같이 코팅시켜준 도관에서 SSI값이 더 큰 것으로 나타났다. 따라서, 콜라겐 및 신경성장인자를 코팅한 신경도관에서 신경회복이 더 잘 이루어짐을 알 수 있다.

<3-4> 좌골신경유발 활동전위 ( Sciatic Nerve Evoked Action Potential )의 측정

좌골 신경의 재생 효과를 확인하기 위해, 전기적 측정 장치 (AD Instruments; stimulation & recording system 및 PowerLab version 5.01)를 이용하여, 신경의 한쪽 끝에서 양극성 자극 (bipolor stimulation) 전극으로 자극전위를 인가한 후, 신경의 반대쪽에서 레코딩 (recording) 전극으로 유발전위를 측정하였다. 측정된 신호는 PC를 사용하여 필터링하여 원하는 자극 신호만 추출하였다. 구체적인 측정방법은 도 12에 나타내었다. 즉, (a) 정상 신경에서 유발 전위를 측정하여 임계값 (threshold)과 활동전위 (action potential)의 발현을 관찰하고, (b) 정상 신경을 절단하고 측정하였다. 절단된 신경에서는 인위적인 결과 (artifact)만 관찰되므로 이를 (a)의 파형과 비교함으로써 인위적인 결과로부터 활동전위 파형을 추출할 수 있다. (a)(b)의 파형으로부터 유발전위를 얻어낼 수 있 으므로 같은 조건에서 수술한 부위의 신경으로부터 측정을 하여 수술 부위에서 유발전위가 발생하는지 검사하였다. 도 13에 전기적 측정 장치를 이용하여 신경의 유발 전위를 측정하는 모습을 나타내었으며, 측정결과는 하기 표 1에 나타내었다.

좌골정지유발 활동전위 측정결과

군	개체	발생빈도	유발된 활동전위	임계점 (mA)	지연시간 (ms)	거리 (mm)	속도 (m/s)
대조군	1	0/3	X	X	X
	2		X	X	X
	3		X	X	X
실험군	4	3/3	O	0.8	5.5	15	2.73
	5		O	0.7	5.3	15	2.83
	6		O	1	5.8	15	2.59

표 1에서 보는 바와 같이, 대조군에서는 유발 전위가 발생하지 않은 것으로 보아 신경의 재생이 이루어지지 않았지만, 신경성장인자를 코팅한 도관이 사용된 실험군에서는 유발전위가 발생한 것으로 보아 신경이 재생되었음을 알 수 있다.

<3-5> 조직학적 검사 ( histological evaluation )

각 실험군 및 대조군으로부터 실험부위를 포함한 15mm의 좌골신경을 박리하여 채취한 후, 10% 파라포름알데히드에 고정하고, 탈수과정을 거친 다음 파라핀으로 조직을 만든 후 신경 재건부 중앙을 횡절단하여 2㎛ 두께의 절편을 만들었다. 그리고 나서, 조직과 함께 부착되어있는 파라핀을 자일렌으로 제거하고, 에탄올 시리즈로 탈수과정을 거친 후, 과산화수소, 프로티나제 K 및 혈청과 단계적으로 반응시키고 나서, 말초수초단백질 PMP-22 (santa cruz)을 면역염색하여 수초(마이엘린) 형성을 확인하였다.

검사 결과는 도 14에 나타내었다. 도 14에서 보는 바와 같이, 콜라겐만 코팅한 그룹보다 콜라겐 및 신경성장인자를 코팅한 그룹에서 정상신경에서 보이는 수초가 더 많이 관찰되었다.

도 1은 본 발명에 따른 in - vitro용 신경재생용 필름을 예시한 것이다.

도 2는 A) 콜라겐으로 코팅되지 않은 필름; 및 B) 콜라겐으로 코팅된 필름의 표면에 부착된 세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 3은 A) 콜라겐으로 코팅되지 않은 필름; 및 B) 콜라겐으로 코팅된 필름 표면에 부착된 세포를 헤마톡실린 염색 후 관찰한 사진이다.

도 4는 신경재생용 필름에 배양된 P12 세포가 신경성장인자 처리시 화살표 방향으로 신경돌기를 뻗으면서 성장함을 보여주는 사진이다.

도 5는 신경성장인자만으로 코팅된 필름 (NGF) 및 콜라겐 및 신경성장인자로 코팅된 필름 (Col+NGF)에서의 배양 기간에 따른 신경성장인자의 방출량을 나타낸 그래프이다.

도 6은 P12 세포 존재하에 배양하였을 경우, 신경성장인자만으로 코팅된 필름 (NGF) 및 콜라겐 및 신경성장인자로 코팅된 필름 (Col+NGF)에서의 배양 기간에 따른 신경성장인자의 방출량을 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명에 따른 신경도관 (in - vivo용)을 예시한 것이다.

도 8은 랫트의 신경을 절단한 후 본 발명에 따른 신경도관 (in - vivo용)을 이용하여 연결하는 과정을 보여주는 사진이다.

도 9는 본 발명에 따른 신경도관으로 절단된 신경을 연결한 후, 신경회복정도를 알아보기 위한 풋 프린팅 사진이다.

도 10은 본 발명에 따른 신경도관으로 절단된 신경을 연결한 랫트를 대상으 로, 신경기능지수 (SFI)를 평가한 그래프이다.

도 11은 본 발명에 따른 신경도관으로 절단된 신경을 연결한 랫트를 대상으로, 정지좌골지수 (SSI)를 평가한 그래프이다.

도 12는 랫트를 대상으로 좌골정지유발 활동전위를 측정하는 과정을 나타낸 사진이다.

도 13은 유발전위를 측정하는 모습을 나타낸 사진이다.

도 14는 본 발명에 따른 신경도관으로 절단된 신경을 연결한 랫트를 대상으로, 말초수초단백질을 면역염색한 사진이다.

Claims

폴리이미드로 제조된 도관으로서, 도관의 내부 표면에 콜라겐 및 신경성장인자 (NGF)가 건조 코팅된 신경도관.
삭제
제1항에 있어서, 상기 신경도관이 100 mm²의 도관 크기 당 1 내지 1000개의 공극을 가지며, 상기 공극은 1 내지 500 μm의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 신경도관.
제1항에 있어서, 상기 콜라겐이 100 mm²의 도관 크기 당 0.1 내지 1000 ng의 양으로 코팅되는 것을 특징으로 하는 신경도관.
제1항에 있어서, 상기 신경성장인자가 100 mm²의 도관 크기 당 10 내지 1000 ng의 양으로 코팅되는 것을 특징으로 하는 신경도관.
제1항에 있어서, 상기 신경도관이 콜라겐 및 신경성장인자가 순서대로 코팅된 것을 특징으로 하는 신경도관.
제1항에 있어서, 상기 신경도관이 전기자극장치를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 신경도관.
제1항에 있어서, 상기 신경도관이 그의 사용전에 세포와 함께 배양되는 것을 특징으로 하는 신경도관.
제8항에 있어서, 상기 세포가 PC12 신경세포인 것을 특징으로 하는 신경도관.