KR101126408B1

KR101126408B1 - 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스의 ｆａｐ로 미성숙 수지상 세포를 성숙화 유도 및 1형 면역 반응을 유도하는 방법

Info

Publication number: KR101126408B1
Application number: KR1020090029993A
Authority: KR
Inventors: 박영민; 이준식; 신성재
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2009-04-07
Filing date: 2009-04-07
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2029-04-07
Also published as: KR20100111523A

Abstract

본 발명은 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP(Fibronectin Attachment protein)로 미성숙 수지상 세포를 성숙화 유도하고, 1형 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP으로 성숙화 유도된 수지상 세포에 의한 T 세포의 활성화 방법에 관한 것이다.

마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)

Description

마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스의 ＦＡＰ로 미성숙 수지상 세포를 성숙화 유도 및 1형 면역 반응을 유도하는 방법{METHOD OF MATURATION OF DENDRITIC CELL BY MYCOBACTERIUM AVIUM PARATUBERCULOSIS FAP AND METHOD OF INDUCING Th1 IMMUNE RESPONSE}

본 발명은 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP(Fibronectin Attachment Protein, 이하 FAP 라 한다)로 미성숙 수지상 세포를 성숙화 유도하고, 1형 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP으로 성숙화 유도된 수지상 세포에 의한 T 세포의 활성화 방법에 관한 것이다.

수지상 세포(DC)는, 나이브 및 면역기억 T 세포 모두를 활성화할 수 있는 것으로 간주되는, 면역계의 전문적인 항원 제공 세포이다. 수지상 세포는 면역요법, 특히 암의 면역요법에 사용하기 위하여 점차 생체외에서 제조되고 있다. 이들 세포 배양을 위한 각종 프로토콜이 기재되어 있고, 최근의 프로토콜은 무혈청 배지의 사용, 및 배양된 세포에 목적하는 면역자극 특성을 부여하는 성숙한 조건의 사용을 포함한다.

수지상 세포의 성숙화는 표현형이 피부 랑게르한스 세포와 유사한 미숙 DC를 림프절로 이동시킬 수 있는 성숙한 항원 제공 세포로 전환시키는 과정이다. 이러한 과정에 의해, 미숙한 수지상 세포를 특징짓는 강력한 항원 섭취 능력이 상실되고, 또한 공동-자극 세포 표면 분자 및 각종 사이토킨의 발현이 상향-조절된다. 공지된 성숙화 프로토콜은 DC가 항원에 노출되는 동안 또는 노출 후 생체내 환경을 기초로 한다. 이러한 접근법의 가장 좋은 예로는 세포 배양 배지로서 단핵구 조건 배지(MCM: Monocyte Conditioned Media)의 사용이 있다. MCM은 단핵구를 배양함으로써 시험관내에서 생성되며, 성숙화 인자의 공급원으로서 사용된다. MCM에서 성숙화에 관여하는 주요 성분은 (원)염증성 사이토킨 인터루킨 1 β(IL-1β), 인터루킨 12(IL-12) 및 종양 괴사 인자α(TNFα)인 것으로 보고되었다. 기타 성숙화 인자로는 프로스타글란딘 E2(PGE2), 폴리-dIdC, 혈관작용성 소장 펩타이드(VIP), 세균성 지다당류(LPS) 뿐만 아니라 미코박테리아 또는 미코박테리아 성분, 예를 들면 특정 세포벽 성분이 포함된다.

완전히 성숙한 수지상 세포는 미숙한 DC와는 정성적 및 정량적으로 상이하다. 완전히 성숙한 DC는 고수준의 MHC I형 및 II형 항원, 및 고수준의 T 세포 공동자극성 분자, 즉 CD80 및 CD86을 발현시킨다. 이들 변화는 수지상 세포의 T 세포 활성화 능력을 증가시키는데, 이는 이들이 세포 표면 상의 항원 밀도를 증가시킬 뿐만 아니라, 예를 들어 CD28과 같은 T 세포상의 공동자극성 분자의 대응물을 통한 T 세포 활성화의 양을 증가시키기 때문이다. 추가로, 성숙한 DC는 다량의 사이토킨을 생성하며, 이 사이토킨은 T 세포 반응을 자극하고 유도한다. 이들 사이토킨중 2가지는 인터루킨 10(IL-10) 및 인터루킨 (IL-12)이다. 이들 사이토킨은 유도된 T 세포 반응의 방향에 대해 정반대의 효과를 갖는다. IL-10이 생성되면 Th-2형 반응이 유도되는 반면, IL-12가 생성되면 Th-1형 반응이 유도된다. 후자의 반응이 세포 면역 반응이 요구되는 경우, 예를 들면 암 면역요법에서 특히 바람직하다. Th-1형 반응에 의해 세포 면역계의 작동인자 공격수단인 세포독성 T 림프구(CTL)가 유도 및 분극화된다. 이러한 작동인자 공격수단은 종양 성장을 억제하는 데 가장 효과적이다. IL-12는 또한 천연 킬러(NK) 세포의 성장을 유도하고, 항-혈관신생 활성을 갖고, 이는 모두 효과적인 항-종양 공격수단이다. 따라서, IL-12를 생성하는 수지상 세포의 사용은 면역자극에 사용하는데 이론상 최적으로 적합하다.

특정 수지상 세포 성숙화제, 예를 들면 세균성 지다당류, 세균성 CpG DNA, 이본쇄 RNA 및 CD40 리간드는 미숙한 DC를 유도하여 IL-12를 생성하고, Th-1 반응을 위해 미숙한 DC를 프라이밍하는 것으로 보고되었다. 대조적으로, 항-염증성 분자, 예를 들면 IL-10, TGF-β, PGE-2 및 코르티코스테로이드는 IL-12 생성을 억제하고, Th-2 반응을 위해 세포를 프라이밍할 수 있다.

마이코박테리움(Mycobacterium) 속(屬)에는 결핵, 우형결핵(牛形結核), 나병(癩病)과 같이 사람과 동물에 심각한 질병을 일으키는 균종(species)뿐 아니라, 기회감염균으로 일컬어지는 균종, 그리고 자연환경에서 볼 수 있는 사물(死物)기생의 균종(saprophytic species) 등 현재까지 약 72 종(species)이 알려져 있으며, 그 중 인체질환과 관련된 것이 25종에 이르는 것으로 알려져 있다.

마이코박테리아 감염증 가운데 가장 많은 질병은 결핵(Tuberculosis)으로, 강한 병원성을 갖는 결핵균군(群)(M. tuberculosis complex: TB complex)으로 구분되는 M. tuberculosis, M. bovis, M.africanum, M. microti의 4종이 원인균이며, 이 중 결핵균(M. tuberculosis)이 가장 흔하고 중요한 원인균으로 알려져 있다. 결핵은 국내에서 아직까지도 중요시되는 질환이며, 전세계적으로는 해마다 약 8백만의 새로운 환자가 발생하는 것으로 보고되고 있다.

피브로넥틴 결합 단백질은 M.avium 의 발명과정에서 중요한 역할을 하는 몇몇의 마이코박테리아로부터 생성되는 FN-결합 단백질 중의 하나로서, 재조합 FAP 를 인간 호흡기에 투여했을 때, M-avium 이 에피테랄 영역에 결합하는 것을 저해한다는 것이 알려져 있다.

본 발명은 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP로 미성숙 수지상 세포를 성숙화 유도하고, 1형 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP으로 성숙화 유도된 수지상 세포에 의한 T 세포의 활성화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 미숙한 수지상 세포를 제공하는 단계; 및 미숙한 수지상 세포에 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP를 접촉시켜 성숙한 수지상 세포 집단을 형성시키는 단계를 포함하는, 1형 면역 반응을 일으키는 성숙한 수지상 세포 집단을 생성하는 방법을 제공한다. 상기 성숙한 수지상 세포 집단을 생성하는 방법은 단구성 수지상 세포 전구체를 분리하는 단계; 및 분화제의 존재하에 전구체를 배양하여 미숙한 수지상 세포를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 분화제가 GM-CSF, 인터루킨 4, GM-CSF와 인터루킨 4의 배합물이 포함된다. 상기 방법에 의해 제조된 성숙 수지상 세포는 CD80, CD86, MHC-클래스 I, II 에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내며, IL-10 에 비해 IL-12 를 보다 많이 생성한다. FAP 처리 농도는 1 ~ 200 ug/ml 인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 미숙한 수지상 세포를 제공하는 단계; 미숙한 수지상 세포를 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP 와 접촉시켜 성숙한 수지상 세포를 형성하는 단계; 및 상기 성숙한 수지상 세포를 나이브 T 세포와 접 촉시켜 IFNγ를 생성시키는 활성화된 T 세포를 형성하는 단계를 포함하는, T 세포를 생성시키는 방법을 제공한다. 상기 T 세포를 생성시키는 방법은 단구성 수지상 세포 전구체를 분리하는 단계; 및 분화제의 존재하에 전구체를 배양하여 미숙한 수지상 세포를 형성시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 분화제가 GM-CSF, 인터루킨 4, GM-CSF와 인터루킨 4의 배합물이 포함된다. 상기 방법에 의해 제조된 성숙 수지상 세포는 CD80, CD86, MHC-클래스 I, II 에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내며, IL-10 에 비해 IL-12 를 보다 많이 생성한다. 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP의 처리 농도는 1 ~ 200 ug/ml 인 것이 바람직하다.

이하에서는 본원 발명을 상세히 설명한다.

미숙한 수지상 세포는 성숙되어 성숙한 수지상 세포를 형성한다. 성숙한 DC는 항원을 포획하고 동시 자극하는 세포 표면 분자 및 각종 사이토킨의 상향-조절된 발현을 나타내는 능력을 상실한다. 특히, 성숙한 DC는 MHC I형 및 Ⅱ형 항원을 미숙한 수지상 세포보다 더 높은 수준으로 발현시키고, 성숙한 수지상 세포는 일반적으로 CD80+,CD83+, CD86+ 및 CD14-인 것으로 확인된다. 더 많은 MHC 발현으로 DC 표면상에서 항원 밀도의 증가를 유도하는 반면, 동시-자극의 분자 CD80 및 CD86의 상향 조절로, T 세포상에 CD28과 같은 동시-자극의 분자 상응물을 통해서 T 세포 활성 시그날을 강화한다.

본 발명의 성숙한 수지상 세포는 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP와 접촉시킴으로써 제조할 수 있다(즉, 성숙시킨다). 유효량의 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP는 전형적으로 조직 배양 배지의 1㎖당 약 1 ~ 200 ug의 범위이다.

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수지상 세포의 성숙은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 모니터할 수 있다. 세포 표면 마커를 유세포 분석기(flow cytometry) 및 면역조직화학법 등과 같은 당해 기술분야에 친숙한 검정으로 검출할 수 있다. 상기 세포를 또한 사이토킨 생성(예, ELISA, FACS 및 다른 면역 검정에 의해서)에 대하여 모니터할 수 있다.

본 발명의 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP는 미성숙 수지상 세포를 성숙화 유도하고, 1형 면역 반응을 유도한다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP 로 성숙화 유도된 수지상 세포는 T 세포를 활성화시키는 효과를 나타내었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실험방법

마우스 및 시약

8 또는 12주된 수컷 C57BL/6 쥐(H-2Kb 와 I-Ab), BALB/c 쥐((H-2Kd 와 I-Ad)는 한국화학연구원(the Korean Institute of Chemistry Technology)로부터 구매되었다. 이 모든 생쥐주가 특정 병원체 무(無) 조건에서 실험전 적어도 1주간 사육되었다. .

재조합 마우스 GM-CSF(rm GMCSF), rmIL-4 를 R&D 시스템즈사(Abington, OX, UK)로부터 구입하였다. D-pinitol, dextran-FITC, 및 LPS(리포폴리사카라이드)를 시그마-알드리치사(St Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

배지는 10 ％ FBS(GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, USA), 50μM의 2-머캅토에탄올(Life technologies,Gaithersburg, MD, USA), 50 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 50 U/㎖의 페니실린, 및 25 ㎍/㎖의 암포테리신 B(GIBCO Laboratories; Grand Island, NY, USA)가 첨가된 OptiMEM(Invitrogen Life Technologies)을 사용 하였다.

면역형광염색을 위해서, PE-콘쥬게이트된 항-마우스 CD11c 및 CD25 항체와 FITC-콘쥬게이트된 항-마우스 MHC 클래스 II, CD80, CD86, CD40, CD54, CD14, 및 CD3 항체를 BD Pharmingen(San Diego, CA, USA)으로부터 구입하였다. FITC-콘쥬게이트된 항-마우스 Foxp3 항체를 eBioscience (San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다.

<제조예 1> 수지상 세포의 생성 및 배양

수지상 세포는 C57BL/6 마우스의 대퇴부 골수로부터 표준 프로토콜에 따라 제조했다. 적혈구 용해 후 골수 세포를, 10% 태내 송아지 혈청이 보충된 RPMI 1640에서, 100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, USA)를 사용하여 5%의 CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 배양하였으며, 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 20 ng/㎖ GM-CSF(R&D Systems, Minneapolis, USA)와 20 ng/㎖의 인터루킨-4(R&D Systems, Minneapolis, USA)를 6일 동안 함께 배양하였다.

<제조예 2> Mycobacterium paratuberculosis JTC303 염색체 DNA의 분리 및 형질전환체 제조, 형질전환체로부터 FAP 의 분리

유전자 조작방법은 주로 분자 클로닝 실험조작법(Molecular Cloning; ALaboratory Manual, 2nd,. J.Sambrook, E. F., Fritch, T., Maniatis) 및 분자 클로닝 기술의 지표(Guide to Molecular Cloning Techniques), Methods inEnzymology(vol. 152, S. L., Berger, A.R., Kimme)등의 방법에 준하여 실시하였다.

Mycobacterium paratuberculosis JTC303 을 10%(v/v) oleic acid-albumin- dextros e-catalase와 2 ug/ml 의 mycobactin J 가 추가된 7H9 변형미디엄에서 배양했다. FAP 를 코딩하는 DNA 가 상기 배양된 Mycobacterium paratuberculosis JTC303 로부터 분리되어 PCR 처리 후 pET-22b(+) 벡터에 접합되었다. 이와 같이 제조된 벡터는 Escherichia coli BL21(DE3)를 형질전환시켰다.

형질전화된 Escherichia coli BL21(DE3) 에서의 FAP 는 isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside 로 발현 유도 되었으며, 발현된 수용성 FAP는 sonication 으로 세포를 파괴한 후 추출되었다.

FN 단편 카르복시 말단에 있는 헥사히스티딘 태그를 이용하고, 제조업자의 설명서에 따라(Qiagen), Ni-NTA 크로마토그래피(IMAC)법으로 재조합 FAP 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 로 정제한 결과 정제된 단백질은 도 1에서 보는 바와 같이 35kDa 분자량을 나타내었다.

또한 FAP의 첨가량을 400 ug/ml 까지 변화시켜가면서 추가하여 사세포(死細胞)를 PI(Propidium Iodide)로 검출하였다. 도 2에서 보는 바와 같이 FAP 가 400 ug/ml까지는 세포 독성을 나타내지 않았다.

<실시예 1> FAP의 수지상 세포의 성숙 유도

상기 제조예 2에서 제조한 FAP의 수지상 세포에 대한 영향을 조사하기 위해, 수지상 세포의 표면 인자의 발현, 수지상 세포의 싸이토카인의 분석, 수지상 세포의 T 세포의 증식능과 T 세포로부터 IL-2 등의 싸이토카인의 생산 등에 대해 조사하였다.

<실시예 1-1> 수지상 세포의 세포 표면 인자에 미치는 영향

제조예 1과 같은 방법으로 수지상세포를 준비하였다. FAP 를 배양액에 추가하고 24시간의 배양이 끝난 후 세포를 수거한 후, PE(R-Phycoerythrin)-CD80, PE-CD86, PE-MHC I, II 등의 항체로 염색한 후 유세포분석기(flow cytometer)를 이용하여 분석하였으며 Mean Fluorescence Intensity(MFI)로 결과를 표현하였다. MFI 수치가 높을수록 표면인자의 발현이 강함을 의미하며, 또한 수지상세포의 성 숙(maturation)도가 증가함을 의미한다. 미디엄만을 사용한 경우와 LPS 를 추가한 경우를 대조군으로 하였다.

CD11c는 수지상세포에서 선택적으로 발현되는 표면인자이며, CD80, CD86, MHC I, II 등은 수지상세포가 성숙할수록 많이 발현되는 표면인자이다. 도 3 에서 알 수 있듯이, CD80의 발현도는 미디엄만을 사용한 경우 144이었으며, LPS 처리군에서는 400로 증가하였으며, FAP 를 처리한 군에서는 농도에 따라서 344, 398로 강하게 증가하였다. CD86의 발현도는 미디엄만을 사용한 경우 366이었으며, LPS 처리군에서는 1031로 증가하였으며, FAP 를 처리한 군에서는 농도에 따라서 639, 804로 강하게 증가하였다. CD40의 발현도는 미디엄만을 사용한 경우 40이었으며, LPS 처리군에서는 190로 증가하였으며, FAP 를 처리한 군에서는 농도에 따라서 127, 138로 강하게 증가하였다.

MHC-I의 발현도는 미디엄만을 사용한 경우 31이었으며, LPS 처리군에서는 104로 증가하였으며, FAP 를 처리한 군에서는 농도에 따라서 73, 82로 강하게 증가하였다. MHC-II의 발현도는 미디엄만을 사용한 경우 162이었으며, LPS 처리군에서는 319로 증가하였으며, FAP 를 처리한 군에서는 농도에 따라서 315, 328로 강하게 증가하였다.

<실시예 1-2> 수지상 세포의 항원취득(antigen uptake)에 미치는 영향

미성숙 수지상세포는 항원취득을 잘하지만, 성숙한 수지상세포는 항원취득 능력이 감소한다고 알려져 있다. 데옥시포도필로톡신이 수지상세포의 성숙도를 증가시켰다면 항원취득 능력이 감소할 것으로 예상되며, 이를 증명하기 위한 실험을 수행하였다.

제조예 1와 같은 방법으로 수지상 세포를 준비하고, 제조예 2에서 제조된 FAP를 100, 200 ug/ml 각각 추가하였다. 총 24시간의 배양이 끝난 후 세포를 수거한 후, dextran-FITC 이라는 항원을 0.7mg/㎖의 농도로 세포에 2시간 동안 처리하였다. 세포를 세척하여 여분의 FITC-dextran을 완전히 제거한 후 수지상세포 내부에 유입된 항원의 양을 유세포분석기를 이용하여 측정하였다. 수지상세포에 선택적으로 결합하는 CD11c-PE 항체를 이용하여 2중 염색을 시도하였으며, 이는 수지상세포를 선택적으로 분리분석한 후 항원취득도를 분석하기 위함이었다.

도 4와 같이 37℃에서 2시간 동안 배양할 때 미성숙 수지상 세포(대조군)의 항원취득도는 33.2% 이었으며, 리포폴리사카라이드(LPS)가 처리된 수지상 세포의 항원취득도는 20.5%로 감소하였으며, FAP로 처리된 수지상 세포의 항원취득도는 농도에 따라서 21.2, 19.4 로 감소하였다. 4℃에서 2시간 동안 배양할 때 미성숙 수지상 세포(대조군)의 항원취득도는 5.0% 이었으며, 리포폴리사카라이드(LPS)가 처리된 수지상 세포의 항원취득도는 6.7% 이었고, FAP로 처리된 수지상 세포의 항원취득도는 농도에 따라서 3.6, 5.4 로 감소하였다. 이는 LPS 및 데옥시포도필로톡신 처리에 의해 수지상세포의 성숙도가 증가하였음을 의미한다.

< 실시예 1-3> 수지상세포의 사이토카인 생성에 미치는 영향

성숙한 수지상세포의 중요한 특성은 사이토카인의 분비이다. 특히 IL-12의 분비는 암세포를 직접적으로 죽일 수 있는 세포 독성 T 세포의 활성화에 매우 중요하다고 알려져 있다.

제조예 1과 같은 방법으로 수지상세포를 준비하였다. 총 24 시간의 배양후에 세포배양을 분리하여 수지상세포에서 분비된 사이토카인의 양을 enzyme-linked immunoassay 방법으로 측정하였다. 실험재료는 R & D Systems로부터 구입하였으며, 회사에서 제공하는 시험법에 준하여 실험을 수행하였다. 간단하게는, 사이토킨에 특이적인 항체(예: IL-12 또는 IL-10)를 사용하여 고체 표면상의 사이토킨을 포획하였다. 이어서, 고체 표면을 2차로 처리하고, 사이토킨에 대한 항체를 표지화하여 포획된 사이토킨의 존재를 검출한다. 2차 항체는 전형적으로 효소로 표지화되어 열량측정 검정에 의한 검출이 용이하다.

도 5과 같이 미성숙 수지상세포(미디엄)는 IL-12 의 사이토 카인을 생성하지 못하였지만, LPS 및 FAP를 처리한 수지상세포에서는 IL-12 의 사이토카인 생성이 강하게 증가하였다. 이는 FAP 처리에 의해 수지상세포가 성숙하였으며, 이에 따라서 사이토카인 분비가 증가하였음을 의미한다. 도 5과 같이 미성숙 수지상세포(미디엄), LPS 및 FAP을 처리한 모든 수지상세포에서 일반적으로 면역을 억제시키거나 혹은 보조 T세포인 Th2 활성을 증가시키는 것과 관련된 IL-10 등의 사이토 카인을 생성하지 못하였다.

수지상 세포에 의해 생산되는 사이토카인 중 IL-12는 대표적인 Th1형 사이토카인이며, IL-10은 활성화된 단핵구, NK 세포 및 Th1 세포에 의해 생산되는 사이토카인(IL-12 포함)의 활성을 블록하는 것으로 알려져 있다. FAP는 유도된 수지상 세포로부터의 IL-10 생산을 억제하지만, IL-12 생산은 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 FAP가 수지상 세포를 Th1형 세포로 편향할 수 있는 가능성을 나타낸다.

< 실시예 1- 4> 수지상세포의 신호전달계에 미치는 영향

수지상세포는 성숙과정 중에 ERK, JNK, p38 등의 MAPK(mitogen-activated protein kinases)가 활성화된다고 알려져 있다.

제조예 1과 같은 방법으로 미성숙 수지상 세포를 만든 후 LPS와 FAP를 15분, 30분, 45분간 처리하였으며, 세포를 파괴하여 단백질을 모두 분리하였다. 인산화되어 있는 ERK, JNK, p65의 단백질양은 특정항체를 이용하는 웨스턴 블랏팅 방법으로 측정하였다. 도 6과 같이 인산화되어 있는 p-ERK, p-JNK, p-p65의 양이 LPS 및 FAP 처리에 의해 증가하였다.

수지상세포는 성숙하는 도중에 NF-κB(nuclear factor-kappa B)가 활성화된 다고 알려져 있다.

제조예와 같은 방법으로 미성숙 수지상세포를 만든 후 LPS와 FAP를 30분간 처리하였으며, 세포의 핵을 분리한 후 파괴하여 단백질을 모두 분리하였다. 핵내의 NF-κB의 양은 electromobility shift assay를 이용하여 NF-κB p65의 양을 측정하였다. 도 6과 같이 핵내의 NF-kB의 양이 증가함을 알 수 있었다.

또한, 수지상 세포는 성숙 과정중에 toll-like receptor가 활성화된다고 알려져 있다. TLR은 p40을 포함한 싸이토카인의 발현을 유도하는 물질로 알려져 있으며 주로 항원제시 세포에서 발현이 되며 바이러스나 박테리아 등의 병원균 침입시에 병원균 고유의 대사물질을 인지하는 역할을 한다. 제조예 1과 같은 방법으로 미성숙 수지상세포를 만든 후 LPS와 FAP를 30분간 처리하였으며, 세포의 RNA를 분리한 후 quantitative real time PCR 을 통해서 toll-like receptor 4 의 발현 정도를 측정했다. 도 7에서 보는 바와 같이 toll-like receptor 중 toll-like receptor 4의 경우 FAP의 처리양에 따라 발현양이 증가하였다.

< 실시예 2> FAP 로 성숙 유도된 수지상 세포의 효능 - T-세포 활성 자극

성숙 수지상 세포의 생체내에서의 가장 중요한 특징은 T 림프구의 활성을 유도하는 것이다. 본 실시예는 FAP로 유도된 수지상 세포가 항원 특이적 세포독성 T 임파구(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL) 반응을 강화하고 종양을 처리하는데 효과적이 라는 것을 밝히기 위함이다. 활성화 되어진 T 림프구는 증식 속도가 증가하며 인터페론 감마의 분비가 증가되어 주변의 다른 T 림프구의 활성을 돕고 면역 작용을 활발하게 일으켜 항원을 제거한다.

BALB/c 마우스 비장으로부터 분리된 CD4+ 세포를 C57BL/6 로부터 유래된 FAP 처리 수지상 세포와 함께 배양한 후 T 세포의 증식 정도를 측정하였다. 도 8 에서 보는 바와 같이 FAP으로 처리한 경우 T 세포의 증식 정도가 높았다.

또한, CD4+ 세포를 FAP 처리된 수지상 세포로 자극한 경우와 LPS로 처리된 수지상 세포로 자극한 경우 각각을 ELISA 분석법에 의해 IL-4, IFN-r 의 발현양을 측정하였다. 도 8 에서 보는 바와 같이 IFN-r 의 발현양은 증가하였으나, IL-4의 발현양은 거의 변화가 없었다.

도 1은 본 발명은 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP의 SDS-PAGE 사진이다.

도 2는 본 발명은 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP의 세포 독성을 측정한 것을 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명은 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP 또는 LPS로 성숙화된 성숙 수지상 세포의 특이적인 단백질 표면인자의 발현을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명은 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP 또는 LPS로 성숙화된 성숙 수지상 세포의 항원 포식 능력을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명은 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP 또는 LPS로 성숙화된 성숙 수지상 세포의 사이토카인의 분비 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명은 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP 또는 LPS로 성숙화된 성숙 수지상 세포의 신호전달계의 변화를 나타내고 있다.

도 7은 본 발명은 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP 또는 LPS로 성숙화된 성숙 수지상 세포의 TLR4 생성 정도를 나타내고 있다.

도 8은 본 발명은 재조합 방법으로 제조된 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP 또는 LPS로 성숙화된 성숙 수지상 세포의 T 세포 자극 효과를 나타내고 있다.

Claims

미숙한 수지상 세포를 제공하는 단계; 및

미숙한 수지상 세포에 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP (Fibronectin Attachment Protein)를 접촉시켜 성숙한 수지상 세포 집단을 형성시키는 단계를 포함하는, Th 1형 면역 반응을 일으키는 성숙한 수지상 세포 집단을 생성하는 방법.
제1항에 있어서,

단구성 수지상 세포 전구체를 분리하는 단계; 및

분화제의 존재하에 전구체를 배양하여 미숙한 수지상 세포를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제2항에 있어서,

분화제가 GM-CSF, 인터루킨 4, 또는 GM-CSF와 인터루킨 4의 배합물인 방법.
제 1항에 있어서

상기 성숙 수지상 세포는 CD80, CD86, MHC-클래스 I, II 에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

상기 FAP의 처리 농도는 1 ~ 200 ug/ml 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

상기 성숙한 수지상 세포 집단은 IL-10 에 비해 IL-12 를 보다 많이 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
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미숙한 수지상 세포를 제공하는 단계;

미숙한 수지상 세포를 마이코박테리움 아비움 종 파라투버클로시스(Mycobacterium avium subspecies paratuberclosis)의 FAP (Fibronectin Attachment Protein)와 접촉시켜 성숙한 수지상 세포를 형성하는 단계; 및

상기 성숙한 수지상 세포를 나이브 T 세포와 접촉시켜 IFNγ를 생성시키는 활성화된 T 세포를 형성하는 단계를 포함하는, T 세포를 생성시키는 방법.
제8항에 있어서,

단구성 수지상 세포 전구체를 분리하는 단계; 및

분화제의 존재하에 전구체를 배양하여 미숙한 수지상 세포를 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제8항에 있어서,

분화제가 GM-CSF, 인터루킨 4, 또는 GM-CSF와 인터루킨 4의 배합물인 방법.
제 8항에 있어서

상기 성숙 수지상 세포는 CD80, CD86, MHC-클래스 I, II 에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서,

상기 FAP 처리 농도는 1 ~ 200 ug/ml 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서,

상기 성숙한 수지상 세포 집단은 IL-10 에 비해 IL-12 를 보다 많이 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
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