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KR101125212B1 - 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템 - Google Patents

아벨리노 각막이상증 진단용 시스템 Download PDF

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KR101125212B1
KR101125212B1 KR1020100096103A KR20100096103A KR101125212B1 KR 101125212 B1 KR101125212 B1 KR 101125212B1 KR 1020100096103 A KR1020100096103 A KR 1020100096103A KR 20100096103 A KR20100096103 A KR 20100096103A KR 101125212 B1 KR101125212 B1 KR 101125212B1
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KR
South Korea
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pcr amplification
exon
amplification value
tgfbi gene
sample
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Active
Application number
KR1020100096103A
Other languages
English (en)
Inventor
이진
윤정국
Original Assignee
(주)아벨리노
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Publication date
Application filed by (주)아벨리노 filed Critical (주)아벨리노
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Priority to JP2013531500A priority patent/JP6071884B2/ja
Priority to CN201180056997.7A priority patent/CN103313648B/zh
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Abstract

본 발명은 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 입력된 제1 PCR 증폭값 및 제2 PCR 증폭값의 비를 이용하여 정상 및 아벨리노 각막이상증을 판별하는 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템은 의사의 숙련도에 영향을 받지 않으면서, 좀더 간단하고 정확한 진단이 가능하게 한다. 특히, 전체 공정이 시스템화되어 체계적이어서 진단이 정확화되고, 다수 검사 대상자도 용이하게 관리할 수 있는 바 유용하다.

Description

아벨리노 각막이상증 진단용 시스템{System for Diagnosis of Avellino Corneal Dystrophy}
본 발명은 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템에 관한 것으로, 보다 상세하게는 입력된 제1 PCR 증폭값 및 제2 PCR 증폭값의 비를 이용하여 정상 및 아벨리노 각막이상증을 판별하는 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템에 관한 것이다.
각막이상증(corneal dystrophy)은 각막 중심에 혼탁이 발생하여 나이가 듦에 따라 점차 혼탁이 많아져서 시력이 감소하는 상염색체 우성 유전질환으로, 아벨리노각막이상증(Avellino corneal dystrophy), 과립형각막이영양증(Granularcorneal dystrophy), 라티스 타입 I 각막이영양증(lattice type I corneal dystrophy) 및 레이스버클러스 I 각막이영양증(Reis-bucklers corneal dystrophy) 등이 있으며, βIG-H3 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이에 의하여 발생한다.
이 중 아벨리노각막이상증 환자는 연령이 증가함에 따라 이형접합체(heterozygote)는 시력의 상당한 손실을 보이고, 동형접합체(homozygote)의 경우에는 6세부터 실명한다.　아벨리노각막이상증은 기존에 과립형 각막이영양증으로 통칭되었던 질환이나 유전자 차이가 발견되어 1988년 분리되어 새로이 명명된 질환으로, 전세계적으로 가장 흔한 각막 이상증으로 알려져 있으며 유전자 검사결과 국내에 1/340~1/1,000 사이의 유병율(heterozygote의 경우)로 상당히 흔한 질환이다 (Holland, E.J. et al., Ophthalmology, 99:1564, 1992; Kennedy, S.M. et al., Br. J. Ophthalmol., 80:489, 1996;Dolmetsch, A.M. et al., Can. J. Ophthalmol., 31:29, 1996; Afshari, N.A. et al., Arch. Ophthalmol., 119:16, 2001;Stewart, H.S. Hum. Mutat., 14:126, 1999).
본 발명자들은 이형접합체의 아벨리노각막이상증 환자가 라식수술을 받으면 약 2년 후부터 각막 혼탁이 급격히 증가하여 실명한다는 것을 발견하였다 (Jun, RM et al., Ophthalmolgy, 111:463, 2004). 이 전에는 라식 또는 엑시머 레이저 수술이 각막이영양증 환자의 혼탁을 없앨 것이라는 예측 하에 많은 시술이 이루어졌으며, 국내 그간 시술된 라식수술은 약 30만 건으로 추정되는바, 국내의 아벨리노각막이상증의 이형접합자의 빈도를 최소한 계산치인 1/1,000로 보더라도 300명이 시력을 상실하고 있다는 추측을 할 수 있다.　라식수술을 받은 환자는 주로 20~30대의 생산적인 활동을 하는 인구로서 이들의 실명은 사회적, 경제적으로 심각한 문제로 판단된다. 또한, 2000년 이후 라식수술의 시술허가가 공표된 미국의 경우 흑인들에서도 아벨리노각막이상증 환자의 라식수술에 의한 실명이 발견되기 시작하였으며, 전세계적으로 많은 환자가 시술받은 후 병이 진행되고 있음을 추측할 수 있다.
따라서, 라식수술의 시술 전에 아벨리노각막이상증 환자에 대한 정확한 진단을 수행하여, 라식수술에 의한 증상 진행을 방지하여야 하나, 기존의 안과에서는 안과의사가 현미경으로 안구 혼탁을 검사하는 것만으로 아벨리노각막이상증을 진단하고 있어, 증상이 진행되지 않은 환자의 경우는 발견하지 못하고, 라식수술을 시행하여 실명으로 발전하는 경우도 종종 발생하고 있으며, 정확하고 신속한 각막이영양증의 진단방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
아울러, 기존 검사는 의사의 숙련도도 및 환자의 상태와 같은 개인차에 따라 검사 결과가 달라지는 경우가 있어, 신뢰도와 정확성이 좀더 높은 진단방법의 개발이 요청되었다.
이에, 본 발명자들은 안과의 시력교정 수술 전에 정확하게 진단되어야 할 아벨리노증을 포함하는 각막이상증을 진단하기 위한 새로운 시스템을 제공하고자 예의 노력한 결과, 시료의 DNA에 TGFBI 유전자(Transforming growth factor b-induced gene)의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하고 있지 않은 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 첨가하여 측정한 제1 PCR 증폭값과 시료 DNA에 TGFBI 유전자의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하는 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 첨가하여 측정한 제2 PCR 증폭값을 비교하여, 상기 제1 PCR 증폭값이 제2 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 정상이고, 제1 PCR 증폭값과 제2 PCR 증폭값의 비율이 1:1.5~1.5:1인 경우 아벨리노 각막이상증 이형접합자이며, 제2 PCR 증폭값이 제1 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 아벨리노 각막이상증 동형접합자임을 확인한 다음, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 의사의 숙련도에 영향을 받지 않으면서, 좀더 간단하고 정확한 진단이 가능한 아벨리노각막이상증 진단을 위한 새로운 진단시스템을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템을 제공한다:
(a) 네트워크를 통해 시료에 대한 정보 및 검사의뢰서를 입력수단을 포함하는 서버로 전송하여 진단서비스를 요청하고, 상기 요청에 응답하여 출력수단을 포함하는 서버로부터 전달되는 아벨리노 각막이상증 판별결과 데이터를 제공받아 저장하는 적어도 하나의 클라이언트로 된 클라이언트 그룹;
(b) 상기 시료에 대한 정보 및 상기 검사의뢰서와, 시료 DNA에 TGFBI 유전자(Transforming growth factor b-induced gene)의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하고 있지 않은 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 첨가하여 측정한 제1 PCR 증폭값 및 시료 DNA에 TGFBI 유전자의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하는 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 첨가하여 측정한 제2 PCR 증폭값을 입력받기 위한 입력수단;
(c) 상기 제1 PCR 증폭값이 제2 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 정상으로 판별하고, 제1 PCR 증폭값과 제2 PCR 증폭값의 비율이 1:1.5~1.5:1인 경우 아벨리노 각막이상증 이형접합자 (heterozygote)로 판별하고, 제2 PCR 증폭값이 제1 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 아벨리노 각막이상증 동형접합자 (homozygote)로 판별하는 분석수단; 및
(d) 상기 분석수단의 판별결과를 출력하기 위한 출력수단.
본 발명에 따른 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템은 의사의 숙련도에 영향을 받지 않으면서, 좀더 간단하고 정확한 진단이 가능한 아벨리노각막이상증 진단을 위한 새로운 진단시스템을 제공하는 장점이 있다. 특히, 전체 공정이 시스템화되어 체계적이어서 진단이 정확화되고, 다수 검사 대상자도 용이하게 관리할 수 있는 바 유용하다.
도 1은 PCR 증폭데이터를 이용한 아벨리노 각막이상증 진단방법의 전 과정을 도시한 도이다.
도 2는 시스템운영자의 서버에 표시되는 온라인 의뢰서 정보서이다.
도 3은 Raw Data를 이용한 DNA 농도 및 순도 계산 결과를 나타낸다.
도 4는 제1 PCR 증폭값과 제2 PCR 증폭값을 이용한 형질선별플롯 및 그 결과표를 나타낸다.
도 5는 의료기관용 유전자 분석결과보고서 예시화면이다.
도 6은 개인용 유전자 분석결과보고서 예시화면이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서, "아벨리노 각막이상증 (Avellino corneal dystrophy)"이란, 제2형 과립형각막이상증(Granular Corneal dystrophy type Ⅱ)라고도 하며, 양안 각막 중심부에 혼탁이 발생하는 질환으로 상염색체 우성유전을 하는 유전질환으로, TGFBI 유전자(Transforming growth factor b-induced gene)의 엑손 4 부위의 CGC 서열이 CAC로 돌연변이되어, BIGH3 단백질의 124번째 아미노산이 아르기닌에서 히스티딘으로 변이(R124H)된 유전자 이상에 의하여 나타나는 질환이다.
본원에서, "이형접합자 (heterozygote)"란, 부모로부터 물려받은 한쌍의 유전자 중 하나만, 돌연변이가 존재하는 경우로, "아벨리노 각막이상증 이형접합자"란 부모로부터 물려받은 한쌍의 TGFBI 유전자(Transforming growth factor b-induced gene) 중 하나만 돌연변이가 존재하는 경우를 말한다.
본원에서, "동형접합자 (homozygote)"란, 부모로부터 물려받은 한쌍의 유전자 모두에 돌연변이가 존재하는 경우로, "아벨리노 각막이상증 동형접합자"란 부모로부터 물려받은 한쌍의 TGFBI 유전자(Transforming growth factor b-induced gene) 모두에 돌연변이가 존재하는 경우를 말한다.
본원에서, "프로그램" 또는 "컴퓨터 프로그램"은 일반적으로 특정 프로그래밍 언어의 규칙에 부합하고 특정 기능, 임무 또는 문제를 해결하거나 실행하는데 필요한 "코드 세그먼트"로 나뉠 수 있는 선언 및 진술 또는 명령으로 구성되는 통사론적 단위를 의미한다. 프로그래밍 언어는 일반적으로 프로그램을 표현하기 위한 인공 언어이다.
본원에서, "시스템" 또는 "컴퓨터 시스템"은 일반적으로 하나 이상의 컴퓨터, 주변 장치 및 데이터 처리를 수행하는 소프트웨어를 의미한다. "시스템 운영자"는 일반적으로 데이터 처리 및 정보 교환을 위해 "시스템 운영자 장치"(예: 컴퓨터, 무선 장치 등)를 통해 접근되는 컴퓨터 네트워크를 이용하는 사람을 포함한다. "컴퓨터"는 일반적으로 사람의 개입 없이 수많은 산술 연산 및 논리 연산을 비롯한 실질적인 계산을 수행할 수 있는 기능적 단위이다.
본 발명은 일 관점에서, PCR 증폭데이터를 이용한 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템에 관한 것으로, 다음 수단을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 네트워크를 통해 시료에 대한 정보 및 검사의뢰서를 입력수단을 포함하는 서버로 전송하여 진단서비스를 요청하고, 상기 요청에 응답하여 출력수단을 포함하는 서버로부터 전달되는 아벨리노 각막이상증 판별결과 데이터를 제공받아 저장하는 적어도 하나의 클라이언트로 된 클라이언트 그룹;
(b) 상기 시료에 대한 정보 및 상기 검사의뢰서와, 시료 DNA에 TGFBI 유전자(Transforming growth factor b-induced gene)의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하고 있지 않은 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 첨가하여 측정한 제1 PCR 증폭값 및 시료 DNA에 TGFBI 유전자의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하는 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 첨가하여 측정한 제2 PCR 증폭값을 입력받기 위한 입력수단;
(c) 상기 제1 PCR 증폭값이 제2 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 정상으로 판별하고, 제1 PCR 증폭값과 제2 PCR 증폭값의 비율이 1:1.5~1.5:1인 경우 아벨리노 각막이상증 이형접합자 (heterozygote)로 판별하고, 제2 PCR 증폭값이 제1 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 아벨리노 각막이상증 동형접합자 (homozygote)로 판별하는 분석수단; 및
(d) 상기 분석수단의 판별결과를 출력하기 위한 출력수단.
도 1은 PCR 증폭데이터를 이용한 아벨리노 각막이상증 진단방법의 전 과정을 도시한 도면으로, 이하, 이를 참조하여 설명한다.
본 발명은, 바람직하게는, 네트워크를 통해 상기 시료에 대한 정보 및 검사의뢰서를 상기 입력수단을 포함하는 서버로 전송하여 진단서비스를 요청하고, 상기 요청에 응답하여 상기 출력수단을 포함하는 서버로부터 전달되는 아벨리노 각막이상증 판별결과 데이터를 제공받아 저장하는 적어도 하나의 클라이언트로 된 클라이언트 그룹을 추가로 포함할 수 있다.
상기 시료에 대한 정보로는 시료의 종류, 의뢰자명, 의뢰기관명, 채취일, 채취시간, 연락처 중 어느 하나 이상을 입력할 수 있고, 이때 상기 시료는 구강점막 세포, 혈액 및 모근 중 어느 하나를 이용할 수 있다. 아울러, 상기 검사의뢰서는 유전자 검사 동의서를 포함할 수 있다.
아울러, 상기 시료의 DNA의 260nm 에서의 흡광도 및 280nm에서의 흡광도가 데이터로서 입력될 수 있으며, 제1 연산수단은 상기 흡광도를 이용하여 시료 DNA의 농도 및 순도를 연산한다. 또한, 전체 시료의 개수와 대조군을 고려하여 프로브, 프라이머쌍 및 증류수의 양을 연산하는 제2 연산수단을 포함할 수 있다. 그리고, 상기 연산된 상기 시료 DNA의 농도 및 순도를 이용하여 시료 DNA의 양을 결정할 수 있다.
상기 프로브는 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하고 있지 않은 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브와 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하는 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 의미하며, 상기 프라이머쌍은 TGFBI 유전자의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 의미한다. 한편, PCR 수행을 위한 시약으로는 Taq 폴리머라제, dNTP, MgCl2, PCR 완충용액 등이 사용될 수 있다.
이때, 상기 TGFBI 유전자의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 TGFBI 유전자의 코돈 124 위치를 증폭할 수 있는 프라이머쌍으로서, 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍인 것을 특징으로 할 수 있다. 아울러, 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하고 있지 않은 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브는 코돈 124 위치가 "CGC"인 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브로서, 서열번호 3으로 표시되는 프로브인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하는 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브는 코돈 124 위치가 "CAC"인 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브로서, 서열번호 4로 표시되는 프로브인 것을 특징으로 할 수 있다.
TGFBI 유전자의 코돈 124 위치를 증폭하기 위한 프라이머쌍
서열번호 1: 5'-TCCACCACCACTCAGCTGTA-3'
서열번호 2: 5'-CCATCTCAGGCCTCAGCTT-3'
코돈 124위치가 " CGC "인 TGFBI 유전자를 식별하기 위한 프로브
서열번호 3: 5'-CACGGACCGCACGGA-3'
코돈 124 위치가 " CAC "인 TGFBI 유전자를 식별하기 위한 프로브
서열번호 4: 5'-CACGGACCACACGGA-3'
본 발명에 따른 아벨리노 각막이상증 진단용 시스템은 추가로 상기 연산된 프로브, 프라이머쌍 및 증류수의 양을 적용하여, 시료 DNA에 TGFBI 유전자(Transforming growth factor b-induced gene)의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하고 있지 않은 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 첨가하여 측정한 제1 PCR 증폭값과, 시료 DNA에 TGFBI 유전자의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하는 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 첨가하여 측정한 제2 PCR 증폭값을 출력하는 PCR 장비를 포함할 수 있다. 상기 PCR 장비는 리얼 타임 PCR 프로그램이 셋팅되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
이때, PCR 수행 시 바람직하게는 신속한 처리를 위하여 시료 DNA에 TGFBI 유전자의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하고 있지 않은 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브 및 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하는 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 동시 첨가하여 PCR을 수행하여 제1 PCR 증폭값 및 제2 PCR 증폭값을 동시에 얻을 수 있다.
상기 출력된 제1 PCR 증폭값 및 제2 PCR 증폭값은 입력수단으로 입력된 다음, 분석수단에서 제1 PCR 증폭값이 제2 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 정상으로 판별하고, 제1 PCR 증폭값과 제2 PCR 증폭값의 비율이 1:1.5~1.5:1인 경우 아벨리노 각막이상증 이형접합자 (heterozygote)로 판별하고, 제2 PCR 증폭값이 제1 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 아벨리노 각막이상증 동형접합자 (homozygote)로 판별되게 된다. 이때, 바람직하게는, 상기 제1 PCR 증폭값이 제2 PCR 증폭값의 7~8배인 경우 정상으로 판별하고, 제2 PCR 증폭값이 제1 PCR 증폭값의 7~8배인 경우 아벨리노 각막이상증 동형접합자 (homozygote)로 판별한다.
상기 제1 PCR 증폭값과 제2 PCR 증폭값을 각각 일축으로 한 2차원의 형질선별플롯을 제공하는 표시수단을 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 2차원 형질선별플롯은 제1 PCR 증폭값은 X축으로 하고, 제2 PCR 증폭값은 Y축으로 하여 나타낼 때, 플롯상에서 우측하단에 표시될 때 정상으로 판별하고, 이와 대칭되는 위치에 표시될 때 아벨리노 동형접합자로 판별한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
아벨리노 각막이상증의 진단예
1-1: 시료 정보 및 검사의뢰서의 입력
개인 클라이언트 또는 개인 클라이언트의 시료를 채취한 의료기관으로 구성되는 클라이언트 그룹은 시료에 대한 정보 및 검사의뢰서를 시스템 운영자의 서버로 전송한다.
이때, 시료에 대한 정보는 시료의 종류, 의뢰자명, 의뢰기관명, 채취일, 채취시간, 연락처 등을 입력하며, 채취된 형태에 따라 시료의 종류를 전혈, 구강상피, 모근 중 택일하였다. 아울러, 검사의뢰서 작성 전단계로서 유전자 검사 동의서의 작성을 포함한다.
이때, 시스템운영자의 서버에 표시되는 온라인 의뢰서 정보는 도 2와 같다.
1-2: 시료 DNA 의 농도 및 순도 연산
본 발명에 따른 아벨리노 각막이상증 진단 시스템은 시료 DNA의 농도 및 순도를 산출하기 위한 제1 연산수단을 포함한다.
시료의 DNA의 260nm 에서의 흡광도 및 280nm에서의 흡광도를 측정할 수 있는 Genios 기기 (TECAN, Austria)는 본 시스템에 연결될 수 있으며, 이때, 상기 기기와 연결된 시스템운영자의 장치(컴퓨터) 상에 XFluor4 (TECAN, Austria) 프로그램이 실행되어 흡광도가 측정되고, DNA의 농도와 순도가 연산되게 된다.
즉, 'XFluor4-> Edit -> Measurement parameter'에서 'Absorbance'를 선택한 다음, 'Meas.params'의 흡수파장은 260nm, 'Number of reads'는 2회 정도 지정한 다음 확인 버튼을 누른다. 그 다음, 'XFluor4 -> Start measurement' 누르면 260nm(흡광도)가 측정된다.
다시, 'XFluor4-> Edit -> Meas.params'에서 흡수파장은 280nm, 'Number of reads'는 2회 정도 지정한 다음 확인 버튼을 누른다. 그 다음, 'XFluor4 -> Start measurement' 누르면 280nm(흡광도)가 측정된다.
OD260=1 일 때 이중나선 DNA의 농도는 약 50ng/ul 에 해당하므로, 260nm 나온 값에 blank 값을 뺀 후 50을 곱하면 DNA 농도가 산출된다. 또한, 260nm 및 280nm에서 흡광도를 측정한 후, 양자의 비(OD260/OD280)로 DNA의 순도를 알 수 있는데, 일반적으로 OD260/OD280의 비가 1.8에서 2.0이면 순도가 좋은 것으로 판정한다.
도 3은 Raw Data를 이용한 DNA 농도 및 순도 계산 결과를 나타낸다.
1-3: PCR 증폭을 위한 시료, 프라이머쌍 , 증류수 등의 양 연산 및 PCR 증폭값의 출력
본 발명에 따른 아벨리노 각막이상증 진단 시스템은 PCR 증폭을 위한 시료 DNA의 양을 산출하기 위한 제2 연산수단 및 PCR 장비를 포함한다.
준비 전 샘플 개수와 대조군인 정상(Normal, NN), 아벨리노 각막이상증 이형접합자 (Heterozygote, HN), 아벨리노 각막이상증 동형접합자 (homozygote, HH), 음성대조군 (negative control, NTC)를 합산하고, 손실을 줄이기 위하여 0.2㎕를 더하여, 프로브, 프라이머쌍 및 증류수의 양을 연산하였다. 시료의 DNA의 양은 상기 연산된 시료 DNA의 농도 및 순도를 이용하여 결정하였다.
이때, 사용된 TGFBI 유전자의 엑손 4의 돌연변이 부위, 즉 코돈 124 위치를 증폭하기 위한 프라이머쌍과, 변이가 없는 정상 유전자 단편과 결합하는 프로브, 즉 코돈 124위치가 "CGC"인 TGFBI 유전자를 식별하기 위한 프로브 및 변이가 있는 유전자 단편과 결합하는 프로브, 즉 코돈 124위치가 "CAC"인 TGFBI 유전자를 식별하기 위한 프로브는 다음과 같다. 이때, 변이가 없는 정상 유전자 단편과 결합하는 프로브는 VIC로 표지하였고, 변이가 있는 유전자 단편가 결합하는 프로브는 FAM으로 표지하였으며, 상보적인 유전자 단편과의 결합이 용이하도록 MGB(minor groove binder)를 부착하였다.
TGFBI 유전자의 코돈 124 위치를 증폭하기 위한 프라이머쌍
서열번호 1: 5'-TCCACCACCACTCAGCTGTA-3'
서열번호 2: 5'-CCATCTCAGGCCTCAGCTT-3'
코돈 124위치가 " CGC "인 TGFBI 유전자를 식별하기 위한 프로브
서열번호 3: 5'-CACGGACCGCACGGA-3'
코돈 124 위치가 " CAC "인 TGFBI 유전자를 식별하기 위한 프로브
서열번호 4: 5'-CACGGACCACACGGA-3'
그 다음, PCR 장비 (Applied Biosystems사)에서 PCR 값을 얻기 위하여, 리얼 타임 PCR 프로그램을 실행한다. 즉, RT-PCR 기기 그림의 Step one software V2.0을 더블 클릭한 다음, 'Advanced setup'을 누르면 'Experiment Properties'라는 첫 번째 화면이 나온다. 그 다음, 'Step One™ Instrument (48wells), Genotyping'로 지정한다. 'Experiment Properties' 칸 아래를 보면 'Plate Setup'에서 'SNP Assay'를 'ACD probe'로 지정하고 48 well plate가 그려진 화면에 A열 1행에 ACD1, A열 2행에 ACD2와 같은 식으로 48 well을 모두 지정해준다. 'Run Method'에서 cycle 수를 36으로 바꿔준다.
PCR 반응을 위한 반응액의 프라이머 용량은 0.0625㎕가 되도록 하였으며, 프로브 용량은 5㎕이 되도록 하고, 증류수는 2.9375㎕가 되도록 하고, 시료 DNA는 2㎕가 되도록 하여 총 10㎕의 마스터믹스를 사용하였으며, Sepup에서는 다음과 같이 실험을 위한 세팅을 하였다.
<온도조건>
Pre-read: 60℃ 30초
Holding: 95℃ 10분
Cyclying: 95℃ 3~15초
60℃ 30ch~1분 -> 36 사이클
Post-read: 60℃ 30초
1-4: PCR 증폭값을 이용한 아벨리노 각막이상증 판별
실시예 1-3의 VID 양성값(TGFBI유전자의 엑손 4 부위를 증폭하는 프라이머쌍 및 정상 유전자 단편과 결합하는 프로브를 첨가하여 측정한 제1 PCR 증폭값)과 FAM 양성값(TGFBI유전자의 엑손 4 부위를 증폭하는 프라이머쌍 및 변이 유전자 단편과 결합하는 프로브를 첨가하여 측정한 제2 PCR 증폭값)을 도 4와 같이, 형질선별플롯으로 나타내었다.
이때, 본 발명의 시스템의 분석수단은 제1 PCR 증폭값이 제2 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 정상으로 판별하고, 제1 PCR 증폭값과 제2 PCR 증폭값의 비율이 1:1.5~1.5:1인 경우 아벨리노 각막이상증 이형접합자 (heterozygote)로 판별하고, 제2 PCR 증폭값이 제1 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 아벨리노 각막이상증 동형접합자 (homozygote)로 판별하여 도 4의 좌측에 색상으로서 정상인지 여부를 표시한다.
1-5: 아벨리노 각막이상증 판별결과의 출력 및 전송
실시예 1-4의 판별결과는 도 5와 같이, 화면 출력된다. 이때, 도 6과 같이, 개인결과지로서 판별될 수 있다. 이러한 결과는 네트워크를 통해 상기 시료에 대한 정보 및 검사의뢰서를 전송해 왔던 클라이언트 그룹으로 전송된다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

  1. 다음을 포함하는 아벨리노 각막이상증 (Avellino corneal dystrophy) 진단용 장치:
    (a) 네트워크를 통해 시료에 대한 정보 및 검사의뢰서를 입력수단을 포함하는 서버로 전송하여 진단서비스를 요청하고, 상기 요청에 응답하여 출력수단을 포함하는 서버로부터 전달되는 아벨리노 각막이상증 판별결과 데이터를 제공받아 저장하는 적어도 하나의 클라이언트로 된 클라이언트 그룹;
    (b) 상기 시료에 대한 정보 및 상기 검사의뢰서와, 시료 DNA에 TGFBI 유전자(Transforming growth factor b-induced gene)의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하고 있지 않은 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 첨가하여 측정한 제1 PCR 증폭값 및 시료 DNA에 TGFBI 유전자의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하는 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 첨가하여 측정한 제2 PCR 증폭값을 입력받기 위한 입력수단;
    (c) 상기 제1 PCR 증폭값이 제2 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 정상으로 판별하고, 제1 PCR 증폭값과 제2 PCR 증폭값의 비율이 1:1.5~1.5:1인 경우 아벨리노 각막이상증 이형접합자 (heterozygote)로 판별하고, 제2 PCR 증폭값이 제1 PCR 증폭값의 5~9배인 경우 아벨리노 각막이상증 동형접합자 (homozygote)로 판별하는 분석수단; 및
    (d) 상기 분석수단의 판별결과를 출력하기 위한 출력수단.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 PCR 증폭값과 제2 PCR 증폭값을 각각 일축으로 한 2차원의 형질선별플롯을 제공하는 표시수단을 추가로 포함하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 PCR 증폭값 및 제2 PCR 증폭값은 시료 DNA에 TGFBI 유전자의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍과, 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하고 있지 않은 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브 및 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하는 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브를 함께 첨가하여 PCR을 수행함으로써 동시에 측정된 것임을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 시료에 대한 정보는 시료의 종류, 의뢰자명, 의뢰기관명, 채취일, 채취시간, 연락처 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
  5. 제4항에 있어서, 상기 시료는 구강점막 세포, 혈액 및 모근 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 검사의뢰서는 유전자 검사 동의서를 포함하는 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
  7. 제1항에 있어서, 상기 PCR 증폭값을 출력하는 PCR 장비를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
  8. 제1항에 있어서, 시료 DNA의 260nm 에서의 흡광도 및 280nm에서의 흡광도를 입력하여 시료 DNA의 농도 및 순도를 연산하는 제1 연산수단과, 상기 프로브, 상기 프라이머쌍 및 증류수의 양을 연산하는 제2 연산수단을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
  9. 제1항에 있어서, 상기 TGFBI 유전자의 엑손 4 부위를 증폭할 수 있는 프라이머쌍은 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머쌍인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
  10. 제1항에 있어서, 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하고 있지 않은 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브는 코돈 124 위치가 "CGC"인 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
  11. 제10항에 있어서, 상기 코돈 124 위치가 "CGC"인 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브는 서열번호 3으로 표시되는 프로브인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
  12. 제1항에 있어서, 상기 엑손 4 부위에 돌연변이를 포함하는 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브는 코돈 124 위치가 "CAC"인 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
  13. 제12항에 있어서, 상기 코돈 124 위치가 "CAC"인 TGFBI 유전자를 검출할 수 있는 프로브는 서열번호 4로 표시되는 프로브인 것을 특징으로 하는 아벨리노 각막이상증 진단용 장치.
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