KR100995133B1

KR100995133B1 - 지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구로부터 세포성장인자의 생산방법 및 그 이용

Info

Publication number: KR100995133B1
Application number: KR1020100012310A
Authority: KR
Inventors: 정영춘; 홍영실
Original assignee: 허쉬바이오주식회사
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2010-11-18
Anticipated expiration: 2030-02-10
Also published as: WO2011099783A9; WO2011099783A3; WO2011099783A2

Abstract

본 발명은 지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구로부터 세포성장인자 생산방법 및 상기 생산방법으로 수득된 배양물의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 (a) 지방조직 유래의 세포분획(Stromal Vascular Fraction, SVF)으로부터 지방유래 줄기세포를 배양하는 단계; (b) 상기 지방유래 줄기세포에 단핵구를 혼합하여 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) 상기 세포 배양액에서 세포 및 부유물을 배양물만을 수득하는 단계를 포함하는 지방조직 유래 줄기세포의 배양물을 제조하는 방법 및 그 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 배양물은 지방조직 유래 줄기세포를 단독으로 배양에 의한 것보다, 지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구의 혼합배양으로부터 고농도의 성장인자가 함유된 배양물을 수득할 수 있기 때문에, 상기 세포에 의한 조직재생 등과 동일한 효과를 얻을 수 있고, 지방조직 유래 줄기세포를 신체에 직접 투여함으로써 야기될 수 있는 종양발생 관련 부작용을 방지할 수 있으므로, 이를 이용한 조직재생 및 피부개선 조성물의 제조에 유용하다.

Description

지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구로부터 세포성장인자의 생산방법 및 그 이용{Method for Producing Cell Growth Factors Secreted from Adipose-derived Stem Cells and Mononucleated Cells and the Use Thereof}

지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구로부터 세포성장인자를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 수득된 배양물을 유효성분으로 하는 조직재생 및 화장료 조성물에 관한 것이다.

지방조직은 발생학적으로 배아의 중배엽으로부터 유래하며, 성숙한 지방세포, 지방전구세포, 섬유아세포, 혈관평활근, 혈관내피세포, 조직 대식세포와 임파구로 구성된 복잡한 조직으로서, 인체 지방조직은 양이 많고, 환자에게 큰 위험없이 쉽게 분리가 가능하며, 재충전이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 최근에는 골, 지방, 연구세포로 분화할 수 있는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)의 공급원으로 알려지면서, 이를 이용한 활발한 연구가 이루어지고 있다.

지방조직에서의 세포분리는 1960년대에 처음으로 개발되어, 수술과정에서 흡입된 지방조직으로부터 조혈세포를 제거하고, 콜라겐분해효소 처리 후 원심분리하여 Stromal vascular fraction(SVF)를 분리하고, 순환혈구세포, 섬유아세포, pericytes, 내피세포, 지방전구세포 등 다양한 세포를 포함한 상기 SVF를 배양용기에 깔아 부착되는 세포를 선별함으로써, 중간엽 줄기세포를 분리한다.

중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)는 연구자에 따라, ASC(Adipose-derived stem/stromal cells), ADAS(adipose-derived adult stem cells), AdMSCs(adipose mesenchymal stem cells) 등 다양한 이름으로 불리고 있다.

지방조직 유래 줄기세포(Adipose-derived stem/stromal cells, ASC)는 FGF-2, Wnt signal, CXCR4 등의 다양한 물질에 의해 영향을 받으며, FGF-2, wint3a, VEGF, HGF 등의 다양한 성장인자를 분비하여, autocrine loop에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다(Rider DA et al ., Stem Cells , 26:1598, 2008; Cho HH et al ., Tissue Eng , 12:111, 2006; Cho HH et al ., Stem Cells Dev , 15:853, 2006; Wang M et al ., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol , 291:R880, 2006).

지방조직 유래 줄기세포에 대해서는 그 특성과 분화능을 이용한 다양한 실험이 진행되고 있으며, (a) 지방조직 유래 줄기세포로부터 분비된 사이토카인 및 성장인자에 의해 조직손상을 회복시키며, (b) stem cell niche 를 변화시켜 내재성 줄기세포의 동원과 분화를 촉진하며, (c) 항산화물질, free radical scavenger, chaperone. heat shock protein 등을 제공하여 국소에 유리된 유해물질을 제거하여 손사세포의 생존을 증가시키고, 또한 (d) 면역기능조절이 있음이 알려져 있다(정진섭, J Korean Sco Transplant , 22:183, 2008). 또한 창상의 회복, 피부의 주름살을 감소시키는 효과, 면역억제능 등이 보고되어, 이를 이용한 다양한 피부성형효과를 나타낼 수 있음이 보고되어 있다(Aggarwal S et al ., Blood , 105:1815, 2005; Nauta AJ et al ., Blood, 110:3499, 2005; Spaggiari GM et al ., Blood , 111:1327, 2008; Altman AM, et al., Stem cells, 27(1):205, 2009; de Vries HJ et al ., Lab Invest , 73:532, 1995; Kim WS et al ., J Dermatol Sci , 48:15, 2007; Kim WS et al ., J Dermatol Sci, 53(2):96, 2009)

지방조직 유래 줄기세포의 다양한 특징을 이용한 세포치료 및 조직공학적 임상적용을 위한 연구가 활발함에도 불구하고, 상기 세포를 본격적으로 임상적용을 위해서는 동종 이식에 대한 면역거부반응에 대한 명확한 이해가 선행되어야 하며, 세포의 장기 체외 배양시 나타날 수 있는 세포 유전학전인 변화에 의한 부작용 및 종양성장촉진, 종양재발 및 전이촉진의 위험성이 있기 때문에, 최근에는 이를 최소화하기 위한 연구가 병행될 필요성이 대두되고 있다.

이에, 본 발명자들은 지방조직 유래 줄기세포를 이용한 피부성형효과에 있어서, 세포를 직접 투여함으로써 야기될 수 있는 부작용을 방지하고, 지방조직 유래 줄기세포로부터 분비되는 다양한 성장인자의 생산량을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 지방조직 유래 줄기세포를 단핵구와 혼합 배양할 경우, 지방조직 유래 줄기세포로부터 배양액으로 분비되는 성장인자의 양이 현저히 증가함을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 지방조직 줄기세포를 신체에 투여함으로써 야기될 수 있는 부작용을 방지하고, 상기 세포로부터 얻을 수 있는 조직 재생 효과를 향상시키기 위하여, 지방조직 유래 줄기세포로부터 고농도의 성장인자 생산방법 및 상기 생산방법으로부터 수득된 배양물을 유효성분으로 하는 조직재생 및 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 지방조직 유래의 세포분획(Stromal Vascular Fraction, SVF)으로부터 지방유래 줄기세포를 배양하는 단계; (b) 상기 지방유래 줄기세포에 단핵구를 혼합하여 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) 상기 세포 배양액에서 세포 및 부유물을 배양물만을 수득하는 단계를 포함하는 지방조직 유래 줄기세포의 배양물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 배양물을 유효성분으로 함유하는 면역억제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 배양물을 유효성분으로 함유하는 조직재생용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 배양물을 유효성분으로 함유하는 발모유도용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 배양물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 지방조직 유래 줄기세포를 단독으로 배양에 의한 것보다, 지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구의 혼합배양으로부터 고농도의 성장인자가 함유된 배양물을 수득할 수 있기 때문에, 상기 세포에 의한 조직재생 등과 동일한 효과를 얻을 수 있고, 지방조직 유래 줄기세포를 신체에 직접 투여함으로써 야기될 수 있는 종양발생 관련 부작용을 방지할 수 있으므로, 이를 이용한 조직재생 및 피부개선 조성물의 제조에 유용하다.

도 1은 지방조직 유래 세포(ASC), 단핵구(MNC) 및 상기 두 세포를 혼합배양 시 세포의 배양상태를 보여주는 사진이다.
도 2는 지방조직 유래 세포(ASC), 단핵구(MNC) 및 상기 두 세포를 혼합배양으로 얻어진 배양물에 포함된 면역, 항염증 효능을 가진 성장인자의 함유량 분석결과이다.
도 3은 지방조직 유래 세포(ASC), 단핵구(MNC) 및 상기 두 세포를 혼합배양으로 얻어진 배양물에 포함된 조직 및 피부재생 효능을 가진 성장인자의 함유량 분석결과이다.
도 4는 지방조직 유래 세포(ASC), 단핵구(MNC) 및 상기 두 세포를 혼합배양으로 얻어진 배양물에 포함된 발모효능을 가진 성장인자의 함유량 분석결과이다.
도 5는 대조군(무혈청 배지), 지방조직 유래 세포(ASC), 단핵구(MNC), 및 상기 두 세포를 혼합배양으로 얻어진 배양물에 대해 함유된 단백질양의 차이를 2D 전기영동으로 분석한 결과이다.
도 6은 지방조직 유래 줄기세포의 계대배양 횟수에 따라 배양물에 함유되는 성장인자의 변화를 분석한 결과이다.

본 발명에서는 자가 지방조직 유래 세포분획(Stromal Vascular Fraction, SVF)을 계대배양하여 얻어진 지방조직 유래 줄기세포와 자가 혈액 유래의 단핵구를 일정비율로 혼합하여 배양하여, 그 배양물에 포함된 유용 성장인자의 함유량을 분석하였으며, 그 결과, 지방조직 유래 줄기세포 또는 단핵구를 단독으로 배양했을 경우보다 상기 두 세포를 혼합 배양했을 경우, 배양액에 성장인자의 농도가 현저히 높게 함유된 것을 확인하였다.

본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 (a) 지방조직 유래의 세포분획(Stromal Vascular Fraction, SVF)으로부터 지방유래 줄기세포를 배양하는 단계; (b) 상기 지방유래 줄기세포에 단핵구를 혼합하여 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및 (c) 상기 세포 배양액에서 세포 및 부유물을 배양물만을 수득하는 단계를 포함하는 지방조직 유래 줄기세포의 배양물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 배양물 생산방법에서는 지방조직 유래 줄기세포에 대해 단핵구와의 혼합배양 비율은 지방조직 유래 줄기세포:단핵구가 1:1 내지 1:1000이며, 바람직하게는 1:1 내지 1:200인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는 지방조직 유래 줄기세포와 단핵구를 일정비율로 혼합하여, 세포 성장을 측정하였으며, 그 결과, 지방조직 유래 줄기세포:단핵구가 1:1 이후의 비율에서는 평균적으로 지방조직 유래 줄기세포의 성장율이 단핵구가 10배씩 증가함에 따라 1.2배씩 꾸준히 상승하는 특징이 있음을 확인하였다.

또한 지방조직은 최소 100 g부터 최대 3 kg 정도까지 적출이 가능하며, 이로부터 수득되는 중간엽 줄기세포의 양은 약 3.8 X 10⁵ 내지 1.14 X 10⁷cells을 수득할 수 있고, 단핵구의 경우 최소 4 ml 부터 40 ml까지 채혈할 수 있으며, 이로부터 수득되는 단핵구의 양은 약 3 X 10⁶ 내지 3 X 10⁷ cells이며, 배양물을 얻기 위한 줄기세포 배양을 하는데 초기 배양개시 농도가 최소 3.8 X 10⁵ cells부터 적절하기 때문에, 지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구의 혼합비율은 최소 1:1 내지 최대 1:200이 적절하다.

본 발명의 배양물 생산방법에서, 지방조직 유래 줄기세포를 단독배양할 경우, 상기 세포로부터 생산되는 유용 성장인자의 양이 1차 계대대양 이후에는 전체적으로 감소하는 것으로 분석되었기 때문에, 지방조직 유래 줄기세포와 단핵구는 따라서, 상기 (a) 단계로부터 계대하여 1 일 동안 혈청배지에서 배양하고, 무혈청 배지로 교체하면서 (b) 단계를 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에 의해서 수득된 배양물에는 지방유래 줄기세포 또는 단핵구를 각각 단독으로 배양했을 때보다, IFN-γ(Interferon γ), IL1β(Interleukin-1β), IL-10(Interleukin 10), GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor), RANTES, FGF(Fibroblast growth factor), PDGF-AA(platelet derived growth factor-AA), PDGF-AB/BB(platelet derived growth factor-AB/BB), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(Hepatocyte growth factor), SOD(Superoxide Dismutase), Collagen, MCP-1, Noggin, Thymosin-β4 또는 하나 이상의 세포성장인자가 고농도로 함유된 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 '고농도'는 지방유래 줄기세포 또는 단핵구를 각각 단독으로 배양했을 경우 배양액으로 분비되는 세포성장인자의 양에 비해, 현저히 증가된 상태를 말하는 것으로, 예를 들면, 지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구를 일정비로 혼합하여 72 시간을 배양한 후, 수득된 배양물에 포함된 IFN-γ(Interferon γ), IL1β(Interleukin-1β), IL-10(Interleukin 10), GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor), RANTES의 양을 분석한 결과, 지방조직 유래 줄기세포단독배양에 비해 190 배 내지 4000 배까지 증가하였으며, 단핵구 단독배양에 비해서는 4.6배 내지 22배 상승한 것으로 나타났다.

본 발명에서, '지방조직 유래 줄기세포(adipose-derived stem/stromal cells, ASC)'는 ADSC(Adipose tissue-derived stromal cells), ADAS(adipose-derived adult stem cells) 또는 AdMSC(adipose mesenchymal stem cells)로 혼용될 수 있다.

본 발명에서, 또한 지방조직 유래 줄기세포는 지방제거수술 과정에서 파생된 지방 조직으로부터 얻어진 지방조직 유래 세포분획(Stroaml Vascular fraction, SVF)에 대해 DMEM(Dulbecco's minimal essential medium), 10% 우혈청(fetal bovine serum) 및 항생물질(antibiotics)와 같은 통상의 기본 '혈청 배지'를 사용하여 용이하게 배양할 수 있으며, 분화 전의 세포 배양에는 추가 성장인자의 첨가가 필요 없다는 점은 당업자에게 자명하다(R lan Freshney, Culture of Human Stem Cells , p305 , Wiley - Liss , 2008; SG Dubois et al., Methods in Molecular Biology - Isolation human adipose - derived stem cells from biopsies and liposuction , 449:69-79, 2008).

따라서 본 발명에서 '혈청 배지'는 DMEM(Dulbecco's minimal essential medium), 10% 우혈청(fetal bovine serum) 및 항생물질(antibiotics)을 포함한 것이며, '무혈청 배지'는 상기 조성에서 우혈청을 첨가하지 않은 배지이다. 상기 무혈청 배지는 DMEM, Ham's F-12 등의 통상의 세포배양용 배지를 사용할 수 있으며, 당업자에 따라 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명에서 '세포분획(Stroaml Vascular fraction, SVF)'은 '기질-혈관 분획'으로도 불리우며, 콜라게나아제에 의한 분해 및 차별적 원심분리에 의한 분쇄방법 등의 공지된 기술로 용이하게 얻을 수 있다(Halvorsen et al ., Tissue Eng. 7(6):729, 2001; Hauner et al ., J. Clin . Invest. 84:1633, 1989; Rodbell et al., J. Bio . Chem ., 241:130, 1966). 상기 세포분획은 성숙한 지방세포를 제외한 지방줄기세포를 포함한 세포혼합물로서, 혈구세포, 섬유아세포, pericyte, 내피세포, 지방전구세포 등 다양한 세포를 포함하나, 이를 배양용기에서 배양할 경우, 계대배양 횟수나 사용배지에 따라 부착 후 배양된 세포의 조성이 달라질 수 있으며, 3회 이상 계대배양할 경우 비교적 균일한 중간엽 기질세포를 얻을 수 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, 지방조직 유래 줄기세포는 지방세포, 근육세포, 골세포, 연골세포 등의 중배엽성 세포로 분화하는 능력을 가질 뿐만 아니라, 비중배엽성 세포인 췌장내분비세포, 간세포, 혈관내피세포 및 심근세포로 분화할 수 있음이 보고되어 있다(정진섭, J Korean Soc Transplant , 22:183-196, 2008).

본 발명에서 단핵구(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 MNC(mononucleated cells)로 혼용될 수 있으며, 자가 유래로서 골수, 제대혈, 태반혈로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 말초혈액에서 분리할 수 있다.

본 발명에서 단핵구(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)는 조혈모세포(hematopoetic stem cells) 및 혈관내피전구세포(epithelial progenitor cells)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구는 포유류 유래인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 배양물을 유효성분으로 함유하는 면역억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 면역억제용 조성물은 배양물에 포함된 IFN-γ(Interferon γ), IL1β(Interleukin-1β), IL-10(Interleukin 10), GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) 및 RANTES를 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 면역억제 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질병 또는 질환은 면역반응을 억제하여 예방 또는 치료될 수 있는 질환을 모두 포함한다. 가장 대표적인 질환 또는 질병은, 자가면역질환, 염증성 질환 및 이식거부이다.

본 발명의 면역억제용 조성물에 의해 예방 및 치료될 수 있는 자가면역질환은 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 류마티스 다발성 근통, 다발성 근염과 피부근염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염 및 아토피를 포함하며, 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명의 면역억제용 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 염증성 질환의 예는 천식, 염증성 장염, 알러지 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증을 포함하나 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 배양물을 유효성분으로 함유하는 조직재생용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조직재생용 조성물은 보다 상세하게는 배양물에 포함된 FGF(Fibroblast growth factor), PDGF-AA(platelet derived growth factor-AA), PDGF-AB/BB(platelet derived growth factor-AB/BB), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(Hepatocyte growth factor), SOD(Superoxide Dismutase), Collagen 및 MCP-1를 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 '조직 재생'은 물리적 원인에 의해 손상된 조직 또는 상흔이 두드러진 부위를 정상 또는 정상에 가까운 상태로 복귀시키는 작용을 말하며, '조직 치유', '조직 재건' 또는 '조직 수복'과 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명은 조직재생용 조성물은 상처, 질병, 노화 등의 원인으로 발생된 피부, 뼈, 연부 조직, 치아 조직의 결함을 수복시키는데 사용할 수 있으며, 그 예로, 주름, 튼살, 파인 흉터, 비외상성 피부함몰, 여드름 흉터, 화상, 피부 궤양 등을 들 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 배양물을 유효성분으로 함유하는 발모유도용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 발모유도용 조성물은 배양물에 포함된 Noggin 및 Thymosin-β4를 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, '발모 유도'는 탈모 부위, 빈모 부위 또는 무모 부위에 모낭을 형성하여 표피에 털이 재건되도록 유도하는 능력을 말하며, 탈모 치료 또는 무모증 치료의 효과를 나타낸다.

본 발명의 발모유도용 조성물은 단독요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 발모 유도 약물요법 또는 수술요법 등과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하였을 경우 극대화된 효능을 나타낼 수 있다.

본 발명의 발모 유도 조성물과 함께 이용될 수 있는 약학 제제는 피나스테라이드(Finasteride), 두타스테라이드, 싸이옥톨(Cyoctol) 및 RU58841를 포함하는 남성 호르몬 또는 DHT 유발 억제제, 부갑상선 호르몬(PTH) 억제제, 미녹시딜, 버셀린(Burserelin), 혈액순환 개선제 및 메소테라피에 응용되는 조성물 등을 들 수 있으며, 수술요법으로는 모발이식, 두피 피판술, 두피 축소술 등을 들 수 있다.

본 발명의 배양물을 유효성분으로 함유된 조성물은 당업계에서 해당 분야의 전문가에 의해 시술할 수 있으며, 질환예방, 치료 및 조직 재건을 필요로 하는 신체 부위라면 어디나 적용할 수 있다. 투여 경로는 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여 등을 포함하는 비경구 투여가 바람직하고, 보다 바람직하게는 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있으며, 상처 부위, 조직재생 또는 발모 유도가 요구되는 부위에 직접 주입하는 방법으로 투여하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 조성물은 한 번 투여 후에 조직 내에 원활하게 정착하도록 일정기간 무처치로 조직을 방치하고, 그 후에 필요에 따라 조성물을 재투여할 수 있으며, 상기 투여 및 무처치의 과정을 1회 내지 그 이상으로 반복할 수 있으며, 이식 후 무처치로 유지하는 기간은 10일 내지 30일일 수 있으나, 피험자의 상태에 따라 당업자의 전문적인 지식에 의해 횟수와 기간은 조정될 수 있다.

본 발명의 조성물에는 생체 적합성 운반체를 추가로 포함하여 조직 내 투여에 사용될 수 있다. 상기 운반체 및 필러는 인간을 포함한 포유동물에 대해 독성, 거부반응 또는 자극성에 의한 부작용이 없는 물질로 구성되어 세포가 이식된 부위로부터 멀리 분산되지 못하도록 포집체 또는 지지체의 역할을 하며, 운반체의 성분 또는 구성비는 이식 시술을 수행하는 당업자가 용이하게 결정할 수 있다는 것은 당업계에서 자명하다.

상기 생체 적합성 운반체는 알지네이트, 아가로즈, 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 피브로넥틴, 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리락타이드산(polylactic acid), 히알우론산(hyaluronic acid), 폴리에틸렌클리콜, 콘드로이탈(chondroital), 덜마탄(dermatan), 폴리사카라이드, 뮤코폴리사카라이드, 하이드로겔, 덱스트란, 아밀로즈, 프로테인, 글리코프로테인 및 그 유도체일 수 있으며, 또는 혈소판 함유 혈청, 농축 혈소판 혼합 조성물 등을 사용할 수 있고, 콘드로이틴-4-설페이트(chondroitin 4-sulfate), 콘드로이틴-6-설페이트(chondroitin 6-sulfate), 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 헤파린 설페이트(heparin sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate), 비타민 A 또는 비타민 C를 단독 또는 혼합 사용하여 함유되도록 구성할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 배양물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은 FGF(Fibroblast growth factor), PDGF-AA(platelet derived growth factor-AA), PDGF-AB/BB(platelet derived growth factor-AB/BB), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(Hepatocyte growth factor), SOD(Superoxide Dismutase), Collagen 및 MCP-1이 포함된 배양물을 유효성분으로 하여 주름 개선 및 피부 미백의 피부개선 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 통상적인 제형으로 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 크린징, 오일, 분말, 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 보다 상세하게는 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 지방조직 유래 세포분획( Stromal Vascular Fraction , SVF )의 제조

피하지방제거술에서 파생된 지방조직에 대해 조직부피의 1 ~ 5배의 멸균 생리 식염수를 첨가하여 2회 세척 세정하고, 세정된 지방 조직을 메스로 얇게 자른 다음, 0.1 ~ 0.3%의 콜라게나아제 제I형이 혼합된 생리 식염수를 조직부피에 대해 1:1로 첨가하여 36 ~ 38℃에서 30 ~ 60 분간 처리하였다. 효소반응은 자가 혈청을 지방조직 부피의 0.2배 첨가하여 정지시켰다. 효소분해된 지방조직을 1,000 ~ 5,000 rpm에서 1 ~ 5분간 원심분리한 후, 10 ~ 40 ml의 멸균 생리식염수를 첨가하여 침전되어 뭉친 세포를 잘 풀어주고 70㎛ 필터를 통과시켜 고형성분을 제거하였다. 상기와 동일한 양의 멸균 생리식염수를 첨가하여 원심분리로 세포를 세척한다. 세척과정을 2회 반복 후 지방조직 유래의 세포분획(Stromal Vascular Fraction, SVF)을 얻었다.

실시예 2: 지방유래 줄기세포의 배양

실시예 1에서 분리한 지방조직 유래 세포로부터 공지된 방법을 사용하여 중간엽 기질세포를 배양하였다(Circ Res . 100:1249-1260, 2007; Methods , 45:115-120, 2008; J Cell physiol, 208:64-76, 2006). 지방조직 유래 세포에 대해 기본배양액(50 ㎍/ml gentamycin, 10~15% FBS in Dulbecco's modified eagle's medium)을 4ml 첨가하여 25cm² 크기의 배양 flask에 넣고 5% CO₂, 37℃의 배양기에서 3 내지 10일 동안 배양하고 배양액은 2~3일에 한번씩 새 것으로 교체하였다. 배양 3 ~ 10일 후에 계대배양을 실시하여 2 x 10⁵~ 1 x 10⁶ cells/cm²의 농도로 75 cm² 크기의 배양 플라스크로 옮기고, 다시 기본배양액을 10 ~ 15 ml 첨가하여 배양하였으며, 총 1 내지 4 주간 배양기간을 거친 후 지방유래 줄기세포를 수득하였다.

실시예 3: 자가 단핵구 분리

말초혈액으로부터 획득한 전혈을 멸균 생리 식염수를 1:1로 첨가하여 희석하고 원심분리관에 넣은 후, 동량의 Ficoll-Pauqe PLUS(밀도: 20에서 1.076 ~ 1.078 g/ml, Amersham-Pharmacia Biotech, 스웨덴)을 혈액 희석액 위에 층을 이루도록 조심스럽게 올리고, 원심분리기 상에서 3,000 rpm, 4℃에서 20 분간 원심분리하였다. 상기 원심분리로 밀도차에 의해 분리된 세포층으로부터 단핵구 세포를 수거하여, 세포에 멸균 생리 식염수를 첨가하여 2,500 rpm, 4℃에서 5 분간 원심분리로 2 회 세척하여 단핵구를 분리하였다.

실시예 4: 지방유래 줄기세포( ASC )의 배양물 제조

실시예 2에서 얻어진 지방 유래 줄기세포를 기본배양액에서 1회 이상 계대배양하여 75 cm² 크기의 배양 플라스크에 95% 이상 Confluency를 나타낼 때, 배양액을 제거하고, 잔류 혈청성분을 제거하기 위하여, PBS(Phosphate Buffered saline)로 3회 세척하였다. DMEM을 주성분으로 하는 무혈청 배지를 10 ~ 15 ml 첨가하여, 5% CO₂, 37℃의 배양기에서 72 시간 이상 배양한 후, 배양액만을 수거하여 500 rpm에서 3분간 원심분리하여, 배양물에 존재하는 세포 및 세포 잔여물을 제거하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후 최종 배양물을 수득하였다. 상기 배양물은 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.

실시예 5: 단핵구(MNC)의 배양물 제조

실시예 3에서 분리한 단핵구 5 x 10⁵~ 1 x 10⁷ cells/cm²를 항생제가 첨가되지 않은 DMEM을 주성분하며 항생물질이 첨가되지 않은 무혈청 배지 10 ~ 15 ml을 첨가하여, 75 cm² 크기의 배양용기에서 5% CO₂, 37℃의 배양기에서 72시간 이상 배양한 후, 배양액만을 수거하여 500 rpm에서 3분간 원심분리하여, 배양물에 존재하는 세포 및 세포 잔여물을 제거하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후 최종 배양물을 수득하였다. 상기 배양물은 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.

실시예 6: 지방유래 줄기세포( ASC ) 및 단핵구( MNC )의 혼합배양에 의한 배양물의 제조

실시예 2에서 얻어진 지방 유래 줄기세포를 2 x 10⁵ cells/ml의 농도로 75㎠ 크기의 배양 flask로 옮기고 기본배양액을 10 ~ 15ml 첨가하여 5% CO2, 37℃의 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 실시예 3에서 분리한 단핵구 1 x 10⁴~ 1 x 10⁷ cells을 기본배양액 10 ~ 15 ml에 부유시켜 1일간 배양한 줄기세포의 기본배양액을 제거하고 그 위에 조심스럽게 얹어주었다. 단핵구 첨가 전, 3일 후, 5일 후, 7일 후 7일째에 배양액을 걷어내고, PBS로 2회 세척 후 트립신/EDTA로 세포를 수거하여 0.1ml의 세포 부유액과 동량의 0.2% trypan blue를 혼합한 후 hemocytometer를 이용하여 현미경 시야에서 염색되지 않은 세포를 세어 전체 세포 중의 살아있는 세포수를 측정하였다. 그 결과, 초기 지방조직 유래 줄기세포의 농도가 2 x 10⁵ cells이었으나, 7일 동안 배양한 후에는 단핵구를 혼합하지 않은 경우에는 6.7 X 10⁵ cells로 약 3.25배 세포수가 증가하였으며, 7일째 배양된 혼합 배양으로 얻어진 줄기세포 수를 측정한 결과, 2배 내지 200배의 혼합비율 사이에서는 세포 수의 증가율이 약 1.2배로 일정하게 유지되는 것을 확인하였다.(표 1).

단핵구 수(cells)	0	10⁴	10⁵	10⁶	10⁷
줄기세포수(7일째) (cells)	6.7 x 10⁵	8.7 x 10⁵	1.1 x 10⁶	1.25 X 10⁶	1.56 X 10⁶

상기 결과를 근거로, 실시예 2에서 얻어진 지방 유래 줄기세포를 1회 이상 계대배양하여 75 cm² 크기의 배양 플라스크에 95% 이상 Confluency를 나타낼 때, 즉 1.5 X 10⁶ 내지 3 X 10⁶cells/ml에 이르렀을 때, 배양액을 제거하고, 잔류 혈청성분을 제거하기 위하여, PBS(Phosphate Buffered saline)로 3회 세척하였다. 또한, 실시예 3에서 분리한 단핵구 5 x 10⁵~ 1 x 10⁷ cells/cm를 항생제가 첨가되지 않은 DMEM을 주성분하며 항생물질이 첨가되지 않은 무혈청 배지 10 ~ 15 ml을 첨가하여 부유시키고, 이를 지방유래 줄기세포가 배양된 75 cm² 크기의 배양 플라스크에 지방유래 줄기세포:단핵구가 1:3이 되도록 첨가하여 5% CO₂, 37℃의 배양기에서 72시간 이상 배양한 후, 배양액만을 수거하여 500 rpm에서 3분간 원심분리하여, 배양물에 존재하는 세포 및 세포 잔여물을 제거하고, 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후 최종 배양물을 수득하였다. 상기 배양물은 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.

실시예 7: 세포 배양물 내 성장인자의 함량변화분석

실시예 4, 5 및 6에 의해 얻어진 배양물에 대해 항체를 이용한 성분분석을 위하여, 비특이반응이 일어나지 않는 최적 조건을 설정 후 SOD, Thymosin β4, Collagen typeⅠ, Noggin 및 Fibronectin의 경우는 ELISA kit (USCN-LIFE)를 이용하여, 그리고 IL-1b, IL-10, EGF, FGF, HGF, GM-CSF, IFN-γ, VEGF, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, MCP-1, TNF-α의 경우는 luminex kit (millipore)를 이용하여 배양물에 함유된 단백질의 농도를 측정하였다.

SOD, Thymosin β4, Collagen typeⅠ, Noggin 및 Fibronectin이 함유된 샘플(배양물)과 상기 단백질에 대한 표준용액을 항체가 코팅되어 있는 well에 100μl씩 넣고 37℃에서 2시간 반응하였다. well에 담겨있는 용액을 제거한 후, 이차 항체 100μl를 첨가하여 37℃에서 1 시간 동안 반응하였다. 이차항체 반응이 종료하면, 각 well을 세척액으로 3회 세척하고 기질용액을 90 μl 넣은 다음, 빛을 차단시킨 상태에서 15~25분간 반응한 후, 반응정지용액 50 μl를 각 well에 첨가하고, 450 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다.

IL-1b, IL-10, EGF, FGF, HGF, GM-CSF, IFN-γ, VEGF, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, RANTES, MCP-1, TNF-α이 함유된 샘플(배양물) 200 μl를 각 well에 첨가하고, 상온에서 10분간 방치한 후, assay buffer 25 μl로 교체하고, 다른 well에는 상기 단백질의 표준 용액 25 μl를 각 well에 첨가하였다. 상기 샘플 및 표준용액이 든 모든 well에 abtibody-immbolized beads가 들어있는 용액을 25 μl 첨가하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 반응이 종료되면 세척액으로 2회 세척하고, 2차 항체를 첨가하여, 다시 상온에서 1시간 동안 반응하도록 하였다. 반응이 끝난 후 각 Well에 형광 접합체인 streptavidin-phycoerythrin을 25 μl씩 넣고 상온에서 30분간 반응하고 세척액으로 2회 세척하였다. 각 well에 150 μl의 Sheath Fluid를 넣고 상온에서 5 분간 반응한 후, Luminex 장비를 사용하여 형광값을 측정하였다.

그 결과, 지방조직 유래 줄기세포(ASC) 및 단핵구(MNC)를 단독으로 배양했을 때보다, 상기 두 세포를 혼합배양하여 얻어진 배양액에서 IFN-γ(Interferon γ), IL1β(Interleukin-1β), IL-10(Interleukin 10), GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor), RANTES, FGF(Fibroblast growth factor), PDGF-AA(platelet derived growth factor-AA), PDGF-AB/BB(platelet derived growth factor-AB/BB), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(Hepatocyte growth factor), SOD(Superoxide Dismutase), Collagen, MCP-1, Noggin, Thymosin-β4의 함량이 월등히 높은 것으로 확인되었다(도 2, 3 및 4)

실시예 8: 전기 영동에 의한 배양물의 단백질 분석

실시예 4, 5 및 6에 의해 얻어진 배양물에 대해 전기영동기술을 이용한 성분분석을 위하여, 배양물에 7M urea, 2M Thiourea, 4%(w/v) CHAPS(3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate), 1%(w/v) DTT, 2%(v/v) pharmalyte, 1mM benzamidine로 구성된 시료용액을 혼합하여 homogenizer(PowerGen125, Fisher Scientific)를 사용하여 균질화시켰다. 그 다음, 1시간 동안 vortex로 단백질이 추출되도록 한 후, 15℃에서 15,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하였으며, 이로부터 얻어진 상층액을 이차원 전기영동의 시료로 사용하였다. 단백질의 농도 측정은 브래드포드법으로 수행하였다(Bradford et al ., Anal . Biochem ., 1976, 72, 248).

이차원 전기영동(2D electrophoresis)을 위하여, 우선 일차 Isoelectric focusing(IEF)에서 IPG strips은 7M urea, 2M thiourea, 2% CHAPS(3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-1-propanesulfonate), 1% DTT(dithiothreitol), 1% pharmalyte로 구성된 reswelling 용액으로 상온에서 12-16시간 정도 reswelling 하였다. Strip 당 시료는 각각 200 ug 씩을 사용하였으며, Multiphore II system(Amersham Biosciences)을 이용하여 20℃에서 IEF를 수행하였다. IEF 조건은 150 V에서 시작하여, 3시간 후 3,500 V에 이르도록 설정하였으며, 3,500V에서 26시간 동안 지속되도록 하여 최종적으로 96 kVh가 되도록 조건을 맞추었다. 이차적으로 SDS-PAGE를 수행하기 전에 IPG Strips을 1% DTT를 함유한 equilibration buffer(50 mM Tris-Cl, pH 6.8, 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol)로 10분간 반응하였으며, 바로 2.5% iodoacetamide를 함유한 equilibration buffer로 10분간 더 반응하였다. Equilibration이 완료된 strips을 SDS-PAGE gels(20x24cm, 10-16%) 위에 배열시키고, Hoefer DALT 2D system(Amersham Biosciences)을 이용하여 20℃에서 최종적으로 1.7kVh가 되게 전개하였다. 이차원 전기영동이 완료된 이차원 젤의 단백질은 Oakley et al .(Anal . Biochem . 1980, 105:361-363) 등의 방법에 따라 silver staining 으로 시각화되었으며, silver staining 된 이차원 젤은 Duoscan T1200 스캐너(AGFA)로 스캐닝하여 이미지를 획득하였다. 스캐닝된 이미지로부터 단백질 spots의 발현변화 확인을 위한 정량적인 분석은 PDQuest software(version 7.0, BioRad)를 이용하여 각 spot의 quantity는 total valid sopts의 크기로 평준화되었으며, 대조군에 비해 두 배 이상의 유의한 발현변화를 보여주는 단백질 스폿을 선정하여 집계하였다.

그 결과, 동일한 양의 배양물에 대한 단백질 함량은 지방조직 유래 줄기세포 및 단핵구의 혼합 배양으로부터 얻어진 배양물에 함유된 단백질양이 가장 높은 것으로 파악되었으며, 전기영동 결과, 총 단백질 개수에 있어서도 대조군에 비해서는 약 8배, 지방조직 유래 줄기세포에 비해서는 약 2배 그리고, 단핵구에 대해서는 1.1배 증가한 것으로 확인되었다(표 1 및 도 5).

실시예 9: 지방조직 유래 줄기세포( ANC )의 계대배양에 따른 배양물의 성분분석

지방조직 유래 줄기세포를 계대배양함으로써 얻어지는 배양물 내에 함유된 성장인자의 함량변화를 확인하기 위하여, 실시예 4로부터 얻어진 배양물에 대해 성장인자의 함유량을 실시예 7의 방법으로 분석하였다. 배양개시 후 1차 계대 후 72시간 경과시점에서 얻어진 배양액(#1), 2차 계대 후 72시간 경과시점에서 얻어진 배양액(#2), 3차 계대 후 72시간 경과시점에서 얻어진 배양액(#3), 및 4차 계대 후 72시간 경과시점에서 얻어진 배양액(#4)는 각각 3일간의 배양기간의 차이가 있으며, 상기 시점에서 얻어진 각각의 배양물에 대해 GM-CSF, VEFG, HGF, KGF, Fibronectin, Collagen, SOD, RANTES, Noggin, Thymosin β4, MCP-1에 대한 함량 변화를 분석하였다.

그 결과, 1차 계대배양 시점에서 KGF, HGF 및 Noggin을 제외한 대부분의 성장인장의 생산량이 가장 높은 것으로 나타났으며, 따라서, 1차 계대배양 시 얻어진 배양물을 수거하는 것이 가장 적절한 것으로 확인되었다(도 6)

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 지방조직 유래 줄기세포의 배양물을 제조하는 방법:
(a) 지방조직 유래의 세포분획(Stromal Vascular Fraction, SVF)으로부터 지방조직 유래 줄기세포를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 지방조직 유래 줄기세포에 단핵구를 혼합하여 무혈청 배지에서 배양하는 단계; 및
(c) 상기 세포 배양액으로부터 세포 및 부유물을 제거하고 배양물만을 수득하는 단계.
제1항에 있어서, (b) 단계에서 세포 혼합비율은 지방조직 유래 줄기세포:단핵구가 1:1 내지 1:200인 것을 특징으로 하는 지방조직 유래 줄기세포의 배양물을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양물은 지방유래 줄기세포 또는 단핵구를 각각 단독으로 배양했을 때보다, IFN-γ(Interferon γ), IL-1β(Interleukin-1β), IL-10(Interleukin 10), GM-CSF(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor), RANTES, FGF(Fibroblast growth factor), PDGF-AA(platelet derived growth factor-AA), PDGF-AB/BB(platelet derived growth factor-AB/BB), VEGF(Vascular endothelial growth factor), HGF(Hepatocyte growth factor), SOD(Superoxide Dismutase), Collagen, MCP-1, Noggin 및 Thymosin-β4로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포성장인자를 고농도로 함유하는 것을 특징으로 하는 지방조직 유래 줄기세포의 배양물을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단핵구는 말초혈액, 제대혈, 골수로부터 유래인 것을 특징으로 하는 지방조직 유래 줄기세포의 배양물을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단핵구는 조혈모세포(hematopoetic stem cells) 및 혈관내피전구세포(epithelial progenitor cells)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 지방조직 유래 줄기세포의 배양물을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포 및 단핵구는 포유류 유래인 것을 특징으로 하는 지방조직 유래 줄기세포의 배양물을 제조하는 방법.
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