KR100994599B1 - 아밀로이드-베타 펩타이드로 향하는 항체 및 이의 사용방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 β-아밀로이드 펩타이드의 C-말단 쪽으로 향하는 항체, 및 알쯔하이머병 및 Aβ 펩타이드 관련 질환을 진단 및 치료하기 위하여 이들 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

β-아밀로이드 펩타이드, 알쯔하이머병.

Description

아밀로이드-베타 펩타이드로 향하는 항체 및 이의 사용 방법{ANTIBODIES DIRECTED AGAINST AMYLOID-BETA PEPTIDE AND METHODS USING SAME}

관련 출원에 대한 교차-참조

본원은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 가출원 제 60/676,093 호(2005년 4월 29일자 출원) 및 미국 특허 가출원 제 60/704,818 호(2005년 8월 1일자 출원)에 기초한 우선권을 주장한다.

본 발명은 아밀로이드-베타 펩타이드에 대한 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 알쯔하이머(Alzheimer's)병 같은 질환의 치료 및/또는 예방에서의 이들 항체의 용도에 관한 것이다.

연방 지원되는 연구 또는 개발에 대한 진술

해당 사항 없음.

알쯔하이머병(AD)은 점진적인 기억 결손, 혼동, 단계적인 신체 저하 및 궁극적으로 사망을 그 임상적 특징으로 하는 퇴행성 뇌 장애이다. 전세계적으로 약 천 오백만 명의 사람들이 알쯔하이머병을 앓고 있으며, 그 수는 수명이 길어짐에 따라 급격하게 증가할 것으로 예상된다. 조직학적으로, 이 질환은 주로 연합 피질, 변연계 및 기저핵에서 발견되는 초로성 반점(plaque)을 그 특징으로 한다. 이들 반점의 주성분은 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)이고, 이는 베타 아밀로이드 전구체 단백질(βAPP 또는 APP)의 절단 생성물이다. APP는 큰 이소성 N-말단 도메인, 막통과 도메인 및 작은 세포질 C-말단 꼬리를 함유하는 유형 I 막통과 당단백질이다. 크로모좀 21 상의 단일 APP 유전자의 전사물의 다른 스플라이싱(splicing)은 아미노산의 수가 상이한 몇 가지 아이소형(isoform)을 생성시킨다.

Aβ는 알쯔하이머병의 신경병리학에 중추적인 역할을 하는 것으로 보인다. 이 질환의 가족형은 APP 및 프레세닐린 유전자의 돌연변이에 관련되어 있다[탄지(Tanzi) 등, 1996, Neurobiol. Dis. 3:159-168; 하디(Hardy), 1996, Ann. Med. 28:255-258]. 이들 유전자의 질환-관련된 돌연변이는 아밀로이드 반점에서 발견되는 우세한 형태인 Aβ의 42-아미노산 형태를 더 많이 생성시킨다. 뿐만 아니라, APP의 질환-관련된 돌연변이 형태를 과발현하는 유전자 이전(transgenic) 마우스를 인간의 Aβ로 면역화시키면 반점 부하 및 수반되는 병리학을 감소시키고[쉥크(Schenk) 등, 1999, Nature 400:173-177; WO 99/27944 호], Aβ로 향하는 항체를 말초 투여해도 뇌에서의 반점 부하를 감소시킨다[바드(Bard) 등, 2000, Nature Medicine 6(8):916-919; WO 2004/032868 호; WO 00/72880 호].

미세아교세포 및/또는 대식세포에 의한 Fc-매개되는 포식작용이 생체 내에서 반점을 없애는 과정에 중요한 것으로 보고되었다. 바드 등의 문헌[Proc . Natl . Acad. Sci . USA 100, 2023-2028 (2003)] 참조. 그러나, 또한 Fc-매개되지 않은 메카니즘이 면역 요법에 의해 생체 내에서 아밀로이드-β를 없애는데 관련되는 것도 보고된 바 있다. 백스카이(Bacskai) 등의 문헌[J Neurosci . 22:7873-7878 (2002)]; 다스(Das) 등의 문헌[J. Neurosci . 23:8532-8538 (2003)] 참조.

따라서, 항체 요법은 알쯔하이머병의 치료 및 예방에 대한 유망한 해결책을 제공한다. 그러나, Aβ1-42를 포함하는 백신을 사용한 인간의 임상 실험은 일부 환자에서의 뇌수막염으로 인해 중단되었다. 올고고조(Orgogozo) 등의 문헌[Neurology 61:7-8 (2003)]; 페러(Ferrer) 등의 문헌[Brain Pathol. 14:11-20 (2004)] 참조. N-말단 특이성 항-Aβ 항체로 수동 면역화시키면 주로 광범성 아밀로이드를 상당히 감소시키지만, 아밀로이드 반점의 연령-관련 발생 및 신경 변성을 나타내는 유전자 이전 마우스에서 대뇌 미세 출혈 빈도의 증가 및 인간의 AD 뇌에서 발견되는 것과 유사한 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)을 유도한다. 파이퍼(Pfeifer) 등의 문헌[Science 298:1379 (2002)] 참조. 베타-아밀로이드로 향하는 항체로 수동 면역화시킴에 의한 APP 유전자 이전 마우스에서 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)-수반 미세 출혈의 악화는 아밀로이드 베타 펩타이드의 침착된 형태의 항체 인식에 의존한다고 제안된 바 있다. 레이크(Racke) 등의 문헌[J. Neurosci. 25:629-636 (2005)] 참조. 염증의 위험을 감소시키기 위하여 아밀로이드 침착물의 펩타이드 성분에 대한 항체(이는 Fc 영역이 없음)를 사용한 수동 면역화가 제안되었다(WO 03/086310 호 참조). 개선된 효능 및 안전성 프로파일을 갖고 사람 환자에 사용하기 적합한 Aβ로 향하는 항체 및 다른 면역치료제가 여전히 필요하다.

본원 전체에 걸쳐 다양한 문헌(특허 및 특허원 포함)이 인용된다. 이들 문헌의 개시내용은 본원에 참고로 인용된다.

발명의 개요

본원에 개시된 발명은 Aβ 펩타이드의 C-말단에 결합하는 항체 및 폴리펩타이드에 관한 것이다. 한 요지에서, 본 발명은 항체 또는 폴리펩타이드가 Aβ_1-42 및 Aβ_1-43에 대한 그의 결합보다 더 높은 친화력으로 Aβ_1-40에 결합하고, 항체 또는 폴리펩타이드가 아미노산 25 내지 34 및 40을 포함하는 Aβ_1-40상의 항원결정기에 결합하는, Aβ_1-40, Aβ_1-42 및 Aβ_1-43에 결합하는 항체 또는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 Aβ_1-42 및/또는 Aβ_1-43에 대한 그의 결합보다 약 40배 이상 더 높은 친화력으로 Aβ_1-40에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 항체 2294가 아니다.

다른 요지에서, 본 발명은 항체 6G(호환가능하게 "6G"라고 함)를 제공한다. 6G의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain) 가변 영역의 아미노산 서열이 도 1이 표시되어 있다. 항체 6G의 상보성 결정 영역(CDR) 부분[코티아(Chothia) CDR 및 카바트(Kabat) CDR 포함] 또한 도 1에 표시되어 있다.

또 다른 요지에서, 본 발명은 또한 표 3에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 6G의 항체 변이체(variant)를 제공한다.

다른 요지에서, 본 발명은 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 단편(fragment) 또는 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 단편은 항체 6G의 경쇄이다. 다른 실시양태에서, 단편은 항체 6G의 중쇄이다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 항체 6G의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 도 1에 나타낸 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 항체 6G의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 CDR을 함유한다.

또 다른 요지에서, 본 발명은 하기중 임의의 하나 이상을 포함하는 폴리펩타이드(이는 항체일 수도 아닐 수도 있음)를 제공한다: a) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 하나 이상의 CDR(들); b) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 중쇄로부터의 CDR H3; c) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 CDR L3; d) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDR; e) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 중쇄로부터의 3개의 CDR; f) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDR 및 중쇄로부터의 3개의 CDR. 본 발명은 추가로 하기중 임의의 하나 이상을 포함하는 폴리펩타이드(이는 항체일 수도 아닐 수도 있음)를 제공한다: a) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체로부터 유도되는 하나 이상(1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 CDR(들); b) 항체 6G의 중쇄로부터의 CDR H3으로부터 유도되는 CDR; 및/또는 c) 항체 6G의 경쇄로부터의 CDR L3으로부터 유도되는 CDR. 일부 실시양태에서, CDR은 도 1에 도시되는 CDR이다. 일부 실시양태에서, 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체로부터 유도되는 하나 이상의 CDR은 6G 또는 그의 변이체의 하나 이상, 둘 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 CDR과 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 동일하다.

몇몇 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 코티아 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR과 코티아 CDR의 조합("조합된 CDR" 또는 "연장된 CDR"이라고도 함)이다. 달리 말해, 하나보다 많은 CDR을 함유하는 임의의 소정 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR 및/또는 조합된 CDR중 임의의 CDR일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간의 항체이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간화된(humanized) 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 단클론이다. 몇몇 실시양태에서, 항체(또는 폴리펩타이드)는 단리된다. 일부 실시양태에서, 항체(또는 폴리펩타이드)는 실질적으로 순수하다.

항체의 중쇄 불변 영역은 IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE 같은 임의의 유형의 불변 영역; 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 같은 임의의 아이소형일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 본원에 기재되는 항체 또는 폴리펩타이드는 손상된 작동자(effector) 기능을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 손상된 작동자 기능을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하며, 이 때 상기 중쇄 불변 영역은 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서는, Fc 영역의 N-글라이코실화가 제거된다. 몇몇 실시양태에서는, Fc 영역이 N-글라이코실화 인지 서열 내에 돌연변이를 포함함으로써, 항체 또는 폴리펩타이드의 Fc 영역이 N-글라이코실화되지 않는다. 몇몇 실시양태에서는, Fc 영역이 PEG일화된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역은 A330P331의 S330S331(야생형 IgG2a 서열을 참조한 아미노산의 넘버링)로의 돌연변이를 함유하는 인간의 중쇄 IgG2a 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 E233F234L235의 P233V234A235로의 돌연변이를 포함하는 IgG4의 불변 영역을 포함한다. 이들 아미노산 위치는 카바트 넘버링을 기준으로 한 위치이다.

다른 요지에서, 본 발명은 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 단편 또는 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드(이는 단리될 수 있음)를 제공한다. 한 실시양태에서, 단편은 항체 6G의 경쇄이다. 다른 실시양태에서, 단편은 항체 6G의 중쇄이다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 항체 6G의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역을 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 단편은 항체 6G의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상(즉, 하나, 둘, 3개, 4개, 5개, 6개)의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다.

또 다른 요지에서, 본 발명은 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드(이는 단리될 수 있음)이다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9 및 서열번호 10에 나타낸 폴리뉴클레오타이드중 하나 또는 둘 다를 포함한다.

다른 요지에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체(항체 단편 포함) 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또 다른 요지에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(발현 벡터 및 클로닝 벡터 포함) 및 숙주 세포를 제공한다.

또 다른 요지에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포이다.

다른 요지에서, 본 발명은 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체에 의해 결합된 Aβ_1-40의 복합체이다.

또 다른 요지에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 항체 또는 폴리펩타이드에 의해 결합된 Aβ_1-40의 복합체이다.

또 다른 요지에서, 본 발명은 유효량의 본원에 기재된 임의의 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 항체 6G의 하나 이상의 CDR을 포함한다.

다른 요지에서, 본 발명은 항체 6G를 생성시킬 수 있는 조건하에서 항체 6G를 코딩하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 또는 그의 자손을 배양하고, 일부 실시양태에서는 항체 6G를 정제함을 포함하는, 항체 6G를 생성시키는 방법이다. 몇몇 실시양태에서, 발현 벡터는 서열번호 9 및 서열번호 10에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열중 하나 또는 둘 다를 포함한다.

다른 요지에서, 본 발명은 항체(이는 단일 경질 또는 중쇄로서 별도로 발현될 수 있거나, 또는 경쇄와 중쇄 둘 다가 하나의 벡터로부터 발현됨) 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 적합한 세포에서 발현시킨 후, 통상적으로는 해당 항체 또는 폴리펩타이드를 회수 및/또는 단리함으로써, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 폴리펩타이드를 생성시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 알쯔하이머병 및 변화된 Aβ 또는 βAPP 발현, 또는 Aβ 펩타이드의 축적과 관련된 다른 질환[예: 다운(Down's) 증후군, 파킨슨(Parkinson's)병, 다발-경색 치매, 가벼운 인지 손상, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 우울증, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob)병, 루이체(Lewy body)를 갖는 치매 및 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)]의 발병을 예방, 치료, 억제 또는 지연시키는 방법도 제공한다. 이 방법은 본 발명의 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자(subject)에게 투여함을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 알쯔하이머병 또는 Aβ 펩타이드의 축적과 관련된 다른 질환에 수반되는 증상의 발생을 지연시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 아밀 로이드 반점의 형성 및/또는 아밀로이드 축적을 억제하는 방법도 제공한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 환자의 뇌(뇌 조직)에 존재한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 대뇌 맥관계에 존재한다. 다른 실시양태에서, 아밀로이드 축적은 순환계에서 이루어진다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 아밀로이드 반점 및/또는 아밀로이드 축적을 감소시키는 방법도 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 환자의 뇌(뇌 조직)에 존재한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 대뇌 맥관계에 존재한다. 다른 실시양태에서, 아밀로이드 축적은 순환계에서 이루어진다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 아밀로이드 반점 및/또는 아밀로이드 축적을 제거하거나 없애는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 환자의 뇌(뇌 조직)에 존재한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 대뇌 맥관계에 존재한다. 다른 실시양태에서, 아밀로이드 축적은 순환계에서 이루어진다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드와 조직을 접촉시킴을 포함하는, 조직에서 Aβ 펩타이드의 축적을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 유효량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 Aβ 펩타이드(예컨대, 가용성, 올리고머 또는 침착된 형태)를 감소시키는 방법도 제공한다. 몇몇 실시양태에서는, 뇌에서 Aβ 펩타이드의 축적이 억제 및/또는 감소된다. 몇몇 실시양태에서는, Aβ 펩타이드의 독성 효과가 억제 및/또는 감소된다. 그러므로, 본 발명의 방법을 이용하여, Aβ 펩타이드의 축적이 존재하거나 의심되는 임의의 질환(예: 알쯔하이머병, 다운 증후군, 파킨슨병, 다발-경색 치매, 가벼운 인지 손상, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 우울증, 크로이츠펠트-야콥병 또는 루이체를 갖는 치매)을 치료할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 인지력을 개선시키거나 또는 Aβ의 아밀로이드 침착과 관련된 질환(예: 알쯔하이머병)에 수반되는 인지 저하를 역전시키는 방법을 제공한다.

본원에 기재된 임의의 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 항체 6G이다.

알쯔하이머병 및 변화된 Aβ 또는 βAPP 발현과 관련된 다른 질환(예: 다운 증후군 및 AIDS)을 검출, 진단 및 모니터링하는 데에도 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드를 또한 사용할 수 있다. 이 방법은 변화된 Aβ 또는 βAPP 발현을 갖는 것으로 의심되는 환자의 검체를 본 발명의 항체와 접촉시키고, Aβ 또는 βAPP 수준이 대조용 또는 비교용 검체와 상이한지의 여부를 결정함을 포함한다. 일부 실시양태에서는, 항-Aβ 항체의 투여 전후에 Aβ의 혈청 수준을 측정하고, Aβ의 혈청 수준의 임의의 증가를 사정한다.

정맥내, 피하, 흡입을 통해, 동맥내, 근육내, 심장내, 심실내, 비경구, 경막 내 및 복강내를 비롯한 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드를 투여할 수 있다. 투여는 전신성(예컨대, 정맥내)이거나 국부화될 수 있다. 이는 일반적으로 본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드에도 적용된다.

다른 요지에서, 본 발명은 본원에 기재된 조성물중 임의의 하나 이상을 포함하는 키트 및 조성물을 제공한다. 통상적으로 적합한 포장재 내에 적절한 사용 설명서가 제공되는 이들 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에 유용하다.

도 1은 6G 항체의 중쇄 가변 영역(서열번호 1) 및 경쇄 가변 영역(서열번호 2)의 아미노산 서열을 도시한다. 카바트 CDR은 진한 글씨로 기재되어 있고, 코티아 CDR은 밑줄이 그어져 있다. 중쇄 가변 영역의 아미노산 잔기 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 잔기는 연속적으로 번호가 매겨져 있다.

도 2는 ELISA에 의한 항체 6G의 항원결정기 맵핑(mapping)을 도시한다. Aβ 펩타이드(1-16, 1-28, 17-40, 17-42, 22-35, 28-40, 28-42, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43 및 33-40)를 ELISA 플레이트에 부동화시켰다. 단클론 항체 6G(20nM)를 다양한 부동화된 펩타이드와 함께 1시간동안 배양하였다. 염소 항-인간 카파 HRP 컨쥬게이트된 2차 항체를 사용하여 부동화된 Aβ 펩타이드에 결합된 항체 6G를 측정하였다.

도 3은 ELISA에 의한 항체 6G의 항원결정기 맵핑을 도시한다. 다양한 Aβ 펩타이드(위쪽 서열로부터 아래쪽 서열까지 서열번호 18 내지 29가 부여됨)를 ELISA 플레이트 상에 부동화시켰다. 항체 6G를 다양한 부동화된 펩타이드와 함께 1시간동안 배양하였다. 염소 항-인간 카파 HRP 컨쥬게이트된 2차 항체를 사용하여 부동화된 Aβ 펩타이드에 결합된 항체 6G를 측정하였다. "NB"는 결합이 검출되지 않았음을 표시한다.

도 4는 항체 6G가 결합하는 Aβ 상의 항원결정기를 도시하는 개략적인 그래프이다. 세포막에서 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 및 APP의 일부에서의 Aβ의 상대적인 위치가 표시되어 있다. "CT99"는 APP의 C-말단 99 아미노산을 말한다. 나타낸 아미노산 서열에는 서열번호 30이 부여된다.

도 5는 Aβ_1-16에 대한 단클론 항체(m2324) 및 항체 6G를 갖는 APP 발현 세포의 면역 염색을 보여주는 사진이다. 위쪽 패널은 m2324 또는 6G(각각 5ug/ml)와 함께 세포를 배양한 후 형광 현미경 하에서의 세포를 보여주며, 2차 Cy3-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 또는 항-인간 항체에 의해 결합을 검출하였다. 아래쪽 패널은 현미경 하에서 관찰된 세포를 보여준다.

도 6은 ELISA에 의한 항체 2294 및 6G의 항원결정기 맵핑을 도시한다. 다양한 Aβ 펩타이드(위쪽 서열로부터 아래쪽 서열까지 서열번호 18 내지 26, 31, 및 27 내지 29가 부여됨)를 ELISA 플레이트 상에 부동화시켰다. 다양한 부동화된 펩타이드와 함께 항체를 1시간동안 배양하였다. 염소 항-인간 카파 HRP 컨쥬게이트된 2차 항체를 사용하여 부동화된 Aβ 펩타이드에 결합된 항체 6G를 측정하였다. 중쇄 및 경쇄 둘 다에 결합하고 HRP 컨쥬게이트된 2차 항체인 염소 항-마우스를 사용하여, 부동화된 Aβ 펩타이드에 결합된 항체 2294를 측정하였다. "NB"는 결합이 검출되지 않았음을 표시한다. "2294" 및 "6G" 아래의 칼럼의 숫자는 450nm에서의 흡광도를 표시한다.

본원에 개시된 발명은 Aβ의 C-말단에 결합하는 항체 및 폴리펩타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 항체 및/또는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 항체 및 폴리펩타이드를 제조 및 사용하는 방법도 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항체, 폴리펩타이드, 또는 이들 항체 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효량을 환자에게 투여함으로써 환자에서 개체의 β-아밀로이드 침착과 관련된 질환(예: 알쯔하이머병, 다운 증후군, 다발-경색 치매, 가벼운 인지 손상, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 우울증, 크로이츠펠트-야콥병 및 루이체를 갖는 치매)을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

일반적인 기법

본 발명을 실행할 때에는 달리 표시되지 않는 한 당해 분야의 기술 내에 속하는 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 이용한다. 이들 기법은 문헌[예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, 샘브룩(Sambrook) 등, 1989, Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis, 게이트(M.J. Gait) 편집, 1984; Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook, 셀리스(J.E. Cellis) 편집, 1998, Academic Press; Animal Cell Culture, 프레쉬니(R.I. Freshney) 편집, 1987; Introduction to Cell and Tissue Culture, 매터(J.P. Mather) 및 로버츠(P.E. Roberts), 1998, Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, 도일(A. Doyle), 그리피쓰(J.B. Griffiths) 및 뉴웰(D.G. Newell) 편집, 1993-1998, J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 웨어(D.W. Weir) 및 블랙웰(C.C. Blackwell) 편집; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 밀러(J.M. Miller) 및 칼로스(M.P. Calos) 편집, 1987; Current Protocols in Molecular Biology, 오스벨(F.M. Ausubel) 등 편집, 1987; PCR: The Polymerase Chain Reaction, 뮬리스(Mullis) 등 편집, 1994; Current Protocols in Immunology, 콜리건(J.E. Coligan) 등 편집, 1991; Short Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, 1999; Immunobiology, 제인웨이(C.A. Janeway) 및 트래버스(P. Travers), 1997; Antibodies, 핀치(P. Finch), 1997; Antibodies: a practical approach, 캐티(D. Catty) 편집, IRL Press, 1988-1989; Monoclonal antibodies: a practical approach, 쉐퍼드(P. Shepherd) 및 딘(C. Dean) 편집, Oxford University Press, 2000; Using antibodies: a laboratory manual, 할로우(E. Harlow) 및 레인(D. Lane), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999; The Antibodies, 자네티(M. Zanetti) 및 카프라(J.D. Capra) 편집, Harwood Academic Publishers, 1995]에 충분히 설명되어 있다.

정의

"항체"는 면역 글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 하나 이상의 항원 인지 부위를 통해 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등과 같은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 면역 글로불린 분자이다. 본원에 사용되는 이 용어는 완전한 다클론 또는 단클론 항체뿐만 아니라 이들의 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 쇄(ScFv), 이들의 돌연변이체, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질 및 항원 인지 부위를 포함하는 면역 글로불린의 임의의 다른 변형된 형태도 포괄한다. 항체는 IgG, IgA 또는 IgM(또는 이들의 아군) 같은 임의의 부류의 항체를 포함하고, 항체는 임의의 특정 부류일 필요가 없다. 그의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 면역 글로불린은 상이한 부류로 지정될 수 있다. 면역 글로불린의 5가지 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들중 몇몇은 아군(아이소형), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉘어질 수 있다. 면역 글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중질-쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 면역 글로불린의 상이한 부류의 아단위 구조 및 3차원 형태는 잘 알려져 있다.

본원에 사용되는 "단클론 항체"는 실질적인 동종 항체의 개체군으로부터 수득되는 항체를 말한다. 즉, 개체군을 구성하는 개별 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연-발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원 부위로만 향한다. 뿐만 아니라, 전형적으로 상이한 결정인자(항원결정기)로 향하는 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자로만 향한다. 수식 어구 "단클론"은 항체의 특징을 실질적인 동종 개체군의 항체로부터 수득되는 것으로 나타내고, 임의의 특정 방법에 의해 항체를 생산해야 하는 것으로 간주되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 콜러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)에 의해 최초로 기재된 하이드리도마 방법[1975, Nature, 256:495]에 의해 제조될 수 있거나, 또는 미국 특허 제 4,816,567 호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 단클론 항체는 또한 예컨대 맥카퍼티(McCafferty) 등의 문헌[1990, Nature, 348:552-554]에 기재되어 있는 기법을 이용하여 제조된 파지 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

본원에 사용되는 "인간화된" 항체는 비-인간 면역 글로불린으로부터 유도되는 최소 서열을 함유하는 특이적인 키메라 면역 글로불린, 면역 글로불린 쇄 또는 이들의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 부서열)인 비-인간(예를 들어, 쥣과) 항체의 형태를 의미한다. 대부분, 인간화된 항체는 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 인간이 아닌 종(공여자 항체)(예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼)의 목적하는 특이성, 친화력 및 용량을 갖는 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간의 면역 글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에는, 인간 면역 글로불린의 Fv 골격 영역(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 뿐만 아니라, 인간화된 항체는 수용자 항체에서도 또한 도입된 CDR 또는 골격 서열에서도 발견되지 않지만 항체 성능을 추가로 정제 및 최적화시키기 위하여 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 이 때 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역 글로불린의 CDR 영역에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역 글로불린 컨센서스 서열의 FR 영역이다. 인간화된 항체는 최적으로는 또한 면역 글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)(전형적으로는 인간 면역 글로불린의 불변 영역 또는 도메인임)의 적어도 일부를 포함한다. 항체는 WO 99/58572 호에 기재된 바와 같이 개질된 Fc 영역을 가질 수 있다. 인간화된 항체의 다른 형태는 원래 항체와 관련하여 변화된 하나 이상의 CDR(1, 2, 3, 4, 5, 6개)을 갖는데, 이는 또한 원래 항체로부터의 하나 이상의 CDR"로부터 유도된" 하나 이상의 CDR이라고도 불린다.

본원에 사용되는 "인간 항체"는 인간에 의해 생성되고/되거나 당해 분야에 공지되어 있거나 본원에 개시된 임의의 인간 항체 제조 기법을 이용하여 제조된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 인간 항체의 이 정의는 하나 이상의 인간 중쇄 폴리펩타이드 또는 하나 이상의 인간 경쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함한다. 이의 한 예는 쥣과의 경쇄 폴리펩타이드 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체이다. 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 기법을 이용하여 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 한 실시양태에서는, 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 인간 항체를 선택한다[보건(Vaughan) 등, 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; 시츠(Sheets) 등, 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; 후겐붐(Hoogenboom) 및 윈터(Winter), 1991, J. Mol. Biol., 227:381; 막스(Marks) 등, 1991, J. Mol. Biol., 222:581]. 내인성 면역 글로불린 유전자를 부분적으로 또는 완전히 불활성화시킨 유전자 이전 동물(예컨대, 마우스) 내로 인간 면역 글로불린 위치를 도입함으로써도 인간 항체를 제조할 수 있다. 이 방법은 미국 특허 제 5,545,807 호; 제 5,545,806 호; 제 5,569,825 호; 제 5,625,126 호; 제 5,633,425 호; 및 제 5,661,016 호에 기재되어 있다. 다르게는, 표적 항원으로 향하는 항체를 생성시키는 인간 B 림프구를 영속화시킴으로써 인간 항체를 제조할 수 있다(이러한 B 림프구는 개체로부터 회수될 수 있거나 또는 시험관 내에서 면역화될 수 있다). 예를 들어, 콜(Cole) 등의 문헌[Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p. 77 (1985)]; 및 뵈너(Boerner) 등의 문헌[1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]; 및 미국 특허 제 5,750,373 호 참조.

본원에 사용되는 용어 "6G" 및 "항체 6G"는 호환가능하게 사용되며 서열번호 11에 나타낸 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 12에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 1에 표시되어 있다. 항체 6G의 CDR 부위(코티아 CDR 및 카바트 CDR 포함)가 도 1에 도표로 표시되어 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 13 및 서열번호 14로 나타낸다. 6G의 특징 결정은 실시예에 기재된다.

용어 "폴리펩타이드", "올리고펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 호환가능하게 사용되며 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 의미한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 개질된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 차단될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개입(예컨대, 다이설파이드 결합 형성, 글라이코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 라벨링 성분과의 컨쥬게이션 같은 임의의 다른 조작 또는 개질)에 의해 개질된 아미노산 중합체도 포괄한다. 이 정의에는 또한 예컨대 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함) 및 당해 분야에 공지되어 있는 다른 개질을 함유하는 폴리펩타이드도 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드가 항체에 기초하기 때문에, 폴리펩타이드는 단일 쇄 또는 관련 쇄로서 발생될 수 있는 것으로 생각된다.

본원에서 호환가능하게 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 일컬으며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 개질된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RAN 폴리머라제에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 이들의 유사체 같은 개질된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 중합체의 조립 전후에 뉴클레오타이드 구조를 개질시킬 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 차단될 수 있다. 중합 후에 예컨대 라벨링 성분과의 컨쥬게이션에 의해 폴리뉴클레오타이드를 추가로 개질시킬 수 있다. 다른 유형의 개질은 예를 들어 "캡"; 천연 발생 뉴클레오타이드중 하나 이상을 유사체로 치환함; 예컨대 하전되지 않은 연결기(예: 메틸 포스폰에이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카밤에이트 등) 및 하전된 연결기(예: 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등)를 사용한 개질, 예컨대 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩타이드, 플라이-L-리신 등) 같은 펜던트 분절을 함유하는 개질, 계간삽입자(예: 아크리딘, 소랄렌 등)를 사용한 개질, 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 개질, 알킬화제를 함유하는 개질, 개질된 연결기(예: 알파 아노머 핵산 등)를 사용한 개질 같은 뉴클레오타이드간 개질; 및 폴리뉴클레오타이드(들)의 개질되지 않은 형태를 포함한다. 또한, 당에 원래 존재하는 임의의 하이드록실기를 예를 들어 포스폰에이트기, 포스페이트기로 대체하거나, 표준 보호기로 보호하거나, 또는 추가적인 뉴클레오타이드에 추가의 연결기를 제조하도록 활성화시킬 수 있거나, 또는 고체 지지체에 컨쥬게이트시킬 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH를 포스포릴화시키거나, 또는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 유기 캡핑 기 분절로 치환시킬 수 있다. 다른 하이드록실은 또한 표준 보호기로 유도화시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 2'--O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보즈, 탄소환상 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당(예: 아라비노즈, 자일로즈 또는 라익소즈), 피라노즈 당, 퓨라노즈 당, 세도헵툴로즈, 비환상 유사체 및 비염기성 뉴클레오사이드 유사체(예: 메틸 리보사이드)를 비롯한 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있는 리보즈 또는 데옥시리보즈 당의 유사한 형태도 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포다이에스터 연결기를 다른 연결기로 대체할 수 있다. 이들 다른 연결기는 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), (O)NR₂("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂("폼아세탈")로 대체된 실시양태를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않으며, 이 때 R 또는 R'은 각각 독립적으로 H 또는 임의적으로 에터(-O-) 연결기를 함유하는 치환되거나 치환되지 않은 알킬(C 1 내지 20개), 아릴, 알켄일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 아르알딜이다. 폴리뉴클레오타이드의 모든 연결기가 동일할 필요는 없다. 전술한 기재내용은 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에 언급되는 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.

항체의 "가변 영역"은 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역(단독으로 또는 조합하여)을 말한다. 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변(hypervariable) 영역으로도 알려진 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된 4개의 골격 영역(FR)으로 이루어진다. 각 쇄의 CDR은 FR에 의해 근접하게 함께 유지되며, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. 두 가지 이상의 CDR을 결정하는 기법이 있다: (1) 종을 뛰어넘는(cross-species) 서열 가변성에 기초한 방법[즉, 카바트 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, 1991, 국립보건원, 메릴랜드주 베데스다]; 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 방법[알-라지카니(Al-lazikani) 등, (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948]. 본원에 사용되는 CDR은 상기 방법중 한 방법에 의해 또는 두 방법의 조합에 의해 정의된 CDR을 나타낼 수 있다.

항체의 "불변 영역"은 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역(단독으로 또는 조합하여)을 일컫는다.

항체 또는 폴리펩타이드에 "우선적으로 결합하거나" 또는 "특이적으로 결합하는"(본원에서 호환성 있게 사용됨) 항원결정기는 당해 분야에서 널리 알려져 있는 용어이고, 이러한 특이적이거나 우선적인 결합을 결정하는 방법도 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 한 분자가 다른 세포 또는 성분에 비해 특정 세포 또는 성분과 더욱 빈번하게, 더욱 신속하게, 더 큰 지속력 및/또는 더 큰 친화력으로 반응 또는 회합하는 경우, 이는 "특이적인 결합" 또는 "우선적인 결합"을 나타낸다고 말해진다. 한 항체가 다른 성분과 결합하는 것보다 더 큰 친화력, 갈망으로, 더욱 용이하게 및/또는 더 큰 지속력으로 결합한다면 이 항체는 표적에 "특이적으로 결합하거나" 또는 "우선적으로 결합한다". 예를 들어, 하나의 Aβ_1-40 항원결정기에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 Aβ_1-40 항원결정기 또는 비-Aβ_1-40 항원결정기와 결합하는 것보다 더 큰 친화력, 갈망으로, 더욱 용이하게 및/또는 더 큰 지속력으로 이 항원결정기와 결합하는 항체이다. 또한, 이 정의를 읽음으로써, 예컨대 제 1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 분절 또는 항원결정기)는 제 2 표적와 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 그러지 않을 수 있음을 알게 된다. "특이적인 결합" 또는 "우선적인 결합"은 반드시 배타적인 결합을 요구하지는 않는다(배타적인 결합을 포함할 수는 있지만). 일반적으로(반드시는 아님), 결합을 인용하는 경우는 우선적인 결합을 의미한다.

본원에 사용되는 "실질적으로 순수한"은 50% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상 순수한(즉, 오염물을 함유하지 않는) 물질을 지칭한다.

"숙주 세포"는 폴리뉴클레오타이드 삽입물을 혼입시키기 위한 벡터(들)의 수용자일 수 있거나 수용자인 개별 세포 또는 세포 배양액을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 이 자손은 자연적인, 우연한 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모세포와 반드시 완전히 동일(형태 면에서 또는 게놈 DNA 보체 면에서)한 것은 아닐 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(들)로 생체 내에서 형질감염된 세포를 포함한다.

용어 "Fc 영역"을 사용하여 면역 글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의한다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이 Fc 영역일 수 있다. 면역 글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 변함에도 불구하고, 인간의 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상 위치 Cys226의 아미노산 잔기로부터 또는 Pro230으로부터 그의 카복실-말단까지 연장되는 것으로 정의된다. Fc 영역에서 잔기의 번호는 카바트의 문헌에서와 같은 EU 색인의 번호이다. 카바트 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, Public Health Service, 국립보건원, 메릴랜드주 베데스다, 1991] 참조. 면역 글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, 즉 CH2 및 CH3을 포함한다.

본원에 사용되는 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체와 결합하는 것(감마 수용체)이고, Fc_γRI, Fc_γRII 및 Fc_γRIII 아군의 수용체를 포함한다(이들 수용체의 대립 유전자 변이체 및 다르게 스플라이싱된 형태 포함). Fc_γRII 수용체는 Fc_γRIIA("활성화 수용체") 및 Fc_γRIIB("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 이들의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 라베치(Ravetch) 및 키넷(Kinet)의 문헌[1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92]; 케이플(Capel) 등의 문헌[1994, Immunomethods, 4:25-34]; 및 드 하스(de Haas) 등의 문헌[1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41]에 개관되어 있다. "FcR"은 또한 신생아 수용체인 FcRn도 포함하며, 이는 어머니 IgG의 태아로의 전달을 담당한다[과이어(Guyer) 등, 1976, J. Immunol., 117:587; 킴(Kim) 등, 1994, J. Immunol., 24:249].

"보체 의존성 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재하에서의 표적의 용해를 일컫는다. 보체 시스템의 제 1 성분(C1q)을 동족형 항원과 복합된 분자(예: 항체)에 결합시킴으로써 보체 활성화 경로를 개시한다. 보체 활성화를 사정하기 위하여, 예컨대 가자노-산토로(Gazzano-Santoro) 등의 문헌[J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.

"기능성 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 작동자 기능을 갖는다. 예시적인 "작동자 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개되는 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예: B 세포 수용체; BCR)의 하향-조절 등을 포함한다. 이러한 작동자 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예: 항체 가변 도메인)과 결합할 것을 요구하며, 이러한 항체 작동자 기능을 평가하기 위해 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 분석법을 이용하여 사정할 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 천연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이 Fc 영역"은 하나 이상의 아미노산 개질로 인해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과는 상이하지만 여전히 천연 서열 Fc 영역의 하나 이상의 작동자 기능을 보유하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모폴리펩타이드의 Fc 영역과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환(천연 서열 Fc 영역 또는 모폴리펩타이드의 Fc 영역에 예컨대 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환)을 갖는다. 본원에서 변이 Fc 치환은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모폴리펩타이드의 Fc 영역과 80% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖는다.

본원에 사용되는 "항체-의존성 세포-매개되는 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예컨대, 천연 킬러(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포상의 결합된 항체를 인식한 후 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개되는 반응을 말한다. 미국 특허 제 5,500,362 호 또는 제 5,821,337 호에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 분석법을 이용하여 해당 분자의 ADCC 활성을 사정할 수 있다. 이러한 분석법에 유용한 작동자 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 다르게는 또는 추가적으로, 예를 들어 클라인즈(Clynes) 등의 문헌[1998, PNAS (USA), 95:652-656]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 생체 내에서 해당 분자의 ADCC 활성을 사정할 수 있다.

본원에 사용되는 "유효 투여량" 또는 "유효량"의 약물, 화합물 또는 약학 조성물은 유리하거나 목적하는 결과를 수행하는데 충분한 양이다. 예방용 사용의 경우, 유리하거나 목적하는 결과는 질환의 위험의 제거 또는 감소, 중증도의 경감, 또는 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동적 증상, 질환의 발병 동안 나타나는 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 비롯한 질환의 개시의 지연을 포함한다. 치료용 사용의 경우, 유리하거나 목적하는 결과는 아밀로이드 반점 형성의 저해, 억제 또는 감소, 아밀로이드 반점의 감소, 제거, 없앰, 인지 개선, 인지 저하의 역전 또는 둔화, 생체 유체 내에서 순환되는 가용성 Aβ 펩타이드의 격리 또는 증가, 질환의 발병 동안 나타나는 그의 합병증 및 중간 병리학적 표현형을 비롯한 질환으로부터 야기되는 하나 이상의 증상(생화학적, 조직학적 및/또는 행동적)의 감소, 질환을 앓는 환자의 생활의 질 증가, 질환을 치료하는데 요구되는 다른 약물의 투여량 감소, 다른 약물의 효과 향상, 질환의 진행 지연 및/또는 환자의 생존 연장 같은 임상적 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여할 수 있다. 본 발명의 경우, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 유효 투여량은 직접적으로 또는 간접적으로 예방적 또는 치료적 처치를 달성하는데 충분한 양이다. 임상적 내용에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 약학 조성물의 유효 투여량은 다른 약물, 화합물 또는 약학 조성물과 함께 달성될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 따라서, "유효 투여량"은 하나 이상의 치료제를 투여하는 상황에서 생각될 수 있으며, 단일 약제는 하나 이상의 다른 약제와 함께 바람직한 결과를 달성할 수 있거나 달성하는 경우 유효량으로 주어진 것으로 생각될 수 있다.

본원에 사용되는 "처치" 또는 "처치하는"은 임상적 결과를 비롯한 유리하거나 목적하는 결과를 수득하기 위한 해결책이다. 본 발명에서, 유리하거나 목적하는 임상적 결과는 아밀로이드 반점 형성의 저해, 억제 또는 감소, 아밀로이드 반점의 감소, 제거 또는 없앰, 인지 개선, 인지 저하의 역전 또는 둔화, 생체 유체 중에서 순환되는 가용성 Aβ 펩타이드의 격리, 조직(예: 뇌)에서의 Aβ 펩타이드(가용성, 올리고머 또는 침착된 펩타이드 포함)의 감소, 뇌에서의 Aβ 펩타이드의 축적 저해, 둔화 및/또는 감소, 조직(예: 뇌)에서의 Aβ 펩타이드의 독성 효과의 둔화 및/또는 감소, 질환으로부터 야기되는 증상의 감소, 질환을 앓는 환자의 생활의 질 향상, 질환을 치료하는데 요구되는 다른 약물의 투여 감소, 질환의 진행 지연 및/또는 환자의 생존 연장중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 국한되지는 않는다.

본원에 사용되는 알쯔하이머병의 발병을 "지연시킴"은 이 질환의 발병을 늦춤, 방해, 둔화, 지연, 안정화 및/또는 연기시킴을 의미한다. 이 지연은 치료되는 질환 및/또는 환자의 이력에 따라 그 시간의 길이가 달라질 수 있다. 당해 분야의 숙련자에게 명백한 바와 같이, 충분하거나 상당한 지연은 각 개체에서 질환이 발병하지 않는다는 점에서 실제로 예방을 포괄할 수 있다. 알쯔하이머병의 발병을 "지연시키는" 방법은 이 방법을 이용하지 않을 때와 비교하여 소정 시간의 틀 내에서 질환 발병 가능성을 감소시키고/시키거나 소정 시간의 틀 내에서 질환의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 숫자의 환자를 이용하는 임상적 연구에 기초한다.

알쯔하이머병의 "발병"은 개체 내에서의 알쯔하이머병의 개시 및/또는 진행을 의미한다. 본원에 기재되는 표준 임상적 기법을 이용하여 알쯔하이머병의 발병을 검출할 수 있다. 그러나, 발병은 또한 초기에는 검출될 수 없을 수 있는 질환 진행을 일컫는다. 본 발명에서, 진행은 이 경우 표준 신경학적 시험 또는 환자 인터뷰에 의해 결정되거나 더욱 특수화된 시험에 의해 결정될 수 있는 질환 상태의 생물학적 경과를 일컫는다. 이들 다양한 진단 시험은 뇌영상(neuroimaging), 혈청 또는 뇌척수액중 특수 단백질(예컨대, 아밀로이드 펩타이드 및 Tau)의 수준 변화 검출, 전산화 단층 촬영술(CT) 및 자기 공명 영상(MRI)을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. "발병"은 발생, 재발 및 개시를 포함한다. 본원에 사용되는 알쯔하이머병의 "개시" 또는 "발생"은 최초의 개시 및/또는 재발을 포함한다.

본원에 사용되는 "함께" 투여함은 동시 투여 및/또는 상이한 시점에서의 투여를 포함한다. 함께 투여함은 또한 공동-제제로서의 투여 또는 별도의 조성물로서의 투여를 포괄한다. 본원에 사용되는 함께 투여함은 항-Aβ 항체 및 다른 약제를 개체에 투여하는(이는 동시에 및/또는 별도로 이루어질 수 있음) 임의의 상황을 포괄하는 의미이다. 본원에 추가로 논의되는 바와 같이, 항-Aβ 항체 및 다른 약제를 상이한 투여 빈도 또는 간격으로 투여할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 항-Aβ 펩타이드는 주 1회 투여할 수 있는 반면, 다른 약제는 덜 빈번하게 투여할 수 있다. 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 이용하여 항-Aβ 항체 및 다른 약제를 투여할 수 있는 것으로 이해된다.

"생물학적 샘플"은 개체로부터 수득되고 진단 또는 모니터링 분석법에 사용될 수 있는 다양한 샘플 유형을 포괄한다. 이 정의는 혈액 및 생물 기원의 다른 액체 샘플, 생검 검체 또는 조직 배양물 또는 그로부터 유도되는 세포 같은 고체 조직 샘플, 및 이들의 자손을 포괄한다. 이 정의는 또한 시약을 사용한 처리, 가용화 또는 특정 성분(예: 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드)의 풍부화, 또는 구획화를 위한 반고체 또는 고체 매트릭스 내에서의 매립에 의한 것과 같이 획득 후 임의의 방식으로 조작된 샘플을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상적 샘플을 포괄하고, 또한 배양액중의 세포, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생체 유체 및 조직 샘플도 포함한다.

"환자"("개체"라고 달리 일컬음)는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 또한 가축(예: 젖소), 스포츠용 동물, 애완동물(예: 고양이, 개, 말), 영장류, 마우스 및 래트도 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다.

본원에 사용되는 "벡터"는 숙주 세포에서 흥미있는 하나 이상의 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달 및 바람직하게는 발현할 수 있는 구조물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 나상(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 관련된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 프로듀서(producer) 세포 같은 특정 진핵생물 세포를 포함하지만, 이들로 국한되지는 않는다.

본원에 사용되는 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 조종하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 구성 프로모터 또는 유도성 프로모터 같은 프로모터, 또는 증강자(enhancer)일 수 있다. 발연 제어 서열은 전사되어야 하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.

본원에 사용되는 "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분과 조합될 때 활성 성분이 생물학적 활성을 보유할 수 있게 하고 환자의 면역 시스템과 비-반응성인 임의의 물질을 포함한다. 예로는 인산염 완충된 염수 용액, 물, 오일/물 유화액 같은 유화액 및 다양한 유형의 습윤제 등의 임의의 표준 약학 담체가 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여에 바람직한 희석제는 인산염 완충된 염수 또는 생리식염수(0.9%)이다. 널리 공지되어 있는 통상적인 방법[예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences , 제18판, 제나로(A. Gennaro) 등, Mack Publishing Co., 펜실베이니아주 이스턴, 1990; 및 Remington , The Science and Practice of Pharmacy 제20판, Mack Publishing, 2000 참조]에 의해 이러한 담체를 포함하는 조성물을 배합한다.

본원에 사용되는 용어 "k_on"은 항체의 항원에 대한 회합의 온(on) 속도 상수를 나타내고자 한다.

본원에 사용되는 용어 "k_off"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리의 오프(off) 속도 상수를 나타내고자 한다.

본원에 사용되는 용어 "K_D"는 항체-항원 상호작용의 평형상태 해리 상수를 나타내고자 한다.

조성물 및 조성물의 제조 방법

항-β-아밀로이드 항체 및 폴리펩타이드

본 발명은 Aβ 펩타이드의 C-말단에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 Aβ_1-40, Aβ_1-42 및 Aβ_1-43에 결합하는 항체 또는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 Aβ_1-42 및 Aβ_1-43에 대한 결합보다 더 큰 친화력으로 Aβ_1-40에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 Aβ_1-36, Aβ_1-37, Aβ_1-38 및 Aβ_1-39에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 Aβ_22-35에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 Aβ_28-40에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 아미노산 25 내지 34 및 40을 포함하는 Aβ_1-40 상의 항원결정기에 결합한다.

본 발명은 또한, 본원에 기재된 임의의 항체 또는 폴리펩타이드(예컨대, 항체 6G 및 표 3에 나타낸 그의 변이체, 또는 항체 6G 및 표 3에 나타낸 그의 변이체로부터 유도되는 폴리펩타이드); 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물을 비롯한 조성물을 제공한다. 본원에 사용되는 조성물은 Aβ_1-40의 C-말단에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 폴리펩타이드(항체일 수 있거나 아닐 수 있음), 및/또는 Aβ_1-40에 결합하는 하나 이상의 항체 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이들 조성물은 당해 분야에 널리 공지되어 있는 완충액을 비롯한 약학적으로 허용가능한 부형제 같은 적합한 부형제를 추가로 포함할수 있다.

본 발명의 항체 및 폴리펩타이드는 하기 임의의(하나 이상) 특징을 그 특징으로 한다: (a) Aβ_1-40, Aβ_1-42, 및 Aβ_1-43에 결합함; (b) Aβ_1-42 및 Aβ_1-43보다 Aβ_1-40에 대해 더 높은 친화력으로 Aβ_1-40, Aβ_1-42, 및 Aβ_1-43에 결합함; (c) 아미노산 25 내지 34 및 40을 포함하는 Aβ_1-40상의 항원결정기에 결합함; (d) Aβ_1-36, Aβ_1-37, Aβ_1-38 및 Aβ_1-39에 결합하지만 Aβ_1-40에 대한 결합에 비해 더 낮은 친화력으로 결합함; (e) 약 1μM 미만의 K_D로 Aβ_22-37에 결합함; (f) Aβ_22-35에 결합함; (g) Aβ_28-40에 결합함; (h) 세포에서 발현되는 APP에 결합하지 않음; (i) 환자에서 아밀로이드 반점의 형성을 억제함; (j) 환자에서 아밀로이드 반점을 감소시킴; (k) 알쯔하이머병 또는 Aβ 축적과 관련된 다른 질환(예컨대, 다운 증후군, 파킨슨병, 다발-경색 치매, 가벼운 인지 손상, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 우울증, 크로이츠펠트-야콥병, 루이체를 갖는 치매)의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 경감시킴; (l) 인지 기능을 개선시킴. 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드는 또한 본원에 기재된 손상된 작동자 기능을 가질 수 있다. 손상된 작동자 기능을 갖는 항체 및 폴리펩타이드는 다른 보고된 항-Aβ 항체와는 대조적으로 바람직한 안전성 프로파일을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 뇌 맥관계에서의 출혈(대뇌 출혈); 뇌수막염(자기 공명 스캔 변화 포함); 뇌척수액중 백혈구 수의 상승; 중추신경계 염증중 임의의 하나 이상의 상당한 또는 허용불가능한 수준을 야기하지 않을 수 있다.

따라서, 본 발명은 (a) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체; (b) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 단편 또는 영역; (c) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄; (d) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 중쇄; (e) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역(들); (f) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 하나 이상의 CDR(들)(하나, 둘, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR); (g) 항체 6G의 중쇄로부터의 CDR H3; (h) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 CDR L3; (i) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDR; (j) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 중쇄로부터의 3개의 CDR; (k) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDR 및 중쇄로부터의 3개의 CDR; 및 (l) (b) 내지 (k)중 임의의 하나를 포함하는 항체중 임의의 것 또는 이들을 포함하는 조성물(약학 조성물 포함)을 제공한다. 본 발명은 또한 상기중 임의의 하나 이상을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다.

항체 6G의 CDR 부분(코티아 CDR 및 카바트 CDR 포함)은 도 1에 도시되어 있다. CDR 영역의 결정은 당해 분야의 기술 내에 속한다. 몇몇 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR과 코티아 CDR의 조합(또한 "조합된 CDR" 또는 "연장된 CDR"이라고도 함)일 수 있는 것으로 이해된다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 다른 실싱양태에서, CDR은 코티아 CDR이다. 달리 말해, 하나보다 많은 CDR을 갖는 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR, 조합 CDR, 또는 이들의 조합중 임의의 것일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 하나 이상, 둘 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 CDR 모두와 실질적으로 동일한 하나 이상, 둘 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 CDR 모두를 포함하는 폴리펩타이드(항체일 수 있거나 아닐 수 있음)를 제공한다. 다른 실시양태는 6G의 또는 6G로부터 유도되는 둘 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개의 CDR과 실질적으로 동일한 둘 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개의 CDR(들)을 갖는 항체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상, 둘 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개의 CDR(들)은 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 하나 이상, 둘 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개의 CDR과 약 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88%, 이상, 89% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일하다. 본 발명에서는 활성의 한도가 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체에 비해 변화(더 크거나 더 작을 수 있음)할 수 있기는 하지만 결합 특이성 및/또는 전반적인 활성이 일반적으로 유지되는 것으로 생각된다.

본 발명은 또한 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 서열의 5개 이상의 인접 아미노산, 8개 이상의 인접 아미노산, 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 15개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 25개 이상의 인접 아미노산, 약 30개 이상의 인접 아미노산중 임의의 것을 갖되, 아미노산중 3개 이상이 6G(도 1) 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 가변 영역으로부터 제공되는, 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드(항체일 수 있거나 아닐 수 있음)도 제공한다. 한 실시양태에서, 가변 영역은 6G의 경쇄로부터 제공된다. 다른 실시양태에서, 가변 영역은 6G의 중질 영역으로부터 제공된다. 예시적인 폴리펩타이드는 6G의 중쇄 가변 영역 및 졍질 쇄 가변 영역 둘 다로부터의 인접 아미노산(상기 기재된 길이)을 갖는다. 다른 실시양태에서, 5개(이상)의 인접 아미노산은 도 1에 나타낸 6G의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 제공된다. 일부 실시양태에서, 인접 아미노산은 6G의 가변 영역으로부터 제공된다.

본 발명의 항체 및 폴리펩타이드의 결합 친화력은 변할 수 있으며, 예시적인 실시양태가 아래 기재되는 바와 같이 특정 값 또는 범위일 필요가 없다(그러나 특정 값 또는 범위일 수 있음). 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드의 Aβ_1-40에 대한 결합 친화력(K_D로 측정됨)은 약 0.10 내지 약 0.80nM, 약 0.15 내지 약 0.75nM, 약 0.18 내지 약 0.72nM일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 친화력은 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 약 40pM이거나 또는 약 40pM보다 더 크다. 한 실시양태에서, 결합 친화력은 약 2 내지 22pM이다. 다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10nM 미만, 약 5nM 미만, 약 4nM 미만, 약 3nM 미만, 약 2nM 미만, 약 1nM 미만, 약 900pM 미만, 약 800pM 미만, 약 700pM 미만, 약 600pM 미만, 약 500pM 미만, 약 400pM 미만, 약 300pM 미만, 약 200pM 미만, 약 150pM 미만, 약 100pM 미만, 약 90pM 미만, 약 80pM 미만, 약 70pM 미만, 약 60pM 미만, 약 50pM 미만, 약 40pM 미만, 약 30pM 미만, 약 10pM 미만이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10nM이다. 다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10nM 미만, 약 50nM 미만, 약 100nM 미만, 약 150nM 미만, 약 200nM 미만, 약 250nM 미만, 약 500nM 미만, 또는 약 1000nM 미만이다. 다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 5nM 미만이다. 다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 1nM 미만이다. 다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 0.1nM 또는 약 0.07nM이다. 다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 0.1nM 미만 또는 약 0.07nM 미만이다. 다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 700pM, 약 600pM, 약 500pM, 약 400pM, 약 300pM, 약 200pM, 약 150pM, 약 100pM, 약 90pM, 약 80pM, 약 70pM, 약 60pM, 약 50pM, 약 40pM, 약 30pM, 약 10pM중 임의의 값으로부터 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM 또는 약 40pM중 임의의 값까지이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화력은 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 700pM, 약 600pM, 약 500pM, 약 400pM, 약 300pM, 약 200pM, 약 150pM, 약 100pM, 약 90pM, 약 80pM, 약 70pM, 약 60pM, 약 50pM, 약 40pM, 약 30pM, 약 10pM이다. 또 다른 실시양태에서, 결합 친화력은 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 약 40pM이거나 또는 약 40pM보다 더 크다.

본 발명의 항체 및 폴리펩타이드는 또한 Aβ_1-36, Aβ_1-37, Aβ_1-38, Aβ_1-39, Aβ_1-42, 및 Aβ_1-43중 임의의 하나 이상과 결합할 수 있으나, 이들 펩타이드중 임의의 하나 이상에 대한 결합 친화력은 Aβ_1-40에 대한 결합 친화력 미만이다. 일부 실시양태에서, Aβ_1-36, Aβ_1-37, Aβ_1-38, Aβ_1-39, Aβ_1-42, 및 Aβ_1-43중 임의의 하나 이상에 대한 항체 또는 폴리펩타이드의 K_D는 Aβ_1-40에 대한 K_D의 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 40배 이상, 약 50배 이상, 약 80배 이상, 약 100배 이상, 약 150배 이상, 약 200배 이상 또는 약 250배 이상이다.

본 발명은 또한 이들 임의의 항체 또는 폴리펩타이드를 제조하는 방법도 제공한다. 당해 분야에 공지되어 있는 절차에 의해 본 발명의 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, Aβ 펩타이드(예컨대, 면역원으로서 Aβ_25-40)를 사용하여 포유동물을 면역화시킴으로써 항체를 생성시킬 수 있다. 항체의 단백질 분해성 열화 또는 다른 열화에 의해, 상기 기재된 재조합 방법(즉, 단일 또는 융합 폴리펩타이드)에 의해 또는 화학적 합성에 의해 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다. 항체의 폴리펩타이드, 특히 약 50개 아미노산 이하의 보다 짧은 폴리펩타이드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 상업적으로 입수될 수 있다. 예를 들어, 고상 방법을 이용하는 자동화된 폴리펩타이드 합성기에 의해 항체를 생성시킬 수 있다. 또한, 미국 특허 제 5,807,715 호; 제 4,816,567 호; 및 제 6,331,415 호 참조.

다른 예에서는, 당해 분야에 널리 공지되어 있는 절차를 이용하여 재조합에 의해 항체를 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 9 및 서열번호 10에 나타낸 항체 6G의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서는, 서열번호 9 및 서열번호 10에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현 또는 전파용의 하나 이상의 벡터 내로 클로닝한다. 해당 항체를 코딩하는 서열을 숙주 세포 내에서 벡터에 유지할 수 있으며, 이어 숙주 세포를 팽창시키고 추후 사용을 위해 냉동시킬 수 있다. 벡터(발현 벡터 포함) 및 숙주 세포는 본원에 추가로 기재된다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체(예: 6G)의 단일 쇄 가변 영역 단편("scFv")도 포함한다. 짧은 연결 펩타이드를 사용하여 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결함으로써 단일 쇄 가변 영역 단편을 제조한다. 버드(Bird) 등의 문헌[(1988) Science 242:423-426] 참조. 연결 펩타이드의 예는 하나의 가변 영역의 카복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이의 약 3.5nm를 가교하는 (GGGGS)₃이다. 다른 서열의 연결기를 디자인하여 사용하였다. 버드 등의 상기 문헌(1988) 참조. 추가적인 기능(예컨대, 약물의 부착 또는 고체 지지체로의 부착)을 위해 연결기를 다시 개질시킬 수 있다. 재조합 방법에 의해 또는 합성에 의해 단일 쇄 변이체를 생성시킬 수 있다. scFv의 합성에 의한 생성을 위해, 자동화된 합성기를 이용할 수 있다. scFv의 재조합 생성을 위해, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 적합한 플라스미드를 적합한 숙주 세포(효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포 같은 진핵생물 세포, 또는 이. 콜라이(E. coli) 같은 원핵생물 세포) 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 연결(ligation) 같은 통상적인 조작에 의해 해당 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 당해 분야에 공지되어 있는 표준 단백질 정제 기법을 이용하여, 생성되는 scFv를 단리할 수 있다.

다이어바디(diabody) 같은 단일 쇄 항체의 다른 형태도 포괄한다. 다이어바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄 상에 발현되지만, 너무 짧아 동일한 쇄 상의 두 도메인 사이에서의 접합(pairing)을 허용할 수 없는 연결기를 사용함으로써 도메인이 다른 쇄의 상보적인 도메인과 접합하도록 하고 2개의 항원 결합 부위를 생성시키는 2가의 양특이성 항체이다[예컨대 홀리거(Holliger, P.) 등, (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; 폴작(Poljak, R.J.) 등, (1994) Structure 2:1121-1123 참조].

예를 들어, 본원에 개시된 항체를 사용하여 양특이성 항체, 즉 둘 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론 항체를 제조할 수 있다. 양특이성 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[예를 들어, 슈레쉬(Suresh) 등, 1986, Methods in Enzymology 121:210]. 전통적으로, 양특이성 항체의 재조합에 의한 제조는 2개의 면역 글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시 발현에 기초하였으며, 두 중쇄는 상이한 특이성을 가졌다[밀스타인(Millstein) 및 큐엘로(Cuello), 1983, Nature, 305, 537-539].

양특이성 항체를 제조하는 한 방법에 따라, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인(항체-항원 조합 부위)을 면역 글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합에서는 바람직하게는 힌지(hinge), CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역 글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 융합체중 하나 이상에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제 1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역 글로불린 중쇄 융합체 및 필요한 경우 면역 글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터 내로 삽입하고 적합한 숙주 생물체 내로 동시 형질감염시킨다. 이는 구조물에 사용되는 3개의 폴리펩타이드 쇄의 동일하지 않은 비가 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3개의 폴리펩타이드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 융통성을 부여한다. 그러나, 동일한 비의 둘 이상의 폴리펩타이드 쇄의 발현이 높은 수율을 제공하거나 또는 비가 특별히 중요하지 않을 때에는, 한 발현 벡터에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩타이드 쇄의 코딩 서열을 삽입할 수 있다.

한 방법에서, 양특이성 항체는 하나의 암(arm)에 존재하는 제 1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역 글로불린 중쇄 및 다른 암에 존재하는 하이브리드 면역 글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제 2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어진다. 이 비대칭 구조(양특이성 분자의 절반에만 면역 글로불린 경쇄가 있음)로 인해, 원치 않는 면역 글로불린 쇄 조합으로부터 목적하는 양특이성 화합물을 용이하게 분리시키게 된다. 이 방법은 1994년 3월 3일자로 공개된 PCT 공개 WO 94/04690 호에 기재되어 있다.

2개의 공유 결합된 항체를 포함하는 헤테로컨쥬게이트(heteroconjugate) 항체도 또한 본 발명의 영역에 속한다. 원치 않는 세포에 면역계 세포를 표적화시키는데(미국 특허 제 4,676,980 호), 또한 HIV 감염을 치료하는데(PCT 공개 WO 91/00360 호 및 WO 92/200373 호; EP 03089 호), 이들 항체를 사용해왔다. 임의의 통상적인 가교결합 방법을 이용하여 헤테로컨쥬게이트 항체를 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제 및 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 제 4,676,980 호에 기재되어 있다.

공지의 합성 단백질 화학 방법(가교결합제 포함)을 이용하여 키메라 또는 하이브리드 항체도 제조할 수 있다. 예를 들어, 다이설파이드 교환 반응을 이용하여 또는 티오에터 결합을 생성시킴으로써, 면역독소를 구성할 수 있다. 이 목적에 적합한 시약의 예는 아미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토뷰티르이미데이트를 포함한다.

당해 분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여, 항체 6G의 하나 이상의 CDR 또는 항체 6G로부터 유도되는 하나 이상의 CDR을 포함하는 인간화된 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 4개의 일반적인 단계를 이용하여 단클론 항체를 인간화시킬 수 있다. 이들은 다음과 같다: (1) 출발 항체 경질 가변 도메인 및 중질 가변 도메인의 뉴클레오타이드 및 예측되는 아미노산 서열을 결정함, (2) 인간화된 항체를 디자인함, 즉 인간화 공정 동안 어느 항체 골격 영역을 사용할 것인지를 결정함, (3) 실제로 인간화 방법/기법을 수행함, (4) 인간화된 항체를 형질감염 및 발현시킴. 예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호; 제 5,807,715 호; 제 5,866,692 호; 제 6,331,415 호; 제 5,530,101 호; 제 5,693,761 호; 제 5,693,762 호; 제 5,585,089 호; 제 6,180,370 호; 제 5,225,539 호; 제 6,548,640 호 참조.

재조합 인간화된 항체에서, Fc_γ 부위를 개질시켜 Fc_γ 수용체 및 보체 면역계와의 상호작용을 피할 수 있다. 이러한 유형의 개질은 케임브리지 대학 병리학부 마이크 클라크 교수(Dr. Mike Clark)가 디자인하였고, 이러한 항체 제조 기법은 1999년 11월 18일자로 공개된 WO 99/58572 호에 기재되어 있다.

예를 들어, 불변 영역을 인간 불변 영역과 더욱 닮도록 처리하여 항체를 인간에서의 임상 실험 및 치료에 사용하는 경우 면역 반응을 피할 수 있다. 예컨대, 미국 특허 제 5,997,867 호 및 제 5,866,692 호 참조.

본 발명은 특성에 큰 영향을 끼치지 않는 기능면에서 동일한 항체 및 향상되거나 감소된 활성 및/또는 친화력을 갖는 변이체를 비롯한 항체 6G의 개질체를 포괄한다. 예를 들어, 항체 6G의 아미노산 서열을 돌연변이시켜, Aβ_1-40 펩타이드에 대한 목적하는 결합 친화력을 갖는 항체를 수득할 수 있다. 폴리펩타이드의 개질은 당해 분야에서의 통상적인 관행이고, 본원에 상세하게 기재할 필요가 없다. 폴리펩타이드의 개질은 실시예에 예시된다. 개질된 폴리펩타이드의 예는 아미노산 잔기의 보존성 치환, 기능적 활성을 크게 유해하게 변화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 부가, 또는 화학적 유사체의 사용을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.

아미노산 서열 삽입체는 하나의 잔기로부터 수백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드까지의 길이에 이르는 아미노-말단 및/또는 카복실-말단 융합체, 및 단일 또는 복수개의 아미노산 잔기의 서열내 삽입체를 포함한다. 말단 삽입체의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 항원결정기 택에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.

치환 변이체는 항체 분자에 제거된 하나 이상의 아미노산 잔기 및 그 대신 삽입된 상이한 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이 발생의 보다 큰 흥미를 끄는 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변형도 고려된다. 보존성 치환은 표 1에서 "보존성 치환"이라는 제목 하에 표시되어 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성을 변화시키는 경우, 표 1에서 "예시적인 치환"으로 명명되거나 또는 아미노산 부류와 관련하여 아래 추가로 기재되는 더욱 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물이 스크리닝될 수 있다.

(a) 치환 구역에서 폴리펩타이드 골격의 구조를 예컨대 시트 또는 나선 형태로 유지하거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 측쇄의 벌크(bulk)를 유지하는데 있어서의 이들의 효과를 크게 변화시키는 치환을 선택함으로써, 항체의 생물학적 특성을 실질적으로 개질시킨다. 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 하기 군으로 나뉘어진다:

(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 극성(전하 없음): Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성(음으로 하전됨): Asp, Glu;

(4) 염기성(양으로 하전됨): Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 끼치는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.

이들 부류중 한 부류의 일원을 다른 부류로 교환함으로써 비-보존성 치환이 이루어진다.

항체의 적절한 형태를 보존하는데 관련되지 않는 임의의 시스테인 잔기를 또한 일반적으로 세린으로 치환시켜, 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교결합을 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)을 항체에 부가하여, 특히 항체가 Fv 단편 같은 항체 단편인 경우 그의 안정성을 개선시킬 수 있다.

아미노산 개질은 하나 이상의 아미노산의 변화 또는 개질로부터 가변 영역 같은 영역의 완전한 재디자인까지 이를 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화력 및/또는 특이성을 변화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서는, CDR 도메인 내에서 1 내지 5개 이하의 보존성 아미노산 치환을 달성한다. 다른 실시양태에서는, CDR 도메인 내에서 1 내지 3개 이하의 보존성 아미노산 치환을 이룬다. 또 다른 실시양태에서, CDR 도메인은 CDRH3 및/또는 CDR L3이다.

개질체는 또한 글라이코실화 및 비-글라이코실화 폴리펩타이드, 및 다른 전사후 개질(예컨대, 상이한 당을 사용한 글라이코실화, 아세틸화 및 포스포릴화)이 이루어진 폴리펩타이드를 포함한다. 항체의 불변 영역에서 보존된 위치에서 항체를 글라이코실화시킨다[제프리스(Jefferis) 및 룬드(Lund), 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; 라이트(Wright) 및 모리슨(Morrison), 1997, TibTECH 15:26-32]. 면역 글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 기능[보이드(Boyd) 등, 1996, Mol. Immunol., 32:1311-1318; 위트위(Wittwe) 및 하워드(Howard), 1990, Biochem. 29:4175-4180] 및 당단백질의 형태 및 제공된 3차원 표면에 영향을 끼칠 수 있는 당단백질의 부위 사이의 분자내 상호작용[제프리스 및 룬드, 상기 문헌; 와이스(Wyss) 및 와그너(Wagner), 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416]에 영향을 준다. 올리고사카라이드는 또한 특이적인 인지 구조에 기초하여 특정 분자에 대해 소정 당단백질을 표적화시키는 역할도 할 수 있다. 항체의 글라이코실화는 또한 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC)에 영향을 주는 것으로 기재된 바 있다. 구체적으로, 이분 GlcNAc의 생성을 촉진하는 글라이코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)의 테트라사이클린-규제되는 발현을 갖는 CHO 세포는 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다[유마나(Umana) 등, 1999, Mature Biotech. 17:176-180].

항체의 글라이코실화는 전형적으로 N-연결되거나 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄로의 탄수화물 분절의 부착을 말한다. 트라이펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인(여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 분절의 아스파라긴 측쇄로의 효소에 의한 부착을 위한 인지 서열이다. 그러므로, 폴리펩타이드에 이들 트라이펩타이드 서열이 존재하면 잠재적인 글라이코실화 부위를 생성시킨다. O-연결된 글라이코실화는 당 N-아세틸갈락토즈아민, 갈락토즈 또는 자일로즈중 하나의 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 부착을 나타내지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 사용할 수 있다.

아미노산 서열이 하나 이상의 상기 트라이펩타이드 서열(N-연결된 글라이코실화 부위)을 함유하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써, 글라이코실화 부위를 항체에 편리하게 부가한다. 원래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나 치환시킴으로써도 변형시킬 수 있다(O-연결된 글라이코실화 부위).

기초가 되는 뉴클레오타이드 서열을 변화시키지 않고도 항체의 글라이코실화 패턴을 변형시킬 수 있다. 글라이코실화는 항체를 발현하는데 사용되는 숙주 세포에 크게 의존한다. 잠재적인 치료제로서 재조합 당단백질(예: 항체)을 발현하는데 사용되는 세포 유형이 거의 천연 세포가 아니기 때문에, 항체의 글라이코실화 패턴에서의 변화를 예상할 수 있다[예컨대, 세(Hse) 등, 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070 참조].

숙주 세포의 선택에 덧붙여, 항체의 재조합에 의한 생성 동안 글라이코실화에 영향을 끼치는 인자는 생육 방식, 매질 제제, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 계획 등을 포함한다. 올리고사카라이드 생성에 관여하는 특정 효소를 도입 또는 과발현시킴을 비롯한 다양한 방법이, 특정 숙주 생물체에서 달성되는 글라이코실화 패턴을 변형시키기 위해 제안되었다(미국 특허 제 5,047,335 호; 제 5,510,261 호 및 제 5,278,299 호). 예를 들어 엔도글라이코시다제 H(Endo H), 실시예 1에 기재되는 N-글라이코시다제, 엔도글라이코시다제 F1, 엔도글라이코시다제 F2, 엔도글라이코시다제 F3을 사용하여, 글라이코실화 또는 특정 글라이코실화 유형을 당단백질로부터 효소적으로 제거할 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포를 유전공학 처리하여 폴리사카라이드의 특정 유형을 가공하는데 하자가 있도록 만들 수 있다. 이들 기법 및 유사한 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.

다른 개질 방법은 효소적 수단, 산화에 의한 치환 및 킬레이트화를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 당해 분야에 공지된 커플링 기법을 이용함을 포함한다. 예를 들어 면역 분석용 라벨의 부착에 개질을 이용할 수 있다. 당해 분야에서 확립된 절차를 이용하여 개질된 6G 폴리펩타이드를 제조하고, 당해 분야에 공지되어 있는 표준 분석법(이들중 일부는 아래 및 실시예에 기재됨)을 이용하여 이를 스크리닝할 수 있다.

다른 항체 개질체는 1999년 11월 18일자로 공개된 PCT 공개 WO 99/58572 호에 기재된 바와 같이 개질된 항체를 포함한다. 이들 항체는 표적 분자로 향하는 결합 도메인에 덧붙여 인간 면역 글로불린 중쇄의 불변 도메인중 전부 또는 일부와 실질적으로 일치하는 아미노산 서열을 갖는 작동자 도메인을 포함한다. 이들 항체는 상당한 보체 의존성 용해 또는 표적의 세포-매개되는 파괴를 촉발시키지 않으면서 표적 분자와 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 작동자 도메인은 FcRn 및/또는 Fc_γRIIb와 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 둘 이상의 인간 면역 글로불린 중쇄 C_H2 도메인으로부터 유도되는 키메라 도메인에 기초한다. 이러한 방식으로 개질된 항체는 통상적인 항체 요법에 대한 염증 반응 및 다른 부반응을 피하기 위하여 장기적인 항체 요법에 사용하기 특히 적합하다.

본 발명은 친화력 성숙(affinity matured) 실시양태를 포함한다. 예를 들어, 당해 분야에 공지되어 있는 절차[막스(Marks) 등, 1992, Bio/Technology, 10:779-783; 바바스(Barbas) 등, 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; 쉬어(Schier) 등, 1995, Gene, 169:147-155; 옐튼(Yelton) 등, 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; 잭슨(Jackson) 등, 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; 호킨스(Hawkins) 등, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; 및 WO 2004/058184 호]에 의해 친화력 성숙 항체를 생성시킬 수 있다.

항체의 친화력을 조정하고 CDR의 특징을 결정하는데 하기 방법을 이용할 수 있다. 항체의 CDR의 특징을 결정하고/하거나 폴리펩타이드(예: 항체)의 결합 친화력을 변화(예컨대, 개선)시키는 한 방법은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발"이라고 명명된다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발은 다음과 같이 작용된다. 당해 분야에서 인식되어 있는 방법을 이용하여 CDR의 하나 이상의 아미노산 위치를 둘 이상(예컨대, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개)의 아미노산으로 대체한다. 이는 각각 둘 이상의 일원의 복잡성을 갖는(모든 위치에서 둘 이상의 아미노산이 치환되는 경우) 클론(몇몇 실시양태에서는, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해 하나씩)의 작은 라이브러리를 생성시킨다. 일반적으로, 라이브러리는 또한 천연(치환되지 않은) 아미노산을 포함하는 클론을 포함한다. 각각의 라이브러리로부터의 소수의 클론, 예컨대 약 20 내지 80개의 클론(라이브러리의 복잡성에 따라)을 표적 폴리펩타이드(또는 다른 결합 표적)로의 결합 친화력에 대하여 스크리닝하고, 증가된 결합, 동일한 결합, 감소된 결합을 갖거나 결합을 갖지 않는 후보를 확인한다. 결합 친화력을 결정하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 약 2배 이상의 결합 친화력 차이를 검출하는 바이아코어 표면 플라스몬 공명 분석을 이용하여 결합 친화력을 결정할 수 있다. 출발 항체가 이미 비교적 높은 친화력(예컨대, 약 10nM 이하의 K_D)으로 결합된 경우 바이아코어가 특히 유용하다. 바이아코어 표면 플라스몬 공명을 이용한 스크리닝은 본원의 실시예에 기재되어 있다.

키넥사 바이오센서(Kinexa Biocensor), 섬광 근접 측정법, ELISA, ORIGEN 면역 분석법(IGEN), 형광 급랭, 형광 전달 및/또는 효모 디스플레이를 이용하여 결합 친화력을 결정할 수 있다. 또한, 적합한 생물 검정법(bioassay)을 이용하여 결합 친화력을 스크리닝할 수 있다.

일부 실시양태에서는, 당해 분야에서 인식된 돌연변이 유발 방법(이들중 일부는 본원에 기재됨)을 이용하여 CDR의 모든 아미노산 위치를 20개의 모든 천연 아미노산으로 대체한다(일부 실시양태에서는 한번에 하나씩). 이는 클론(일부 실시양태에서는 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해 1개씩)의 작은 라이브러리를 생성시키고, 이들 각각은 20개 일원의 복잡성을 갖는다(20개의 모든 아미노산이 모든 위치에서 치환되는 경우).

일부 실시양태에서, 스크리닝되는 라이브러리는 둘 이상의 위치(동일한 CDR에 또는 둘 이상의 CDR에 존재할 수 있음)에 치환을 포함한다. 따라서, 라이브러리는 한 CDR의 둘 이상의 위치에 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 둘 이상의 CDR의 둘 이상의 위치에 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR에서 발견되는 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 위치에 치환을 포함할 수 있다. 저 반복성(low redundancy) 코돈을 사용하여 치환을 제조할 수 있다. 예컨대, 밸린트(Balint) 등의 문헌[(1993) Gene 137(1):109-18]의 표 2 참조.

CDR은 CDRH3 및/또는 CDRL3일 수 있다. CDR은 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 및/또는 CDRH3중 하나 이상일 수 있다. CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR 또는 연장된 CDR일 수 있다.

개선된 결합을 갖는 후보의 서열을 결정함으로써 개선된 친화력을 야기하는 CDR 치환 돌연변이(또한 "개선된" 치환이라고도 함)를 확인할 수 있다. 결합하는 후보의 서열을 결정함으로써 결합을 유지하는 CDR 치환을 확인할 수 있다.

스크리닝을 수회 반복할 수 있다. 예를 들어, 각각의 개선된 CDR 위치(즉, 치환 돌연변이가 개선된 결합을 나타내는 CDR에서의 아미노산 위치)에 적어도 원래의 아미노산 및 치환된 아미노산을 함유하는 제 2 라이브러리를 디자인하는데, 개선된 결합을 갖는 후보(이들 각각은 하나 이상의 CDR의 하나 이상의 위치에 아미노산 치환을 포함함)가 유용하다. 이 라이브러리의 제조, 스크리닝 또는 선택은 아래에서 추가로 논의된다.

라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발은 또한 개선된 결합, 동일한 결합, 감소된 결합을 갖거나 결합을 갖지 않는 클론의 빈도가 항체-항원 복합체의 안정성을 위한 각 아미노산 위치의 중요성에 관한 정보를 제공하는 한 CDR의 특징을 결정하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, CDR의 한 위치가 20개의 모든 아미노산으로 변화될 때 결합을 유지하는 경우, 이 위치는 항원 결합에 요구되지 않을 위치로 확인된다. 반대로, CDR의 한 위치가 적은 백분율의 치환에서만 결합을 유지하는 경우, 이 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로 확인된다. 그러므로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이 유발 방법은 다수의 상이한 아미노산(20개의 모든 아미노산 포함)으로 변화될 수 있는 CDR의 위치 및 변화될 수 없거나 소수의 아미노산으로만 변화될 수 있는 CDR의 위치에 관한 정보를 생성시킨다.

개선된 친화력을 갖는 후보를 제 2 라이브러리에서 조합할 수 있으며, 이 라이브러리는 그 위치에서 개선된 아미노산, 원래 아미노산을 포함하고, 목적하는 스크리닝 또는 선택 방법을 이용하여 목적하거나 허용되는 라이브러리의 복잡성에 따라 그 위치에 추가적인 치환을 포함한다. 또한, 필요한 경우, 인접 아미노산 위치를 둘 이상의 아미노산으로 무작위화시킬 수 있다. 인접 아미노산의 무작위화는 돌연변이 CDR에 추가적인 형태 융통성을 허용할 수 있으며, 이는 다시 더욱 다수의 개선 돌연변이의 도입을 허용하거나 용이하게 할 수 있다. 라이브러리는 또한 첫번째 스크리닝에서 개선된 친화력을 나타내지 않은 위치에 치환을 포함할 수 있다.

바이아코어 표면 플라스몬 공명 분석법을 이용하는 스크리닝 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보좀 디스플레이를 비롯한 선택을 위해 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하는 선택을 포함하는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 이용하여, 개선되고/되거나 변화된 결합 친화력을 갖는 라이브러리 일원에 대해 제 2 라이브러리를 스크리닝 또는 선택한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체(예컨대, 6G) 또는 폴리펩타이드로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포괄한다. 한 실시양태에서는, 서열번호 2(도 1)에 나타낸 가변 경쇄 영역의 10개 이상의 인접 아미노산 및/또는 서열번호 1(도 1)에 나타낸 가변 중쇄 영역의 10개 이상의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩타이드가 제공된다. 다른 실시양태에서는, 서열번호 2(도 1)에 나타낸 가변 경쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상 또는 약 30개 이상의 인접 아미노산 및/또는 서열번호 1(도 1)에 나타낸 가변 중쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상 또는 약 30개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩타이드가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩타이드는 도 1의 서열번호 2 및 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩타이드는 6G의 하나 이상의 CDR(들)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩타이드는 항체 6G의 CDR H3 및/또는 CDR L3을 포함한다. 본 발명에서, 6G 융합 단백질은 하나 이상의 6G 항체 및 천연 분자에서 예컨대 다른 영역으로부터의 상이한 서열 또는 동일한 서열이 부착되지 않은 다른 아미노산 서열을 함유한다. 예시적인 상이한 서열은 FLAG 택 또는 6His 택 같은 "택"을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 택은 당해 분야에 널리 알려져 있다.

당해 분야에 공지되어 있는 방법(예컨대, 합성 또는 재조합)에 의해 6G 융합 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다. 전형적으로, 본원에 기재된 재조합 방법을 이용하여 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제조 및 발현시킴으로써 본 발명의 6G 융합 단백질을 제조하지만, 예컨대 화학적 합성을 비롯하여 당해 분야에 알려져 있는 다른 수단에 의해서도 이들을 제조할 수는 있다.

본 발명은 또한 고체 지지체로의 커플링을 촉진시키는 약제(예: 바이오틴 또는 아비딘)에 컨쥬게이트(예컨대, 연결)된 6G 항체 또는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물도 제공한다. 간단히 하기 위해, 이들 방법을 본원에 기재된 임의의 Aβ_1-40 결합 실시양태에 적용한다는 이해하에, 일반적으로 6G 또는 항체를 언급한다. 컨쥬게이션은 통상 본원에 기재되는 바와 같이 이들 성분을 연결함을 일컫는다. 임의의 수의 방식으로 연결(이는 일반적으로 이들 성분을 적어도 투여하기 위해 근접시켜 고정하는 것임)시킬 수 있다. 예를 들어, 약제와 항체가 각각 서로와 반응할 수 있는 치환기를 갖는 경우, 약제와 항체 사이의 직접 반응이 가능하다. 예를 들어, 하나상의 친핵성 기(예: 아미노 또는 설프하이드릴기)는 다른 것상의 카본일-함유 기(예: 무수물 또는 산 할라이드) 또는 알킬기를 함유하는 우수한 이탈기(예: 할라이드)와 반응할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드를 형광 분자, 방사성 분자 또는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 다른 라벨 같은 라벨링제("라벨"이라고 달리 칭함)에 연결할 수 있다. 일반적으로 (직접적으로 또는 간접적으로) 신호를 제공하는 라벨은 당해 분야에 알려져 있다.

본 발명은 또한 항체 6G 및 본 개시내용에 의해 명백해지는 바와 같이 본원에 기재되는 항체 및/또는 폴리펩타이드중 임의의 것 또는 모두를 포함하는 조성물(약학 조성물 포함) 및 키트를 제공한다.

손상된 작동자 기능을 갖는 항-Aβ 항체 및 폴리펩타이드

본원에 기재된 항체 또는 폴리펩타이드(항체 또는 폴리펩타이드를 포함하는 약학 조성물 포함)은 손상된 작동자 기능을 가질 수 있다. 본원에 사용되는 "손상된 작동자 기능"을 갖는("면역학적으로 불활성" 또는 "부분적으로 면역학적으로 불활성"과 호환가능하게 사용됨) 항체 또는 폴리펩타이드는 작동자 기능을 갖지 않거나 (개질되지 않거나 또는 천연 발생된 불변 영역을 갖는 항체 또는 폴리펩타이드에 비해) 작동자 기능의 감소된 활성 또는 활성들을 갖는, 예를 들어 하기중 임의의 하나 이상에서 활성을 갖지 않거나 감소된 활성을 갖는 항체 또는 폴리펩타이드를 일컫는다: a) 보체 매개되는 용해를 촉발시킴; b) 항체-의존성 세포 매개되는 세포독성(ADCC)을 자극함; 및 c) 미세아교세포를 활성화시킴. 작동자 기능 활성은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 및 100% 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 상당한 보체 의존성 용해 또는 표적의 세포 매개되는 파괴를 촉발시키지 않으면서 베타-아밀로이드 펩타이드에 결합한다. 예를 들어, 불변 영역상의 Fc 수용체 결합 부위를 개질 또는 돌연변이시켜, 특정 Fc 수용체(예: Fc_γRI, Fc_γRII 및/또는 Fc_γRIII)에 대한 결합 친화력을 제거하거나 감소시킬 수 있다. 간단히 하기 위해, 이 실시양태를 폴리펩타이드에도 적용한다는 이해하에 항체를 인용한다. EU 번호 시스템[카바트 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest; 제5판, Public Health Service, 국립보건원, 메릴랜드주 베데스다, 1991]을 이용하여 (예컨대, IgG 항체의) 불변 영역의 어느 아미노산 잔기(들)가 변화되거나 돌연변이되는지를 표시한다. 항체의 유형 및 종을 불문하고 유사하게 변화시킬 수 있다는 이해하에, 특정 항체 유형(예: IgG1) 또는 종(예: 인간)에 대해 번호를 사용할 수 있다.

일부 실시양태에서, Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체는 손상된 작동자 기능을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 천연 발생 서열을 가질 수 있거나 또는 변이체이다. 몇몇 실시양태에서는, 예를 들어 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 천연 발생 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 돌연변이시킴으로써, 불변 영역의 작동자 기능을 손상시킨다. 일부 실시양태에서는, 중쇄 불변 영역의 Fc 영역의 N-글라이코실화를 또한 변화시켜(예컨대, 완전히 또는 부분적으로 제거하여), 불변 영역의 작동자 기능을 손상시킬 수 있다.

일부 실시양태에서는, 항-Aβ 펩타이드의 Fc 영역(예: IgG의 CH 2 도메인)의 N-글라이코실화를 제거함으로써 작동자 기능을 손상시킨다. 일부 실시양태에서는, 불변 영역에 있는 글라이코실화 인식 서열의 일부인 글라이코실화된 아미노산 잔기 또는 인접(flanking) 잔기를 돌연변이시킴으로써 Fc 영역의 N-글라이코실화를 제거한다. 트라이펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린(N-X-S), 아스파라긴-X-트레오닌(N-X-T) 및 아스파라긴-X-시스테인(N-X-C)(여기에서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 N-글라이코실화를 위한 아스파라긴 측쇄로의 탄수화물 분절의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 불변 영역에 있는 트라이펩타이드 서열의 임의의 아미노산을 돌연변이시키면 글라이코실화되지 않은(aglycosylated) IgG를 생성시킨다. 예를 들어, 인간 IgG1 및 IgG3의 N-글라이코실화 부위 N297을 A, D, Q, K 또는 H로 돌연변이시킬 수 있다. 타오(Tao) 등의 문헌[J. Immunology 143:2595-2601 (1989); 및 제프리스 등, Immunological Reviews 163:59-76 (1998)] 참조. Asn-297을 Gln, His 또는 Lys로 치환한 인간 IgG1 및 IgG3은 인간 Fc_γRI에 결합하지 않고 IgG1의 경우 C1q 결합능이 완전히 상실되고 IgG3의 경우 급감된 보체를 활성화시키지 않는 것으로 보고되었다. 일부 실시양태에서는, 트라이펩타이드 서열의 아미노산 N을 아미노산 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, Y중 임의의 하나로 돌연변이시킨다. 몇몇 실시양태에서는, 트라이펩타이드 서열의 아미노산 N을 보존성 치환으로 돌연변이시킨다. 몇몇 실시양태에서는, 트라이펩타이드 서열의 아미노산 X를 프롤린으로 돌연변이시킨다. 일부 실시양태에서는, 트라이펩타이드 서열의 아미노산 S를 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, Y로 돌연변이시킨다. 일부 실시양태에서는, 트라이펩타이드 서열의 아미노산 T를 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, Y로 돌연변이시킨다. 몇몇 실시양태에서는, 트라이펩타이드 서열의 아미노산 C를 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W, Y로 돌연변이시킨다. 일부 실시양태에서는, 트라이펩타이드에 따른 아미노산을 P로 돌연변이시킨다. 일부 실시양태에서는, 불변 영역의 N-글라이코실화를 효소(예컨대, 실시예 1에 기재된 N-글라이코시다제, 엔도글라이코시다제 F1, 엔도글라이코시다제 F2, 엔도글라이코시다제 F3 및 엔도글라이코시다제 H)에 의해 제거한다. N-글라이코실화가 결핍된 세포주에서 항체를 생성시킴으로써 N-글라이코실화를 제거할 수도 있다. 라이트 등의 문헌[J Immunol., 160(7):3393-402 (1998)] 참조.

일부 실시양태에서는, 불변 영역의 N-글라이코실화 부위에 부착된 올리고사카라이드와 상호작용하는 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 Fc_γRI에 대한 결합 친화력을 감소시킨다. 예를 들어, 인간 IgG3의 F241, V264, D265를 돌연변이시킬 수 있다. 룬드 등의 문헌[J. Immunology 157:4963-4969 (1996)] 참조.

일부 실시양태에서는, PCT WO 99/58572 호 및 아머(Armour) 등의 문헌[Molecular Immunology 40:585-593 (2003)] 및 레디(Reddy) 등의 문헌[J. Immunology 164:1925-1933 (2000)]에 기재된 바와 같이, 인간 IgG의 233 내지 236, 297 및/또는 327 내지 331 같은 영역을 개질시킴으로써 작동자 기능을 손상시킨다. PCT WO 99/58572 호 및 아머 등의 문헌에 기재된 항체는 표적 분자로 향하는 결합 도메인에 덧붙여 인간 면역 글로불린 중쇄의 불변 영역중 전부 또는 일부와 실질적으로 일치하는 아미노산 서열을 갖는 작동자 도메인을 포함한다. 이들 항체는 상당한 보체 의존성 용해 또는 표적의 세포-매개되는 파괴를 촉발시키지 않으면서 표적 분자와 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 작동자 도메인은 Fc_γRI, Fc_γRIIa 및 Fc_γRIII에 대해 감소된 친화력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 작동자 도메인은 FcRn 및/또는 Fc_γRIIb와 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 둘 이상의 인간 면역 글로불린 중쇄 C_H2 도메인으로부터 유도되는 키메라 도메인에 기초한다. 이러한 방식으로 개질된 항체는 통상적인 항체 요법에 대한 염증 반응 및 다른 부반응을 피하기 위하여 장기적인 항체 요법에 사용하는데 특히 적합하다. 일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 하기 임의의 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 IgG1이다: 1) A327A330P331의 G327S330S331로의 돌연변이; 2) E233L234L235G236의 P233V234A235(G236은 결실됨)로의 돌연변이; 3) E233L234L235의 P233V234A235로의 돌연변이; 4) E233L234L235G236A327A330P331의 P233V234A235G327S330S331(G236은 결실됨)로의 돌연변이; 5) E233L234L235A327A330P331의 P233V234A235G327S330S331로의 돌연변이; 및 6) N297의 A297 또는 N을 제외한 임의의 다른 아미노산으로의 돌연변이. 이들 돌연변이를 조합할 수 있다. 예를 들어, 1) 내지 5)중 임의의 것을 6)과 조합할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 하기 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 IgG2이다: A330P331의 S330S331로의 돌연변이; N297의 Q297로의 돌연변이; 및 N297G327A330P331의 Q297G327S330S331로의 돌연변이. 일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 하기 임의의 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 IgG4이다: E233F234L235G236의 P233V234A235(G236은 결실됨)로의 돌연변이; E233F234L235의 P233V234A235로의 돌연변이; P228L235의 S228E235로의 돌연변이; N297의 Q297로의 돌연변이; 및 E233F234L235G236N297의 P233V234A235G236Q297로의 돌연변이.

항체의 불변 영역을 또한 개질시켜 보체 활성화를 손상시킬 수 있다. 예를 들어, C1 결합 모티프(예컨대, C1q 결합 모티프)에서 불변 영역의 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 보체의 C1 성분의 결합에 이은 IgG 항체의 보체 활성화를 감소시킬 수 있다. 인간 IgG1의 D270, K322, P329, P331 각각의 Ala 돌연변이가 C1q에 결합하고 보체를 활성화시키는 항체의 능력을 크게 감소시키는 것으로 보고되었다. 쥣과의 IgG2b의 경우, C1q 결합 모티프는 잔기 E318, K320 및 K322를 구성한다. 이두소기(Idusogie) 등의 문헌[J. Immunology 164:4178-4184 (2000)]; 던컨(Duncan) 등의 문헌[Nature 322:738-740 (1988)] 참조.

쥣과의 IgG2b에 대해 확인된 C1q 결합 모티프 E318, K320 및 K322는 다른 항체 아이소형에 공통적인 것으로 생각된다. 던컨 등의 문헌[Nature 322:738-740 (1988)] 참조. 3개의 규정된 잔기중 임의의 하나를 측쇄상에 부적절한 작용기를 갖는 잔기로 대체함으로써, IgG2b에 대한 C1q 결합 활성을 없앨 수 있다. C1q 결합을 없애기 위해 이온성 잔기를 Ala로만 대체할 필요는 없다. C1q 결합을 없애기 위하여 3개 잔기중 임의의 하나 대신 Gly, Ile, Leu 또는 Val 같은 다른 알킬-치환된 비이온성 잔기, 또는 Phe, Tyr, Trp 및 Pro 같은 방향족 비-극성 잔기를 사용할 수도 있다. 또한, C1q 결합 활성을 없애기 위하여 잔기 320 및 322(318은 아님) 대신 Ser, Thr, Cys 및 Met 같은 극성 비이온성 잔기를 사용할 수도 있다.

본 발명은 또한 개질된 힌지 영역을 갖는, 손상된 작동자 기능을 갖는 항체도 제공한다. 힌지 영역을 개질시킴으로써 인간 IgG의 그의 Fc 수용체에 대한 결합 친화력을 조정할 수 있다. 캔필드(Canfield) 등의 문헌[J. Exp . Med . 173:1483-1491 (1991)]; 헤자레(Hezareh) 등의 문헌[J. Virol . 75:12161-12168 (2001)]; 레드패쓰(Redpath) 등의 문헌[Human Immunology , 59:720-727 (1998)] 참조. 특정 아미노산 잔기를 돌연변이시키거나 결실시킬 수 있다. 개질된 힌지 영역은 CH1 도메인의 부류와는 상이한 항체 부류 또는 아부류의 항체로부터 유도되는 완전한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 부류 IgG 항체의 불변 도메인(CH1)을 부류 IgG4 항체의 힌지 영역에 부착할 수 있다. 다르게는, 새로운 힌지 영역은 천연 힌지의 일부 또는 반복 단위(반복체의 각 단위는 천연 힌지 영역으로부터 유도됨)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 하나 이상의 시스테인 잔기를 천연 잔기(예: 알라닌)로 전환시킴으로써 또는 적합하게 위치된 잔기를 시스테인 잔기로 전환시킴으로써, 천연 힌지 영역을 변형시킨다. 미국 특허 제 5,677,425 호 참조. 당해 분야에서 인식된 단백질 화학 및 바람직하게는 유전 공학 기법을 이용하여, 또한 본원에 기재된 바와 같이, 이들 변형을 수행한다.

Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하고 손상된 작동자 기능을 갖는 중쇄 불변 영역에 융합된 폴리펩타이드를 또한 본원에 기재된 방법에 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체로부터 유도되는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 Aβ 펩타이드에 결합하는 단일 도메인 항체로부터 유도된다. 당해 분야에 알려져 있는 방법을 이용하여 단일 도메인 항체를 생성시킬 수 있다. 오미드파(Omidfar) 등의 문헌[Tumour Biol. 25:296-305 (2004)]; 헤링(Herring) 등의 문헌[Trends in Biotechnology 21:484-489 (2003)] 참조.

일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 F(ab')₂ 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 Fab 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 단일 쇄 항체 scFv이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 PEG일화된 F(ab')₂ 단편이다. 몇몇 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 PEG일화된 Fab 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩타이드는 PEG일화된 단일 쇄 항체 scFv이다.

당해 분야에 공지되어 있는 손상된 작동자 기능을 갖는 항체를 제조하는 다른 방법도 이용할 수 있다.

개질된 불변 영역을 갖는 항체 및 폴리펩타이드를 하나 이상의 분석법으로 시험하여, 출발 항체와 비교하여 생물학적 활성 면에서의 작동자 기능 감소 수준을 평가할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 분석법 및 당해 분야에서 인식된 임의의 분석법을 이용하여, 변화된 Fc 영역을 갖는 항체 또는 폴리펩타이드가 보체 또는 Fc 수용체(예컨대, 미세아교세포상의 Fc 수용체), 또는 변형된 힌지 영역에 결합하는 능력을 사정할 수 있다. PCT WO 99/58572 호; 아머 등의 문헌[Molecular Immunology 40:585-593 (2003)]; 레디 등의 문헌[J. Immunology 164:1925-1933 (2000)]; 송(Song) 등의 문헌[Infection and Immunity 70:5177-5184 (2002)] 참조.

경쟁 분석법을 이용하여, 동일한 항원결정기 또는 입체적으로 중첩되는 항원결정기를 인식함으로써 두 항체가 동일한 항원결정기와 결합하는지, 또는 한 항체가 항원에 대한 다른 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는지의 여부를 결정할 수 있다. 이들 분석법은 당해 분야에 알려져 있다. 전형적으로는, 항원을 복수개-웰 플레이트에 부동화시키고, 라벨링되지 않은 항체가 라벨링된 항체의 결합을 차단하는 능력을 측정한다. 이러한 경쟁 분석법에 통상적인 라벨은 방사성 라벨 또는 효소 라벨이다.

Aβ에 특이적으로 결합하는 항체 및 폴리펩타이드를, 아밀로이드 침착 제거 및 다른 유리한 효과(예컨대, 인지 개선)에서의 효능에 대해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 폴리펩타이드를 알쯔하이머병을 앓는 동물에 투여할 수 있다. 알쯔하이머병에 대한 다양한 동물 모델이 당해 분야에 공지되어 있다. 투여 후, 당해 분야에 공지되어 있고 실시예 2에 상세하게 기재되어 있는 방법을 이용하여, 밀집성 및 광범성 아밀로이드 반점의 수준, 인지에 대한 행동 분석 및 미세아교세포 활성화 및 미세 출혈을 시험할 수 있다. PCT WO 2004/032868 호; 윌콕(Wilcock) 등의 문헌[J. Neurosci . 23:3745-3751 (2003); 윌콕 등, J. Neuroinflammation 1:24 (2004)] 참조.

폴리뉴클레오타이드 , 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본 발명의 항체(도 1에 나타낸 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체 포함) 및 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 및 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.

따라서, 본 발명은 하기중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드(또는 약학 조성물을 비롯한 조성물)를 제공한다: (a) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체; (b) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 단편 또는 영역; (c) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄; (d) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 중쇄; (e) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 하나 이상의 가변 영역(들); (f) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 하나 이상의 CDR(들)(1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR); (g) 항체 6G의 중쇄로부터의 CDR H3; (h) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 CDR L3; (i) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDR; (j) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 중쇄로부터의 3개의 CDR; (k) 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDR 및 중쇄로부터의 3개의 CDR; 및 (l) (b) 내지 (k)중 임의의 하나를 포함하는 항체. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9 및 서열번호 10에 나타낸 폴리뉴클레오타이드(들)중 하나 또는 둘 다를 포함한다.

다른 요지에서, 본 발명은 손상된 작동자 기능을 갖는 항체 및 폴리펩타이드 같은 본원에 기재된 임의의 항체(항체 단편 포함) 및 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 당해 분야에 공지되어 있는 절차에 의해 폴리뉴클레오타이드를 제조할 수 있다.

다른 요지에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물(예컨대, 약학 조성물)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 6G 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 임의의 항체 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 서열번호 9 및 서열번호 10에 나타낸 폴리뉴클레오타이드중 하나 또는 둘 다를 포함한다. 발현 벡터, 및 폴리뉴클레오타이드 조성물의 투여는 본원에 추가로 기재된다.

다른 요지에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 제공한다.

이러한 임의의 서열에 상보적인 폴리뉴클레오타이드도 본 발명에 포괄된다. 폴리뉴클레오타이드는 단일-스트랜드 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중-스트랜드일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 일대일 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가적인 코딩 또는 비-코딩 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수 있으나 그래야 할 필요는 없으며, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있으나 그래야 할 필요는 없다.

폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, 항체 또는 그의 일부를 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 이들 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 코딩된 폴리펩타이드의 면역 반응성이 천연 면역 반응성 분자에 비해 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩된 폴리펩타이드의 면역 반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 사정할 수 있다. 변이체는 천연 항체 또는 그의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을 보인다.

두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 아래 기재되는 바와 같이 최대로 일치하도록 정렬될 때 두 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 서열이 동일한 경우 "동일하다"고 말해진다. 비교 윈도우에 걸쳐 서열을 비교하여 서열 유사성의 국부적인 영역을 확인 및 비교함으로써 전형적으로 두 서열을 비교한다. 본원에 사용되는 "비교 윈도우"는, 두 서열을 최적으로 정렬시킨 후 동일한 수의 인접 위치의 참조 서열에 대해 서열을 비교할 수 있는, 약 20개 이상의 인접 위치, 통상적으로는 30개 내지 약 75개, 40개 내지 약 50개의 인접 위치의 구획을 말한다.

결손 매개변수를 이용하는, 래저젠 수트 오브 바이오인포매틱스 소프트웨어(Lasergene suite of bioinformatics software)[디엔에이스타, 인코포레이티드(DNASTAR, Inc.), 위스콘신주 매디슨]의 메걸린(Megalign) 프로그램을 사용하여, 서열을 비교하기 위해 최적으로 정렬시킬 수 있다. 이 프로그램은 하기 참조 문헌에 기재된 몇 가지 정렬 계획을 구체화한 것이다: 데이호프(Dayhoff, M.O.), (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships; 데이호프(편집), Atals of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, 워싱턴 DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; 하인(Hein J.), 1990, Unified Approach to Alighment and Phylogenes ppl 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., 캘리포니아주 샌디에고; 히긴스(Higgins, D. G.) 및 샤프(Sharp, P.M.), 1989, CABIOS 5:151-153; 마이어스(Myers, E. W.) 및 뮬러(Muller W.), 1988, CABIOS 4:11-17; 로빈슨(Robinson, E.D.), 1971, Comb. Theor. 11:105; 산토우(Santou, N.), 네스(Nes, M.), 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; 스니쓰(Sneath, P.H.A.) 및 소칼(Sokal, R.R.), 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, 캘리포니아주 샌프란시스코; 윌버(Wilbur, W.J.) 및 립맨(Lipman, D.J.), 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

바람직하게는, 20개 이상의 위치의 비교 윈도우에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 "서열 동일성의 백분율"을 결정하는데, 이 때 비교 윈도우의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 일부는 두 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하, 통상 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 두 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 나타나는 위치의 수를 결정하여 매치되는 위치의 수를 수득하고, 매치되는 위치의 수를 참조 서열의 위치의 총수(즉, 윈도우 크기)로 나눈 후, 그 결과를 100으로 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득함으로써, 백분율을 계산한다.

변이체는 또한 또는 다르게는 천연 유전자 또는 그의 일부 또는 보체에 실질적으로 일치할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 변이체는 중간 정도로 엄격한 조건하에서 천연 항체를 코딩하는 천연 발생 DNA 서열(또는 상보적인 서열)로 하이브리드 형성될 수 있다.

적합한 "중간 정도로 엄격한 조건"은 5×SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 예비 세척하고; 50 내지 65℃, 5×SSC에서 하룻밤동안 하이브리드 형성한 후; 65℃에서 20분간 각각 0.1% SDS를 함유하는 2×, 0.5× 및 0.2×SSC로 세척함을 포함한다.

본원에 사용되는 "매우 엄격한 조건" 또는 "높은 엄격성의 조건"은 (1) 세척하기 위해 낮은 이온 강도 및 고온(예를 들어, 50℃에서 0.015M 염화나트륨/0.0015M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 설페이트)을 이용하는 조건; (2) 하이브리드 형성하는 동안, 42℃에서 750mM 염화나트륨, 75mM 시트르산나트륨과 함께 폼아마이드 같은 변성제, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)을 갖는 50%(v/v) 폼아마이드를 사용하는 조건; 또는 (3) 42℃에서 50% 폼아마이드, 5×SSC(0.75M NaCl, 0.075M 시트르산나트륨), 50mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5×덴하르트(Denhardt's) 용액, 초음파 처리된 연어 정액 DNA(50㎍/ml), 0.1% SDS 및 10% 황산덱스트란과 함께, 0.2×SSC(염화나트륨/시트르산나트륨) 중에서 42℃에서 또한 55℃에서 50% 폼아마이드 세척 후, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1×SSC로 이루어진 고-엄격성의 세척을 이용하는 조건이다. 당해 분야의 숙련자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 수용하는데 필요한 만큼 온도, 이온 강도 등을 조정하는 방법을 알 것이다.

당해 분야의 숙련자는 유전정보의 퇴화의 결과로서 본원에 기재된 폴리펩타이드를 코딩하는 다수의 뉴클레오타이드 서열이 존재함을 알게 될 것이다. 이들 폴리펩타이드중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소한의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 변화되는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다. 또한, 본원에 제공되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 발명의 영역에 속한다. 대립유전자는 하나 이상의 돌연변이(예컨대, 뉴클레오타이드의 결실, 부가 및/또는 치환)의 결과로서 변형되는 내인성 유전자이다. 생성되는 mRNA 및 단백질은 변형된 구조 또는 기능을 가질 수 있으나 그래야 할 필요는 없다. 표준 기법(예컨대, 하이브리드 형성, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 이용하여 대립유전자를 확인할 수 있다.

화학적 합성법, 재조합 방법 또는 PCR을 이용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 당해 분야에 널리 알려져 있으며, 본원에 상세하게 기재할 필요가 없다. 당해 분야의 숙련자는 본원에 제공되는 서열 및 시판중인 DNA 합성기를 이용하여 목적하는 DNA 서열을 생성시킬 수 있다.

재조합 방법을 이용하여 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위하여, 본원에 추가로 논의되는 바와 같이, 목적하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적합한 벡터 내로 삽입할 수 있고, 복제 및 증폭을 위하여 이 벡터를 다시 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 삽입할 수 있다. 직접적인 도입(uptake), 세포내 이입, 형질감염, F-메이팅(mating) 또는 전기 천공법에 의해 외인성 폴리뉴클레오타이드를 도입함으로써 세포를 형질전환시킨다. 도입한 후, 외인성 폴리뉴클레오타이드를 비-일체화된 벡터(예: 플라스미드)로서 세포 내에 유지시키거나 또는 숙주 세포 게놈 내로 일체화시킬 수 있다. 이렇게 증폭된 폴리뉴클레오타이드를 당해 분야에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리할 수 있다. 예컨대 샘브룩 등의 문헌(1989) 참조.

다르게는, PCR에 의해 DNA 서열을 복제할 수 있다. PCR 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,800,159 호, 제 4,754,065 호 및 제 4,683,202 호, 및 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, 뮬리스(Mullis) 등 편집, Birkauswer Press, 보스턴 (1994)]에 기재되어 있다.

적절한 벡터 내에 단리된 DNA를 사용하고, 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써, RNA를 수득할 수 있다. 세포가 복제하고 DNA가 RNA로 전사될 때, 예컨대 샘브룩 등의 문헌(1989)에 기재된 바와 같이 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있는 방법을 이용하여 RNA를 단리할 수 있다.

표준 기법에 따라 적합한 클로닝 벡터를 구성할 수 있거나, 또는 당해 분야에서 입수가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 적합한 클로닝 벨터를 선택할 수 있다. 선택되는 클로닝 벡터가 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있으나, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제하는 능력을 갖고, 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 가질 수 있고/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 가질 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 세균성 바이러스, 예컨대 pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript)(예: pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 pSA3 및 pAT28 같은 셔틀 벡터를 포함한다. 이들 및 다수의 다른 클로닝 벡터는 바이오라드(BioRad), 스트레이트진(Strategene) 및 인비트로젠(Invitrogen) 같은 상업적 판매처에서 입수할 수 있다.

발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오타이드 구조물이다. 발현 백터는 에피좀으로서 또는 염색체 DNA의 일체형 일부로서 숙주 세포에서 복제될 수 있어야 하는 것으로 의미된다. 적합한 박현 벡터는 플라스미드, 바이러스성 벡터(아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스), 코스미드 및 PCT 공개 WO 87/04462 호에 개시된 발현 벡터(들)를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 하기중 하나 이상을 포함하지만 이들로 국한되는 것은 아니다: 신호 서열; 복제 원점; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 조절 요소(예컨대, 프로모터, 증강자 및 종료자). 발현(즉, 번역)을 위해, 리보좀 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈 같은 하나 이상의 번역 제어 요소가 통상적으로 요구된다.

전기 천공; 염화칼슘, 염화루비늄, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 성분을 사용한 형질 감염; 미소발사체 충격; 리포펙션; 및 감염(예컨대, 벡터가 백시니아 바이러스 같은 감염원인 경우)을 비롯한 다수의 적절한 수단에 의해, 관심 있는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 방법의 선택은 흔히 숙주 세포의 특징에 따라 달라진다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 상이한 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포를, 관심 있는 항체, 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하기 위해 사용할 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비제한적인 예는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 또한 PCT 공개 WO 87/04462 호 참조. 적합한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵 생물[예컨대, 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스(B. subtillis)] 및 효모[예컨대, 에스. 세레비자에(S. cerevisae), 에스. 폼베(S. pombe) 또는 케이. 락티스(K. lactis)]를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 숙주 세포 내에서 존재하는 경우 관심 있는 내인성 항체 또는 단백질보다 약 5배, 더욱 바람직하게는 10배, 더더욱 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. 면역 분석법 또는 FACS에 의해 Aβ_1-40으로의 특이적인 결합에 대해 숙주 세포를 스크리닝한다. 관심 있는 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포를 확인할 수 있다.

손상된 작동자 기능을 갖는 6G 유도되는 항체 및 항-Aβ 항체의 진단을 위한 사용

Aβ의 C-말단에 결합하는 항체 6G를 사용하여, Aβ의 존재 또는 부재를 확인 또는 검출할 수 있다. 간단히 하기 위하여, 이들 방법을 본원에 기재된 임의의 Aβ 결합 실시양태에 적용한다는 이해하에 6G 또는 항체를 일반적으로 인용한다. 검출은 일반적으로 Aβ에 결합하는 본원에 기재된 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키고, Aβ와 Aβ에 특이적으로 결합하는 항체(예컨대, 6G) 사이에서 복합체를 생성시킴을 포함한다. 이러한 복합체의 생성은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 이루어질 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "검출"은 대조용을 참조하거나 참조하지 않는 정성적인 검출 및/또는 정량적인 검출(수준 측정)을 포함한다.

예컨대, 효소-결합 면역 흡수 분석법(ELISA), 방사성 면역 분석법(RIA) 등에 의한 폴리펩타이드와 결합하는 항체를 사용하는 면역 분석법; 및 코딩된 폴리펩타이드에 대한 기능적 분석법, 예컨대 결합 활성 또는 효소에 의한 분석법을 비롯한(이들로 한정되지는 않음) 임의의 다양한 공지 방법을 검출에 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서는, 항체를 검출가능하게 라벨링한다. 다른 실시양태는 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기재된다.

본 발명의 항체 및 폴리펩타이드를, 변화된 또는 이상 Aβ 또는 βAPP 발현과 관련된 질환, 상태 또는 장애(예를 들어, 알쯔하이머병 및 다운 증후군)를 검출, 진단 및 모니터링하는데 사용할 수 있다. 그러므로, 일부 실시양태에서, 본 발명은 변화된 또는 이상 Aβ 발현을 갖는 것으로 의심되는 개체의 검체(샘플)를 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드와 접촉시키고, Aβ의 수준이 대조용 또는 비교용 검체의 수준과 상이한지의 여부를 결정함을 포함하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 개체의 검체(샘플)을 접촉시키고 Aβ 발현의 수준을 결정함을 포함하는 방법을 제공한다.

진단 용도의 경우, 방사성 동위원소, 형광 라벨 및 다양한 효소-기질 라벨을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 검출가능한 분절로 항체를 라벨링시킬 수 있다. 라벨을 항체에 컨쥬게이트시키는 방법은 당해 분야에 알려져 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서는, 본 발명의 항체를 라벨링할 필요가 없으며, 본 발명의 항체에 결합하는 라벨링된 항체를 사용하여 그의 존재를 검출할 수 있다.

경쟁적 결합 분석법, 직접 또는 간접 샌드위치 분석법 및 면역 침전 분석법 같은 임의의 공지 분석 방법에 본 발명의 항체를 사용할 수 있다. 졸라(Zola)의 문헌[Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc., 1987] 참조.

또한, 생체내 영상 같은 생체내 진단 분석법에 항체를 사용할 수도 있다. 일반적으로는, 이뮤노신티오그래피(immunoscintiography)를 이용하여 해당 세포 또는 조직을 국부화시킬 수 있도록 항체를 방사성 핵종(예컨대, ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I 또는 ³H)으로 라벨링시킨다.

당해 분야에 널리 알려진 기법에 따라 병리학에서 염색 시약으로서 항체를 사용할 수도 있다.

AD의 위험이 있거나 AD를 갖는 것으로 진단된 환자의 진단을 위해 뇌 아밀로이드 부하를 측정하고, 임의의 치료 또는 질환 단계의 진행을 사정하기 위해, 손상된 작동자 기능을 갖는 항-Aβ 항체를 사용할 수 있다. 단클론 항-Aβ 항체를 말초 투여한 결과 혈장 Aβ가 급격히 증가되고 이 증가 크기가 해마 및 피질에서의 아밀로이드 부하와 매우 상관있는 것으로 보고되었다. 드매토스(DeMattos) 등의 문헌[Science 295:2264-2267 (2002)] 참조. 일부 실시양태에서는, 손상된 작동자 기능을 갖는 항-Aβ 항체를 환자에게 투여하고, 혈장중 Aβ의 수준을 측정하는데, 이로써 혈장 Aβ의 증가가 환자의 뇌 아밀로이드 부하의 존재 및/또는 수준을 표시한다. 이들 방법을 이용하여 치료의 효율 및 질환 단계를 모니터링하고 추후 투여량 및 빈도를 결정할 수 있다. 손상된 작동자 기능을 갖는 항체는 더욱 우수한 안전성 프로파일을 가질 수 있고 이들 진단 용도에서 이점을 제공할 수 있다.

치료 목적을 위해 항-Aβ 항체를 사용하는 방법

알쯔하이머병, 및 다운 증후군, 파킨슨병, 다발-경색 치매, 가벼운 인지 손상, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 혈관중 Aβ 펩타이드의 침착에 의해 야기되는 혈관 장애(예컨대, 발작 및 HCHWA-D), 우울증, 크로이츠펠트-야곱병 및 루이체를 갖는 치매 같은 변화된 Aβ 또는 βAPP 발현 또는 Aβ 펩타이드의 축적 또는 침착과 관련된 다른 질환("Aβ-관련 질환"으로 통칭함)의 발병을 치료, 예방 및 억제하는 방법에, 본원에 기재된 항체(폴리펩타이드 포함), 폴리뉴클레오타이드 및 약학 조성물을 사용할 수 있다. 이들 방법은 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 또는 약학 조성물을 환자에게 투여함을 포함한다. 예방을 위한 용도에서는, 알쯔하이머병(또는 다른 Aβ-관련 질환)에 걸리기 쉽거나 그러한 위험이 있는 환자에게 위험을 제거 또는 감소시키거나 중증도를 경감시키거나 질환(질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 행동적 증상, 그의 합병증 및 질환의 발병 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형 포함)의 개시를 지연시키는데 충분한 양으로 약학 조성물 또는 약물을 투여한다. 치료를 위한 용도에서는, 질환의 합병증 및 그의 발병 동안의 중간 병리학적 표현형을 비롯한 질환의 증상(생화학적, 조직학적 및/또는 행동적)을 치료하거나 적어도 부분적으로 억제하기에 충분한 양으로 조성물 또는 약물을 이러한 질환이 의심되거나 이러한 질환을 이미 앓고 있는 환자에게 투여한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 알쯔하이머병(또는 다른 Aβ-관련 질환)에 수반되는 증상의 발생을 지연시키는 방법도 제공한다. 알쯔하이머병에 수반되는 증상은 기억, 문제 해결, 언어, 계산, 시공간 지각, 판단 및 행동의 이상을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 아밀로이드 반점의 형성 및/또는 Aβ 축적을 저해 또는 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 환자의 뇌에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 환자의 대뇌 맥관계에 존재한다. 다른 실시양태에서, Aβ 축적은 환자의 순환계에 존재한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 아밀로이드 반점을 감소시키고/시키거나 Aβ 축적을 감소 또는 둔화시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 환자의 뇌에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 환자의 대뇌 맥관계에 존재한다. 다른 실시양태에서, Aβ 축적은 환자의 순환계에 존재한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 아밀로이드 반점 및/또는 Aβ 축적을 제거하거나 없애는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 환자의 뇌에 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 아밀로이드 반점은 환자의 대뇌 맥관계에 존재한다. 다른 실시양태에서, Aβ 축적은 환자의 순환계에 존재한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자의 조직(예컨대, 뇌)에서 Aβ 펩타이드를 감소시키고, 조직(예컨대, 뇌)에서 Aβ 펩타이드의 축적을 억제 및/또는 감소시키며, 조직(예컨대, 뇌)에서 Aβ 펩타이드의 독성 효과를 억제 및/또는 감소시키는 방법을 제공한다. Aβ 폴리펩타이드는 가용성, 올리고머 또는 침착된 형태일 수 있다. Aβ의 올리고머 형태는 2 내지 50개의 Aβ 폴리펩타이드로 구성될 수 있으며, 이는 전체 길이 1-40 및 1-42 펩타이드 및/또는 이들 펩타이드의 임의의 절단된 형태의 혼합물일 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 항체, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 약학 조성물 유효 투여량을 환자에게 투여함을 포함하는, 환자에서 인지를 개선시키거나 또는 Aβ의 아밀로이드 침착과 관련된 질환(예: 알쯔하이머병)에 수반되는 인지 저하를 역전시키는 방법도 제공한다.

단일 또는 다중 부위로의 1회 또는 수회 단일 직접 주사에 의해 본원에 기재된 방법(예방 또는 치료 포함)을 달성할 수 있다. 또한, 여러 부위에 거의 동시에 투여할 수도 있다. 투여 빈도는 치료 경과에 따라 결정 및 조정될 수 있으며, 목적하는 결과의 달성에 기초한다. 일부 경우에는, 본 발명의 항체(폴리펩타이드 포함), 폴리뉴클레오타이드 및 약학 조성물의 지속적인 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속적인 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 당해 분야에 공지되어 있다.

환자 또는 개체는 인간, 소, 말, 개, 고양이, 돼지 및 양 같은 포유동물을 포함한다. 환자는 바람직하게는 인간이고, 질환에 걸리거나 현재 증상을 나타낼 수 있거나 그러지 않을 수 있다. 알쯔하이머병의 경우, 충분히 장수한 경우 본질적으로 누구나 알쯔하이머병에 걸릴 위험이 있다. 그러므로, 환자의 위험을 사정할 필요 없이 일반 대중에게 본 방법을 예방적으로 투여할 수 있다. 본 방법은 알쯔하이머병의 공지된 발생 위험을 갖는 개체에 유용하다. 이러한 개체는 이 질환을 경험한 친척이 있거나 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 그 위험이 결정된 개체를 포함한다. 알쯔하이머병의 위험의 유전적 마커는 APP 유전자의 돌연변이, 특히 각각 하디(Hardy) 및 스웨디쉬(Swedish) 돌연변이로 불리는 위치 717 및 위치 670과 671에서의 돌연변이를 포함한다[하디 (1997) Trends Neurosci. 20:154-9 참조]. 위험의 다른 마커는 프레세닐린 유전자에서의 돌연변이, PS1 및 PS2, 및 ApoE4, AD, 고콜레스테롤혈증 또는 죽상 경화증의 가족력이다. 현재 알쯔하이머병을 앓고 있는 개체는 특징적인 치매 및 상기 기재된 위험 인자의 존재로부터 인식될 수 있다. 또한, AD를 갖는 개체를 확인하는데 다수의 진단 시험을 이용할 수 있다. 이들은 CSF tau 및 Aβ42 수준의 측정을 포함한다. 높아진 tau 및 감소된 Aβ42 수준은 AD의 존재를 표시한다. ADRDA(알쯔하이머병 및 관련 장애 협회) 기준에 의해서도 알쯔하이머병을 앓는 개체를 진단할 수 있다. 증상이 없는 환자에서는, 임의의 연령(예컨대, 10세, 20세, 30세)에서 치료를 시작할 수 있다. 그러나, 통상적으로는, 환자가 40세, 50세, 60세 또는 70세가 될 때까지 치료를 시작할 필요가 없다. 치료에는 전형적으로 장기간에 걸친 다수회의 투여가 따른다. 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 방법에 의해 시간에 따라 치료를 모니터링할 수 있다. 잠재적인 다운 증후군 환자의 경우에는, 치료제를 엄마에게 투여함으로써 출생 전에 또는 출생 직후에 치료를 시작할 수 있다.

상기 방법에 사용될 수 있는 약학 조성물은 본원에 기재된 임의의 항체, 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 6G 또는 표 3에 나타낸 그의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Aβ 펩타이드에 특이적으로 결합하고 손상된 작동자 기능을 갖는 불변 영역을 포함하는 항체이다.

투여 및 투여량

담체, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체 중에서 항체를 포유동물에 투여한다. 적합한 담체 및 이들의 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 제18판, 제나로 편집, Mack Publishing Co., 펜실베이니아주 이스턴, 1990; 및 Remington , The Science and Practice of Pharmacy 제20판, Mack Publishing, 2000]에 기재되어 있다. 전형적으로는, 제제를 등장성으로 만들기에 적절한 양의 약학적으로 허용가능한 염을 제제에 사용한다. 담체의 예는 염수, 링거 용액 및 덱스트로즈 용액을 포함한다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가의 담체는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스 같은 지속적인 방출 제제를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형품, 예컨대 필름, 리포좀 또는 미소입자의 형태이다. 당해 분야의 숙련자는 특정 담체가 더욱 바람직하게는 예컨대 투여 경로 및 투여되는 항체의 농도에 의존할 수 있음을 알 것이다.

주사(예컨대, 전신, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 문맥내, 대뇌내, 뇌심실내 및 비강내)에 의해, 또는 효과적인 형태로 혈류로의 전달을 보장하는 주입 같은 다른 방법에 의해 항체를 포유동물에게 투여할 수 있다. 단리된 조직 관류 같은 단리된 관류 기법에 의해 항체를 투여하여 국부적인 치료 효과를 발휘시킬 수 있다. 정맥내 주사가 바람직하다.

항체를 투여하는 효과적인 투여량 및 투여 계획을 실험적으로 결정할 수 있으며, 이러한 결정은 당해 분야의 기술 범위에 속한다. 당해 분야의 숙련자는 투여되어야 하는 항체의 투여량이 예컨대 항체를 수용하는 포유동물, 투여 경로, 사용되는 항체의 특정 유형 및 포유동물에게 투여되는 다른 약물에 따라 달라짐을 알 것이다. 항체의 적절한 투여량 선택의 지침은 항체의 치료적 사용에 관한 문헌, 예를 들어 문헌[Handbook of Monoclonal Antibodies, 페론(Ferrone) 등 편집, Noges Publications, 뉴저지주 파크 리지, 1985, ch. 22 및 pp. 303-357; 스미스(Smith) 등, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, 헤이버(Haber) 등 편집, Raven Press, 뉴욕, 1977, pp. 365-389]에서 발견된다. 단독으로 사용되는 항체의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 1일당 체중 1kg당 약 1㎍ 내지 100mg 이상이다. 일반적으로, 하기 투여량중 임의의 투여량을 사용할 수 있다: 체중 1kg당 약 50mg 이상; 체중 1kg당 약 10mg 이상; 체중 1kg당 약 3mg 이상; 체중 1kg당 약 1mg 이상; 체중 1kg당 약 750㎍ 이상; 체중 1kg당 약 500㎍ 이상; 체중 1kg당 약 250㎍ 이상; 체중 1kg당 약 100㎍ 이상; 체중 1kg당 약 50㎍ 이상; 체중 1kg당 약 10㎍ 이상; 체중 1kg당 약 1㎍ 이상을 투여한다. 가능한 부작용[예를 들어, 일시적인 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)]을 피하기 위하여 치료 개시시에는 더 낮은 투여량 또는 더 적은 빈도로 항체를 투여할 수 있다.

일부 실시양태에서는, 하나보다 많은 항체가 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 본 발명의 하나 이상, 둘 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상의 상이한 항체(폴리펩타이드 포함)를 함유할 수 있다.

항체를 또한 하나 이상의 다른 치료제 유효량과 함께 포유동물에게 투여할 수도 있다. 항체를 하나 이상의 다른 치료제와 연속적으로 또는 동시에 투여할 수 있다. 항체 및 치료제의 양은 예컨대 사용되는 약물의 유형, 치료되는 병리학적 상태, 및 투여 스케쥴 및 경로에 따라 달라지지만, 일반적으로는 각각을 개별적으로 사용하는 경우보다 더 적다.

항체를 포유동물에게 투여한 후, 당해 분야의 숙련자에게 널리 공지되어 있는 다양한 방식으로 포유동물의 생리학적 상태를 모니터링할 수 있다.

상기 투여 원리 및 투여량은 본원에 기재된 폴리펩타이드에 적합화될 수 있다.

목적하는 세포에서 항체 또는 폴리펩타이드를 전달 및 발현시키는데, 본원에 기재된 항체 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 또한 사용할 수 있다. 발현 벡터를 사용하여 항체의 발현을 조절할 수 있음을 명백하다. 발현 벡터를 전신, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 경막내, 심실내, 경구, 장내, 비경구, 비강내, 피부 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터의 투여는 주사, 경구 투여, 입자 건 또는 카테터 투여 및 국부 투여를 비롯한 국부 또는 전신 투여를 포함한다. 당해 분야의 숙련자는 생체 내에서 외인성 단백질의 발현을 달성하기 위해 발현 벡터를 투여함을 잘 알고 있다. 예컨대 미국 특허 제 6,436,908 호; 제 6,413,942 호; 및 제 6,376,471 호 참조.

본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 치료 조성물의 표적화된 전달도 이용할 수 있다. 수용체-매개되는 DNA 전달 기법은 예를 들어 핀데이스(Findeis) 등의 문헌[Trends Biotechnol. (1993) 11:202]; 치오(Chiou) 등의 문헌[Gene Therapeutics : Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, 월프(J.A. Wolff) 편집, (1994)]; 우(Wu) 등의 문헌[J. Biol . Chem . (1988) 263:621]; 우 등의 문헌[J. Biol . Chem . (1994) 269:542]; 젠크(Zenke) 등의 문헌[Proc . Natl . Acad . Sci . ( USA ) (1990) 87:3655]; 우 등의 문헌[J. Biol . Chem . (1991) 266:338]에 기재되어 있다. 유전자 요법 계획에서 국부 투여를 위해 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 치료 조성물을 DNA 약 100ng 내지 약 200mg의 범위로 투여한다. DNA 약 500ng 내지 약 50mg, 약 1㎍ 내지 약 2mg, 약 5㎍ 내지 약 500㎍, 및 약 20㎍ 내지 약 100㎍의 농도 범위를 또한 유전자 요법 계획 동안 사용할 수 있다. 유전자 전달 비히클을 사용하여 본 발명의 치료용 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 전달할 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스 기원 또는 비-바이러스 기원일 수 있다[일반적으로, 졸리(Jolly), Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; 기무라(Kimura), Human Gene Therapy (1994) 5:845; 코넬리(Connelly), Human Gene Therapy (1995) 1:185; 및 카플리트(Kaplitt), Nature Genetics (1994) 6:148 참조]. 내인성 포유동물 프로모터 또는 상이한 프로모터를 사용하여 이러한 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성성일 수 있거나 조절될 수 있다.

목적하는 세포에서의 목적하는 폴리뉴클레오타이드의 전달 및 발현을 위한 바이러스-계 벡터는 당해 분야에 널리 알려져 있다. 예시적인 바이러스-계 비히클은 재조합 레트로바이러스[예컨대, PCT 공개 WO 90/07936 호; WO 94/03622 호; WO 93/25698 호; WO 93/25234 호; WO 93/11230 호; WO 93/10218 호; WO 91/02805 호; 미국 특허 제 5,219,740 호; 제 4,777,127 호; GB 특허 제 2,200,651 호; 및 EP 0 345 242 호 참조], 알파바이러스-계 벡터[예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키(Semliki) 포레스트 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버(Ross River) 바이러스(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네주엘란(Venezuelan) 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)], 및 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터[예를 들어, PCT 공개 WO 94/12649 호, WO 93/03769 호, WO 93/19191 호, WO 94/28938 호, WO 95/11984 호 및 WO 95/00655 호 참조]를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 큐리엘(Curiel)의 문헌[Hum . Gene Ther . (1992) 3:147]에 기재된 바와 같이 킬드(killed) 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여도 이용할 수 있다.

킬드 아데노바이러스 단독에 연결되거나 연결되지 않은 다중양이온성 축합된 DNA[예컨대, 큐리엘, Hum . Gene Ther . (1992) 3:147 참조]; 리간드-연결된 DNA[예를 들어, 우, J. Biol . Chem . (1989) 264:16985 참조]; 진핵생물 세포 전달 비히클 세포[예컨대, 미국 특허 제 5,814,482 호; PCT 공개 WO 95/07994 호; WO 96/17072 호; WO 95/30763 호; 및 WO 97/42338 호 참조]; 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 비-바이러스 전달 비히클 및 방법도 사용할 수 있다. 나상 DNA도 사용할 수 있다. 예시적인 나상 DNA 도입 방법은 PCT 공개 WO 90/11092 호 및 미국 특허 제 5,580,859 호에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포좀은 미국 특허 제 5,422,120 호; PCT 공개 WO 95/13796 호; WO 94/23697 호; WO 91/14445 호; 및 EP 0 524 968 호에 기재되어 있다. 추가적인 방법은 필립(Philip)의 문헌[Mol . Cell Biol . (1994) 14:2411] 및 워펜딘(Woffendin)의 문헌[Proc . Natl . Acad . Sci . (1994) 91:1581]에 기재되어 있다.

키트

본 발명은 또한 알쯔하이머병 또는 다른 Aβ-관련 질환(예컨대, 다운 증후군, 파킨슨병, 다발-경색 치매, 가벼운 인지 손상, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 혈관에서의 Aβ 펩타이드의 침착에 의해 야기되는 혈관 장애(예: 발작 및 HCHWA-D)] 같은 병리학적 상태를 치료하거나, 또는 Aβ 또는 βAPP를 검출 또는 정제하는데 유용한 물질을 함유하는 제품 및 키트를 제공한다. 제품은 라벨을 갖는 용기를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알 및 시험관을 포함한다. 유리 또는 플라스틱 같은 다양한 물질로부터 용기를 제조할 수 있다. 용기는 병리학적 상태를 치료하거나 Aβ 또는 βAPP를 검출 또는 정제하는데 효과적인 활성 약제를 갖는 조성물을 보유한다. 조성물중의 활성 약제는 항체이고, 바람직하게는 Aβ 또는 βAPP에 특이적인 단클론 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성 약제는 항체 6G 또는 항체 6G로부터 유도되는 임의의 항체 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 활성 약제는 손상된 작동자 기능을 갖는 본원에 기재된 항-Aβ 항체 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Aβ 항체 또는 폴리펩타이드는 중쇄 불변 영역을 포함하는데, 이 불변 영역은 손상된 작동자 기능을 갖는다. 용기의 라벨은 조성물이 알쯔하이머병 같은 병리학적 상태를 치료하거나 또는 Aβ 또는 βAPP를 검출 또는 정제하는데 사용됨을 나타내고, 또한 상기 기재된 것과 같은 생체내 또는 시험관내 사용을 위한 설명을 나타낼 수도 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 항체(예: 6G), 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 상기 기재된 용기를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 키트는 상기 기재된 용기 및 완충액을 포함하는 제 2 용기를 포함한다. 이는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 본원에 기재된 임의의 방법(예를 들어, 알쯔하이머병을 치료하는 방법, 및 뇌에서 Aβ 펩타이드의 축적을 억제 또는 감소시키는 방법)을 수행하기 위한 사용 설명서를 갖는 포장 삽입물을 비롯한, 상업적인 관점 및 사용자의 관점에서 바람직한 물질을 추가로 포함할 수 있다. Aβ 또는 βAPP를 검출 또는 정제하는데 사용되는 키트에서는, 항체를 전형적으로는 예컨대 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생체 발광 화합물, 화학 발광 화합물, 금속 킬레이트화제 또는 효소 같은 검출가능한 마커로 라벨링한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 약제로서 사용되는지 및/또는 약제의 제조에 사용되는지에 관계없이 본원에 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 조성물(본원에 기재됨)을 제공한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되며, 본 발명을 한정하지는 않는다.

실시예 1. 항체 6G 및 그의 변이체의 결합 친화력 결정

A. 일반적인 방법

하기 일반적인 방법을 본 실시예 및 다른 실시예에 이용하였다.

클론 특징 결정에 사용되는 발현 벡터

항체의 Fab 단편의 발현은 바바스(Barbas)의 문헌[(2001) Phage display: a laboratory manual, 뉴욕주 콜드 스프링 하버, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vector pComb3X]에 기재된 것과 유사한 IPTG 유도성 lacZ 프로모터에 의해 제어하였으나, 개질은 하기 추가적인 도메인의 부가 및 발현을 포함하였다: IgG2a 인간 면역 글로불린의 Ig 감마-2 쇄 C 영역, 단백질 수납 번호 P01859; 면역 글로불린 카파 경쇄(호모사피엔스), 단백질 수납 번호 CAA09181의 인간 카파(Kappa) 경쇄 불변 도메인 및 CHI 불변 도메인.

소규모 Fab 제조

다음과 같이 96개 웰 플레이트에서 Fab의 소규모 발현을 수행하였다. Fab 라이브러리로 형질전환된 이. 콜라이로부터 출발하여, 콜로니를 채집하여 마스터 플레이트(한천 LB + 암피실린(50㎍/ml) + 2% 글루코즈) 및 작업 플레이트(2ml/웰, LB + 암피실린(50㎍/ml) + 2% 글루코즈 1.5mL를 함유하는 96개 웰/플레이트)에 접종하였다. 두 플레이트를 30℃에서 8 내지 12시간동안 생육시켰다. 마스터 플레이트를 4℃에 저장하고, 작업 플레이트로부터의 세포를 5000rpm에서 펠렛화시킨 후, LB + 암피실린(50㎍/ml) + 1mM IPTG 1mL에 재현탁시켜 Fab의 발현을 유도하였다. 30℃에서 5시간동안 발현시킨 후 원심분리에 의해 세포를 수획하고, 이어 완충액 HBS-EP(100mM HEPES 완충액 pH 7.4, 150mM NaCl, 0.005% P20) 500μL에 재현탁시켰다. 동결(-80℃) 후 37℃에서 해동시키는 1회 싸이클에 의해 HBS-EP 재현탁된 세포를 용해시켰다. 세포 용해물을 5000rpm에서 30분간 원심분리시켜, Fab를 함유하는 상청액으로부터 세포 찌꺼기를 분리하였다. 이어, 상청액을 바이아코어 플라스몬 공명 장치에 주입하여 각각의 Fab에 대한 친화력 정보를 수득하였다. DNA의 서열을 결정하기 위해 또한 아래 기재되는 바와 같은 대규모 Fab 생산 및 상세한 특징 결정을 위해, Fab를 발현하는 클론을 마스터 플레이트로부터 꺼내었다.

대규모 Fab 제조

상세한 동역학 매개변수를 수득하기 위하여, Fab를 발현시키고 대량 배양액으로부터 정제하였다. LB + 암피실린(50㎍/ml) + 2% 글루코즈 200mL를 함유하는 얼렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크에, 선택된 Fab-발현 이. 콜라이 클론으로부터의 하룻밤 배양액 5mL를 접종하였다. 1.0의 OD_550nm가 수득될 때까지 30℃에서 클론을 배양한 다음, 매질을 LB + 암피실린(50㎍/ml) + 1% IPTG 200mL로 대체함으로써 유도하였다. 30℃에서 5시간동안 발현시킨 후, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화시키고 PBS(pH 8) 10mL에 재현탁시켰다. 동결/해동(각각 -80℃ 및 37℃에서)의 2회 싸이클에 의해 세포를 용해시켰다. 세포 용해물의 상청액을, PBS(pH 8)로 평형화시킨 Ni-NTA 슈퍼플로우 세파로즈[퀴아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아] 칼럼에 넣은 후, 칼럼 부피 5배의 PBS(pH 8)로 세척하였다. 개별적인 Fab는 PBS(pH 8) + 300mM 이미다졸을 갖는 상이한 분획에 용리되었다. Fab를 함유하는 분획을 모으고 PBS에서 투석한 다음, ELISA에 의해 정량한 후 친화력 특징을 결정하였다.

전체 항체 제조

전체 항체의 발현을 위해, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포유동물 발현 벡터에서 클로닝시키고, 일시적인 발현을 위해 리포펙타민을 사용하여 HEK 293 세포 내로 형질감염시켰다. 표준 방법을 이용하여 단백질 A로 항체를 정제하였다.

벡터 pDb.6G.hFc2a는 6G 항체의 중쇄를 포함하는 발현 벡터이고, 중쇄의 일시적인 발현 또는 안정한 발현에 적합하다. 벡터 pDb.6G.hFc2a는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다: 쥣과의 사이토메갈로바이러스 프로모터 영역(뉴클레오타이드 1-612); 합성 인트론(뉴클레오타이드 619-1507); DHFR 코딩 영역(뉴클레오타이드 707-1267); 인간 성장 호르몬 신호 펩타이드(뉴클레오타이드 1525-1602); 6G의 중쇄 가변 영역; A330P331의 S330S331(아미노산 번호는 야생형 IgG2a 서열을 참조함; Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624 참조)로의 돌연변이를 함유하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역; SV 40 레이트(late) 폴리아데닐화 신호; SV40 증강자 영역; 파지 f1 영역 및 베타 락타마제(AmpR) 코딩 영역.

벡터 pEb.6G.hK는 6G 항체의 경쇄를 포함하는 발현 벡터이고, 경쇄의 일시적인 발현에 적합하다. 벡터 pEb.6G.hK는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다: 쥣과의 사이토메갈로바이러스 프로모터 영역(뉴클레오타이드 1-612); 인간 EF-1 인트론(뉴클레오타이드 619-1142); 인간 성장 호르몬 신호 펩타이드(뉴클레오타이드 1173-1150); 항체 6G 경쇄 가변 영역; 인간 카파 쇄 불변 영역; SV40 레이트 폴리아데닐화 신호; SV40 증강자 영역; 파지 f1 영역 및 베타 락타마제(AmpR) 코딩 영역.

바이아코어(biacore) 분석법

바이아코어(core)3000™ 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템[바이아코어, 인코포레이티드(BIAcore, INC.), 뉴저지주 피스카웨이]을 이용하여 6G 단클론 항체의 친화력을 결정하였다. 친화력을 결정하는 한 방법은 CM5 칩 상에 6G를 부동화시키고, Aβ_1-40 펩타이드 또는 다른 Aβ 펩타이드의 항체로의 결합 동력학을 측정하는 것이었다. CM5 칩을 공급자의 사용 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시켰다. 항체 6G 또는 그의 변이체를 10mM 아세트산나트륨(pH 4.0 또는 5.0) 중으로 희석시키고, 0.005mg/mL의 농도로 활성화된 칩 위에 주입하였다. 개별적인 칩 채널을 가로질러 가변적인 유동 시간을 이용하여, 광범위한 항체 밀도, 즉 1000 내지 2000 또는 2000 내지 3000 응답 단위(RU)를 달성하였다. 칩을 에탄올아민으로 차단하였다. 재생 연구는 200회의 주입에 걸쳐 칩 상의 6G의 활성을 유지하면서 피얼스(PIERCE) 용리 완충액 2부피 및 4M NaCl 1부피를 함유하는 용액이 결합된 Aβ 펩타이드를 효과적으로 제거하였음을 보여주었다. HBS-EP 완충액(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)을 모든 바이아코어 분석법의 유동 완충액으로서 사용하였다. 정제된 Aβ_1-40 합성 펩타이드 또는 다른 Aβ 펩타이드 샘플의 연속적인 희석액(0.1-10x 추정 K_D)을 100μL/분으로 1분간 주입하였고, 10분간의 해리 시간을 허용하였다. BIA평가 프로그램을 이용하여 데이터를 1:1 랑뮈르(Langmuir) 결합 모델[칼슨(Karlsson, R.), 루스(Roos, H.), 페이거스탐(Fagerstam, L.), 피터슨(Petersson, B.), (1994), Methods Enzymology 6.99-110]에 핏팅함으로써 동역학적 회합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 동시에 수득하였다. 평형상태 해리 상수(K_D) 값을 k_off/k_on으로서 계산하였다.

다르게는, Aβ_1-40 펩타이드 또는 다른 Aβ 펩타이드를 SA 칩 상에 부동화시키고, 부동화된 Aβ 펩타이드로의 6G Fab 및 6G 변이체의 Fab의 결합 동력학을 측정함으로써, 친화력을 결정하였다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템(바이아코어 3000™, 바이아코어, 인코포레이티드, 뉴저지주 피스카웨이)에 의해 6G Fab 단편 및 그의 변이체 Fab 단편의 친화력을 결정하였다. 공급자의 사용 설명서에 따라 SA 칩(스트렙트아비딘)을 사용하였다. 바이오틴일화된 Aβ 펩타이드를 HBS-EP(100mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% P20) 중으로 희석시키고, 0.005mg/mL의 농도로 칩 상에 주입하였다. 개별적인 칩 채널을 가로질러 가변적인 유동 시간을 이용하여, 두 범위의 항원 밀도를 수득하였다: 상세한 동력학 연구의 경우 100 내지 400 응답 단위(RU) 및 농도 연구 및 스크리닝의 경우 500 내지 2000 RU. 재생 연구는 200회의 주입에 걸쳐 칩 상의 Aβ 펩타이드의 활성을 유지하면서 100mM 인산(이 후에 50mM NaOH 2부피 및 70% 에탄올 1부피를 함유하는 용액이 따를 수 있음)이 결합된 Fab를 효과적으로 제거하였음을 보여주었다. HBS-EP 완충액을 모든 바이아코어 분석법의 유동 완충액으로서 사용하였다. 정제된 Fab 샘플의 연속 희석액(0.1-10x 추정 K_D)을 100μL/분으로 2분간 주입하였고, 10분간의 해리 시간을 허용하였다. 공지 농도(아미노산 분석에 의해 결정함)의 표준 Fab를 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기 영동에 의해 Fab 단백질의 농도를 결정하였다. 바이아평가 프로그램을 이용하여 데이터를 1:1 랑뮈르 결합 모델[칼슨, 루스, 페이거스탐, 피터슨, (1994), Methods Enzymology 6.99-110]에 핏팅함으로써 동역학적 회합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 동시에 수득하였다. 평형상태 해리 상수(K_D) 값을 k_off/k_on으로서 계산하였다.

ELISA 분석법

항체 6G 및 변이체의 바이오틴일화되지 않은 Aβ 펩타이드로의 결합을 측정하는데 ELISA를 이용하였다. NUNC 막시소프(maxisorp) 플레이트를 4℃에서 1시간 이상동안 PBS(pH 7.4)중 Aβ 펩타이드 2.5ug/ml로 코팅하였다. 플레이트를 PBS 완충액(pH 7.4)중 1% BSA로 차단하였다. 1차 항체(세포 상청액, 즉 항-Aβ 항체를 함유하는 혈청으로부터, 또는 목적하는 대로 희석된 정제된 전체 항체 또는 Fab)를 실온에서 1시간동안 부동화된 Aβ 펩타이드와 함께 배양하였다. 세척 후, 플레이트를 2차 항체, 즉 1:5000의 희석비의 HRP 콘쥬게이트된 염소 항-인간 카파 쇄 항체[MP 바이오메디칼즈(MP Biomedicals), 55233]와 함께 배양하였다. 세척 후, TMB 기질(KPL, 50-76-02, 50-65-02)을 첨가함으로써 결합된 2차 항체를 측정하였다. 1M 인산을 첨가함으로써 HRP 반응을 중단시키고 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.

바이오틴일화된 Aβ 펩타이드로의 항체 6G 및 변이체의 결합을 측정하는데 ELISA를 사용하였다. NUNC 막시소프 플레이트를 4℃에서 1시간 이상동안 PBS(pH 7.4)중 스트렙트아비딘[피어스(Pierce), 21122] 6ug/ml로 코팅하였다. 플레이트를 PBS 완충액(pH 7.4)중 1% BSA로 차단하였다. 세척 후, PBS(pH 7.4)중 바이오틴일화된 Aβ 펩타이드를 실온에서 1시간동안 배양하였다. 1차 항체(세포 상청액, 즉 항-Aβ 항체를 함유하는 혈청으로부터, 또는 목적하는 대로 희석된 정제된 전체 항체 또는 Fab)를 실온에서 1시간동안 부동화된 Aβ 펩타이드와 함께 배양하였다. 세척 후, 플레이트를 2차 항체, 즉 1:5000의 희석비의 HRP 콘쥬게이트된 염소 항-인간 카파 쇄 항체(MP 바이오메디칼즈, 55233)와 함께 배양하였다. 세척 후, TMB 기질(KPL, 50-76-02, 50-65-02)을 첨가함으로써 결합된 2차 항체를 측정하였다. 1M 인산을 첨가함으로써 HRP 반응을 중단시키고 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.

B. 항체 6G 및 변이체의 Aβ_1-40, Aβ_1-42 및 다른 Aβ 펩타이드로의 결합 친화력

항체 6G의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 도 1에 표시되어 있다. 상기 기재된 바이아코어를 이용하여 결정된 6G 항체의 Aβ_1-40, Aβ_1-42 및 Aβ_22-37에 대한 결합 친화력은 아래 표 2에 기재된다.

6G의 변이체의 아미노산 서열이 아래 표 3에 표시되어 있다. 표 3에 나타낸 변이체의 모든 아미노산 치환이 6G의 서열과 비교하여 기재된다. 6G 변이체의 상대적인 결합도 표 3에 기재된다. ELISA 플레이트의 표면 상에 부동화된 바이오틴일화되지 않은 Aβ_1-40 또는 Aβ_1-42를 사용하여 상기 ELISA에 의해 결합을 결정하였다.

실시예 2: 항체 6G와 결합하는 Aβ 펩타이드상의 항원결정기의 특징 결정

항체 6G에 의해 인식되는 Aβ 펩타이드상의 항원결정기를 확인하기 위하여, ELISA 결합 분석을 이용하였다. 다양한 Aβ 펩타이드[글로벌 펩타이드 서비시즈, 캄파니(Global Peptide Services, CO)]를 ELISA 플레이트 상에 부동화시켰다. 부동화된 Aβ로의 6G 전체 항체(20nM)의 결합을 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 결정하였다. Aβ_1-40, Aβ_1-42 및 Aβ_1-43의 아미노산 서열이 아래 표 5에 나타나 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 항체 6G는 Aβ 펩타이드 17-40, 17-42, 22-35, 28-40, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43 및 28-42에 결합하지만, 28-42에의 결합은 다른 Aβ 펩타이드보다 훨씬 약하다. 항체 6G는 Aβ 펩타이드 1-16, 1-28 및 33-40과는 결합하지 않았다. 그러므로, 항체 6G는 다양한 절단된 Aβ 펩타이드, 예를 들어 22-35, 1-38, 1-40, 1-42 및 1-43의 C-말단에 결합한다.

아래 표 4는 바이아코어 분석법을 이용하여 k_off(l/s)에 의해 측정된 6G의 Aβ_1-40로의 결합 친화력을 다른 Aβ 펩타이드로의 결합 친화력과 비교한 결과를 보여준다. 항체 6G는 다른 펩타이드에 비해 가장 높은 친화력으로 Aβ_1-40에 결합하며, 절단된 Aβ_1-40(예컨대, 1-36, 1-37, 1-38 및 1-39), Aβ_1-42 및 Aβ_1-43에는 훨씬 더 낮은 친화력으로 결합한다. 이는 Aβ의 아미노산 40(발린)의 측쇄 또는 골격이 6G의 Aβ_1-40으로의 결합에 관여하고, 이 아미노산이 없는 경우에는 결합이 상당히 감소됨(예를 들어 약 10배 내지 약 50 내지 250배의 친화력 손실)을 보여준다. 카복시-말단 아마이드화된 Aβ_1-40으로의 더욱 낮은 친화력의 결합은 6G의 Aβ_1-40으로의 결합이 Aβ_1-40의 자유 C-말단과 관련있지만 그에 의존하지는 않음을 보여준다. Aβ_1-42 및 Aβ_1-43으로의 더욱 낮은 친화력의 결합은 Aβ_1-40과 Aβ_1-42 또는 Aβ_1-43의 단량체 형태 사이의 형태 차이에 기인할 수 있다. Aβ_1-42의 단량체는 용액 중에서 Aβ_1-40 단량체와 상이한 형태를 갖는 것으로 밝혀졌다. 프로테인 데이터 뱅크(Protein Data Bank)에서 수납 번호 1IYT로 나타낸 Aβ_1-42의 단량체 구조 좌표(pdb 파일); 및 프로테인 데이터 뱅크에서 수납 번호 1BA6 및 1BA4로 나타낸 Aβ_1-40의 단량체 구조 좌표(pdb 파일) 참조.

ELISA 분석법에 의해 항체 6G의 항원결정기 맵핑을 수행하였다. 다양한 Aβ 펩타이드의 바이오틴일화된 15량체 또는 10량체(이들 펩타이드는 C-말단에 부가된 글라이신을 가짐)를 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트 상에 부동화시켰다. 항체 6G(2.5 내지 10ug/ml)를 부동화된 펩타이드와 함께 배양하고, 상기 기재된 바와 같이 결합을 측정하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 항체 6G는 C-말단에 글라이신이 있는 아미노산 20-34, 21-35, 22-36, 23-37, 24-38, 25-39 및 25-34를 갖는 Aβ 펩타이드에는 결합하지만; 이들 펩타이드의 C-말단에 글라이신이 있는 아미노산 19-33, 26-40, 27-41, 24-33 및 26-35를 갖는 Aβ 펩타이드에는 결합하지 않는다. 이는 항체 6G가 결합하는 항원결정기가 아미노산 25 내지 34를 포함함을 암시한다.

상기 나타낸 데이터에 기초하여, 항체 6G가 결합하는 항원결정기는 아미노산 25 내지 34 및 40을 포함하는 것으로 보인다. 도 4는 항체 6G의 항원결정기를 보여주는 개략적 그래프이다.

B. 항체 6G는 APP 에 결합하지 않음

6G가 아밀로이드 전구체 단백질(APP)에 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, 야생형 APP로 형질감염된 세포로의 6G의 결합을 결정하였다. 야생형 인간 아밀로이드 전구체 단백질을 코딩하는 cDNA로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48시간 후, 세포를 단클론 항체 항-Aβ_1-16, (m2324) 또는 6G(10% FCS를 함유하는 DMEM중 5ug/ml)와 함께 얼음 상에서 45분간 배양하였다. 이어, 세포를 PBS 중에서 5분간 3회 세척하고 4% PFA로 고정시켰다. 세포를 다시 PBS 중에서 3회 세척하고, 형광 현미경 하에서 잭슨 이뮤노리써치(Jackson Immunoresearch)로부터의 2차 Cy3-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 항체(1:500의 희석비)로 항체 결합을 검출하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, Aβ의 N-말단 항원결정기를 인식하는 항-Aβ_1-16 항체는 세포상에 발현된 APP 전구체 단백질과 상당한 결합을 나타내었다. 대조적으로, 6G는 APP 발현 세포에 결합하지 않았다.

실시예 3. 항체 2294와 결합하는 Aβ 펩타이드상의 항원결정기의 특징 결정

항체 2294는 Aβ_1-40으로 마우스를 면역화시킴으로써 생성시키는 쥣과의 항체이다. 이 항체는 미국 특허원 제 2004/0146512 호 및 WO 04/032868 호에 기재되어 있다.

상기 기재된 바와 같이 바이아코어를 사용하여 Aβ_1-40, Aβ_1-42 또는 Aβ_22-37에 대한 항체 2294의 결합 친화력을 측정하였다. 하기 표 6은 항체 2294 Fab 분절의 다양한 Aβ 펩타이드로의 친화력을 보여준다.

ELISA 분석법에 의해 항체 2294의 항원결정기 맵핑을 수행하였다. 다양한 Aβ 펩타이드의 바이오틴일화된 15량체 또는 10량체(이들 펩타이드는 C-말단에 부가된 글라이신을 가짐)를 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트 상에 부동화시켰다. NUNC 막시소프 플레이트를 4℃에서 1시간 이상동안 PBS(pH 7.4)중 스트렙트아비딘(피어스, 21122) 6ug/ml로 코팅하였다. 플레이트를 PBS 완충액(pH 7.4)중 1% BSA로 차단하였다. 세척 후, PBS(pH 7.4)중 바이오틴일화된 Aβ 펩타이드를 실온에서 1시간동안 배양하였다. 항체 2294(2.5 내지 10ug/ml)를 부동화된 Aβ 펩타이드와 함께 실온에서 1시간동안 배양하였다. 세척 후, 플레이트를 2차 항체, 즉 1:5000의 희석비의 HRP 콘쥬게이트된 염소 항-인간 카파 쇄 항체(MP 바이오메디칼즈, 55233)와 함께 배양하였다. 세척 후, TMB 기질(KPL, 50-76-02, 50-65-02)을 첨가함으로써 결합된 2차 항체를 측정하였다. 1M 인산을 첨가함으로써 HRP 반응을 중단시키고 450nm에서의 흡광도를 측정하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 항체 2294는 C-말단에 글라이신이 있는 아미노산 20-34, 21-35, 22-36, 23-37, 24-38, 25-39, 26-40 및 25-34를 갖는 Aβ 펩타이드에는 결합하지만; 이들 펩타이드의 C-말단에 글라이신이 있는 아미노산 19-33, 27-41, 24-33 및 27-35를 갖는 Aβ 펩타이드에는 결합하지 않는다. 이는 항체 2294가 결합하는 항원결정기가 아미노산 26 내지 34를 포함함을 암시한다.

항체 2294에 의해 인식되는 Aβ 펩타이드상의 항원결정기를 추가로 결정하기 위하여, ELISA 결합 분석을 이용하였다. 다양한 Aβ 펩타이드(글로벌 펩타이드 서비시즈, 캄파니)를 ELISA 플레이트 상에 부동화시켰다. 부동화된 Aβ로의 2294 전체 항체(20nM)의 결합을 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 결정하였다. 항체 2294는 Aβ 펩타이드 17-40, 17-42, 28-40, 1-38, 1-40, 1-42 및 1-43에 결합한다. 항체 2294는 Aβ 펩타이드 1-16, 1-28, 28-42, 22-35 및 33-40에는 결합하지 않았다. 그러므로, 항체 2294는 다양한 절단된 Aβ 펩타이드, 예를 들어 1-38, 1-40, 1-42 및 1-43의 C-말단에 결합한다.

아래 표 7은 바이아코어 분석에 의해 측정된 2294의 Aβ_1-40로의 결합 친화력을 다른 Aβ 펩타이드로의 결합 친화력과 비교한 결과를 보여준다. 항체 2294(전체 항체)는 다른 펩타이드에 비해 Aβ_1-40에 가장 강하게 결합하며, 절단된 Aβ_1-40(예컨대, 1-36, 1-37, 1-38 및 1-39), Aβ_1-42 및 Aβ_1-43에는 훨씬 더 약하게 결합한다. 이는 Aβ의 아미노산 40(발린)의 측쇄 또는 골격이 2294의 Aβ_1-40으로의 결합에 관여하고, 이 아미노산이 없는 경우에는 결합이 상당히 감소됨을 보여준다.

상기 나타낸 데이터에 기초하여, 항체 2294가 결합하는 항원결정기는 아미노산 26 내지 34 및 40을 포함하는 것으로 보인다. 항체 2294는 도 6에 나타낸 항체 6G와 매우 유사한 항원결정기에 결합한다. 그러나, 항체 6G의 결합은 항체 2294보다 아미노산 40에 덜 의존적이다.

바이아코어 분석을 이용하여 2294, 6G, 2H6 및 2289 사이의 항체 결합 경쟁 실험을 수행하였다. 항체 2H6은 Aβ_33-40에 결합하는 항체이고, 2005년 2월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 60/653,197 호에 기재되어 있다. 항체 2289는 Aβ_16-28에 결합하는 항체이고, 미국 특허 공개 제 2004/0146512 호 및 PCT WO 04/032868 호에 기재되어 있다. 바이아코어 분석법을 이용하여 경쟁 실험을 수행하였다. 항체 2294, 6G, 2H6 및 2289를 CM5 칩의 상이한 채널상에 부동화시켰다. CM5 칩 채널을 공급자의 사용 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시켰다. 항체 2294, 6G, 2H6 및 2289를 각각 10mM 아세트산나트륨(pH 4.0) 중으로 희석시키고, 0.005mg/mL의 농도로 활성화된 칩 위에 주입하였다. 각 채널을 에탄올아민으로 차단하였다. Aβ_1-40 펩타이드(150uM)를 2분동안 칩 상으로 유동시켰다. 이어, 0.6uM의 항체 2294(경쟁 결합을 위해 시험되어야 함)를 1분동안 칩 상으로 유동시켰다. HBS-EP 완충액(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)을 모든 바이아코어 분석법의 유동 완충액으로서 사용하였다. Aβ_1-40의 결합을 측정한 후, 피어스 용리 완충액[제품 번호 21004, 피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology), 일리노이주 락포드]과 4M NaCl(2:1)의 혼합물로 6초간 2회 세척함으로써, 칩의 모든 채널을 재생시켰다. 항체 6G, 2H6에 대해, 이어 항체 2289에 대해 경쟁 결합을 수행하였다. 2294와 6G 사이, 또한 2294와 2H6 사이에서는 Aβ_1-40에 대한 결합에서의 경쟁이 관찰되었으나, 2294와 2289 사이 또는 6G와 2289 사이에서는 경쟁이 관찰되지 않았다. 부동화된 항체와 칩 상으로 유동된 동일한 항체 사이의 경쟁의 관찰은 양성 대조용으로서의 역할을 하였다. 데이터는 항체 2294가 Aβ_1-40으로의 결합에 대해 2H6 및 6G와 경쟁함을 보여준다.

실시예 4. 항체 2294 Fc 영역의 쥣과 Fc _γ 수용체로의 결합 친화력

상기 기재된 바와 같이 바이아코어를 이용하여 항체 Fc 영역의 Fc_γ 수용체로의 결합 친화력을 측정하였다. 간단히, 정제된 쥣과의 Fc_γ 수용체[알앤드디 시스템즈(R&D Systems) 제품]를 아민 화학에 의해 바이아코어 CM5 칩 상에 부동화시켰다. 단클론 항체의 연속적인 희석액(2nM로부터 표 8에 나타낸 바와 같은 최대 농도까지)을 주입하였다. HBS-EP(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)를 유동 및 샘플 완충액으로서 사용하였다. 고친화력 상호작용에 대한 1:1 랑뮈르 상호작용 모델 또는 저친화력 상호작용에 대한 정상상태 친화력 모델을 사용하여 결합 데이터를 분석하였다.

아래 표 8은 쥣과의 Fc_γRI, Fc_γRIIb 및 Fc_γRIII에 대한 K_D(nM)에 의해 측정된 항체 2294의 결합 친화력을 도시한다. 탈글라이코실화된 항체는 N-글라이코실화가 제거된 불변 영역을 갖는다. 표 8에 나타낸 바와 같이, 탈글라이코실화된 2294는 N-글라이코실화가 제거되지 않은 각각의 상응하는 항체와 비교할 때 시험된 모든 쥣과의 Fc_γ 수용체에 대해 감소된 친화력을 가졌다.

실시예 5. 알쯔하이머병의 동물 모델에서 Aβ 침착의 감소 및 인지력에 있어서의 항체 2294 및 탈글라이코실화된 항체 2294의 효과

20mM Tris-HCl(pH 8.0)중에서 펩타이드-N-글라이코시다제 F[프로자임(Prozyme), 항체 1mg당 0.05U]와 함께 정제된 항체 2294를 37℃에서 7일간 배양함으로써 탈글라이코실화된 항체 2294를 제조하였다. MALDI-TOF-MS 및 단백질 겔 전기 영동에 의해 탈글라이코실화가 종결되었음을 입증하였다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 탈글라이코실화된 항체를 정제하고, Q-세파로즈에 의해 내독소를 제거하였다. 상기 기재된 Bia코아 분석법을 이용하여, 탈글라이코실화된 2294의 Aβ_1-40에 대한 결합 친화력을 시험하였으며, Aβ_1-40에 대한 탈글라이코실화된 2294의 결합 친화력이 완전한 항체 2294와 동일함을 발견하였다.

항체 2294 및 탈글라이코실화된 2294를 유전자 이전 마우스 APP Tg2576에서, 인지 결손, 조직학적 증상 및 미세 출혈의 역전에 대한 이들의 효과에 대해 시험하였다. 항체 투여, 조직학적 및 행동적 분석을 아래 기재되는 바와 같이 수행한다.

항체의 투여. "스웨디쉬" 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질[K670N/M671을 갖는 APP Tg2576; 시아오(Hsiao) 등, Science 274:99-102 (1996)]을 과발현하는 유전자 이전 마우스를 실험에 이용하였다. 이들 마우스에 존재하는 알쯔하이머와 유사한 표현형은 잘 특징화되어 있다. 홀콤(Holcomb) 등의 문헌[Nat. Med. 4:97-100 (1998)]; 홀콤 등의 문헌[Behav. Gen. 29:177-185 (1999)]; 및 맥고원(McGowan E)의 문헌[Neurobiol. Dis. 6:231-244 (1999)] 참조. 16주 치료 연구를 위해, 20개월령의 APP-유전자 이전 마우스를 4개 군중 하나에 할당하였다. 제 1 군에는 16주동안 항-Aβ 항체 2294를 매주 1회 복강내 주사하였다(n=4). 제 2 군에는 16주동안 탈글라이코실화된 항-Aβ 항체 2294를 매주 1회 복강내 주사하였다(n=5). 제 3 군에는 16주동안 항-AMN 항체(2906; 마우스-단클론 항-드로소필라(Drosophila) 기억상실 단백질 IgG1)를 매주 1회 복강내 주사하였다(n=6). 유전자 이전되지 않은 한배 새끼를 항-AMN 항체(n=4) 또는 2294(n=2)로 16주간 처치하였다.

행동 분석. 16주간의 항체 처리 후, 연구되는 마우스를 이미 기재된 바 있는 2일 방사상-암 물-미로에 넣는다. 윌콕 등의 문헌[J. Neuroinflammation 1:24 (2004)] 참조. 장치는 이미 기재된 바 있는 6-암 미로이다. 고든(Gordon) 등의 문헌[Neurobiol . Aging 22:377-385 (2001)]. 제1일에, 5회씩 3개의 블록으로 15회 실험을 수행한다. 각각의 블록에서 4마리 마우스 무리를 연속적으로 실험한다(즉, 4마리의 마우스 각각을 1회씩 실험한 다음 동일한 마우스를 2회째 실험하는 등). 각각 5회 실험 블록 후, 마우스를 5회 실험의 두번째 블록에 노출시키기 전에 마우스의 두번째 무리를 연장된 시간동안 휴식시킨다. 목표 암은 무리내의 각 마우스에서 상이하게 하여 냄새로 인한 단서를 최소화시킨다. 출발 암은 각 실험마다 변화시키고, 소정 개체에 있어서는 2일 동안 목표 암을 동일하게 유지시킨다. 처음 11회 실험의 경우, 플랫폼을 교대로 보이게 하다가 숨긴다(마지막 4회 시험동안 숨김). 제2일에는, 플랫폼을 모든 실험동안 숨기는 것을 제외하고는 제1일과 완전히 동일한 방식으로 마우스를 실험한다. 과실의 수(잘못된 암 입장)를 1분의 시간 틀에서 측정한다. 20초 내에 암 선택을 하지 못한 마우스에게 1회 과실을 부여하였으나, 이 연구에서의 마우스는 이러한 방식으로 과실을 부여받지 않았다. 연구의 마우스의 수가 많기 때문에, 실험자는 각 마우스의 처리군 번호를 알지 못한다. 방사상-암 물-미로 과업에서 의존하는 수단이 정량적이고 평가적이지 않기 때문에, 시험자 편견 가능성은 감소된다. 개별 실험 가변성의 영향을 최소화하기 위하여, 3회의 연속적인 실험에서 각 마우스의 과실을 평균하여 매일 5개의 데이터 지점을 생성시키고, 이를 스탯뷰(StatView)[SAS 인스티튜트 인코포레이티드(SAS Institute Inc.), 노쓰캐롤라이나주]를 사용하는 ANOVA에 의해 통계적으로 분석한다.

조직학적 분석. 죽이는 날에, 마우스의 체중을 재고 100mg/kg 넴부탈[애보트 래보러토리즈(Abbott laboratories), 일리노이주 노쓰 시카고]을 과투여한 다음 0.9% 염화나트륨 25mL를 심장내로 관류시킨다. 뇌를 신속하게 제거하고, 조직학적 분석을 위해 100mM KPO₄(pH 7.2)중 새롭게 제조된 4% 파라폼알데하이드에 뇌의 왼쪽 절반을 24시간동안 침지시켜 고정시킨다. 세포 보호를 위해 뇌의 절반을 10%, 20% 및 30% 슈크로즈 중에서 연속적으로 24시간동안 배양한다. 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 25μ 두께의 수평 절편을 수집하고, 4℃에서 아지드화나트륨을 갖는 덜베코(Dulbecco's) 인산염-완충된 염수(pH 7.2) 중에 저장하여, 미생물 생육을 방지한다. 600μ 이격된 8개의 동일하게 떨어진 일련의 조직 절편을, 전체 뇌의 스캐닝을 위해 무작위적으로 선택하고, 이미 기재된 바와 같이 전체 Aβ[토끼 다클론 항-pan Aβ; 바이오쏘스(Biosource), 캘리포니아주 카마릴로, 1:10,000]에 대한 자유-부유 면역조직화학을 이용하여 염색한다. 고든 등의 문헌[Exp . Neurol . 173:183-195 (2002)]; 윌콕 등의 문헌[J. Neurosci. 24:6144-6151 (2004)] 참조. 600㎛ 이격된 두번째 일련의 조직 절편을, NaCl-포화된 80% 에탄올중 0.2% 콩고 레드를 사용하여 염색한다. 다른 절편 세트를 또한 적재하고, 2% 염산중 2% 포타슘 페로사이아나이드를 15분간, 이어 1% 내츄럴 레드 용액중의 대비 염색제를 10분간 사용하여 헤모시데린에 대해 염색한다. 이미지-프로 플러스(Image-Pro Plus)[미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics), 메릴랜드주 실버 스프링]를 사용하여 콩고 레드 염색 및 Aβ 면역조직화학의 정량화를 수행하여, 양성 염색제에 의해 점유된 면적의 백분율을 분석한다. 전두 피질의 한 영역 및 해마의 세 영역을 분석한다(해마 값에 영역에 따른 치우침이 없도록 보장하기 위하여). 콩고 레드의 초기 분석을 수행하여 전체 값을 제공한다. 실질 아밀로이드 침착물을 모두 수동 제거한 후 두번째 분석을 수행하여, 혈관 콩고 레드 염색으로 제한된 면적의 백분율을 수득한다. 콩고 레드의 실질 면적을 평가하기 위하여, 전체 백분율에서 혈관 아밀로이드 값을 뺀다. 헤모시데린 염색제의 경우, 모든 절편상에서 프러시안 블루-양성 부위의 수를 세고, 절편 1개당 부위의 평균 수를 계산한다. 낮은 배율하에 절편에서 동물 사이의 정성적 차이를 관찰한다. 8개의 동일하게 떨어진 절편을 시험하고, 양의 프로파일의 수를 결정한 후 절편 1개당 값의 평균을 구한다. 가능한 치료-관련 차이를 사정하기 위하여, 각 처리군의 값을 일방 ANOVA에 이어 피셔(Fisher's) LSD 평균 비교에 의해 분석한다.

ELISA 를 사용한 Aβ 펩타이드의 혈청 수준의 측정. 항체를 마지막으로 투여한지 1일 후에 수집된 혈청을 희석시키고, PBS 완충액(pH 7.4)중 5ug/ml의 항체 6E10[Aβ_1-17에 결합하는 항-베타 아밀로이드 항체; 시그넷(Signet), 매사추세츠주 데드햄]으로 미리 코팅한 96개-웰 미소적정 플레이트(막시소프; Nunc, 덴마크 로스클라이드)에서 배양한다. 2차 항체는 1:5000의 희석비의 바이오틴일화된 4G8(Aβ_17-24에 결합하는 항-베타 아밀로이드 항체; 시그넷)이다. 스트렙트아비딘-고추냉이 퍼옥시다제 컨쥬게이트[애머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences)], 이어 TMB 기질(KPL, 메릴랜드주 게이터스버그)을 이용하여 검출한다. 표준 곡선을 수득하기 위해 6 내지 400pM의 Aβ_1-40(어메리칸 펩타이드) 눈금을 이용한다.

본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시 목적을 위한 것이며, 당해 분야의 숙련자는 이에 비추어 다양하게 변형 또는 변화시킬 것이며, 이들 변형 또는 변화는 본원의 원리 및 범위 내에 속하는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허원은 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허원을 구체적으로 또한 개별적으로 인용하는 것으로 표시되는 것과 동일한 한도로 본원에 참고로 인용된다.

생물학적 물질의 기탁

하기 물질을 미국 종균 협회(American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801; ATCC)에 기탁하였다:

벡터 pEb.6G.hK는 6G 경쇄 가변 영역 및 경쇄 카파 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이고; 벡터 pDb.6G.hFc2a는 6G 중쇄 가변 영역 및 A330P331의 S330S331(아미노산 번호는 야생형 IgG2a 서열을 참조하는 카바트 넘버링을 기준으로 함; Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624 참조)로의 돌연변이를 함유하는 중쇄 IgG2a 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다.

특허 절차 목적을 위한 미생물 기탁의 국제 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그에 따른 규칙(부다페스트 조약)하에 이렇게 기탁하였다. 이는 기탁일로부터 30년동안 기탁물의 살아 있는 배양액의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약하에 ATCC에 의해 입수될 수 있고, 리냇 뉴로사이언스 코포레이션(Rinat Neuroscience Corp.)과 ATCC 사이의 동의를 받는데, 이는 관련 미국 특허의 허여시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허원의 공개시(어느 것이 먼저이든 간에) 기탁물의 배양액의 자손을 대중에게 제한없이 영구적으로 입수가능하게 할 것을 보장하며, 미국 특허법 122 조 및 그에 따른 특허상표청장의 명령(886 OG 638을 구체적으로 참조하는 37 CFR 섹션 1.14 포함)에 따라 특허상표청장이 그렇게 명명되는 것으로 결정된 기탁물의 자손의 입수가능성을 결정함을 보장한다.

본원의 양수인은, 적합한 조건하에서 배양할 때 기탁물의 배양액이 죽거나 상실되거나 파괴되는 경우, 고지 즉시 기탁물을 그와 동일한 다른 배양물로 교체할 것에 동의하였다. 기탁물의 입수가능성은 해당국의 특허법에 따른 임의의 정부의 권한에 위배하면서 본 발명을 실행할 권리로서 간주되어서는 안된다.

항체 서열

6G 중쇄 가변 영역 아미노산 서열(서열번호 1)

6G 경쇄 가변 영역 아미노산 서열(서열번호 2)

6G CDR H1(연장된 CDR)(서열번호 3)

GYTFTTYAIH

6G CDR H2(연장된 CDR)(서열번호 4)

FTSPYSGVSNYNQKFKG

6G CDR H3(연장된 CDR)(서열번호 5)

FDNYDRGYVRDY

6G CDR LI(연장된 CDR)(서열번호 6)

RASESVDNDRISFLN

6G CDR L2(연장된 CDR)(서열번호 7)

AATKQGT

6G CDR L3(연장된 CDR)(서열번호 8)

QQSKEFPWS

6G 중쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열(서열번호 9)

6G 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열(서열번호 10)

6G 중쇄 전체 항체 아미노산 서열(본원에 기재된 개질된 IgG2a 포함)(서열번호 11)

6G 경쇄 전체 항체 아미노산 서열(서열번호 12)

6G 중쇄 전체 항체 뉴클레오타이드 서열(본원에 기재된 개질된 IgG2a 포함)(서열번호 13)

6G 경쇄 전체 항체 뉴클레오타이드 서열(서열번호 14)

SEQUENCE LISTING <110> RINAT NEUROSCIENCE CORP. ROSENTHAL, Arnon PONS, Jaume HO, Wei-Hsien <120> ANTIBODIES DIRECTED AGAINST AMYLOID-BETA PEPTIDE AND METHODS USING SAME <130> 514712002840 <140> PCT/US2006/016071 <141> 2006-04-28 <150> US 60/704,818 <151> 2005-08-01 <150> US 60/676,093 <151> 2005-04-29 <160> 32 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Phe Thr Ser Pro Tyr Ser Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Asp Asn Tyr Asp Arg Gly Tyr Val Arg Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Asp 20 25 30 Arg Ile Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Lys Gln Gly Thr Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Phe Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Ala Ile His 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Phe Thr Ser Pro Tyr Ser Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Phe Asp Asn Tyr Asp 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 10 gacatcgtga tgacccagtc cccagactcc ctggccgtgt ccctgggcga gcgcgccacc 60 atcaactgcc gcgccagcga atccgtggat aacgatcgta tttcctttct gaactggtac 120 cagcagaaac caggccagcc tcctaagctg ctcatttacg ccgccaccaa acagggtacc 180 ggcgtgcctg accgcttctc cggcagcggt tccggcaccg atttcactct gaccatctcc 240 tccctgcagg ccgaagatgt ggcagtgtat tactgtcagc agtccaaaga gtttccctgg 300 tcctttggcg gtggcaccaa ggtggagatc aaacgcactg tg 342 <210> 11 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Phe Thr Ser Pro Tyr Ser Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 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300 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 12 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 12 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Asp 20 25 30 Arg Ile Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 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cgtggtgcac caggactggc tgaacggaaa ggagtataag 960 tgtaaggtgt ccaacaaggg actgccatcc agcatcgaga agaccatctc caagaccaag 1020 ggacagccaa gagagccaca ggtgtatacc ctgcccccat ccagagagga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggattctatc catccgacat cgccgtggag 1140 tgggagtcca acggacagcc agagaacaac tataagacca cccctccaat gctggactcc 1200 gacggatcct tcttcctgta ttccaagctg accgtggaca agtccagatg gcagcaggga 1260 aacgtgttct cttgttccgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagagc 1320 ctgtccctgt ctccaggaaa g 1341 <210> 14 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 14 gacatcgtga tgacccagtc cccagactcc ctggccgtgt ccctgggcga gcgcgccacc 60 atcaactgcc gcgccagcga atccgtggat aacgatcgta tttcctttct gaactggtac 120 cagcagaaac caggccagcc tcctaagctg ctcatttacg ccgccaccaa acagggtacc 180 ggcgtgcctg accgcttctc cggcagcggt tccggcaccg atttcactct gaccatctcc 240 tccctgcagg ccgaagatgt ggcagtgtat tactgtcagc agtccaaaga gtttccctgg 300 tcctttggcg gtggcaccaa ggtggagatc aaacgcactg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttccctc catctgatga gcagttgaaa tccggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atccacgcga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcc 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga ccctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagttc tccagtcaca aagagcttca accgcggtga gtgc 654 <210> 15 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 16 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 17 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr 35 40 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 18 Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Gly 1 5 10 15 <210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 19 Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Gly 1 5 10 15 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 20 Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Gly 1 5 10 15 <210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 21 Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly 1 5 10 15 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 22 Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly 1 5 10 15 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 23 Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 24 Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Gly 1 5 10 15 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 25 Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Gly 1 5 10 15 <210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 26 Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Gly 1 5 10 15 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 27 Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Gly 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 28 Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Gly 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 29 Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Gly 1 5 10 <210> 30 <211> 49 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 15 His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 30 Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val 35 40 45 Ile <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 31 Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Gly 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 32 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15

Claims (44)

1. 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5에 나타낸 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 나타낸 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단클론 항체.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서,

   Fc 영역의 N-글라이코실화가 제거된, 단클론 항체.
7. 제 1 항에 있어서,

   상기 항체의 중쇄 불변 영역이 A330P331로부터 S330S331로의 아미노산 돌연변이를 포함하는 인간 IgG2a 불변 영역이고, 이때 상기 아미노산 위치가 인간 야생형 IgG2a 서열에 대한 카바트(Kabat) 넘버링을 기준으로 한 것인, 단클론 항체.
8. 제 1 항에 있어서,

   상기 항체의 중쇄 불변 영역이 E233F234L235로부터 P233V234A235로의 아미노산 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 불변 영역이고, 이때 상기 아미노산 위치가 인간 야생형 IgG4 서열에 대한 카바트 넘버링을 기준으로 한 것인, 단클론 항체.
9. 제 1 항에 있어서,

   상기 항체가 인간 항체인 단클론 항체.
10. 제 1 항에 있어서,

    상기 항체가 인간화된(humanized) 항체인 단클론 항체.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 제 1 항에 있어서,

    상기 중쇄 가변 영역이 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역이 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 단클론 항체.
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 서열번호 11에 나타낸 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 12에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단클론 항체.
20. 삭제
21. 삭제
22. 제 1 항의 단클론 항체의 단편으로서, 상기 단클론 항체의 결합 특이성을 갖거나 보유하는 단편.
23. 제 22 항에 있어서,

    상기 단편이 Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 Fv인 단편.
24. 제 1 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 14 항 및 제 19 항 중 어느 한 항의 단클론 항체 또는 제 22 항 또는 제 23 항의 단편의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, Aβ 또는 베타 아밀로이드 전구체 단백질(βAPP)의 변화된 발현 또는 Aβ 펩타이드의 축적과 관련된 질환의 예방, 치료, 억제 또는 발달 지연을 위한 약학 조성물.
25. 서열번호 1의 항체 중쇄 또는 서열번호 2의 항체 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
26. 삭제
27. Aβ 또는 βAPP의 변화된 발현 또는 Aβ 펩타이드의 축적과 관련된 질환의 예방, 치료, 억제 또는 발달 지연에 사용하기 위한 제 1 항, 제 6 항 내지 제 10 항, 제 14 항 및 제 19 항 중 어느 한 항의 단클론 항체 또는 제 22 항 또는 제 23 항의 단편.
28. 삭제
29. 삭제
30. 제 25 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
31. 삭제
32. 제 30 항에 있어서,

    기탁 번호가 ATCC PTA-6786인 pDb.6G.hFc2a이거나 기탁 번호가 ATCC PTA-6787인 pEb.6G.hK인 벡터.
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 제 25 항의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상 포함하는 숙주 세포.
37. 삭제
38. 삭제
39. 삭제
40. 제 25 항의 폴리뉴클레오타이드를 하나 이상 함유하는 제 36 항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 숙주 세포 또는 배양물로부터 항체를 단리하는 단계를 포함하는 항체의 제조 방법.
41. 제 24 항에 있어서,

    상기 질환이 알쯔하이머병 또는 알쯔하이머병과 관련된 증상인, 약학 조성물.
42. 제 24 항에 있어서,

    아밀로이드 반점(plaque)의 형성 억제 또는 감소를 위한 약학 조성물.
43. 제 24 항에 있어서,

    인지를 개선시키거나 Aβ의 아밀로이드 침착과 관련된 인지 저하를 역전시키기 위한 약학 조성물.
44. 제 24 항에 있어서,

    상기 질환이 다발-경색 치매, 가벼운 인지 손상, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 다운 증후군, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야콥병, 루이체(Lewy body)를 갖는 치매 또는 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)인, 약학 조성물.

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